Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Futter- mittelzusatzes, in welchem ein Fermentationsmedium, enthaltend mindestens eine Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, Vitamine, Makro- und Mikroelemente, mit einer Hefekultur inokuliert wird, das mit der Hefekultur inokulierte Fermentationsmedium in einem Fermenter bei Temperaturen zwischen 25°C und 35°C für mehrere Stunden inkubiert und autolysiert wird, wobei die Autolyse über einen Zeitraum von mehreren Stunden bei einem leicht sauren pH-Wert und bei Temperaturen zwischen 25°C und 80°C durchgeführt wird, und anschließend einem Aufkonzentrierungs- oder Abtrennschritt und einen Trockenschritt unterworfen wird. Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf einen gesundheits- bzw. leistungsfördernden Futtermittelzusatz für Tiere, enthaltend mindestens eine Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, Vitamine, Makro- und Mikro- elemente und eine inokulierende, aufkonzentrierte und getrocknete Hefekultur.

Die zunehmende Industrialisierung der landwirtschaftlichen Nutztierhaltung und damit verbunden die Intensivtierhaltung führten zu einer großen Steigerung der Produktivität und somit zu einer kostengünstigeren Erzeugung tierischer Produkte. Mit diesen wirt- schaftlichen Aspekten verbunden ist jedoch die Problematik, daß eine hohe Anzahl von

Tieren auf engem Raum gehalten wird, wodurch diese Tiere einem hohen Krankheitsdruck ausgesetzt sind. Dieser Problematik wurde durch Einsatz von Antibiotika begegnet, wobei durch die exzessive Gabe von Antibiotika eine Anreicherung von gegen Antibiotika resistenten Mikroorganismusstämmen in den Exkrementen der Nutz- tiere herausgebildet wurde, so daß die Gefahr besteht, daß eine Verbreitung und Weitergabe der Resistenzgene aus den Mikroorganismen der Fäkalfiora von Nutztieren auf andere Keime bis zu humanpathogenen Bakterien erfolgen könnte. Aus diesem Grund wurde am 1. Jänner 2006 ein EU-weites Verbot von Antibiotika als Wachstumsförderer in Futtermitteln erlassen, um die Antibiotikaresistenzen in Bakterien zu be- kämpfen.

Die meisten durch Bakterien verursachten Infektionen im Verdauungstrakt von Tieren beginnen mit der Anlagerung von Bakterien an das Epithelgewebe des Wirts, wobei Glycoproteinstrukturen das Anwachsen von Bakterienkolonien ermöglichen. Diese Glycoproteinstrukturen binden an spezifische, komplementäre Kohlenhydratstrukturen, wobei Hefezellwände, welche teilweise aus Mannan bestehen, die Eigenschaft besit- zen, mit verschiedenen Bakterienstämmen zu agglutinieren. Weiterhin wurde bekannt, daß Pektin und saure Oligogalacturonide aus Pektinen diese Anhaftung von Bakterien blockieren können. Darüber hinaus wurde gefunden, daß pathogene Keime sich nicht nur in an sich bekannter Weise an Hefen bzw. Hefezellwandprodukte binden können, sondern sich auch an Galacturonsäure bzw. Galacturonsäurederivate binden können.

So ist beispielsweise aus der DE-A 4330773 die Blockierung der Anlagerung von Keimen an menschliche Zellen mit einem pharmazeutischen Präparat, welches als Wirkstoff ein Galacturonid enthält und die Verwendung dieses Präparats zur Blockierung der Anlagerung von Keimen an Säugerzellen bekannt geworden. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß verschiedene Pflanzenprodukte die Adhärenz pathogener Keime, wie beispielsweise E. coli an Epithelzellen des Magen-Darm- und Urogenitaltrakts, aufgrund des Vorhandenseins von Pektinen in den Pflanzenprodukten, wesentlich reduzieren können.

