Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Carbonsäuren.

Bekanntermaßen können durch die Kultivierung von Bakterien, Hefen und filamentösen Pilzen eine Vielzahl von Mono-, Di- und Tricarbonsäuren wie Äpfel-, Bernstein-, Brenztrauben-, Citronen-, Fumar-, Glucon-, Itacon-, Ketoglutarsäure oder Milchsäure in hohen Produktkonzentrationen, Produktbildungsraten, Selektivitäten und Ausbeuten gewonnen werden. Diese Carbonsäuren stehen für eine Vielzahl von Anwendungen in diversen Industriezweigen (z.B. Chemie, Lebensmittel-, Pharmabereich) zur Verfügung.

Als Kohlenstoffquellen für Wachstum und die Carbonsäurebildung der Mikroorganismen werden dabei überwiegend Kohlenhydrate, Proteine und Lipide aus nachwachsenden Rohstoffen sowie Abprodukte eingesetzt, welche diese Substratklassen enthalten. Die Verwendung von Kohlenstoffquellen aus landwirtschaftlichen Anbau für biotechnologische Verfahren steht dabei häufig in Konkurrenz zu deren Einsatz als Lebens- und Futtermittel.

Um hohe Produktivitätskennziffern zu erzielen, werden die biotechnologischen Produktionsverfahren für Carbonsäuren nahezu ausschließlich unter Einhaltung allgemein bekannter steriler (aseptischer) Kultivierungsbedingungen durchgeführt, wobei insbesondere die Kohlenstoffquellen, Nährmedienbestandteile, die erforderliche Luftzufuhr und das Reaktorequi- pment für die Durchführung der Bioproduktionsstufe entsprechenden Aufwendungen (z.B. durch chemische oder thermische Sterilisation, Filter) zur Erzeugung und Aufrechterhaltung der Keimfreiheit unterzogen werden.

Die überwiegend als Submerskultivierungen ausgeführten biotechnologischen Produktionsverfahren verlangen die Bereitstellung von erheblichen Mengen frischem Brauchwasser, häufig in Trinkwasserqualität und diese überschreitenden Qualitäten. Nach Durchführung der Kultivierungen und Abtrennung der Biomassen und Carbonsäuren muss das verbleibende Prozesswasser gewöhnlich einer konventionellen Abwasserbehandlung zugeführt werden.

Eine herausragende Stellung bezüglich der biotechnologisch erzeugten Carbonsäuren nimmt die Citronensäure (2-Hydroxypropan-1 ,2,3-tricarbonsäure) mit einer weltweiten Jahresproduktion von 1 ,6 Millionen Tonnen ein. Aufgrund ihrer geschmacklichen, antioxidativen, färb- stabilisierenden und komplexbildenden Eigenschaften findet Citronensäure bekanntermaßen eine breite Anwendung in der chemischen Industrie (z.B. Wasch- und Reinigungsmittelzusatz, Entkalker), Lebensmittel- und Getränkeindustrie (z.B. Geschmacksverbesserung) sowie pharmazeutischen Industrie (z.B. Stabilisierung von Blutkonserven).

Als industrielle Produktionsverfahren für Citronensäure sind seit Jahrzehnten Submersver- fahren mit dem filamentösen Pilz Aspergillus niger etabliert. Dabei werden ausschließlich Kohlenhydrate wie Saccharose, Glucose, Stärkehydrolysate und kohlenhydrathaltige Abprodukte, insbesondere Zuckerrohr- und Rübenmelassen, als Kohlenstoffquellen eingesetzt.

Trotz jahrzehntelanger Optimierung des Aspergillus-Prozesses besitzt dieser eine Reihe von Nachteilen. Insbesondere nachteilig bei allen Submersverfahren zur Citratgewinnung ist die erforderliche vollständige sterile Prozessführung, in welche die Sterilisierung (1 10-130°C für 0,5-1 h) oder Pasteurisierung (85-95°C) der Kohlenstoffquellen und Sterilfiltration der Luft für die Sauerstoffversorgung der Pilzkulturen eingeschlossen ist. Dafür sind erhebliche energetische und apparative Aufwendungen vorzusehen.

Ebenso nachteilig sind bei der submersen Citratherstellung mit Aspergillus niger die hohen Anforderungen bezüglich der Reinheit des Betriebswassers für die Kultivierung. Es sollte mindestens Trinkwasserqualität eingesetzt werden. Zusätzlich erfordert die geringe Toleranz von Aspergillus niger gegenüber Schwermetallen deren vorherige Ausfällung aus den eingesetzten Substraten und Prozesswässern durch Zusatz von Cyaniden (z.B. Hexacyanoferrat) vor der Bioprozessstufe.

