Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von D-Xylonat sowie ein coryneformes Bakterium.

D-Xylonsäure (C5H10O6) ist eine organische Säure, die, wie von Toivari et al. in Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 96(1 ): 1-8 dargelegt wurde, als Vorstufe für Polyamide, Polyester und 1 ,2,4-butantriol dienen kann und weist somit ein breites Anwendungspotenzial in der pharmazeutischen Industrie, der Lebensmittelindustrie und in der chemischen Industrie auf. Die nachfolgenden Erläuterungen beziehen sich auf D-Xylonat, dem Salz der D-Xylonsäure. D-Xylonat zählt zu den Top 30 der potenziell hochwertigen, auf nachwachsenden Rohstoffen der 2. Generation, z.B. Pentose-haltige Hemicellulosen basierenden, Vorstufen-Chemikalien. D-Xylonat hat Ähnlichkeit zu D-Gluconat (C6H1 107), welches einen globalen Markt von 80 kt/Jahr besitzt.

D-Xylonat wird natürlicherweise in einigen Bakterien über eine zweistufige Reaktion gebildet. In der ersten Reaktion wird D-Xylose zu D-Xylonolacton oxidiert, wobei hier je nach Organismus spezifische Dehydrogenasen katalytisch aktiv sind. Das D-Xylonolacton kann anschließend entweder durch spezifische Lactonasen oder spontan, ohne Enzymkatalysator, zum D-Xylonat umgewandelt werden. Zum Beispiel für die Spezies Gluconobacter oxydans und Pseudomonas fragi werden hohe Produkttiter an D-Xylonat berichtet, (Buchert et al., Applied Microbiology and Biotechnology, 27(4): 333-336, Toivari et al., Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 96(1): 1-8) beschrieben wurde.

Darüber hinaus wurden alternative D-Xylonat-Produktionsstämme (z. B. Hefe der Spezies Saccharomyces cerevisiae, Bakterien der Spezies Escherichia coli und Pilze der Spezies Aspergillus niger) durch eine heterologe Expression von D-Xylose-Dehydrogenasen, z. B. aus Caulobacter crescentus, erzeugt, wie von (Liu et al., Bioresour Technol, 2012, 1 15: 244- 248, Richard et al., 2012, US20120005788 A1 (US 13/256,559), Toivari et al., Metab Eng, 2012, 14(4): 427-436) dargelegt.

Neben der mikrobiellen Produktion kann D-Xylonat elektrochemisch (Jokic et al., Journal of Applied Electrochemistry, 21 (4): 321-326), enzymatisch (Pezzotti et al., Carbohydr Res, 2006, 341 (13): 2290-2292) oder durch chemische Oxidation (Isbell et al., Bureau of

Standards Journal of Research, 1932, 8(3): 327-338) hergestellt werden. Es ist bekannt, dass organische Säuren, bzw. deren Salze, durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden können.

Die Schrift US 2013/0295621 A1 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von D-Xylonsäure durch gentechnisch veränderte Bakterien.

Die nach dem Stand der Technik bekannten Produktionsstämme mit endogener D-Xylonat- Synthesekapazität, wie z. B. Gluconobacter oxydans, benötigen nicht definierte Medien für ihr Wachstum, wodurch die D-Xylonat-Produktion deutlich aufwendiger, teurer und damit unwirtschaftlicher wird.

Alle bisher beschriebenen "nicht-natürlichen" D-Xylonat-Produzenten sind gentechnisch veränderte Organismen im Sinne des Gesetzes zur Regelung der Gentechnik (GenTG) §3 wonach ein Organismus gentechnisch verändert ist, wenn er zur heterologen Expression befähigt ist, bzw. für diesen Organismus fremde Gene enthält, also rekombinant verändert ist, u.a. verschiedene Hefe, Pilze und Bakterien. Dadurch entsteht ein Nachteil für die Verwendung in bestimmten industriellen Bereichen, wie z. B. Lebensmittel- und Pharmaindustrie infolge aufwändiger Genehmigungsverfahren.

