Gushing bezeichnet ein Phänomen, das bei kohlenstoffdioxid-haltigen Getränken wie Bier, Sekt, Fruchtschorlen und sogar Mineralwasser auftritt. Das Öffnen eines Getränkebehälters führt zum sofortigen Überschäumen des Getränks, ohne dass der Behälter zuvor geschüttelt wurde. Das Problem des Gushings ist seit über 100 Jahren bekannt, jedoch konnten weder der Verursacher noch der dazu führende Mechanismus bis jetzt final geklärt werden. Für Brauereien und Getränkehersteller kann ein solcher Qualitätsfehler schwerwiegende Image- Schäden beim Konsumenten nach sich ziehen, welche sich auch in finanziellen Verlusten niederschlagen. Alleine in Deutschland hatten 54% der Brauereien in den letzten zehn Jahren bereits Erfahrungen mit Gushing. Dieser Wert zeigt die hohe Relevanz der Gushing- Erforschung und dessen Prophylaxe.

Gushing wird anhand des ursprünglichen Auslösers in zwei unterschiedliche Typen einge- teilt: das primäre rohstoffbedingte Gushing wird durch Schimmelpilze hervorgerufen, die bei ungünstigen klimatischen Bedingungen auf beispielsweise Gerstenkörnern wachsen. Das sekundäre Gushing entsteht durch fehlerhafte Herstellungsmethoden, beispielsweise durch turbulentes Befüllen der Getränkebehälter, Tensidrückstände auf der Innenseite der Getränkebehälter oder einer suboptimalen Temperatur und Dauer während der Getränkelagerung. Als wahrscheinlichste Auslöser für das primäre Gushings gelten Schimmelpilze der Gattung Fusarium, vor allem Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium avenaceum, Fusarium sabucinum und Fusarium equiseti. Eine Infektion mit diesen Schimmelpilzen führt zu einer Rotfärbung des Korns. Darüber hinaus werden von den Schimmelpilzen Stoffwechselprodukte produziert, welche direkt ins Korn abgegeben werden und dieses weiter infizie- ren. Eine wichtige Gruppe dieser Stoffwechselprodukte sind die Hydrophobine, denen eine entscheidende Rolle bei der Entstehung des Gushings zugeschrieben wird. Hydrophobine sind niedermolekulare Proteine mit einem Molekulargewicht von 7 bis 15 kDa. Sie besitzen oberflächenaktive Eigenschaften und bilden in kohlenstoffdioxid-haltigen Getränken zusammen mit den hydrophoben C0 ₂ -Molekülen Nano-Strukturen, in dem sie eine Art Membran um die C0 ₂ -Blasen formen und diese vor der Dilatation schützen. Die Nano-Blasen-Entste- hung erfolgt ausschließlich in einem geschlossenen System. Wird der Getränkebehälter geöffnet, führt die Druckentlastung zu einer plötzlichen und massiven Freisetzung des gasförmigen C0 ₂ , welches das Gushing darstellt. Weitere Gushing-fördernde Faktoren sind unter anderem Metallionen wie Kupfer, Nickel, Zink, Cobalt, Mangan und vor allem Eisen, welche bereits in den Rohstoffen für die Getränkeherstellung vorhanden sind (z. B. im Wasser, Hopfen, Malz). Aus früheren Untersuchungen ist ersichtlich, dass diese Ionen auch trübungsaktive Protein-Polyphenol-Komplexe bin- den und so als Entbindungskeime für das Gushing fungieren.

Es gibt einige physikalische, biologische und chemische Maßnahmen zur Verringerung des Gushing-Effekts bei Getränken, beispielsweise der Verschneidung von gushingaktiven Malzchargen oder Behandlung des infizierten Getreides mit heißem Wasser, H ₂ 0 ₂ , oder 0 _3. Diese Maßnahmen haben die Nachteile, dass sie in der Durchführung oftmals äußerst aufwändig sind und erhebliche Mehrkosten für die Getränkehersteller bedeuten.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es einen oder mehrere Nachteile des Standes der Technik zu vermindern oder zu vermeiden. Insbesondere ist es eine Aufgabe der Erfindung ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem kohlenstoffdioxid-haltige Getränke mit einem verminderten Gushing-Potenzial hergestellt werden können. Die vorliegende Erfindung löst diese Aufgabe durch Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von kohlenstoffdioxidhaltigen Getränken mit einem verminderten Gushing-Potenzial, wobei > 10 g/hl Gallotannine zum Getränk hinzugegeben werden und das Getränk nachfolgend filtriert wird.

Überraschenderweise wurde festgestellt, dass die Zugabe von >10 g/hl Gallotanninen bei der Herstellung von Getränken gushingaktive Proteinfraktionen und Metallionen gezielt entfernt und eine Verminderung des Gushingpotenzials des Getränkes erzielt wird.