Hefebasierte Verfahren zur Gewinnung von Citronensäure wurden und werden als Alternative zu dem Aspergillus n/ ^' ger-Verfahren seit den 60er Jahren des vorigen Jahrhunderts entwickelt.

Vorrangig wurde dabei die Hefeart Yarrowia lipolytica eingesetzt, die sich durch eine hohe Vielfalt an verwertbaren Kohlenstoffquellen für die Citronensäurebildung auszeichnet und damit den Nachteil des engen nutzbaren Substratspektrums, welches Aspergillus niger kennzeichnet, überwindet.

Die Kultivierungen mit Y. lipolytica erfolgen im Allgemeinen unter vollständig sterilen Bedingungen (inklusive steriler Kohlenstoffquellen und Belüftung) und werden bevorzugt im Batch-, Fedbatch-, oder semikontinuierlichen Betrieb realisiert. Nachteilig für alle gentechnisch veränderten Y. lipolytica Hefestämme ist, dass deren Einsatz den Bestimmungen des deutschen Gentechnikgesetztes (GenTG) aber auch vergleichbaren internationalen Regelungen unterliegt, und damit explizit eine sterile Prozessführung in geschlossenen Systemen erfordert, welche ein Austreten der GVO in die Umwelt verhindert.

Hefebasierte Verfahren zur Citratbildung mit Y. lipolytcia werden, vergleichbar mit den A. niger Verfahren, gewöhnlich unter Einsatz eines Betriebswassers mit mindestens Trinkwasserqualität durchgeführt.

Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe besteht darin, die Nachteile der bestehenden Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Carbonsäuren zu vermeiden und solche Verfahren bereitzustellen, welche hohe Produktkonzentrationen und Produktivitäten bei gleichzeitiger Schonung der Ressourcen Wasser und Energie ermöglicht.

Die Lösung der Aufgabe erfolgt mit der Erfindung gemäß Anspruch 1 , die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten.

Erfindungsgemäß ist ein submerses Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Carbonsäuren mit Mikroorganismen vorgesehen, wobei die Mikroorganismen unsteril in einem Abwasser unter Zugabe von kohlenstoffreichen Verbindungen kultiviert werden.

Bevorzugt bezeichnet der Begriff „Carbonsäuren" in der Erfindung die Intermediate des Tri- carbonsäurezyklus: Aconit-, Äpfel-, Bernstein-, Citronen-, Fumar-, Isocitronen-, a-Ketoglutar-, Oxalessigsäure, sowie die mit dem Tricarbonsäurezyklus assoziierten Verbindungen Brenztrauben- und Itaconsäure. Besonders bevorzugt werden die Citronensäure und deren Salze (z.B. Calzium-, Kalium- und Natriumeitrate) bezeichnet.

Der Begriff „Mikroorganismen" umfasst Algen, Bakterien, filamentöse Pilze und Hefen. Bevorzugt werden unter dem Begriff „Hefe" alle Arten der Gattungen Candida, Cryptococcus, Debaromyces, Hansenula, Meyerozyma, Pichia, Pseudozyma, Rhodosporidium, Rhodotoro- la, Schizosacchoromyces, Saccharomyzes, Torulopsis und Yarrowia verstanden. Besonders bevorzugt handelt es sich dabei um die Hefeart Yarrowia lipolytica. Ganz besonders bevorzugt wird der Stamm Yarrowia lipolytica H181 (DSM 7806) verwendet, welcher bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH unter der Nummer DSM 7806 hinterlegt ist. Mit dem Begriff „Abwasser" werden alle Wässer bezeichnet, die durch ihre Nutzung und Gebrauch verunreinigt sind. Bevorzugt wird der Einsatz von Grauwasser, industriellen (z.B. aus der Lebensmittelindustrie, chemischer, pharmazeutischer und biotechnologischer Industrie, Erdgas- und Erdölgewinnung und -Verarbeitung) und kommunalen Abwässern vorgesehen.

Besonders bevorzugt werden Abwässer aus der Lebensmittelverarbeitung (z.B. Reinigungswässer des Küchen- und Cateringbetriebes) und kommunale Abwässer nach deren Vorklärung vorgesehen.