Der WO 03/011310 ist entnehmbar, daß Hefezellwandbestandteile, welche Mannan- Oligosaccharide enthalten, im Tierversuch Kokziodose entgegenwirken können.

Schließlich wurde von der Anmelderin die Fähigkeit von Hefezellwandprodukte enthal- tenden Futtermittelzusätzen in bezug auf die Bindungsfähigkeit von spezifischen Salmonella ssp. Keimen untersucht, wobei Hefezellwandfraktionen, die von Trichosporon mycotoxinivorans abgeleitet sind, zum Einsatz gelangten. Bei diesen Versuchen konnte gezeigt werden, daß Hefezellwandfraktionen Salmonella ssp. in vitro stark binden können.

Die vorliegende Erfindung zielt nun darauf ab, die Vorteile des Einsatzes von Hefezellwandprodukten und jene von Pektinen bzw. Galacturonsäuren bzw. Galacturonsäure- derivaten bei der Bekämpfung von pathogenen Keimen im Magen-Darm-Trakt zu nutzen und ein Verfahren zur Herstellung eines ausschließlich auf natürlichen Substanzen beruhenden Futtermittelzusatzes sowie einen derartigen Futtermittelzusatz zur Verfügung zu stellen, welcher eine gegenüber dem Einsatz von Hefezellwandprodukten und Galacturonsäurederivaten deutlich verbesserte Wirksamkeit gegenüber pathogenen Keimen aufweist. Zur Lösung dieser Aufgabe ist das erfindungsgemäße Verfahren im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, daß dem Fermentationsmedium Pektine, Pektinbestandteile, Pektinderivate oder eine pektinhaltige Zubereitung, enthaltend wenigstens eine Substanz aus der Gruppe der Polyuronide, Polygalacturonsäure, a-D-Galacturonsäure oder einer Mischung davon zugesetzt wird. Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß, wenn Hefen auf Pektinen oder deren Derivaten fermentiert werden, die resultie- renden Fermentationsprodukte eine gegenüber dem Summeneffekt der Bindungsfähigkeit von Hefezellwandprodukten und Pektinen hinausgehende Bindungsfähigkeit für pathogene Keime aufweisen. In überraschender Weise bleibt diese verbesserte Patho- genbindung auch nach Aufarbeitung, d.h. nach Waschen und einer Säurebehandlung der Hefen bestehen und ist somit eindeutig nicht durch die additive Wirkung von Hefen und Pektinderivaten verursacht.

Die erfindungsgemäße Verfahrensführung ist vom Stand der Technik grundsätzlich verschieden, da üblicherweise versucht wird die Anwesenheit von Pektinen oder pektinähnlichen Substanzen in der Fermentation zu vermeiden, da dadurch einerseits das Fermentationsmedium dickflüssig wird und schwer zu bearbeiten ist, andererseits das Fermentationsprodukt von Pektinen Methanol ist, welcher sowohl für menschlichen als auch tierischen Genuß unerwünscht bzw. ungeeignet ist.

Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung der vorliegenden Erfindung wird das Verfah- ren so geführt, daß dem Fermentationsmedium Pektine, Pektinbestandteile und/oder Pektinderivate in einer Menge von 0,25 g/l bis 20 g/l, insbesondere von 1 g/l bis 4 g/l zugesetzt werden. In einer derartigen Verfahrensführung gelingt eine besonders starke Verbesserung der Bindungsfähigkeit der mit Pektinderivaten fermentierten Hefezellwandprodukte und es kann eine besonders stark verringerte Adhärenz von pathogenen Keimen an den Epithelzellen des Magen-Darm-Trakts von Tieren beobachtet werden. Gleichzeitig können bei einer derartigen Verfahrensführung die negativen Wirkungen von Pektinen auf die Fermentation niedrig gehalten werden.