Soweit nachfolgend der Kontext nicht eindeutig etwas anderes ergibt, ist bei der Verwendung von Singular-Formen bzw. Plural-Formen stets sowohl die Mehr- als auch die Einzahl um- fasst. Unter dem Begriff„Verminderung" oder„vermindert" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Herabsetzung, Reduktion, Vermeidung oder Verhinderung des Gushing-Poten- zials bei kohlenstoffdioxid-haltigen Getränken verstanden, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren im Vergleich zu kohlenstoffdioxid-haltigen Getränken, die nicht nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt worden sind. Im erfindungsgemäßen Verfahren werden Gallotannine in einer Konzentration von >10 g Gallotannine pro Hektoliter zu behandelndes Getränk zum Getränk hinzugegeben und das derart behandelte Getränk wird nachfolgend filtriert. Bevorzugt werden >10 g/hl, besonders bevorzugt >10 bis < 30 g/hl, ganz besonders bevorzugt >10 bis <19 g/hl, insbesondere bevorzugt >10 bis <16 g/hl Gallotannine zum Getränk hinzugegeben und das Getränk wird nachfolgend filtriert.

Der Begriff„nachfolgend" bezeichnet im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung einen Zeitpunkt im Herstellungsverfahren, der zeitlich nach der Zugabe der Gallotannine zum Getränk liegt. Dabei muss„nachfolgend" nicht„unmittelbar danach" bedeuten. Zwischen der Zugabe der Gallotanine und dem als„nachfolgend" bezeichneten Schritt können im erfindungsgemäßen Verfahren auch weitere Verfahrensschritte vorgesehen sein.

Unter dem Begriff„Gallotannin" wird ein Naturstoff verstanden, der zur Gruppe der hydrolysierbaren Tannine, einer Gruppe von pflanzlichen Gerbstoffen, gehört, die als Sekun- därmetabolite in dikotylen Stauden, Sträuchern, Baumblättern und anderen Pflanzenteilen vorkommen. Viele Büsche und Bäume der Sumachgewächse (Anacardiaceae), wie beispielsweise der chinesische Sumach (Rhus semialatä) oder der Gerber-Sumach (Rhus coriariä) weisen einen hohen Gallotannin-Gehalt in ihren Blättern, bzw. in den an den Blättern oder Zweigen wachsenden Galläpfeln, auf und werden als Rohstoffe für die kommerzielle Produktion von Gallotanninen verwendet.

Gallotannine bestehen aus einem Kern aus D-Glukose, an deren Hydroxygruppen

Gallussäure-Reste, sogenannte Galloyl-Reste, gebunden sind. Die Biosynthese eines Gallotannins ist in folgender Abbildung dargestellt:

Die Glucose wird aus dem Hexose-Intermediat Uridindiphosphat-Glucose (UDP-Glc), welches wesentlicher Bestandteil der Synthese von Saccharose ist, durch Abspaltung der UDP in Form eines ß-D-Glycosyl-Rests von der Pflanze bereitgestellt. An diesen Rest kann sich die Carboxyl-Gruppe der Gallussäure binden. Es entsteht das Tannin ß-D-Glucogallin. Die- ses kann im Laufe der Biosynthese sowohl als Akzeptor von Gallussäure-Resten als auch als Donor fungieren. Schrittweise können jetzt weitere Gallolyl-Reste an die Hydroxygruppen des Glucogallins binden. Dies passiert in einer spezifischen Reihenfolge, die durch die Position der an die Hydroxygruppen gebundenen Kohlenstoffatome vorgegeben ist. Nach der Bindung der Gallussäure an das C1 -Atom folgen aufeinander die Kohlenstoffatome sechs, zwei, drei und vier. Das C5-Atom bietet keinen Hydroxy-Rest, kann somit keine Verbindung eingehen. Sind alle fünf Hydroxy-Reste der Glucose mit genau einem Gallolyl-Rest (Fall n=1 , s. Abb. 15) besetzt, ergibt sich das Molekül 1 ,2,3,4,6-Pentagalloyl-Glucose (PGG). Des Weiteren ist es an den Hydroxygruppen des C2-, C3-, C4-Atoms möglich, dass weitere Gallolylgruppen depsidisch binden. Chemisch gesehen handelt es sich bei den Gallotanninen um Polyhydroxyphenole. Sie sind in Wasser, Ethanol und Aceton löslich und enthalten ausreichend ortho-ständige phenolische Hydroxygruppen, um Quervernetzungen zwischen Makromolekülen wie Proteinen, Cellulose und Pektin ausbilden zu können. Die nachfolgende Abbildung zeigt die Komplexbildung von Polyphenolen, Proteinen und Eisenionen nach Gallotannin-Zugabe.

Zwischen den Proteinsträngen treten intermolekulare Bindungen auf, welche innerhalb des Proteins die Sekundärstruktur des Moleküls bestimmen. Daneben treten einerseits Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Sauerstoff- bzw. Schwefelatomen des Proteins und

Hydroxygruppen der Galloyl-Reste im Gallotannin auf. Au ßerdem spielen hydrophobe

Wechselwirkungen zwischen Aminosäuren des Proteins und des Gallotannins eine wichtige Rolle bei der Komplexbildung. Die Gallotannine sind über ihre Galloyl-Reste au ßerdem in der Lage, einen Großteil der Metallionen zu binden.

Verfahren und Gewinnung bzw. Herstellung von Gallotanninen sind im Stand der Technik beschrieben und dem Fachmann bekannt.