Unter dem Begriff „kohlenstoffreiche Verbindung", wie hier verwendet, werden organische kohlenstoffhaltige Substrate verstanden, die von Mikroorganismen als heterotrophe Kohlenstoffquelle utilisiert werden. Diese kohlenstoffhaltigen Verbindungen werden durch landwirtschaftliche Produktion gewonnen oder stellen überwiegende biogene Abprodukte dar. Der Anteil des utilisierbaren Kohlenstoffanteils ist dabei vom Reinheits- und Aufbereitungsgrad der Substrate abhängig. Bevorzugt werden kohlenstoffreiche Verbindungen aus landwirtschaftlicher Produktion oder in Form von Abprodukten eingesetzt, welche Mono-, Di-, Triglyceride, Fettsäuren, Fettsäuremethyl- oder ethylester, Ethanol, Methanol, Glycerol, Glucose, Fruktose, Galactose, Lactose, Milchsäure, Saccharose, Xylose, Arabinose und/oder n-Alkane (n-Paraffin) enthalten.

Besonders bevorzugt wird die Verwendung von Abprodukten in Form von genutzten Frittier- ölen (Altfrittenöl), welche Mono-, Di-, Triglyceride und Fettsäuren enthalten, vorgesehen.

Die eingesetzten kohlenstoffreichen Verbindungen können dabei schon partiell oder vollständig in dem Abwasser bei dessen Anfallen vorliegen oder diese werden vollständig dem Abwasser zugefügt. Ebenso können Gemische von zwei oder mehreren kohlenstoffreichen Verbindungen für die Erfindung genutzt werden.

Mit dem Begriff„unsteril" wird bezeichnet, dass vor, während und nach der Kultvierung keine üblichen, bekannten Maßnahmen (z.B. chemische oder thermische Sterilisierung, Pasteurisierung) und Vorrichtungen (z.B. Sterilfilter für Belüftung, sterile Probenentnahme) zur Erzeugung und zum Erhalt einer Keimfreiheit und Sterilität und Vermeidung des Eindringens von Fremdkeimen in das Kultivierungsmedium vorgesehen werden.

Anhand der hefebasierten biotechnologischen Gewinnung von besonders bevorzugt produzierter Citronensäure wird die Erfindung detailliert beschrieben, ohne sie darauf zu beschränken. Als bevorzugte Hefegattungen mit der Befähigung, Citronensäure in hohen Konzentrationen zu akkumulieren, haben sich Candida, Meyerozyma und Yarrowia erwiesen. Insbesondere Mutanten, Selektanten und rekombinante Stämme der Hefeart Yarrowia lipolytica besitzen die Fähigkeit zur Citratproduktion mit einer Selektivität von größer 90%, wobei Isocitronen- säure als einziges signifikantes Nebenprodukt auftritt.

Erfindungsgemäß werden vorzugsweise Yarrowia lipolytica Stämme, bevorzugt Y. lipolytica H181 (DSM 7806), unter unsterilen aeroben, submersen Bedingungen in einem abwasserhaltigen Kultvierungsmedium, welches die üblichen, bekannten synthetischen oder halbsynthetischen Nährmedienbestandteile und Kohlenstoffquellen für die Bildung und Ausscheidung von Citronensäure enthält, kultiviert. Dabei wird die Bildung und Akkumulation der Citronensäure in bekannter Weise durch Limitation einer Nährstoffkomponente (z.B. Stickstoff, Phosphor oder Schwefel), vorzugsweise Ammoniumstickstoff, ausgelöst. Dem Kultivierungsmedium wird eine für die Citratbildung erforderliche stammspezifische Thiaminkonzent- ration von >0,5 mg/L Thiamin x HCl _. , vorzugsweise 1 mg/L und bis zu 1000 mg/L zugegeben.

Die Kultivierung wird erfindungsgemäß bevorzugt in der Art und Weise ausgeführt, dass in einer Reaktionseinrichtung ein Abwasser in unsteriler Form vorgelegt wird.

Als Reaktionseinrichtungen werden vorzugsweise alle Reaktionsbehälter vorgesehen, die für eine Submerskultivierung geeignet sind, sich aber hinsichtlich ihrer Bauart, Ausführung, Art der Mischung und Belüftung unterscheiden können. Als Reaktionsbehälter sind z.B. übliche Rührreaktoren, Airliftreaktoren, Blasensäulen aber auch abwasserbehandlungsrelevante Ausführungen wie Belebungsbecken oder Sequencing batch-Reaktoren zu benennen. Die Reaktionseinrichtungen können in geschlossener oder offener Bauweise ausgeführt sein. Offene Bauweise bedeutet, dass ein Eindringen von Mikroorganismen aus der Umwelt in die Reaktionseinrichtung möglich ist.