Indem, wie dies einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung entspricht, das Verfahren so geführt wird, daß die Pektine, Pektinbestandteile und/oder Pektinderivate einem Fermentationsmedium enthaltend 15 g/l bis 45 g/l sterilisierte Melasse zugesetzt werden, gelingt es, eine industrielle Fermentation in Flüssigkultur unter sterilen Bedingungen durchzuführen, wobei insbesondere aufgrund des Einsatzes eines definierten Mediums das Verfahren so geführt werden kann, daß die Pathogenbindungseigen- schaft der in dem Verfahrensendprodukt enthaltenen Hefezellwände bedeutend erhöht werden können, so daß insbesondere bei Einsatz eines mit einem derartigen Verfahren hergestellten Futtermittels im Verdauungstrakt von nicht wiederkauenden Tieren, wie Schweinen, Hühnern und dgl. deutlich verbessert werden kann.

Besonders hohe Bindungsraten von bekannten Magen-Darm-Erkrankungen hervorru _: fenden pathogenen Keimen, wie E. coli oder Salmonella typhimurium, können dadurch erreicht werden, daß das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt so geführt wird, daß in der Hefekultur wenigstens eine Hefe, gewählt aus der Gruppe Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Trichosporon mycotoxinivorans, Klyveromyces lactis, Candida utilis und Rhodutorula sp. eingesetzt wird. Betreffend die Hefen aus dieser Gruppe hat sich herausgestellt, daß die Ergebnisse noch weiter verbessert werden können, wenn spezielle Stämme, nämlich Saccharomyces cerevisiae DSM 22708, Trichosporon mycotoxinivorans DSM 14153, Klyveromyces lactis DSM 22709, Candida utilis DSM 22710 und Rhodutorula sp. eingesetzt werden, wie dies einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung entspricht. Bei einer derartigen Verfahrensführung können die Fermentationsprodukte unmittelbar nach der Aufarbeitung und ohne weitere Behandlung z.B. als Futtermittelzusatz eingesetzt werden, wobei die Bindungsfähigkeit der mit den Pektinen bzw. Pektinbestandteilen gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren fermentierten Hefezellwandprodukte gegenüber herkömmlichen mit Hefezellwandprodukten bzw. Pektinen versetzten Futtermitteln deutlich überlegen ist. Bei einer Untersuchung der mit Pektinen bzw. Pektinbestandteilen fermentierten, speziellen Hefen konnte nachgewiesen werden, daß Bestandteile der Pektine, insbesondere Glucu- ronsäurereste und deren Derivate in die Mannanketten der Hefezellwände eingebaut wurden und dadurch die Bindungsfähigkeit der Hefezellwände an pathogene Keime signifikant verbessert wurde. Weiterhin wird durch Auswahl der Hefen aus den erfin- dungsgemäßen Gruppen bzw. durch Auswahl spezifischer Stämme die Bindungsfähigkeit gegenüber pathogenen Keimen noch weiter verbessert, so daß insbesondere die mit einem derartigen Futtermittelzusatz gefütterten Tiere eine erhöhte Leistungsfähigkeit im Vergleich zu mit herkömmlichen Futtermittelzusätzen und auch zu mit Antibiotika gefütterten Tieren besitzen.