Gallotannine können beispielsweise aus pflanzlichem Rohmaterial gewonnen werden, welches zerkleinert und pelletiert wird bevor man es mit einem Lösungsmittel durch Fest-Flüs- sig-Extraktion extrahiert. Es werden nur Lösungsmittel verwendet, die der Richtlinie

2009/32/EC18 entsprechen. Um einen Rohextrakt zu erhalten, kann beispielsweise als pri- märes Lösungsmittel Wasser oder Alkohol wie z. B. Aceton verwendet werden. Abhängig von den Anforderungen an die Reinheit können zusätzliche Flüssig-Flüssig-Extraktions- schritte durchgeführt werden, um weitere Verunreinigungen zu entfernen. Zusätzlich können weitere Reinigungsschritte, z. B. eine Aktivkohle-Filtration, durchgeführt werden. Der wasserbasierte Extrakt wird anschließend sprühgetrocknet. Das Gallotannin-Material ist typischer- wiese ein wasserlösliches, amorphes Pulver.

Die erfindungsgemäßen Gallotannine können dem Getränk in jeder geeigneten Weise hinzugefügt werden, beispielsweise durch direkte Zugabe als trockenes Pulver oder in einem Lösungsmittel gelöst.

Die erfindungsgemäßen Gallotannine werden bevorzugt gewonnen, indem mittels Fest- Flüssig-Extraktion aus gallotannin-haltigen Pflanzenteilen, wie beispielsweise Blättern oder Galläpfeln, ein Rohextrakt erhalten wird, aus dem die Gallotannine mittels wässriger, alkoholischer oder wässrig-alkoholischer Lösung extrahiert werden. Bevorzugt werden die Gallotannine aus Galläpfeln von Rhus semialata (chinesischer Gallapfel) oder Quercus infectoria, aus Blättern von Sumachgewächsen wie z.B. Rhus coriaria oder Rhus typhina, oder aus Samenkapseln von Caesalpina spinosa gewonnen. Besonders bevorzugt werden die Gallotannine aus Blättern von Sumachgewächsen oder aus Galläpfeln von Rhus semialata gewonnen.

Daneben sind die erfindungsgemäßen Gallotannine ebenfalls kommerziell erhältlich. Gallotannine aus Sumachgewächsen sind z.B. bei Omnichem S.A. (Brüssel, Belgien) als TANAL™SC-Gallotannin und BREWTAN™SI-Gallotannin erhältlich. Gallotannin aus chinesischen Galläpfeln ist bei Omnichem als BREWTAN™C-Gallotannin und TANAL™02C- Gallotannin erhältlich sowie bei Mallinckrodt (St. Louis, Missouri) als TANNIC 4027-Gallo- tannin. Alle diese Gallotannine haben einen D-Glukose-Kern und besitzen ein

durchschnittliches Molekulargewicht von über 1000, typischerweise von 1000 bis 2000, bevorzugt zwischen 1200 und 1600, besonders bevorzugt zwischen 1250 und 1500.

Die chemische Struktur für das erfindungsgemäße Verfahren besonders geeigneter Gallotannine ist in folgender generischer Struktur dargestellt:

wobei unabhängig voneinander jedes R H oder

ist.

Typischerweise sind 1 bis 14 Galloylgruppen

in jedem Gallotannin enthalten. Natürlich-gewonnene Gallotannine enthalten viele verschiedene Galloylglukosen in Form von homologen und isomerischen Verbindungen.

Die erfindungsgemäßen Gallotannine weisen bevorzugt ein durchschnittliches Molekulargewicht von 1000 bis 1600, vorzugsweise von 1250 bis 1500 auf. Für das Verfahren der vorliegenden Erfindung sind die in EP 0626139 A1 (Seite 4f.) dargestellten Gallotannine besonders geeignet.

Beispielsweise kann das Gallotannin, welches aus Galläpfeln von Rhus semialata /..-Zweigen gewonnen wird, für das erfindungsgemäße Verfahren benutzt werden. Niakizawa und Yamagishi berichteten im Artikel "Tannins and Related Compounds. Part 5. Isolation and Characterization of Polygalloylglucoses from Chinese Gallotannin" (J. Chem. Soc. Perkin

Trans. I 1982, Seiten 2963-68), dass dieses Gallotannin durchschnittlich 8,3 Galloyl-Gruppen pro Glukose-Molekül enthält und ein durchschnittliches Molekulargewicht von 1434 aufweist. Es besteht aus einem Gemisch aus hauptsächlich Penta-bis Dodeka-Galloylglukosen, deren depsidische Galloylgruppen zufällig an den C2-, C3- und C4-Positionen des Penta-O-galloyl- ß-D-Glucose-Kerns verteilt sind.

Insbesondere können im erfindungsgemäßen Verfahren Gallotannine eingesetzt werden mit der folgenden Formel:

wobei

usw. ist und l+m+n eine Zahl zwischen 0 und 7 ist. Die relative Zusammensetzung der Penta-bis Dodeka-Galloylglukosen des Gallotannins aus Galläpfeln von Rhus semialata L, die mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) analysiert wurde, wurde wie folgt beschrieben:

Besonders bevorzugt stellen die erfindungsgemäßen Gallotannine ein Gemisch aus Verbindungen der allgemeinen Formel

dar, in der l+m+n = 0 bis 7 ist, wobei mindestens 40 % der Verbindungen des Gemisches mindestens 8 Galloylgruppen enthalten, bevorzugt mindestens 50 % der Verbindungen min- destens 8 Galloylgruppen enthalten, besonders bevorzugt mindestens 85 % der Verbindungen mindestens 5 Galloylgruppen enthalten.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Herstellung von kohlenstoffdioxid-haltigen Getränken verwendet werden, insbesondere zur Herstellung von alkoholfreien Getränken, wie z. B. Mineralwasser, Erfrischungsgetränken, Fruchtsäften oder -nektaren sowie alkoho- lischen Getränken wie z. B. Bier oder Schaumweinen. Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Bier verwendet.