Es besteht der Bedarf, ein Verfahren und einen Mikroorganismus zur Verfügung zu stellen, mit denen D-Xylonat und damit D-Xylonsäure in hoher Enantiomerenreinheit und hoher Ausbeute hergestellt werden kann. Insbesondere soll ein Mikroorganismus und ein Verfahren zur Verfügung gestellt werden, welche in der industriellen Anwendung, insbesondere in der Lebensmittelindustrie, der pharmazeutischen und der chemischen Industrie angewendet werden können und ohne weiteres die Zulassungsbedingungen für den Einsatz in der Lebensmittelindustrie und pharmazeutischen- sowie chemischen Industrie erfüllen. Die mit genetisch veränderten Organismen im Sinne des Gesetzes zur Regelung der Gentechnik §3 verbundenen Nachteile, insbesondere rekombinant veränderten Organismen, verbundenen Nachteile sollen vorzugsweise vermieden werden. Insbesondere sollen einfache und kostengünstige Medien für die Kultivierung eingesetzt werden können, die preiswert und leicht einsetzbar sind. Die eingesetzten Mikroorganismen sollen auf definierten Medien hohe Wachstumsraten besitzen, hohe Biomasseerträge erzielen und die anschließende Produktaufarbeitung vereinfachen.

Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 und der nebengeordneten Ansprüche wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst mit denen im kennzeichnenden Teil der Ansprüche angegebenen Merkmalen. Mit dem erfindungsgemäßen Mikroorganismus, seinem Genom und dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren ist es nunmehr möglich, D-Xylonat in einer hohen Ausbeute, beispielsweise > 0,5 g D-Xylonat / g D-Xylose, bei einer Enantiomerenreinheit von 100 % herzustellen. Die erfindungsgemäßen Mikroorganismen sind für den industriellen Einsatz gut geeignet und überwinden in einer bevorzugten Ausführungsform die Zulassungskriterien für den Gebrauch in der Lebensmittelindustrie und der pharmazeutischen und chemischen Industrie, insbesondere gelten sie nach dem Gentechnikgesetz als nicht rekombinant verändert. Die erfindungsgemäßen Mikroorganismen erzielen auf definierten Medien hohe Wachstumsraten und hohe Biomasseausbeuten und ermöglichen eine einfache Produktaufarbeitung. Die Nachteile des Standes der Technik werden überwunden. Die definierten Medien sind preisgünstiger und weniger aufwändig in der Verwendung. Das Wachstum der Produktionsorganismen ist reproduzierbarer als bei nicht definierten Medien. Die Komplexität der Medien ist gering und reduziert damit die Anzahl notwendiger Verfahrensschritte zur Produktaufarbeitung.

Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.

Im Folgenden wird die Erfindung in ihrer allgemeinen Form beschrieben ohne dass es einschränkend auszulegen ist.

Überraschenderweise wurde gefunden, dass mit coryneformen Bakterien, bei denen die Aktivität des Gens loIR, kodierend für einen Regulator des myo-lnositol Stoffwechsels, nachfolgend lolR-Gen genannt, gemindert oder ausgeschaltet bzw. bei denen das lolR-Gen mindestens teilweise deletiert ist, ausgehend von D-Xylonat als Substrat eine sehr hohe Ausbeute von enantiomerenreinem D-Xylonat erzielt werden kann.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein coryneformes Bakterium bei dem die Aktivität des lolR-Gens gegenüber der Wildform oder einer Mutante der Wildform, vorzugsweise einer nicht rekombinanten Mutante die dieses Gen enthält, vermindert oder komplett ausgeschaltet bzw. bei denen das lolR-Gen mindestens teilweise deletiert ist, sowie ein Verfahren zur Herstellung von D-Xylonat mit einem coryneformen Bakterium , bei dem das lolR-Gen in seiner Aktivität vermindert oder komplett ausgeschaltet bzw. bei denen das lolR-Gen mindestens teilweise deletiert ist.