Anschließend werden dem vorgelegten Abwasser alle erforderlichen Nährkomponenten und kohlenstoffreichen Verbindungen unsteril zugeführt. Abschließend wird dem Reaktionsbehälter die Animpfkultur (Inokulum) der Hefe zugeführt, welche über eine oder mehrere Stufen auf übliche, bekannte Art erzeugt wird. Die Vorkulturstufen können dabei vollständig oder partiell unsteril ausgeführt werden.

Für die Erfindung können prinzipiell alle Arten von Abwasser eingesetzt werden, welche das Wachstum der Hefe Yarrowia lipolytica nicht inhibieren. Vorzugsweise wird die Verwendung von Abwasser aus den Reinigungsstufen des Küchen- und Cateringsbetriebes, Abläufen von gewerblichen ÖI-/Fettseparatoren und der Vorklärungsstufe von Abwasserbehandlungsanlagen für kommunale Abwässer. Die Abwässer werden dem Reaktionsbehälter in einem Volumenanteil von 5-100% des gesamten Kultivierungsmediums zugeführt; vorzugsweise mit einem Anteil von 90-100%.

Als kohlenstoffreiche Verbindungen (Kohlenstoffquellen) können im Prinzip alle Verbindungen für die Erfindung verwendet werden, welche von Yarrowia Iipolytica verstoffwechselt werden können. Die Kohlenstoffquellen können als Einzelverbindungen oder Mischungen eingesetzt werden.

Vorzugsweise wird der Einsatz von benutzen pflanzlichen oder tierischen Fetten oder Ölen, besonders bevorzugt von Altfrittenöl, vorgesehen. Die Kohlenstoffquelle wird nach bekannten Kultivierungsregimes entweder bereits zu Beginn der Kultivierung (Batch-Betrieb) vollständig zugeführt oder es erfolgt zu bestimmten Zeitpunkten eine Nachdosierung des Substrates (Fedbatch-Betrieb).

Vorzugweise werden die Altfrittenole mit einer Konzentration 35-40 g/L im Reaktionsbehälter vorgelegt und unsteril mit einem üblichen Feeding-Regime auf Endkonzentrationen von 100- 180 g/L nachdosiert.

Zusätzlich wird bevorzugt vorgesehen, dass die Kultivierung von Y. Iipolytica in üblicher Batch-, Fedbatch-, Repeated Fedbatch (semikontinuierlicher) oder kontinuierlicher Betriebsweise erfolgt, wobei besonders bevorzugt der C-Betrieb vorgesehen wird.

Die Kultivierung von Y. Iipolytica erfolgt bei einem pH-Wert von 2,0 bis 8,0 und einer Temperatur von 5 bis 45°C, vorzugsweise bei pH 3,5 bis 5,5 und einer Temperatur von 26 bis 33°C.

Als Neutralisationsmittel für die pH-Statierung sind bevorzugt CaC0 ₃ , Ca(OH) ₂ , KOH, NaOH, Na ₂ C0 ₃ , NaHC0 ₃ geeignet, besonders bevorzugt NaOH.

Die Citratbildung von Y. Iipolytica als bekanntermaßen aerober Bioprozess erfordert die Zufuhr von Sauerstoff während der Kultivierung, wobei die Sauerstoffverteilung im Kultivierungsmedium wie üblich durch Belüftung und Umwälzung realisiert wird. Erfindungsgemäß hält man Gelöstsauerstoffkonzentration, gemessen als p0 ₂ -Wert, in einem Bereich von p0 ₂ =1 % bis 100%, vorzugsweise ist eine Sauerstoffsättigung von p0 ₂ > 20% zu gewährleisten. Die Kultivierung von Y. lipolytica beginnt mit einer Wachstumsphase, welche in der Regel mit Auszehrung der wachstumslimitierenden Nährstoffkomponente nach 8 bis 30 h in die Produktbildungsphase für Citronensaure übergeht. Üblicherweise wird die Kultivierung zu einem ökonomischen Zeitpunkt bezüglich der Produktivität z.B. bei erheblich abnehmender oder stagnierender Carbonsäurebildung abgebrochen. Die Gesamtkultivierungszeit dauert im Allgemeinen etwa 60 bis 250 Stunden in Abhängigkeit von der eingesetzten Menge der Kohlenstoffquelle und dem gewählten Kultivierungs-Modus (z.B. Fedbatch- und Repeated Fedbatch).