Die Herstellung von Bier, das Bierbrauen, ist ein lebensmitteltechnologischer Prozess, der normalerweise in einer Brauerei stattfindet. Verfahren zum Bierbrauen sind dem Fachmann bekannt.

Beim Bierbrauen werden die Zutaten Hopfen, Malz und Wasser miteinander vermischt und teilweise durch Hefe biochemisch verändert. Nachdem aus Getreide, z. B. Gerste, Malz hergestellt wurde, wird dieses geschrotet. Der eigentliche Brauprozess beginnt mit dem

Maischen. Dabei wird Wasser auf etwa 60 °C erwärmt und das geschrotete Malz hinzuge- fügt. Die so entstandene Maische wird unter ständigem Rühren je nach Verfahren bis auf etwa 75 'Ό erhitzt. Bei verschiedenen Rast-Temperaturen setzen Enzyme die Stärke aus dem Malz in Malzzucker um. Alternativ werden Teile der Maische gekocht, was zu einer physikalischen Verkleisterung der Stärke führt. Mit einer lodprobe wird anschließend festgestellt, ob die gelöste Stärke vollständig verzuckert ist. Daraufhin wird die Maische im Läuterbottich geläutert. Der Malztreber wird von dem Würzesud (so heißt der flüssige, vergärbare Teil der Maische) getrennt. Durch zusätzliche Nachgüsse mit heißem Wasser wird der restliche Extrakt aus dem Treber gespült und der Würzesud anschließend in der Kochpfanne mit Hopfen gekocht. Nach der Würzekochung wird der Würzesud aus der Würzepfanne in einen Whirlpool oder durch einen Filter gepumpt, um den sogenannten Heißtrub (ausgefällte Eiweiße, Polyphenole und andere Schwebstoffe) von der nun Anstellwürze genannte Flüssigkeit zu trennen. Dieser Vorgang wird als Ausschlagen im Whirlpool bezeichnet. Im Weiteren wird die Anstellwürze in einem Kühler auf die optimale Gärtemperatur abgekühlt und je nach Biersorte die passende Hefekultur zugesetzt. Obergärige Hefesorten vergären bei Temperaturen zwischen 18 'Ό und 24 °C, untergärige bei 8 'Ό bis 14 °C. Bei der alkoholischen Gärung setzt die Hefe den in der Würze gelösten Zucker zu Ethanol und Kohlendioxid um. Dieses Gas bleibt zum Teil im fertigen Bier unter Druck als Kohlensäure gebunden. Nach der Hauptgärung, die etwa eine Woche dauert, muss das Jungbier noch etwa ein bis vier Wochen nachgären und lagern. Das gereifte Bier wird in der Regel nochmals gefiltert und schließlich in Flaschen, Fässer oder Dosen abgefüllt. Bevorzugt wird das Bier in folgenden Schritten gebraut: Maischen, Läutern, Kochen des Würzesuds, Ausschlagen des Würzesuds im Whirlpool, Fermentation/Reifung, Filtration.

Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen Gallotannine im Herstellungsprozess nach dem Kochen des Würzesuds und vor der Fermentation hinzugegeben. Besonders bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Gallotannine im Herstellungsprozess nach dem Kochen des Würzesuds und vor dem Ausschlagen im Whirlpool hinzugegeben.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird ebenfalls bevorzugt zur Herstellung von koffeinhaltigen Getränken verwendet. Verfahren zur Herstellung von koffeinhaltigen Getränken sind dem Fachmann bekannt.

Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen Gallotannine vor und/oder nach der Karbonisierung des Getränks hinzugegeben und das Getränk wird nachfolgend filtiert.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung von Gallotanninen in einem Verfahren zur Herstellung von kohlenstoffdioxidhaltigen Getränken mit einem verminderten Gushing-Potenzial.

Koffeinhaltiges Getränk auf Basis von Kaffeebohnenschalen mit hohem Gushing-Potenzial (linke Flasche).

Koffeinhaltiges Getränk auf Basis von Kaffeebohnenschalen und dem Einsatz von Gallotanninen zur Verringerung des Gushing-Potenzials bei der Herstellung (rechte Flasche).

EAP-Bestimmung des mit Gallotanninen behandelten Bieres gegenüber dem Referenzbier.

Gelelektrophorese der Bierproben. A: unbehandeltes Bier. B: mit Gallotanninen behandeltes Bier. C: Marker.

Gushing-Test. A: Bier mit hohem Gushing-Potenzial ohne Gallotannin-Zugabe im Brauprozess gebraut. B: Bier mit hohem Gushing-Potenzial mit Gallotannin- Zugabe im Brauprozess gebraut. C: Zum Vergleich ein Standardbier ohne Gushing-Potenzial.