Die erfindungsgemäß veränderten coryneformen Bakterien können von der Wildform abstammen oder von einer gegenüber der Wildform genetisch veränderten Form die vorzugsweise nicht rekombinant verändert ist. Die Stämme, die von der Wildform ausgehen sind für die pharmazeutische und Lebensmittelindustrie besonders bevorzugt, da sie besonders leicht zur Produktion zugelassen werden. Die Wildform enthält als Ausgangsstamm des erfindungsgemäßen Verfahrens ein natürliches lolR-Gen.

Die genetisch veränderten Stämme beinhalten in ihrer Ausgangsform ebenfalls ein natürliches lolR-Gen. Unter einem genetisch veränderten Stamm im Sinne der Erfindung ist beispielsweise ein Stamm zu verstehen, der genetisch so verändert ist, dass Targets bzw. Zielgene des Regulators loIR vermehrt exprimiert werden. So können alle oder ein Teil der im myo-lnositol Stoffwechsel relevanten Gene, die für die Enzyme des myo-lnositol Stoffwechsel kodieren, überexprimiert werden. Hierzu können beispielsweise Gene ins Genom integriert werden, die für diese Enzyme kodieren und eine gesteigerte Expression dieser Gene erlauben. Die Gene können auch chromosomal eingeführt werden. Denkbar sind auch andere Aktivierungsmechanismen für die gesteigerte Expression von Enzymen des myo- lnositol Stoffwechsels, beispielsweise das Einbringen von stärkeren Promotoren und die Modulation der Translationseffizienz. Darüber hinaus kann auch die Stabilität von Enzymen des myo-lnositol Stoffwechsels erhöht sein.

Insbesondere können coryneforme Bakterien der Art Corynebacterium, Brevibacterium, insbesondere Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium thermoaminogenes, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum oder Brevibacterium divaricatum eingesetzt werden.

Bevorzugt sind coryneforme Bakterien, die ausgehend von der Wildform erfindungsgemäß verändert sind, beispielsweise werden die Wildformen

Corynebacterium glutamicum ATCC 13032

Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870

Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539

Brevibacterium flavum ATCC 14067

Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 und

Brevibacterium divaricatum ATCC 14020. eingesetzt. Die Aufzählung ist nicht einschränkend, sondern beispielhaft.

Besondere Vorteile bietet die Verwendung von Corynebacterium glutamicum als Produktionsorganismus, denn i) es handelt sich um einen„Generally Recognized As Safe" (GRAS)-Organismus, welcher in allen industriellen Bereichen eingesetzt werden kann;

ii) auf definierten Medien werden damit hohe Wachstumsraten und Biomasseerträge erreicht (Unthan et al., Biotechnol Bioeng, 2014, 1 11 (2): 359-371 ) und

iii) es existieren umfangreiche Erfahrung im industriellen Einsatz (Becker et al., Curr Opin Biotechnol, 2012, 23(4): 631 -640).

Die Teilinaktivierung, Inaktivierung oder die Teildeletion oder die komplette Deletion des myo-lnositol Stoffwechsel-Regulators loIR, insbesondere loIR (cg0196) in coryneformen Bakterien, vorzugsweise Corynebacterium glutamicum ATCC13032, bewirkt die Bildung von D-Xylonat aus D-Xylose. Diese bevorzugte Ausführungsform hat den Vorteil, dass sie als erfindungsgemäß veränderte Wildform keine Zulassungsbeschränkungen in der chemischen, pharmazeutischen oder Lebensmittelproduktion erfährt.

In der bevorzugten Ausführungsform ist das lolR-Gen komplett ausgeschaltet.

Dies kann vorzugsweise durch die komplette Deletion des lolR-Gens geschehen. Sofern die Inaktivierung des lolR-Gens komplett ist, kann dies auch durch Teildeletion bewirkt werden.

