트랜스펙션 후 48시간 후에 VSV-G 단백질로 포장된 바이러스들을 수득하였다. 바이러스를 생산하는 세포를 포함한 모든 세포는 4.5 g/l 글루코오스(GibcoBRL, Grand Island, NY, USA), 소 태아 혈청(10%) 및 스트렙토마이신(100 μ/ml)을 함유하고 있는 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO ₂ 조건에서 배양한다. 상기의 감염 및 트랜스팩션된 GP2-293 세포로부터 수거한 바이러스-함유 배지는 0.45㎛ 포어(pore) 크기의 필터를 통해 여과한 후 개의 섬유아세포들을 감염시키는데 사용하였다. 감염과정을 거친 섬유아세포는 하이그로마이신 (150 μg/ml)으로 6일간 선별하였다.

(3) RFP 유전자가 도입된 공여 핵 세포의 선별 및 증식

레트로바이러스 벡터를 이용하여 RFP 유전자를 암캐(BF3) 및 수캐(BF4) 태아 섬유아세포의 공여 세포에 도입하고, 안정된 이입세포(transfectant)(BF3/RFP 및 BF4/RFP)를 hygromycin selection으로 분리하고자 하였다. 항생제를 이용한 세포선별을 위해 유전자 도입 후 2-3일 간격으로 6일간 하이글로마이신을 150ug/ml 용량으로 적용하여 선별을 실시하였다(Fig. 2의 b).

선별 후 세포들은 하나의 집락(colony)으로 자라게 되는데 이를 트립신으로 처리하여 96-웰(96-well)의 배양용기로 옮겨 배양 한 후 이들이 증식되면 이후 24-웰로 옮겨 배양하고 더 나아가서 12-웰과 6-웰까지 증식 배양을 실시하였다. 트립신처리로 분리한 단세포 중 현미경하에서 자외선 필터를 이용하여 RFP 단백질이 발현되는 세포만을 선택하여 핵이식에 적용하였다.

RFP유전자 도입과 항생제 선별이 끝나 증식배양된 세포를 15 % 소태아혈청과 10 % 세포배양배지를 이용하여 세포를 부유한 다음 4℃에서 2시간, -70℃에서 12시간 이상 정치시킨 후 -150℃에서 동결보관하였다.

체세포 핵 이식을 하기에 앞서, 세포들을 해동하고, 15 μM의 로스코비틴이 첨가된 배양 배지(즉, DMEM + 10% FBS + 15 μM 로스코비틴) 에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 체세포 핵이식시 약 2분 동안 트립신 처리하여 단일층으로부터 세포를 회수하였다.

실험예 1 : 로스코비틴 처리군과 대조군의 비교

로스코비틴을 처리하지 않은 대조군과 로스코비틴을 24시간 처리한 처리구간에, 탈핵된 난자에 미세주입방법을 이용하여 개의 체세포 이식을 실시한 후, 핵의 형성 및 변화에 있어서 차이점을 조사하였다.

그 결과 로스코비틴 처리구가 대조군에 비하여 더 높은 비율로 조숙 염색체 응축(premature chromosome condensation, PCC)가 일어나며, 융합란의 활성화 후에도 계속적인 핵의 팽윤과 재응축이 대조군과 상이하게 차이를 보이며 일어나는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과들은 개 난자의 미세주입법을 이용한 핵치환 이후에도 개의 재구축된 복제수정란이 정상적으로 리모델링(remodeling) 될 수 있음을 보여주고 있으며, 대조군에 비하여 처리군이 더 우수하게 발달하는 것을 보여주고 있다. 실제 이러한 핵 리모델링으로 인한 핵의 다양한 형태학적 양상을 표 3에 나타내었다.

하기 표 4는 로스코비틴을 처리한 처리군과 대조군 간의 탈핵된 난자에 체세포를 이식한 후 재구축된 난자의 핵 리모델링을 관찰한 결과이다. PCC, NE, NS는 핵이 시간에 지남에 따라 정상적으로 발달하는데 겪게되는 현상들로, 시간의 흐름에 따라서 PCC → NE → NS 의 순서대로 과정을 겪게 되는데, 전기 융합후 1시간째, 대조군에 비하여 처리군에서 PCC가 유의하게 더 높은 비율로 일어나있는 것을 확인하였다. 그리고 융합란의 활성화 후 4시간째, 핵의 팽윤 (NS)이 처리군에서 더 많이 발생되는 것이 확인되었다.