Beispiele

Beispiel 1 : Einsatz von Gallotanninen zur Reduzierung des Gushing-Potenzials am Beispiel eines koffeinhaltigen Getränkes auf Basis von Kaffeebohnenschalen mit hohem Gushing-Potenzial Die Gallotannine können zu den unterschiedlichsten Prozessschritten bei der Getränkeherstellung vor der Filtration eingesetzt werden. Im gegeben Beispiel wurden 16 g/hl Gallotannine (Brewtan C, Firma Omnichem) vor der Filtration zugesetzt, wodurch das Gushen des koffeinhaltigen Getränkes verhindert wird. Das Gushing-Potenzial lässt sich bei dargestellter Getränkematrix auch mit >10 g/hl ausreichend herabsetzen.

In Fig. 1 ist das Gushing eines koffeinhaltigen Getränks mit hohem Gushing-Potenzial dargestellt. Im Vergleich dazu ist die Wirkungsweise des gezielten Einsatzes von Gallotanninen auf das Gushing-Potenzial in Fig. 2 dargestellt.

Beispiel 2: Einsatz von Gallotanninen zur Reduzierung des Gushing-Potenzials am Beispiel von Bieren mit hohem Gushing-Potenzial

Großbrau-Versuch Zur Verifizierung des Ansatzes mit Hilfe von Gallotanninen das Gushing-Potenzial von Bieren signifikant zu mindern, wurde ein Brauversuch in der Studienbrauerei der Technischen Universität Berlin an einem Zwei-Geräte-Sudwerk durchgeführt. Dazu wurde ein Malz verwendet, welches in jüngster Vergangenheit bereits zu Gushing geführt hat. 15kg des genannten Gushing-Malzes wurden mit 25— ^ _Maiz — konditioniert und je einmal bei den Walzenabständen 1 ,7 und 1 ,2mm in einer Zweiwalzenmühle geschrotet. Zur Enthärtung wurde den 60I Einmaischwasser 15g Calciumchlorid (CaCl ₂ , 0,25 ^ψ ) zugegeben. Die

Einmaischtemperatur betrug 45 °C. Das Sudprotokoll ist in Tabelle 1 dargestellt. Der gesamte Maischprozess beinhaltete neben Ein- und Abmaischen zwei Rasten bei 64 und 75°C und dauerte insgesamt zwei Stunden und 20 Minuten.

Tab. 1 : Maischprozess

Die Maische wurde nach Ablauf der Aufheizzeit auf 78^ in das zweite Sudwerk-Gefäß, welches sowohl als Läuterbottich als auch als späterer Whirlpool fungiert, überführt und die Läuterruhe eingehalten (siehe Tabelle 2). Nach dem Trübwürze-Pumpen lief die Vorderwürze mit 14,40% Extrakt ab. Die Pfanne-voll-Würze von 1 1 % Extrakt wurde nach 40I Nachgüs- sen erreicht. Die Volumenbestimmung des Sudes wurde auf Basis der Kesselmaße gemacht:

_T . , '' ^■ Flüssigkeit

Volumen = — (Gl. 1) π * r ^z

Tab. 2: Läuterprozess

Die Hopfengabe in Gramm wurde nach Gleichung 2 berechnet und der Würze zum Beginn des Kochvorgangs (siehe Tabelle 3) zugefügt.

Hopfengabe [g]

rmg a ^■

Bittereinheiten ^a ■ ^ ^ure ] * Ausschlagmenge [l] * Prozentanteil der Gabe * 100%

I

Bitter ausbeute [%] * a— Säure im Hopfen [%] * 1000——

(Gl. 2)

30 ^{mg CC} ^ ^Ure * 901 * 100% * 100%

= 16, 86g

33,3% * 48,1% * 1000 ^

9

Tab. 3: Kochprozess

Kochvorgang

Aufheizen von 20:20 bis 20:50

Kochen von 20:50 bis 21 :50

Hopfengabe: 16,86g

gewünschte BE: 30BE

Bitterstoffausnutzung 33,30% Nachdem die Würze eine Stunde lang gekocht wurde, fand eine Aufteilung der Kochwürze statt. Die eine Hälfte des Sudes wurde direkt in den Whirlpool gepumpt, der andere Teil in der Sudpfanne belassen. Nach der Whirlpoolrast, während der der sogenannte Teetassen- Effekt die im Laufe des Kochvorgangs ausgefallenen Trübstoffe in die Mitte des Gefäßes zieht, wurde der erste Teil des Sudes über einen Plattenwärmetauscher in ein 401-ZKG