Vorteilhafterweise ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren Citronensäurekonzentratio- nen von sS210 g/L.

Die erfindungsgemäß gewonnene Kulturlösung, welche die produzierte Citronensäure und Hefebiomasse von Y. lipolytica enthält, kann anschließend den für die Produktisolierung und -konzentrierung von Carbonsäuren üblichen Verfahren des Downstream processing zugeführt werden. Diese Verfahren beinhalten mindesten eine übliche Abtrennstufe für Mikroorganismen (z.B. Crossflow-Filtration, Sedimentation, Filtration, Zentrifugation) und eine Isolierstufe für Citronensäure (z.B. Adsorption/Desorption, Ausfällung, Elektrodialyse mit bipolaren Membranen, Simulated Moving Bed (SMB)-Chromatografie, Reaktivextraktion).

Die erfindungsgemäße Anwendung des Verfahrens ist mit deutlichen Vorteilen im Vergleich zum gegenwärtigen Stand der Technik verbunden, die wie folgt zusammengefasst werden können:

Produktkonzentrationen von < 210 g/L Citronensäure liegen über mit den bekannten Verfahren erzielten Ausbeuten.

Die Produktion von Citronensäure unter komplett unsterilen Bedingungen vermeidet die apparativen, energetischen und materiellen Aufwendungen die bei den bestehenden Verfahren für die Erzeugung und Aufrechterhaltung von sterilen Kulturbedingungen erforderlich sind.

Die vorgesehene ausschließliche Nutzung von Abwässern für die submerse Kultivierung vermeidet die bei den bestehenden Verfahren vorgesehene Nutzung von Betriebswasser und höheren Qualitäten sowie die apparativen, energetischen und materiellen Aufwendungen für deren Herstellung. Der bevorzugte Einsatz von Abprodukten als kohlenstoffreiche Verbindungen für die Produktion von Citronensäure vermeidet die konkurrierende Nutzung von Kohlenstoffquellen aus dem landwirtschaftlichen Anbau, welche als Lebens- und Futtermittel eingesetzt werden können.

Die Produktionskulturen können als freie Hefezellen eingesetzt werden und damit Aufwendungen für eine Zellimmobilisierung, wie sie teilweise in den beschriebenen Verfahren und Veröffentlichungen erforderlich sind, vermieden werden.

In den nachfolgenden Beispielen wird die Erfindung näher beschrieben. Beispiel 1

Gewinnung Vorkultur

Der Stamm Yarrowia lipolytica H181 (DSM 7806) wurde auf einem bekannten für Hefen geeigneten Nährmedium (z.B. Pepton Hefeextrakt Agar oder Reader-Agar) für 24 bis 48 h bei 30°C kultiviert.

Von der gewachsenen Agarkultur wurden 2 bis 3 Impfösen auf 100 ml einer sterilen mit destilliertem Wasser hergestellten Vorkulturlösung folgender Zusammensetzung überimpft:

NH ₄ CI 3,00 g/L

MgS0 ₄ x 7 H20 0,35 g/L

NaCI 0,10 g/L

CaCI ₂ x 2 H ₂ 0 0,13 g/L

FeS0 ₄ x 7 H ₂ 0 3,5 mg/L

Thiamin x HCl 1 mg/L

Spurensalzlösung 5 ml/L

Sonnenblumenöl 50 g/L

Die Spurensalzlösung des Vorkulturmediums hatte folgende Zusammensetzung:

CuS0 ₄ x 5 H ₂ 0 4,0 g/L

MnS0 ₄ x 5 H ₂ 0 4,0 g/L ZnCI ₂ 2,1 g/L

Die Vorkultur wurde und bei pH 5-6 in 500 ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen bei 30 °C für 48 h auf einer Schüttelapparatur bei einer Schüttelfrequenz von 120 bis 140 rpm kultiviert.