Eine noch weitere Verbesserung der Bindungsfähigkeit der mit Pektinen fermentierten Hefezellwandprodukte kann gemäß einer bevorzugten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens dadurch erzielt werden, daß das Fermentationsmedium nach einem Abtrennen von flüssigen Bestandteilen und vor dem Trockenschritt einer Säure- behandlung unterworfen wird. Um die Hefezellwandprodukte, insbesondere die mit Pektinbestandteilen bzw. mit Pektinen fermentierten Hefezellwandprodukte durch die Säurebehandlung nicht zu schädigen, wird das erfindungsgemäße Verfahren bevor- zugt so geführt, daß die Säurebehandlung durch Resuspendieren von festen Bestandteilen des Fermentationsmediums, insbesondere Hefezellwänden, in einer verdünnten organischen Säure, wie z.B. Essigsäure, Zitronensäure oder Ameisensäure vorgenom- men wird. Bei einer Säurebehandlung mit verdünnten, organischen Säuren, wie Essigsäure, Zitronensäure oder Ameisensäure, insbesondere bei einer Inkubation bei erhöhten Temperaturen, beispielsweise 50°C bis 80°C, konnte die Bindungsfähigkeit gegenüber einzelnen pathogenen Stämmen noch weiter verbessert werden. Das die erhöhte Bindungsfähigkeit von pathogenen Keimen durch einen Einsatz von verdünnten, schwachen, organischen Säuren erzielt werden kann, ist dahingehend überraschend, da säurebehandelte Produkte üblicherweise von unerwünschten Nebenprodukten gereinigt sind, jedoch keine verbesserte Bindungsfähigkeit zeigen. Im vorliegenden Fall wird angenommen, daß durch die Säurebehandlung die Bindungsfähigkeit der Hefezellwände an pathogene Keime noch weiter verbessert ist, so daß mit dem erfindungsgemäßen Futtermittelzusatz bei Einsatz kleiner Mengen sehr hohe Bindungsraten der pathogenen Keime erzielt werden.

Die vorliegende Erfindung zielt weiters darauf ab, einen Futtermittelzusatz, mit welchen pathogene Keime gebunden bzw. immobilisiert werden können, zur Verfügung zu stellen. Zur Lösung dieser Aufgabe ist der erfindungsgemäße Futtermittelzusatz dadurch gekennzeichnet, daß weiters eine unter Zusatz von Pektin, Pektinbestandteilen, pektinhaltigen Zubereitungen, gewählt aus der Gruppe der Polyuronide, Polygalacturon- säure, a-D-Galacturonsäure oder einer Mischung davon, fermentierte Hefe sowie we- nigstens ein Träger enthalten sind. Indem eine mit Zusatz von Pektin, Pektinbestandteilen bzw. pektinhaltigen Zubereitungen, fermentierte Hefe sowie wenigstens Träger enthalten sind, gelingt es, einen Futtermittelzusatz herzustellen, welcher im Vergleich mit sowohl nicht fermentierten Pektinbestandteilen als auch mit nicht unter Zusatz von Pektinen oder Pektinderivaten fermentierten Hefekulturen eine bedeutend höhere Bin- dungsfähigkeit gegenüber pathogenen Keimen des Magen-Darm-Trakts aufweist und überdies aus ausschließlich natürlichen Bestandteilen besteht, weshalb für einen derartig verwendeten Futtermittelzusatz keinerlei Sperrfristen von Seiten der EU bestehen. Indem zusätzlich wenigstens ein Träger enthalten ist, kann eine weitere Verbesserung der Aufnahme von pathogenen Keimen durch Immobilisierung auf dem Träger erzielt werden, so daß in der Folge die Leistungsfähigkeit der Nutztiere gesteigert werden kann. Indem, wie dies einer bevorzugten Weiterbildung der vorliegenden Erfindung entspricht, zusätzlich wenigstens ein Mikroorganismus, gewählt aus Eubacterium sp. DSM 11798, Enterococcus faecium DSM 19764, DSM 3530, DSM 16211 und DSM 21913, Lactobacillus salivarius DSM 21286 und DSM 16351 , Bifidobacterium thermophilium DSM 19765, Bifidobacterium animalis DSM 16284, Pediococcus acidilactici DSM 16210, Lactobacillus sobrius DSM 21285, Lactobacillus reuteri DSM 21288 und DSM 21443 enthalten ist, kann die Bindungsfähigkeit des verwendeten Futtermittelzusatzes gegenüber pathogenen Keimen noch weiter verbessert werden, insbesondere kann die Leistungsfähigkeit der Tiere noch weiter erhöht werden.

Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung der vorliegenden Erfindung ist der erfindungsgemäße Futtermittelzusatz dadurch gekennzeichnet, daß als Träger Bentonite, Zeo- lithe, Calciumkarbonat, Magnesiumkarbonat, Albumin, Stärke, Süßmolkepulver, Malto- dextrine, Lactose, Inulin, Dextrosen, oder als Träger einsetzbare Nährsubstanzen und/oder prebiotische Substanzen, gewählt aus Fructo-Oligosacchariden, Inulinen, Iso- malto-Oligosacchariden, Lactitol, Lactosucrose, Lactulose, Pyrodextrinen, Soja-Oligo- sacchariden, Transgalacto-Oligosacchariden, Xylo-Oligosacchardien, Vitaminen enthalten sind. Indem dem erfindungsgemäßen Futtermittelzusatz spezifische Träger bei- gefügt werden, gelingt es, einen an den spezifischen Einsatzzweck angepaßten Futtermittelzusatz zur Verfügung zu stellen, wobei beispielsweise bei Einsatz von als Träger verwendbaren Nährsubstanzen und/oder probiotischen Substanzen die Leistungssteigerung von Nutztieren noch weiter erhöht werden kann. Um die Bindungsfähigkeit gegenüber pathogenen Keimen des erfindungsgemäßen Futtermittelzusatzes noch weiter zu erhöhen, wird gemäß einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung so vorgegangen, daß im Fermentationsmedium Zubereitungen aus pektinhaltigen Pflanzen bzw. pektinhaltigen Pflanzenbestandteilen, wie Isländisch Moos, Erdbeerblätter, Kranbeeren, Karotten, Äpfel, Apfeltrester oder dgl., enthalten sind. Indem in dem Fermentationsmedium Zubereitungen aus pektinhaltigen Pflanzen bzw. pektinhaltigen Pflanzenbestandteilen enthalten sind, insbesondere Zubereitungen aus Pflanzen, welche einen hohen Pektingehalt aufweisen, wie z.B. Isländisches Moos, Erdbeerblätter, Kranbeeren, Karotten, Äpfel, Apfeltrester und dgl., wird eine weitere Verbesserung des Anhaftens von pathogenen Keimen an dem Futtermittelzusatz er- zielt. Insbesondere wird bei Zusatz von derartigen Zubereitungen aus pektinhaltigen Pflanzen sichergestellt, daß keinerlei synthetische bzw. halbsynthetische Produkte in dem Futtermittelzusatz enthalten sind, so daß ein derartiger Futtermittelzusatz auch in der biologischen Landwirtschaft einsetzbar ist.

Mit einem derartigen Futtermittelzusatz gelingt eine deutliche Leistungssteigerung von Tieren und überdies werden die Ausfälle in Zuchtbetrieben deutlich herabgesetzt.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Beispiel 1 : Fermentationsversuche

Eingesetzte Mikroorganismen: Saccharomyces cerevisiae (DSM 22708), Trichosporon mycotoxinivorans (DSM 14153), Saccharomyces boulardii BIO 235 und BIO 236, Klyveromyces lactis (DSM 22709) und Candida utilis (DSM 22710).

Alle Fermentationen wurden in 1 I Schikanekolben durchgeführt. Die Medienbestand- teile wurden in 350 ml destilliertem Wasser gelöst, mit 2-3 Tropfen Antischaummittel versetzt und mit NaOH oder H ₃ P0 ₄ , z.B. bei Saccharomyces-Fermentation auf pH 5,6 und bei Trichosporon mycotoxinivorans-Fermentation auf pH 4,5 eingestellt und 21 min bei 121°C autoklaviert. Die Fermentationsmedien wurden unter sterilen Bedingungen mit 2 ml Hefekultur inokuliert und in einem Schüttelinkubator bei 30°C und 130 U/min 21 h bis 24 h fermentiert. Die Fermentation wurde beendet, wenn die OD einer 1:10- Verdünnung der Fermentationsbrühe mit physiologischer Kochsalzlosung bei einer Wellenlänge von 650 nm über 1 ,0 lag.