(zylindro-konisches Gefäß) geschlaucht. Danach wurde der in der Pfanne verbliebene Sud in den Whirlpool gepumpt und sofort mit einer zehn prozentigen Mischung aus destilliertem Wasser und darin gelösten Gallotanninen (16g/hl) versetzt. Genau wie der unbehandelte Teil wurde die mit Gallotanninen behandelte Würze über den gespülten Plattenwärmetauscher in ein 401-ZKG geschlaucht und mit Hefe versetzt. Von jeder der beiden Würzen wurden vor der Hefe-Zugabe Proben zur Würze-Analyse genommen. Mit Hilfe der an den ZKG vorhandenen Mantelkühlungen wurden beide Jungbiere bei 12 ^< Ό über mehr als eine Woche vergoren. Danach wurden die Biere in je ein 30I-Edelstahl-Fass überführt. Nach einem Lagerungstag bei Raumtemperatur (Diacetyl-Rast) wurden die Fässer bei 1 'Ό in einem Kühlraum gelagert. Nach der Lagerung wurde das unbehandelte Referenzbier und das mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens mit Gallotanninen behandelte Bier nacheinander mit Hilfe eines drei-stufi- gen Kerzen-Filters (5, 1 und 0,45μηι Durchmesser Filterporen) filtriert. Nach jedem Filtrationsschritt wurde der Filter mit Brauwasser rückgespült und so die belegten Filterporen gereinigt. Nach der Filtration wurden die Biere in 301-Edelstahlfässern carbonisiert und vor der Abfüllung in 0,331 Longneck-Flaschen für 7 Tage bei 1 'Ό gelagert.

Malz-Analyse

Zur Beurteilung der eingesetzten Rohstoffe, wurden folgende Analysen anhand der Vorga- ben der Mitteleuropäischen Brautechnischen Analysekommission MEBAK durchgeführt. Neben dem zu messenden Gushing-aktiven Malz wurde ein Pilsener-Handelsmalz zum Vergleich untersucht. Die Analyse-Daten sind in Tabelle 4 dargestellt.

Tab. 4: Analysen-Ergebnisse des Gushing-Malzes

Würzefarbe [EBC] 4,1 3,8

Kochfarbe [EBC] 7,3 6,2

pH-Wert (Anton-Paar) 5,85 5,83

Gesamt-Stickstoff (Trs., 12%) [%] 1 ,49 1 ,62

Gesamt-Eiweiß (Trs.) [%] 9,33 10,1 1

löslicher Stickstoff [mg/l] 677 740

löslicher Stickstoff (Trs.) [g/100g] 0,61 0,66

lösliches Eiweiß (Trs.) [%] 4 4

Kolbach-Index

41 41

(Eiweißlösungsgrad) [%]

Friabilimeter (Mehligkeit) [%] 86,3 93,2

Ganzglasigkeit [%] 2,5 0,6

Gesamt-Polyphenole (Trs.) [mg/l] 73 43

90 ° 5,5 7,4

Trübung

25° 5,5 6,0

Die meisten der dargestellten Werte entsprechen in etwa den Referenz- und Literaturwerten. Das Gushing-Malz weist jedoch mit 86,3% einen zu niedrigen Friabilimeter-Wert auf. Dieser sollte über 91 % liegen. Darüber hinaus liegt die Ganzglasigkeit des Gushing-Malzes um 0,5% über dem Grenzwert. Ebenfalls der Polyphenol-Gehalt liegt mit 73mg/l wesentlich über dem des Referenzmalzes. Unter Berücksichtigung von Referenz- und Literaturwerten handelt es sich bei dem Gushing-Malz und dem Referenzmalz um eine gute bis sehr gute Malzqualität.

Bier-Analyse Zur Untersuchung der Bier-Parameter der Proben wurden die in TabTab. eile 5 dargestellten Analysen durchgeführt.

Tab. 5: Analyse-Ergebnisse vom fertigen Bier

Alkohol- [%w/w] 3,72 3,92

Gehalt [%v/v] 4,76 5,03

Vergärungsgrad [%] 73,9 73,7

Farbe [EBC] 7,2 6,6

pH-Wert (Anton-Paar) 4,65 4,60

Gesamt-Stickstoff (12%) [mg/l] 731 701

MgSCvfällbarer Stickstoff (12%)

157 124

[mg/l]

Anthocyanogene (12%) [mg/l] 55 68

C0 ₂ -Gehalt [g/l] 5,4 5,4

Freier a-Amino-Stickstoff (12%)

98 106

[mg/l] (FAN)

Gesamt-Polyphenole (12%) [mg/l] 233 296

S0 ₂ , Skalar [mg/l] 0,8 0,6

Eisen [mg/l] 0,014 0,006

Wie zu sehen ist, liegt der Stammwürzegehalt des mit Gallotanninen behandelten Bieres über dem unbehandelten Bier. Vergleicht man nun die Vergärungsgrade erkennt man, dass diese für beide Biere mit 73,9% und 73,7% ungefähr gleich sind. Die erhöhte Stammwürze und der identische Vergärungsgrad bedeuten, dass das behandelte Bier mehr wirklichen Extrakt und einen leicht höheren Alkoholgehalt aufweist. Die Bierfarbe liegt beim dem unbehandelten Bier mit 7,2 EBC leicht über dem behandelten Bier. Im behandelten Bier sind mit 701 mg/l etwas weniger Gesamt-Stickstoffe als in dem nicht-behandelten Bier (731 mg/ml) vorhanden. Analog dazu verlaufen die Analyse-Ergebnisse der Magnesiumsulfat-fällbaren Stickstoffe, das mit Gallotanninen behandelte Bier mit nur 124mg/l merklich weniger dieser hochmolekularen Stickstoffe als das unbehandelte Bier mit 157mg/l. Die FAN-Daten erscheinen bei beiden Bieren mit 98mg/l (unbehandelt) und 106mg/l (behandelt) etwas zu hoch für ein filtriertes Bier. Das mit Gallotanninen behandelte Bier weist auch einen merklich höheren Gesamtpolyphenol-und Anthocyanogen-Gehalt gegenüber dem unbehandelten Bier auf. Der C0 ₂ -Gehalt beider Proben beträgt 5,4g/l. Bemerkenswert sind die sehr niedrigen S0 ₂ -Werte, die allesamt unter 1 mg/l liegen. Des Weiteren weisen die Biere einen eindeutigen Unterschied im Eisen-Gehalt auf. Das Bier, das mit Gallotanninen behandelt wurde, weist mit 0,006 mg Eisen pro Liter einen sehr geringen Wert auf. Die Eisen-Konzentration des unbehandelten Bieres hingegen liegt mit 0,014mg/l mehr als doppelt so hoch. ESR-Messunq