표 3

(hpf = hour post fusion; hpa = hour post activation; IN = intact nucleus; PCC = premature chromosome condensation; NE = nuclear enlargement; NS = nuclear swelling. (P < 0.05))

다음으로, 본 발명의 방법에 따라 로스코비틴을 처리한 공여 핵 세포와 그에 대한 대조군으로 로스코비틴을 처리하지 않고 배양한 공여 핵 세포를 사용하여 체세포 핵이식을 실시한 후 각 그룹의 임신율을 조사하였다.

그 결과, 대조군에서는 체세포 핵이식한 478 개의 배아를 26 마리의 대리모에 이식하였으며, 그 중 4 마리가 임신이 되었다 (15.3%,임신 대리모수/총 대리모수). 로스코비틴 처리군에서는 체세포 핵이식 후 556 개의 배아를 29마리의 대리모에 이식하였으며, 그 중 11 마리가 임신에 성공하였다 (37.9%,임신 대리모수/총 대리모수).

이 결과로 볼 때, 로스코비틴 처리 후 체세포 이식한 경우에 임신율이 매우 유의미하게 향상되었음을 확인할 수 있었다.

표 4

실시예 5: 체세포 핵이식

(1) 탈핵 난자에 공여 핵 세포의 미세주입 및 융합

상기 실시예 2에서 제조한 탈핵 난자에 상기 실시예 4에서 제조한 RFP 유전자가 도입된 공여 핵 세포를 미세주입하였다. RFP 유전자가 도입된 공여 핵 세포는 탈핵 난자의 주란강(perivitellin) 공간으로 다음과 같은 방법으로 미세주입하였다. 미세주입시 정치된 탈핵 난자를 100/mL 피토헤마글루티닌(phytohemagglutinin)이 함유된 표1의 배지에 처리하고, 탈핵 난자의 절개창을 고정용 피펫으로 고정한 다음 이식용 피펫을 절개창으로 삽입하여 실시예 3에서 단일세포로 분리된 섬유아세포를 탈핵 난자의 세포질과 투명대 사이에 주입하였다.

그 다음 상기 RFP 유전자가 도입된 공여 핵 세포-난자 결합체(couplets)를 융합 배지(0.26M 만니톨, 0.1mM MgSO ₄ , 0.5mM 헤페스 및 0.05% BSA)에 넣고 미세조작장치(Nikon-Narishige, Japan)에 부착되어 있는 평행한 2개의 전극사이에 놓고 전기-세포 융합 장치(Electro-Cell Fusion apparatus) (NEPA GENE Co., Chiba, Japan)로, 전압 4kV/cm 조건으로 15㎲ 동안 2회간 전기적 자극을 가하였다.

상기에서 전극 사이의 거리는 약 180 ㎛ (난자의 직경) 정도였다. 전기 융합 장치의 전압을 72V로 조절하고, 15μsec으로 2 펄스를 인가하였으며, 전기 자극 1시간 후에 공여 핵 세포와 난자 세포질체의 융합을 입체현미경 하(stereomicroscope)에서 관찰하였다.

전기자극 1시간 후에 공여 핵 세포와 난자 세포질체의 융합을 입체현미경 하(stereomicroscope)에서 관찰하였다. 융합된 수정란을 선별하였고 이를 10%(v/v) FBS가 첨가된 TCM-199(표 2)에서 1.5~4시간 동안 배양하였다.

(2) 활성화

상기 세포융합과정이 끝난 형질전환 핵이식란은 10μM 이오노포어(Sigma)가 함유된 변형된 합성 난관액((modified synthetic oviductal fluid; mSOF) (표 5)에 넣고 39℃에서 4분간 배양하여 핵 이식란의 활성화를 유도하였다. 그 다음 상기 핵 이식란을 세척하고 1.9mM 6-디메틸아미노퓨린이 첨가된 mSOF에서 4시간 동안 추가로 배양하였다. 상기 핵 이식란은 대리모에 이식하기 전까지 미네랄 오일이 덮여진 mSOF 25㎕ 미세유적(microdrop)에서 배양하였다.