Eine komplette Inaktivierung des lolR-Gens kann auch durch andere, dem Fachmann bekannte Maßnahmen erfolgen. Beispielhaft können die geeignete Kulturführung, z.B. durch die Verwendung von myo-lnositol als Substrat/Induktor von loIR, Einfügen einer anderen DNA-Sequenz in den Genbereich vom lolR-Gen, insbesondere dem lolR-Gen cg0196, genannt werden. Als Genbereich im Sinne der Erfindung ist ein Bereich zu verstehen, in dem die Veränderung noch Einfluss auf die Aktivität des lolR-Gens hat. Dieser Bereich kann vor, nach oder im offenen Leseraster des lolR-Gens lokalisiert sein.

Eine komplette Inaktivierung kann auch durch eine komplette Ausschaltung der Genexpression von loIR durch genetische Veränderung (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression erfolgen. Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann z. B. in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Boyd und Murphy (Boyd et al., J Bacteriol, 1988, 170(12): 5949- 5952), bei Voskuil und Chambliss (Voskuil et al., Nucleic Acids Research, 1998, 26(15): 3584-3590), bei Jensen und Hammer (Jensen et al., Biotechnol Bioeng, 1998, 58(2-3): 191- 195), bei Patek et al. (Patek et al., Microbiology, 1996, 142 ( Pt 5): 1297-1309) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knip- pers („Molekulare Genetik", 8. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 2001 ) oder dem von Winnacker („Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990).

Mutationen, die zu einer Veränderung der funktionellen Eigenschaften von loIR führen, insbesondere zu einer veränderten Substratspezifität können ebenfalls zu einer kompletten Ausschaltung der Aktivität des lolR-Gens führen. Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen in Betracht, sowie Methoden der gerichteten Evolution. Anleitungen zur Erzeugung derartiger Mutationen und Proteine gehören zum Stand der Technik und können bekannten Lehrbüchern (R. Knippers„Molekulare Genetik", 8. Auflage, 2001 , Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland), oder Übersichtsartikeln (Pokala et al., J Struct Biol, 2001 , 134(2-3): 269-281 , Jaenicke et al., Angew Chem Int Ed Engl, 2003, 42(2): 140-142, Lilie, EMBO Rep, 2003, 4(4): 346-351 , Pei et al., Proc Natl Acad Sei U S A, 2003, 100(20): 1 1361-1 1366, Dokholyan, Proteins, 2004, 54(4): 622-628, Tramontano, Angew Chem Int Ed Engl, 2004, 43(25): 3222-3223) entnommen werden.

Die auf diese Weise erzeugten cor neformen Bakterien haben keinerlei lolR-Gen Aktivität und führen zu einer Produktion von enantiomerenreinem D-Xylonat einer hohen Ausbeute. Es handelt sich um die beste Ausführungsform der Erfindung, insbesondere die Komplett- deletion ist bevorzugt.

Bei Corynebacterium glutamicum ATCC13032 AloIR ist das loIR Gen cg0196 komplett dele- tiert.

In einer anderen Ausführungsform ist die Aktivität des lolR-Gens gemindert.

Dies kann auch durch Teildeletion bewirkt werden, sofern die Aktivität dadurch nicht komplett ausgeschaltet wird.

Eine teilweise Inaktivierung des lolR-Gens kann auch durch andere, dem Fachmann bekannte Maßnahmen erfolgen. Beispielhaft können die geeignete Kulturführung, z.B. durch die Verwendung von myo-lnositol als Substrat/Induktor von loIR, Einfügen einer anderen DNA-Sequenz in den Genbereich des lolR-Gens, insbesondere des lolR-Gens cg0196 genannt werden. Als Genbereich im Sinne der Erfindung ist ein Bereich zu verstehen, in dem die Veränderung noch Einfluss auf die Aktivität des lolR-Gens hat. Dieser Bereich kann vor, nach oder im offenen Leseraster des lolR-Gens lokalisiert sein.

Eine teilweise Inaktivierung kann auch durch eine teilweise Ausschaltung der Genexpression von loIR durch genetische Veränderung (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression erfolgen. Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren. Hierzu können grundsätzlich die gleichen Verfahren angewendet werden, wie bei der Komplettdeletion.