Danach wurden die Hefen entweder direkt auf ihre Bindungsfähigkeit gegenüber patho- genen und probiotischen Keimen untersucht, oder zuerst autolysiert. In beiden Fällen wurden die Fermentationsbrühen abgetrennt und das erhaltene Pellet in destilliertem Wasser resuspendiert. Im Falle der Autolyse erfolgte eine Inkubation in Phosphatpuffer z.B. bei 50°C, 24 h. Die Zellwände wurden nach der Autolyse abgetrennt, ggf. mit Essigsäure behandelt, und auf ihre Bindungseigenschaften gegenüber den nachfol- gend genannten Keimen untersucht.

Hierzu wurden 1 %ige Hefe-Zellwandsuspensionen oder Zellsuspensionen in PBS Puffer hergestellt und Verdünnungsreihen erstellt. Je 100 μΙ wurden in Mikrotiterplatten- wells bzw. -Vertiefungen überführt und für einige Stunden inkubiert; danach wurden 100 μΙ einer 3 h alten E. coli, Salmonellen- oder Milchsäurebakterienkultur in einer Verdünnung im Bereich von 10 ^"1 bis 0 ^"8 in gewaschene und mit 300 μΙ BSA (1 %ig) be- schichtete (1 h, 4°C) und wieder gewaschene Wells überführt. Die Platten wurden 1 h bei 37°C inkubiert und danach gewaschen, um die Keimsuspension zu entfernen. Nur an Hefezellen oder Hefezellwände gebundene Keime blieben in der Vertiefung erhalten. Nach Zugabe von je 200 μΙ Trypton-Soja-Medium zu jedem Well und im Vergleich zu frisch aufgetragenen Verdünnungsreihen der jeweils zu messenden Keime wurde über einen Zeitraum von 18 h und mit Messungen im Abstand von jeweils 15 min die Wachstumskurve der jeweiligen Keime im Vergleich zu Kontrollkulturen erstellt. Zur Berechnung der Anzahl der an die Hefezell- und Hefezellwandproben gebundenen Keime wurde die Detektionsschwelle des exponentiellen Wachstums herangezogen und mit den Vergleichsproben verglichen. Es wurde der Mittelwert aus drei Wiederholungen ermittelt. Im Fall, daß dieser Mittelwert aufgrund der Meßungenauigkeit über dem Kontrollwert lag, d.h., daß keine Bindung erfolgte bzw. bei einer errechneten Bindung von weniger als 1 %, erfolgt die Darstellung in Tabelle 1 durch„—„, d.h., keine Bindung. Die Angabe„n.a.„ bedeutet nicht analysiert.

Eingesetzte Testkeime:

Pathogene: Escherichia coli (E. coli), Salmonella typhimurium (S. typhimurium, S. typh.)

Milchsäurebakterien: Enterococcus faecium IMB 53 (IMB 52), Lactobacillus salivarius (L. sal.)

Tabelle 1

g/l, Hefeextrakt: 10 g/l

Aus Tabelle 1 ist ersichtlich, daß die Bindungseigenschaft für pathogene Keime von Produkten gemäß der vorliegenden Erfindung deutlich über jener lag, welche nicht durch Zusatz von Pektinen oder Pektinderivaten im Medium fermentiert wurden.

Beispiel 2: Fermentation verschiedener Saccharomvces cerevisiae Stämme und Vergleich der Pathogenbindungseigenschaften in Abhängigkeit von der Anwesenheit von Pektin.