표 5

실험예 2: 체세포 핵이식한 배의 In vitro 발생 및 RFP 발현확인

형질전환 SCNT군(SCNT-BF3/REF), 비형질전환 SCNT군(SCNT-BF3) 및 단위발생(parthenogenetic)군별로 in vitro 배 발생 비율을 비교하여 살펴보았다(표 6).

표 6

(평균%±SEM; p < 0.05)

SCNT 배들의 전체 배발생율은 단위발생군보다 현저히 낮았으나, 형질전환군 및 비형질전환군은 각각 2 cell (53.4±0.07 vs. 58.7±0.05%), 4 cell (30.2±0.04 vs. 29.9±0.04%), 8 cell (17.9±0.04 vs. 17.4±0.06%), 및 16-32 cell (6.2±0.02 vs. 6.1±0.07%) stages에서 유사한 발생율을 나타내었다. 붉은 형광이 2, 4, 8-16 cell에서 모자이크 현상없이 나타난 반면(Fig. 2의 c), 단위발생군에서는 형광이 나타나지 않았다.

실시예 6: 대리모 이식 및 복제개의 생산

상기 실시예 5의 핵 이식란을 발정 동기화된 대리모의 난관에 외과적 수술방법을 사용하여 이식하였다. 이식은 상기에서 핵 이식란을 활성화한 후 4시간 이내에 수행하였다. 대리모로는 질병에 이환되지 않으며 정상적인 발정주기가 반복되며 자궁상태가 정상인 암캐를 사용하였다. 전체 344개의 배(287 BF3/RFP 및 57 BF4/RFP)를, 대리모 20마리의 난관에 이식하였다. 그 중 16 마리에는 BF3/RFP배를, 4마리에는 BF4/RFP 배를 이식하였다.

이를 위해 먼저 대리모에 케타민 HCl(ketamine HCl) 6mg/kg과 자일라진(xylazine) 1mg/kg을 투여하여 전 마취시키고, 2% 이소플루란(isoflurane)을 이용하여 흡입마취상태를 유지하였다. 마취된 개의 수술부위를 무균처리하고 난관을 노출시키기 위해 일반적인 개복수술법에 따라 등배쪽 부위를 절개하였다. 손으로 복강 내를 촉진하여 난소와 난관 및 자궁을 절개창으로 견인하였다. 견인된 난소의 난소간막을 조심스레 다루어 난관의 개구부를 인지하고 1.0ml 튜버큘린(tuberculin) 주사기(Latex free, Becton Dickinson & CO. Franklin lakes, NJ 07417)가 장착된 3.5F 톰 캣 카테터(Tom cat catheter, Sherwood, St. Louis, MO)를 난관 내로 넣어 카테터 전방에 충분한 공간을 확보하고 핵 이식란을 주입하였다. 핵 이식란의 주입여부는 현미경을 검경하였다. 복부의 봉합은 흡수성 봉합사를 이용하였고 이후 피부봉합을 실시하였다. 수술 후 감염을 방지하기 위하여 광범위 항생제를 3일이상 혈중 유지되도록 투여하였다.

임신여부는 대리모에 핵 이식란을 이식한 후 23일째에 7.0 MHZ 리니어-어레이 프로브(linear-array probe)가 장착된 SONOACE 9900 초음파 스캐너(Medison Co. LTD, Korea)를 이용하여 검사하였다. 즉 이식 후 23일째에 초음파에 의해 각 대리모로부터 한 개의 태아 낭(embyonic sac)이 검출되었으며 태아 사망이나 유산은 검출되지 않았다. 대리모 중 7마리가 이식 후 약 25일 후에 초음파 검사를 통해 임신한 것으로 나타났다(5마리:BF3/RFP 및 2마리:BF4/RFP)(표 7). 약 60일 후에 제왕절개 또는 자연분만을 통해 암컷 4마리(R1-R3 및 R5로 명명) 및 수컷 2마리(R6 및 R7로 명명)의 형질전환된 복제개가 태어났다.

표 7

실험예 3 :본 발명의 방법에 따라 생산된 복제개의 특성 확인

핵이식에 따른 강아지의 특성을 이하 표 8에 요약하였다. 형질전환된 복제 강아지들은 유전학적으로 각각 공여 세포와 동일하였다.