Mutationen, die zu einer Veränderung der funktionellen Eigenschaften von loIR führen, insbesondere zu einer veränderten Substratspezifität können ebenfalls zu einer teilweisen Ausschaltung der Aktivität des lolR-Gens führen. Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen in Betracht, sowie Methoden der gerichteten Evolution. Auch hier können die oben genannten Methoden eingesetzt werden.

Die angegebenen erfindungsgemäßen genetischen Veränderungen führen zu den erfindungsgemäßen coryneformen Bakterien sowie bei Isolation zu dem erfindungsgemäßen Genom.

Das lolR-Gen cg0196 ist im Sequenzprotokoll Nr.1 angegeben.

Ein lolR-Gen eines coryneformen Bakteriums ATCC13032 mit offenem Leseraster ist in Sequenz Nr. 2 dargestellt.

Überraschenderweise bewirkt die Inaktivierung des lolR-Gens auf definiertem Medium mit einer Kohlenstoff- und Energiequelle für Wachstum, z.B. D-Glucose, und D-Xylose als weitere Kohlenstoff- und Energiequelle die Bildung von D-Xylonat. Dieses kann von coryneformen Bakterien natürlicherweise nicht verstoffwechselt werden, akkumuliert daher im Medium und kann anschließend aus diesem aufgereinigt werden.

Die erfindungsgemäß veränderten Organismen von coryneformen Bakterien produzieren D- Xylonat bzw. D-Xylonsäure zu 100 % enantiomerenrein bei einer hohen Ausbeute. Das auf diesem Weg erzeugte erfindungsgemäße Genom befähigt coryneforme Bakterien D-Xylonat bzw. D-Xylonsäure mit einer hohen Ausbeute und einer Enantiomerenreinheit von 100 % herzustellen.

Die Produktion des D-Xylonats mit den erfindungsgemäßen coryneformen Bakterien kann mit bekannten, im Labor oder in der Produktion üblichen fermentativen Verfahren durchgeführt werden.

Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im Batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im Fed-Batch (Zulaufverfahren) oder Repeated-Fed-Batch (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der D-Xylonat-Produktion kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991 )) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben. Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Mikroorganismen genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedenner Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981 ) enthalten.

Neben D-Xylose als Ausgangssubstrat der D-Xylonatbildung können als Kohlenstoffquelle für Wachstum Zucker und Kohlenhydrate wie z.B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Besonders bevorzugt ist das CGXII Medium (Unthan et al., Biotechnol Bioeng, 2014, 1 1 1 (2): 359-371 ) mit D-Xylose und D-Glucose als Kohlenstoff- und Energiequellen. Damit können hohe spezifische Wachstumsraten für Corynebacte um glutamicum ATCC13032 von bis zu 0.61 h ^"1 erreicht werden. Darüber hinaus gewährleistet der Einsatz des CGXII Mediums eine einfache Abtrennung des Zielproduktes D-Xylonat aus dem Kulturüberstand, z. B. durch eine Ethanolfällung mit anschließender Vakuumtrocknung (Liu et al., Bioresource Technology, 2012, 1 15: 244-248). Das einfache Medium ist Bestandteil der Aufgabe, die zu lösen ist.

Als Stickstoffquelle können organische, stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Als Phosphorquelle können Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden natriumhaltigen Salze verwendet werden.

Weiterhin sollte das Kulturmedium Salze von Metallen enthalten wie z.B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind.

Schließlich können essentielle Wuchsstoffe, wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden.

Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter weise während der Kultivierung zugefüttert werden.

Zur pH - Kontrolle der Kultur können basische Verbindungen wie beispielsweise Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak oder saure Verbindungen wie Salzsäure, Phosphorsäure g oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt werden. Ein bevorzugter pH-Bereich für das Zellwachstum liegt zwischen 6 und 8.

Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z.B. Fettsäurepolyglyko- lester eingesetzt werden.

Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten werden vorzugsweise Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasmischungen wie z.B. Luft in die Kultur eingetragen.

Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C.

Die Kultur wird vorzugsweise solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum an D-Xylonat gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.

Die Figuren zeigen experimentelle Ergebnisse aus den Beispielen, die die erfindungsgemäßen Vorteile belegen.

Es zeigt:

Fig: 1 Kultivierungsverläufe für den Stamm Corynebacterium glutamicum AloIR

Fig.2: GC-ToF-MS Spektrum eines aufgereinigten Präzipitats

In Figur 1 sind die Kultivierungsverläufe für den Stamm Corynebacterium glutamicum AloIR in den Teilfiguren A) und B) dargestellt. Dabei sind die Abszissen der Graphiken in allen Teilfiguren die Zeit in Stunden h. Die Ordinaten der ersten Reihe bedeuten die Menge von D-Xylose sowie D-Glucose in Millimolar [mM].

Die Ordinaten der zweiten Reihe bedeuten die Biomasse in Gramm pro Liter [g/L] und die Ordinaten der dritten Reihe bedeuten die Menge von D-Xylonat in Millimolar [mM].

Teilfigur 1 A zeigt die Kultivierungsverläufe für den Stamm C. glutamicum AloIR im Batch- Prozess. Es wurde ein finaler Titer an D-Xylonat von 9.2 ± 0.6 g/L erreicht. Die spezifische Ausbeute sowie Produktionsrate betragen Y _P/S = 0.49 ± 0.01 g D-Xylonat g D-Xylose bzw. 0.30 ± 0.02 g/(L h). Teilfigur 1 B zeigt die Kultivierungsverläufe für den Stamm C. glutamicum AloIR im Fed-Batch-Prozess. Es wurde ein finaler Titer an D-Xylonat von 20.0 ± 1.0 g/L erreicht. Die spezifische Ausbeute sowie Produktionsrate betragen Y _{P S} = 0.51 ± 0.02 g D- Xylonat/ g D-Xylose bzw. 0.45 ± 0.02 g/(L h). Figur 2 zeigt das Spektrum des aufgereinigten Präzipitat^, welches mittels GC-ToF-MS- Analyse erzeugt wurde (Paczia et al., Microbial Cell Factories, 2012, 1 1 ). In ihr ist in der Ordinate die relative Peakintensität gegen die chromatographische Laufzeit als Abszisse aufgetragen.

Beispiele:

Im Folgenden werden experimentelle Belege als Beispiele angeführt, die nicht einschränkend auszulegen sind.