Durchführung Haupt-/Produktionskultur

Von der Vorkultur erfolgte die Überimpfung von 30 ml Inokulum bei einem Animpfverhältnis 1 :10 in einen 0,5 L-Rührreaktor mit 300 ml Arbeitsvolumen zur Durchführung der unsterilen submersen Haupt-/Produktionskultivierung, wobei die Begriffe Haupt- und Produktionskultur als Synonyme verwendet werden. Das Produktionsmedium enthielt folgende Komponenten:

MgS0 ₄ x 7 H ₂ 0 0,35 g/L

CaCI ₂ x 2 H ₂ 0 0,13 g/L

FeS04 x 7 H20 3,5 mg/L

Thiamin x HCl 1 mg/L

Spurensalzlösung 1 ml/l

(Zusammensetzung der Spurensalzlösung wie Vorkultur)

Als Kohlenstoffquelle enthielt das Produktionsmedium ein Altfrittenol, welches zuvor für zwei Tage als Frittieröl zur Herstellung von Pommes frites verwendet wurde. Das Altfrittenol wies folgendes Fettsäuremuster (Masseprozente) auf:

Myristinsäure (14:0) 5,4%

Palmitinsäure (16:0) 0,2%

Stearinsäure (18:0) 1 ,6%

Ölsäure (18:1 ; w9c) 58,7%

Vaccensäure (18:1 ; w7c) 3,5%

Linolsäure (18:2) 19,6%

Linolensäure (18:3) 8,7%

Arachdonsäure (20:0) 0,4%

Eicosensäure (20:1 ; w9c) 0,9% andere Fettsäuren

Als flüssige Phase für die Herstellung des Produktionsmediums wurde das Abwasser aus dem Ablauf eines Öl- und Fettseparators eines gewerblichen Kantinen- und Cateringbetrie- bes eingesetzt. Der Ablauf des ÖI-/Fettseparators war durch folgende abwasserbezogenen Kennziffern gekennzeichnet:

Parameter

pH 6,3

DOC 6,7 mg 0 ₂ /L

Leitfähigkeit 2,17 mS/cm

CSB 2830 mg/L

BSB ₅ 161 1 mg/L

TOC 954 mg/L

TSS 576 mg/L

TN 32 mg/L

Alle Nährmedienbestandteile des Produktionsmediums wurden unsteril in dem Abwasser gelöst und dem 0,5 L-Rührreaktor zugegeben. Die Startkonzentration des Altfrittenöls im Rührreaktor betrug 40 g/L und wurde unsteril im Fedbatch-Betrieb in Schritten von 20 g/L bis auf eine Endkonzentration von 140 g/L zugegeben. Die Produktionskulturen wurden als Doppelansatz bei 30°C, Rührerdrehzahl = 900 rpm und einer Gelöstsauerstoffkonzentration pO ₂ =50% durchgeführt. Die Gelöstsauerstoffkonzentration wurde über einen Gasmix aus Luft/Stickstoff/Sauerstoff geregelt, wobei die Belüftung der Rührreaktoren unsteril ohne Zu- und Abluftfilter mit einem Gesamtgasfluss von 0,5 L/min erfolgte. Der pH-Wert wurde bei pH 5 mit 20%iger NaOH statiert.

Zum Vergleich wurden sterile Doppelansätze, mit a.) destilliertem Wasser (inklusive aller Nährkomponenten sterilisiert bei 121 °C für 20 min), anstelle Abwasser und Altfrittenöl (pasteurisiert bei 80°C für 20 min) sowie b.) ÖI-/Fettseparatorablauf (inklusive aller Nährkomponenten, sterilisiert bei 121 °C für 20 min) und Altfrittenöl (pasteurisiert bei 80°C für 20 min) realisiert.

Mit Auszehrung der Stickstoffquelle Ammoniumsulfat nach 21 h begann die Akkumulation von Citronensäure und Isocitronensäure in den Kulturlösungen. Nach 166 h wurden die Kultivierungen beendet. Für den unsterilen Ansatz mit Abwasser (Ablauf ÖI-/Fettseparator) wurde eine Carbonsäurebildung von 137 g/L Citronensäure und 1 1 g/L des Nebenproduktes Isocitronensäure festgestellt (Mittelwerte aus zwei Kultivierungen). Dies entsprach einer Pro- duktivität von 0,83 g/L ^* h. Bei Nutzung von Abwasser unter sterilen Bedingungen waren die Produktmengen an Carbonsäuren nur unwesentlich erhöht; mit destilliertem Wasser wurden die niedrigsten Konzentrationen an Citrat gebildet (Tabelle 1 ).