표 8

또한, 형질전환된 강아지들의 mtDNA는 전부 공여 개의 난자로부터 유래됨을 보여주었다(데이터 도시 않음).

실험예 4 :본 발명의 방법에 따라 생산된 복제개의 RFP 유전자 발현 In vivo 확인

실시예 6에서 생산된 각각의 형질전환 산자는 육안적 방법 및 분자생물학적 방법으로 유전자 분석을 하였다. RFP발현 복제개는 외견관찰 및 조직을 이용한 서던블럿 및 현미경의 자외선 필터을 이용하여 RFP 발현 및 유전자 도입을 분석하였다.

(1) 서던 블럿 및 RT-PCR 분석

분자생물학적 검사로 우선, 서던 블럿으로 산자의 Genomic DNA를 분석하였다. 서던 블럿 분석에서 RFP 유전자 프로브의 합성을 위한 프라이머로, pDsRed2-C1 (Clontech, Mountain View, CA, USA) 뉴클레오티드 서열 606-623 위치 및 1270-1287위치에 해당하는 5’- CGCCACCATGGCCTCCTC-3’(SEQ ID NO.: 2) 및 5’-CAGGAACAGGTGGTGGCG-3’(SEQ ID NO.: 3)을 사용하였다. 상기 프로브(3905 bp)를 the PCR DIG Probe Synthesis kit (Roche, Mannheim, Germany)를 이용하여 합성하고, 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리정제하고, 혼성화 전에 digoxigenin으로 표지하였다.

그 결과, 양성전하를 띠는 나일론 막(positively-charged nylon membrane) 상에서, 표지된 DNA가 DIG luminescent detection kit (Roche, Mannheim, Germany)에 의해 나타남을 확인하였다(Fig. 3).

마찬가지로, RFP 유전자의 전사수준에서의 확인을 위하여 복제개에 대하여 RT-PCR을 수행하였다. 전체 RNA를 DNase I로 처리하고, the first-strand cDNA synthesis kit (Amersham Pharmacia Biotech, Oakville, ON, Canada)를 이용하여 상기 RNA를 역전사시켰다. RT-PCR을 수행함에 있어서, 정방향 프라이머 RFP-F : 5’-CGTGAAGCTGAAGGTGA-3’(SEQ ID NO.: 4) 및 역방향 프라이머 RFP-R : 5’- CTCGTACTGCTCCACGA-3’(SEQ ID NO.: 5)를 사용하여 RFP cDNA의 증폭 후 산물(517 bp)을 수득하였다. 그리고, β-actin 내부 전사 조절을 위하여, 베타 액틴-F 정방향 프라이머:5’-TGCCTTGAAGTTGGAAAACG-3’(SEQ ID NO.: 6) 및 역방향 프라이머:5’-CTGGGGCCTAATGTTCTCACA-3’(SEQ ID NO.: 7)을 사용하여 베타-액틴 전사산물(153 bp)을 수득하였다.

RT-PCR 결과를 Fig. 4에 도시하였다. 즉, RFP 유전자의 전사수준에서의 발현을 확인하였다.

(2) 붉은 형광 발색 확인

Texas red filter set를 구비한 Leica inverted microscope과 특정 DsRed filter set를 구비한 Leica upright stereomicroscope을 이용하여 붉은 형광의 발색을 검출하였다. 상기 붉은 형광 발색은 540±0 nm에서의 방출로 나타나고 600±5 nm의 최대 투과율의 파장에서 emission filter에 의해 검출되어진다.

GFsP-5 head light source (Biochemical Laboratory Services, Budapest, Hungary)를 이용하여 DsRed를 발현하는 산자들을 확인하였다.

그 결과, Fig. 5에 나타난 바와 같이 형질전환된 복제개로부터 붉은 형광이 나타나는 것을 쉽게 확인할 수 있었으나, 대조군인 비형질전환된 개에서는 전혀 붉은 형광이 나타나지 않음이 관찰되었다(Fig. 5의 b 및 c).