Zur Generierung des Stammes C. glutamicum AloIR wurde das Gen loIR im Leseraster („in- frame') deletiert, um die Expression stromabwärts liegender Gene möglichst nicht zu beeinträchtigen. Dazu wurde zunächst eine cross-over PCR durchgeführt. In zwei ersten PCRs wurden zwei jeweils 400 bp lange stromabwärts und stromaufwärts liegende, flankierende DNA-Bereiche des zu deletierenden Gens getrennt amplifiziert. Die dazu verwendeten Oli- gonukleotide (iolR_DF1_for CCCAAGCTTGAGGTACTTGCCGAAAGATTG (Hindill), i- olR_DF1_rev CTCGATTACTTGGCCGGAGGGCTACTTGGAAGTAGAGG, iolR_DF2_for TCCGGCCAAGTAATCGAG, iolR_DF2_rev CGGGATCCATCGCGTTGGCATTCTTC (Bam- Hl)) wurden so modifiziert, dass die entstandenen PCR-Fragmente am 5 ^' -Ende jeweils mit einer 18 Nukleotid langen homologen Sequenz verbunden waren, die bei den Fragmenten zueinander komplementär war. Zur cross-over PCR fanden die Produkte der ersten PCRs als DNA-Matrize Verwendung, wobei über den komplementären Bereich während der Reaktion eine Anlagerung stattfand. Durch Einsatz der äußeren Primer entstand so das Deletions- konstrukt, das in den Vektor pK19mobsacB kloniert wurde. Nach Transformation dieses nicht frei replizierbaren Vektors in C. glutamicum und anschließender Selektion auf die durch pK 9mobsacB-AiolR2 vermittelte Kanamycinresistenz wurden Klone isoliert, in denen das Plasmid durch homologe Rekombination in das Chromosom integriert war. Durch Kultivierung dieser Zellen in Vollmedium ohne Kanamycin konnte ein zweites Rekombinationsereignis über die jetzt im Chromosom doppelt vorliegenden DNA-Bereiche erfolgen. Die Bakterienkultur wurde in verschiedenen Verdünnungen auf LB-Medium mit 10 % Saccharose ausplattiert. Aufgrund der durch sacB auf pK19mobsacB-AiolR2 kodierten Levan-Sucrase wurde Saccharose zu Levan polymerisiert. Dieses Polymer wiederum führte zur Letalität. So konnten nur solche Klone wachsen, die das Plasmid durch die zweite Rekombination verloren hatten. Bei den dann Saccharose-resistenten und Kanamycin-sensitiven Klonen war entweder die genetische Wildtyp-Situation wieder hergestellt oder das gewünschte Gen deletiert. Die Bestätigung der Deletion im Genom von C. glutamicum erfolgte über die PCR mit Pri- mern, die zu einem Bereich außerhalb des Gens komplementär waren (K_DiolR_for GCACGTTATGACCTGCAAACTC, K_DiolR_rev TACGGTCTGGCTATCTACATCC).

Der auf diese Weise erzeugte Stamm C. glutamicum AloIR wurde im Batch und Fed-Batch- Verfahren in 1.5 L Bioreaktoren (DASGIP AG, Jülich, Germany) bei 30°C und einem konstanten Begasungsrate von 1 vvm kultiviert. Durchgehend aerobe Bedingungen (>30 % Gelöst-Sauerstoff) wurden über den Sauerstoffeintrag mit Anpassung der Rührerdrehzahl (400 - 1200 rpm) erreicht. Der pH-Wert im Kultivierungsmedium wurde konstant auf pH 7.1 mit 5 M H ₃ PO4 und 5 M NH ₄ OH geregelt. Der Batch-Prozess wurde in zwei unabhängigen Reaktoren aus einer Übernacht-Vorkultur auf CGXII Medium (Unthan et al., Biotechnol Bioeng, 2014, 1 11 (2): 359-371 ) mit 40 g/L D-Glucose auf eine OD von 1 in CGXII-Medium ohne Harnstoff und mit 10 g/L D-Glukose sowie 30 g/L D-Xylose angeimpft. Der Fed-Batch- Prozess wurde in zwei unabhängigen Reaktoren aus einer Übernacht-Vorkultur auf CGXII Medium mit 40 g/L D-Glucose auf eine OD von 1 in CGXII-Medium ohne Harnstoff und mit 20 g/L D-Glukose sowie 40 g/L D-Xylose angeimpft. Nach einer Prozesszeit von 20 h mit Einsetzen der Glucose-Limitation wurde ein kontinuierlicher Feed mit 100 g/L D-Glucose und einer Rate von 2.5 mL/h (Reaktor 1 ) bzw. 5 mUh (Reaktor 2) gestartet. Alle Kultivierungen wurden in regelmäßigen Abständen beprobt, die Proben wurden zentrifugiert und der resultierende zellfreie Überstand wurde für die Substrat- und Produktanalytik verwendet. Für die Substratanalytik (D-Glucose bzw. D-Xylose) wurden zwei enzymatische Assays angewendet (Unthan et al., Microb Cell Fact, 2015, 14: 32) und das Produkt (D-Xylonat) wurde mittels HPLC (300 x 8 mm Organische Säure Säule, CS Chromatographie, Langerwehe, Germany) bei 80°C und einer isokratischen Elution mit 0.1 M H ₂ S0 und einer Flussrate von

0.6 mL/min über einen DAD-Detektor (Agilent, Santa Clara, CA, USA) quantifiziert.