Eine ESR-Messung zur Überprüfung der oxidativen Bierstabilität wurde nach der MEBAK- Analysenvorschrift 2.15.3 durchgeführt. Die verwendeten Geräte-Einstellungen können Tabelle 6 entnommen werden. Tab. 6: Parameter der Messungen mittels ESR-Spektrometer

Im Rahmen der angewendeten EAP-Bestimmung wird mittels der ESR-Spektroskopie die zeitliche Entwicklung der Radikalgenerierung in Getränken während einer forcierten Alterung bei 60 °C aufgezeichnet. Bis zu einem bestimmten Zeitpunkt, dem sogenannten EAP-Wert, ist die Getränke-Matrix auf Grund ihrer antioxidativen Eigenschaften in der Lage, die Radikalgenerierung zu inhibieren. Nach Verbrauch ist ein signifikanter Anstieg in der Radikalgenerierung festzustellen. Die Signalintensität steigt an. Der EAP-Wert entspricht dem Schnittpunkt dieser beiden Graphen-Abschnitte.

In Fig. 3 ist die zugehörige EAP-Bestimmung des mit Gallotanninen behandelten Bieres gegenüber der des unbehandelten Bieres dargestellt. Die ESR-Signalintensität des unbehandelten Bieres (Referenz) steigt sofort nach Start der Messung stark an. Es ist kein EAP- Wert festzustellen. Der T ₆₀₀ -Wert beträgt 1 ,86 ^* 10 ⁶ . Dagegen steigt die ESR-Signalintensität des behandelten Bieres wesentlich weniger an. Der EAP-Wert beträgt 38 Minuten und der T ₆ oo-Wert 0,95 ^* 10 ⁶ . Zur genaueren Bestimmung der Molekülmassen der Proteinfraktionen, die durch Gallo- tanninzugabe entfernt wurden, wurde eine Gelelektrophorese beider Bierproben

durchgeführt. Dabei wurde ein Marker verwendet, der die Protein-Banden von 1 ,42 bis 26,62kDa kennzeichnet. Das Ergebnis der Gelelektrophorese ist in Fig. 4 verdeutlicht.

Sowohl in der unbehandelten Probe (Fig. 4 A) als auch in der mit Gallotanninen behandelten Probe treten (Fig. 4 B) keine Proteine mit den Molekülgrößen 1 ,42, 14,43 und 26,62kDa auf. Man erkennt jedoch eine Protein-Fraktion um 6,51 kDa, die in unterschiedlichen Mengen in den beiden Proben vorhanden ist (siehe Einrahmung). Während diese niedermolekulare Protein-Gruppe deutlich in der unbehandelten Probe vorhanden ist, sieht man, dass in der behandelten Probe fast nichts mehr von dieser Fraktion vorhanden ist.

Gushing-Test

Zur Einschätzung der analytisch nachgewiesenen Unterschiede und der erfindungsgemäßen Galltanninbehandlung auf das Gushing-Potenzial der Biere, wurde der Gushing-Test (in Anlehnung an Amaha et al. (1973)) durchgeführt. Zur Untersuchung des Gushing-Potenzials wurde nach einem weiteren Lagerungstag bei 1 °C der Gushing-Test mit dem unbehandelten Bier und dem Gallotannin-behandelten Bier durchgeführt. In Tabelle 7 ist der Ablauf des Gushing-Tests aufgeführt.

Tab. 7: Gushing-Test

Nachdem die zu testenden Proben auf 20 ^ im Wasserbad erwärmt wurden, fand ein Erhitzungsvorgang statt, welcher eine Pasteurisation simulieren sollte. Auf den erneuten Temperierungsschritt auf 20 °C folgte das Einspannen der Flaschen in liegender Position in einen Horizontalschüttler. Dieser wurde eine Stunde bei einer Frequenz von 100 Hüben pro Minute eingestellt. Damit wurde der Einfluss von mechanischer Energie nachgeahmt, welcher beispielsweise beim Transport auch auf die Flaschen und das Bier einwirkt und ein wesentlicher Bestandteil in der Bildung von stabilisierten Nanoblasen ist. Zur Überprüfung, dass der Gushing-Effekt nicht durch dieses Schütteln hervorgerufen wird, wurden die Flaschen zehn Minuten aufrecht stehen gelassen, damit ein erneuter Gasausgleich zwischen Gasraum und Flüssigkeit stattfinden konnte. Danach wurden die Proben sowie zum Ver- gleich ein Standardbier ohne Gushing-Potenzial geöffnet und die qualitativen Aufschäum- Ergebnisse dokumentiert. Das Ergebnis ist in Fig. 5 dargestellt. Die unbehandelte Probe schäumte nach dem Entfernen des Kronkorkens schlagartig über, es entbanden sich wesentlich mehr C0 ₂ -Blasen (Fig. 5A). In Fig. 5B ist zu sehen, dass die mit Gallotanninen behandelte Probe hingegen nur sehr wenig aufschäumte und der Schaum nicht über die Flaschenmündung hinaus trat. Die Schaumbildung ist vergleichbar mit der Schaumbildung, die ein Standardbier verursacht (Fig. 5C).