또한, 활성 필터(excitation filter)(HQ 540/40; Chroma Technology Corp., Rockingham, VT, USA)를 갖춘 70W 외과용 라이트(surgery light)로 형질전환된 복제개의 피부 및 발톱에 빛을 가했을때, 카메라 렌즈에 인접하게 붙어있는 방사 필터(emission filter)(HQ 600/50; Chroma Technology Corp., Rockingham, VT, USA)를 갖춘 SAMSUNG 디지털 카메라(GX10, Republic of Korea)를 이용하여 붉은 형광의 발광(Red fluorescence emission)이 나타남을 확인하였다(Fig. 5의 b’ 및 c’).

그리고, Fig. 6에 나타낸 바와 같이, RFP 유전자로 형질전환된 복제개는, 뇌, 심장, 간, 신장, 정소, 폐, 근육, 소장, 흉선, 비장, 피부, 위 등 각 조직에서 RFP 유전자를 100% 발현하고 있음을 알 수 있다. 이에 반하여, RFP 유전자를 도입하지 않은 대조구 복제개의 경우는 전혀 형광물질이 검출되지 않았다.

한편, 형질전환된 산자들로부터 섬유아세포를 수득한 후, RFP specific filter (EX 510-560 nm, BA 590 nm)를 구비하고 있는 도립 현미경을 이용하여 RFP 발현을 관찰하고, FACS(fluorescence activated cell sorter)로 확인하고자 하였다. 이를 위해 우선, 섬유아세포를 PBS로 세척하고 부착된 세포를 트립신으로 탈착시킨 후, 4℃에서 10 min동안 70% 에탄올로 고정시켰다. FACS Caliber (Becton-Dickinson, NY, USA)를 이용하여 분석하였다. 그 결과, 마찬가지로 형질전환된 복제개의 섬유아세포에서의 RFP 발현을 확인하였다(데이터 도시 않음).

(3) FISH(Fluorescence in situ hybridization)분석

또한 Fluorescence in situ hybridization (FISH) 분석으로 RFP 유전자의 삽입을 확인하였다.

FISH 분석을 위하여, RFP 특이 프로브를 Biotin nick translation mix kit (Roche, Mannheim, Germany)를 이용하여 biotin으로 표지하고, 표지된 프로브 100ng을 Salmon sperm DNA 및 Hyb 혼합물[50% formamide, 10% dextran sulfate (Sigma), 2x SSC]과 섞은 후 75 ℃에서 5분 동안 변성시키고(denatured), 변성된 염색체를 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 그 후, 2x SSC에서 45℃ 및 30분 동안 50%의 포르마미드(formamide)로 세척하고, 2x SSC에서 5분동안 추가로 세척한 후, 4xSSC/0.1% Tween 20으로 헹구었다. 그리고, fluorescein avidin DCS (Vector Laboratories Inc., Burlingame, USA) 처리 후 커버슬립하여 37℃에서 20분동안 인큐베이션한 후, 4x SSC로 세척하였다. immunopure biotinylated goat anti-avidine (Pierce, Rockford, USA) 처리하여 37℃에서 20 분동안 다시 인큐베이션하고, 세척한 다음 fluorescein avidin DCS 처리하였다. 이어서, 슬라이드를 세척하고 4’,6-diamidino-2-phenylindole (Vector Laboratories Inc.)로 염색하였다. FISH 이미지는 Leica DMRXA2 (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)로 관찰하였고, CoolSNAP cf digital camera (Roper Scientific photometrics, Tucson, USA)로 캡쳐하여, Leica CW4000 (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)로 분석하였다.

그 결과, Fig. 7에 나타낸 바와 같이, 유사분열 중기 염색체에 있어서 RFP 유전자의 삽입이 한 군데(Fig. 7의 a) 또는 두 군데(Fig. 7의 b)에서 일어나 있음을 확인할 수 있었고, 두 군데에서 삽입이 일어난 경우는 다른 염색체 상에서 이루어져 있었다.

상기 실험들을 결과를 종합해보면, 본 발명의 방법에 따라, 목적하는 유전자로 형질 전환시킨 복제개를 생산할 수 있음을 의미한다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명은 체세포에서 목적 유전자를 도입한 후, 상기 체세포를 핵이식 복제 기술을 접목하여 목적 유전자가 발현되는 개를 제공함으로써, 인간 및 동물 질환모델동물의 생산가능성 및 초급성 면역거부반응없이 인체에 이식 가능한 장기나 치료용 세포를 공급하는 동물의 생산 가능성을 제공한다.

전자 파일 첨부하였음.