Tab. 1 Citronensaureproduktion von Yarrowia lipolytica H181 (DSM 7806) unter unsterilen Kulturbedingungen (Mittelwerte aus je zwei identischen Versuchsansetzen)

Ansatz KulturCitronen- Isocitronen- Produktivität Selektivität dauer säure säure Citrat Citrat

(g/L) (g/L) (g/L ^* h) (%) unsteril

Ablauf Öl-Separator + 166 h 137 ± 8,5 1 1 ,2 ± 1 ,4 0,83 ± 0,05 92,4 ± 0,5 Altfrittenöl

steril

a.) Destilliertes Was166 h 125 ± 4,6 15,2 ± 3,7 0,75 ± 0,03 89,3 ± 2,0 ser + Altfrittenöl

b.) Ablauf Öl- 166 h 145 ± 9,6 14,9 ± 0,6 0,88 ± 0,06 90,7 ± 0,2 Separator + Altfrittenöl

Beispiel 2

Die Kultivierung erfolgte, wie in Beispiel 1 beschrieben, wobei ein Abwasser (Ablauf Öl- /Fettseparator) in der Hauptkultur eingesetzt wurde, welches folgende Zusammensetzung hatte:

Parameter

pH 5,9

DOC 1 ,7 mg 0 ₂ /L

Leitfähigkeit 3,0 mS/cm

CSB 1760 mg/L

BSB ₅ 1036 mg/L

TOC 676 mg/L

TSS 315 mg/L

TN 29 mg/L

Die Hauptkultur wurde als semikontinuierliche Kultivierung (repeated Fedbatch Betrieb) in einem 15-L-Rührreaktor durchgeführt. Dabei wurde Zyklus 1 mit 9 L Arbeitsvolumen gestar- tet, welches 900 ml der Vorkultur von Y. lipolytica H181 (DSM 7806) und eine initiale Altfrit- tenöl-Konzentration von 40 g/L enthielt. Das Feeding der Kohlenstoffquelle erfolgte bis zu einer summarischen Endkonzentration von 120 g/L Altöl.

Abweichend von Beispiel 1 wurde der pH-Wert 5 mit 45%iger NaOH statiert und die Sauerstoffversorgung der Hefen mittels einer Belüftungsmenge von 4 L/min bei einer Rührerdrehzahl von 800 rpm realisiert. Die Gelöstsauerstoffkonzentration betrug über die gesamte Kultivierung p0 ₂ S 20%.

Mit Auszehrung der Stickstoffquelle Ammoniumsulfat nach 20 h konnte die Akkumulation von Citronensäure und Isocitronensäure registriert werden. Nach 70 h Kulturdauer wurde Zyklus 1 der Hauptkultivierung beendet. Das Volumen der Kulturlösung betrug 10,5 L und enthielt 77 g/L Citronensäure, 3,8 g/l Isocitronensäure. Dies entsprach einer Produktivität von 1 ,1 g/L ^* h und Selektivität von 95,2% für Citronensäure.

Nach Abschluss von Zyklus 1 wurden 9,5 L der Kulturlösung bis auf 1 L Restvolumen abgelassen und unsteril mit 8 L des ÖI-/Fettseparatorablaufes inklusive der Nährmedienkomponenten des Produktionsmediums aufgefüllt. Die in dem Restvolumen von Zyklus 1 enthaltene Hefebiomasse von Y. lipolytica H181 fundierte als Inokulum für die Fortsetzung der Kultivierung im zweiten Kultivierungszyklus.

In Zyklus 2 wurden dem Rührreaktor 150 g/L Altfrittenöl als externe Kohlenstoffquelle im Fedbatch-Modus zudosiert. Bezüglich des pH-Wertes und der Sauerstoffversorgung wurden die Bedingungen von Zyklus 1 eingehalten. Mit wiederholter Auszehrung Stickstoffquelle Ammoniumsulfat nach 20 h in Zyklus 2 begann die Bildung von Citronensäure und Isocitronensäure durch die Hefe Yarrowia lipolytica H181. Bei Abbruch von Zyklus 2 nach 95 h Zyklusdauer, bei einer Gesamtkultvierungszeit von 165 h über beide Zyklen, betrug die Konzentration an Citronensäure 91 g/L und Isocitronensäure 4,4 g/L in 10,6 L Kulturlösung. Damit waren die Produktivität (0,96 g/L ^* h) und Selektivität (95,4%) der Citratbildung in Zyklus 2 nahezu identisch mit den Ergebnissen von Zyklus 1 .

Insgesamt konnten in beiden unsterilen Zyklen 20,1 L Kulturlösung geerntet werden, welche 1 ,7 Kg Citronensäure enthielten.