Am Ende der Fed-Batch-Kultivierung wurde ein Reaktor komplett zur Produktaufreinigung und -analyse abgeerntet. Für die Produktaufreinigung wurde ein bestehendes Protokoll (Liu et al., Bioresource Technology, 2012, 115: 244-248) wie folgt angewendet: 1. Zellabtrennung mittels Zentrifugation (4500 rpm für 10 min bei 4°C); 2. Entkolorisierung des resultierenden Überstandes in aktiviertem Kohlenstoff (AC); 3. Filtration des AC-behandelten Überstandes (0.22 μιτι) und Aufkonzentrierung mittels Rotationsverdampfer (100 mbar, 60°C Wasserbad); 4. Filtration des Konzentrats (0.22 pm) und Präzipitation von D-Xylonat durch Zugabe von EtOH (3:1 , v/v); Vakuumtrocknung des Produktes für mindestens 12 h bei -10°C.

Gensequenz von loIR mit offenem Leseraster (fett) sowie 250 bp up und downstream. CCCTCGCTTTGGAAGGTGCGGGGTTAACAAAGTTGCACGTTATGACCTGCAAAC

TCTGCCCTTTTCACTAAGTTTCGCTACTCATTCCCTAATGCAAGTGATAATGTCA

GATCAATAAAAGCCCTGGATGACACAAAAGTCCTGCATGAACACGGATTTACCA

AGACCACCACCCGCAACTCAGTTACATTGTTCAAATGTCCTAACACATTTACATG

AGCTTGTTGGGTGGGCAACGAAAGGAGACATCATGACCACCGAAGCTCCCATT

TGGCCAGCCGAACTCTTCGAAGACCTCGACCGCAACGGACCAATCCCCCTCT

ACTTCCAAGTAGCCCAACGCCTCGAAGACGGCATCCGCAGCGGAGTCCTCCC

ACCCGGAGCACGCCTAGAAAACGAGATCTCCGTGGCGAAACACCTCAACGTA

TCCCGCCCCACCGTCCGACGCGCCATCCAAGAAGTCGTAGACAAAGGCCTCT

TAGTTCGCCGCCGCGGTGTTGGCACCCAGGTCGTCCAAAGCCACGTCACCCG

CCCAGTCGAACTGACCAGTTTCTTCAACGACCTCAAAAACGCCAACCTGGACC

CCAAAACCCGAGTCCTCGAGCACCGCCTCCTTGCAGCAAGTTCCGCCATCGC

AGAAAAACTCGGAGTTTCCGCAGGTGACGAAGTCCTCCTCATCCGCCGCCTC

CGCTCCACCGGAGACATCCCCGTAGCGATCCTGGAAAACTACCTCCCCCCAG

CGTTCAACGACGTCTCCCTCGACGAACTAGAAAAGGGTGGACTCTACGATGC

GCTGCGCAGCCGAGGTGTTGTCTTAAAAATCGCCAACCAGAAAATCGGTGCG

CGCCGAGCAGTCGGTGAAGAAAGCACCCTCCTCGACATCGAAGACGGCGGA

CCACTTCTCACCGTCGAACGCGTTGCATTGGATAATTCCGGCCAAGTAATCGA

GTTGGGAAGCCACTGCTACCGCCCAGATATGTACAACTTTGAAACCACTCTGG

TGGCCAGGTAAGAAATAAACCAAAGAGCCCTTCTGAACTGGAGCTCTTGGTCTG

ATATGGCATTTTCAAGGCTGGAAAACTGCTCTATCAGACCAAACGGATGCTGAA

TTTCAGGGTCTTTGGTCTGGATATGCAGCAGCGCTCCAAGGCGTCGAGTTTCTC

AAACGAGCATTGGTATCGATGACACCCTGAAAGGCCCTTAGAAGCGATTCTGTG

AGGTCGAGTTCCCAGGGTTTGAGTGCAAG I I I I I I ACGTGAA