Zur Untersuchung eventueller Einflüsse der verwendeten Gallotannine auf die Schaumhaltbarkeit wurde zudem eine Schaumstabilitätsmessung nach NIBEM durchgeführt, deren Parameter in Tabelle 8 aufgelistet sind.

Tab. 8: Schaumstabilitätsmessung

Das verwendete Handelsbier weist in allen drei Zeitstufen der Messung eine ähnliche Schaumstabilität gegenüber der mit Gallotanninen behandelten Bierprobe auf.

In der Gesamtbetrachtung der Ergebnisse sind die Einflüsse der Gallotannin-Anwendung auf den Eisen-Gehalt der fertigen Biere offensichtlich. Während das unbehandelte Bier einen normalen Eisen-Anteil von 0,014mg/l nach Membran- bzw. Kerzenfiltration aufwies, wurde der überwiegende Teil der Eisen-Ionen durch die Gallotanninzugabe aus dem Bier entfernt. Der Bindungsmechanismus wurde bereits beschrieben (siehe oben). Entsprechend sind die Einflüsse der erfindungsgemäßen Gallotanninzugabe auf die oxidative Bierstabilität signifi- kant und mittels der durchgeführten ESR-Messungen eindeutig zu interpretieren. Auf Grund des sehr niedrigen S0 ₂ -Gehalts konnte kein EAP-Wert im unbehandelten Bier ermittelt werden. Durch den hohen Eisen-Gehalt der unbehandelten Probe und dem vergleichsweise verschwindend geringen Schwefeldioxid-Anteil im Bier beginnt die Radikalgenerierung nahezu sofort. Im Gegensatz dazu ist bei dem behandelten Bier ein EAP-Wert von 38 min und eine signifikant geringere Radikalgenerierung festzustellen. Die Gesamtradikalgenerierung am Ende der Messung lag mit T ₆₀₀ = 1 ,86 ^* 10 ⁶ beim unbehandelten Bier etwa doppelt so hoch wie bei dem mit Gallotanninen behandelten Bier (T ₆₀₀ = 0,95 ^* 10 ⁶ ). Zur Differenzierung der entfernten Protein-Fraktionen wurde eine Gelelektrophorese durchgeführt. Betrachtet man die Ergebnisse, ließen sich klare Konzentrationsunterschiede innerhalb der niedermolekula- ren 6,51 kDa-Fraktion feststellen. Mit etwa 7 kDa gehören gushing-aktive Hydrophobine, aber auch schaumaktive nichtspezifische Lipidtransfer-Proteine, zu dieser Protein-Fraktion. Während im unbehandelten Bier noch eine höhere Konzentration dieser Proteine zu finden war, waren im behandelten Bier wesentlich geringere Mengen erkennbar. Folglich wurde durch den Einsatz der Gallotannine ein Großteil der im Bier befindlichen niedermolekularen und gushing-aktiven Proteine, insbesondere Hydrophobine, entfernt.

Die Ergebnisse des Gushing-Tests unterstreichen die Übertragungsberechtigung der Gushing-Erkenntnisse von alkoholfreien auf alkoholische Getränke. Der klare Unterschied zwischen dem stark gushenden unbehandelten Bier und dem nur leicht gushenden mit Gallotanninen behandelten Bier macht klar, dass die Gallotanninzugabe dem Gushing- Phänomen effektiv entgegenwirkt. Als schaumpositive Proteine werden vor allem niedermolekulare Lipidtransfer-Proteine welche ähnliche Eigenschaften wie gushing-aktive Hydrophobine aufweisen, und das Protein Z genannt. Zweiteres gehört wie oben bereits genannt mit etwa 40kDa zu den höhermolekularen Proteinen, welche durch die Magnesiumsulfatfällung bestimmt werden können. Zur Beurteilung eines eventuell zu befürchteten negativen Einfluss der erfindungsgemäßen Gallotanninzugabe auf die Schaumhaltbarkeit aufgrund der Entfernung bestimmter Proteinfraktionen beurteilen zu können, wurde zusätzlich vom behandelten Bier eine Schaumhaltbarkeitsbestimmung im Vergleich zu einem Referenzbier (Handelsbier) durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen eine zumindest gleichwertige Schaumstabilität im Vergleich zum Handelsbier in allen Zeitstufen der Messung. Folglich wurden weder Lipidtransfer-Proteine noch Protein Z-Fraktionen durch den Einsatz der Gallotannine beeinflusst. Die gushing-aktiven Hydrophobine wurden durch den gezielten Gallotannineinsatz nahezu komplett aus der Würze entfernt. Folglich reagieren die Gallotannine trotz des Überschusses in der Würze nicht mit Schaum-aktiven Proteinen.