Beispiel 3 Die in Beispiel 2 beschriebene Kultivierung wurde dahingehend modifiziert, dass auch die Vorkultur unter Verwendung eines Abwassers (Ablauf ÖI-/Fettseparator) gewonnen wurde. Zusätzlich abweichend von Beispiel 2 erfolgte die unsterile Hauptkultur mit einem unbehandelten Abwasser eines gewerblichen Kantinen- und Cateringbetriebes, welches als Zulauf in einen Öl-/Fettabscheider eingeleitet wird. Das verwendete Abwasser (Zulauf Öl- /Fettabscheider) hatte folgende Zusammensetzung:

Parameter

pH 5,8

DOC 0,6 mg 0 ₂ /L

Leitfähigkeit 2,9 mS/cm

CSB 5240 mg/L

BSB ₅ 1661 mg/L

TOC 1095 mg/L

TSS 191 mg/L

TN 1 17 mg/L

Die Hauptkultur wurde als Fedbatch-Kultivierung in einem 15-L-Rührreaktor mit 9 L Startvolumen durchgeführt. Die initiale Altfrittenölkonzentration betrug 35 g/L und wurde durch kontinuierliche Substratzufuhr bis auf 175 g/L nach 120 h Kulturdauer erhöht. Abweichend von Beispiel 2 wurde die Rührerdrehzahl auf 600 rpm abgesenkt. Die Gelöstsauerstoffkonzentration betrug während der Kultivierung p0 ₂ ^ 5%.

Nach 21 h war die Ammoniumstickstoffquelle ausgezehrt; ab diesem Zeitpunkt erfolgte die Akkumulation von Citrat und Isocitrat. Bei Abbruch der Hauptkultivierung nach 166 h konnten 181 g/L Citronensäure und 5,4 g/L Isocitronensäure in der Kulturbrühe gemessen werden. Dies einsprach einer Produktivität von 1 ,1 g/(L ^* h) für Citronensäure. Die Selektivität für Citrat betrug 97%.

Beispiel 4

Die Kultivierung wurde wiederholt, wie in Beispiel 2 beschrieben, wobei ein kommunales Abwasser (Ablauf Septic tank) als flüssige Phase in der Hauptkultur verwendet wurde. Das kommunale Abwasser hatte folgende Zusammensetzung: Parameter

pH 7,2

DOC 0,76 mg 0 ₂ /L

Leitfähigkeit 1 ,66 mS/cm

CSB 486 mg/L

BSB ₅ 287 mg/L

TOC 163 mg/L

TSS 65 mg/L

TN 91 mg/l

E. coli 4,6 x 10 ⁶ MPN/100 mL

Abweichend von Beispiel 2 wurde die unsterile Hauptkultur als Fedbatch-Kultivierung (15 L- Rührreaktor mit 9 L Arbeitsvolumen) durchgeführt. Dabei wurde Altfrittenöl als Kohlenstoffquelle bis zu einer Endkonzentration von 180 g/L zudosiert, ausgehend von einer initialen Substratkonzentration von 40 g/L. Die Kultivierung erfolgte bei pH 5, welcher mit 45%iger NaOH eingestellt wurde und einer Rührerdrehzahl von 600 rpm. Die Luftbegasungsrate betrug 4 L/min. Damit konnten über die gesamte Kulturdauer die Gelöstsauerstoffkonzentrationen p0 ₂ ^ 3% gehalten werden.

Nach Auszehrung der NH4-N-Quelle bei 21 h wurden innerhalb der nachfolgenden von 56 h Kultivierung 95 g/L Citronensäure und 2 g/L Isocitrat von Y. lipolytica H181 (DSM 7806) gebildet, entsprechend einer Citronensaurebildungsrate von 1 ,2 g/(L ^* h). Die Fortsetzung der Kultvierung bis 189 h führte zu einer weitere Erhöhung der Citroenensäurekonzentration bis auf 133,7 g/L. Bei gleichzeitig gemessenen 4,8 g/L Isocitronensäure konnte eine Selektivität von 96,5% für die Citratbildung ermittelt werden. Die Produktivität für Citrat betrug für den Gesamtzeitraum 0,71 g/(L ^* h).

Bei Kultivierungsende waren in der Kulturlösung keine £. co//-Keime (Summenparameter pathogene Bakterien) mehr nachweisbar. Dies ist ein Indiz für hygienisierende Wirkung der hefebasierten Citratproduktion auf Abwässer.

In den vorstehenden Beispielen 1 bis 4 werden folgende Abkürzungen verwendet: pH pH-Wert

DOC Dissolved oxygen content

CSB Chemischer Sauerstoffbedarf

BSB ₅ Biologischer Sauerstoffbedarf (nach 5 Tagen) TOC Total organic carbon

TSS Total suspended solids

TN Total nitrogen

E. coli Escherichia coli