Fünf verschiedene Hefestämme wurden in einem Parallel Reaktor System von DAS- GIP Technology fermentiert. Hierbei wurde jeder Stamm zweimal kultiviert, wobei jeweils eine Fermentation unter Zusatz von Pektin geführt wurde, die zweite nicht. Die Produkte aus den einzelnen Fermentationen wurden in je 2 Chargen aufgeteilt, wobei eine direkt in den nachfolgenden Tests eingesetzt wurde und die 2. Charge wurde einer Essigsäurebehandlung unterzogen. Dafür wurde das Hefezellwandprodukt im Verhältnis 1 :10 (w/w) in 0,5 N Essigsäure suspendiert und 1 h bei 75°C inkubiert. Die Hefezellwandbestandteile werden anschließend erneut zentrifugiert, gewaschen und anschließend getrocknet. Die eine Hälfte der Fermentationslösung jedes Ansatzes wurde mit Säure behandelt, die andere nicht. Die Aufarbeitung und Bestimmung der Pathogenbindung erfolgte im wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben. Fermentationsstämme:

Trichosporon mycotoxinivorans (DSM 14153)

Saccharomyces cerevisiae sp (DSM 22708)

Klyveromyces lactis (DSM 22709)

Saccharomyces boulardii BIO 235 und BIO 236

Tabelle 2 zeigt die durchschnittliche Bindung (drei Wiederholungen der Bindungsversuche von je zwei Parallel-Fermentationen) pathogener Keime (E. coli, S. typhimurium) an verschiedene Hefeprodukte

Bindung < 10 %: - Bindung zwischen 10 und 20 %: +/- Bindung zwischen 20 und 30 %: +

Bindung zwischen 30 und 50 %: ++

Bindung > 50 %: +++ Tabelle 2

SäurebePektinzugabe in der E. coli S.

handlung Fermentation typhimurium

Trichosporon Ja Nein - - mycotoxinivorans

Trichosporon Ja Ja +++ +++ mycotoxinivorans

Trichosporon Nein Nein +/- +/- mycotoxinivorans

Trichosporon Nein Ja +++ +++ mycotoxinivorans

Saccharomyces cerevisiae Ja Nein +/- -

Saccharomyces cerevisiae Ja Ja +++ ++

Saccharomyces cerevisiae Nein Nein - -

Saccharomyces cerevisiae Nein Ja +++ ++

Klyveromyces lactis Ja Nein - -

Klyveromyces lactis Ja Ja +++ ++

Klyveromyces lactis Nein Nein - -

Aus Tabelle 2 ist zu ersehen, daß die besten Ergebnisse erzielt werden können, wenn während der Fermentation Pektin zugesetzt war und sowie ggf. anschließend eine Säurebehandlung durchgeführt wurde. Die Verbesserung gegenüber einer Fermenta- tion ohne Pektin geht hierbei weit über den Summeneffekt hinaus.

Beispiel 3: Vergleich des Effekts verschiedener Hefezellwandprodukte bei natürlicher

E. coli challenge in der Ferkelaufzucht eines Problembetriebs.

Ferkel mit einem Anfangsgewicht von etwa 8,3 bis 8,5 kg wurden in vier Gruppen ein- geteilt und einem Fütterungsversuch unterworfen, wobei eine Vergleichsgruppe ein gängiges Ferkelfutter erhielt (Kontrolle) und bei drei Gruppen dem gängigen Ferkelfutter 0,2 % ein Futterzusatz bestehend aus Hefezellwandprodukten zugesetzt war, und zwar Gruppe 1 wurden Hefezellwände von unbehandelter Saccharomyces cerevisiae verfüttert, Gruppe 2 wurden Hefezellwände von Saccharomyces cerevisiae aus einer Fermentation mit Pektin verfüttert und Gruppe 3 wurden Hefezellwände von Saccharomyces cerevisiae aus einer Fermentation mit Pektin und einer nachfolgenden Säurebehandlung verfüttert. Die Ergebnisse des Fütterungsversuchs sind in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3

Hälfte betroffen; + kaum: weniger als fünf Tiere betroffen)

Aus Tabelle 3 ist ersichtlich, daß bei Verabreichung der erfindungsgemäß mit Pektin fermentierten Hefezellwandprodukte (Gruppe 2 und Gruppe 3) die Tiere einerseits eine bedeutend höhere Gewichtszunahme und somit eine höhere Leistung zeigten und andererseits die Mortalität und die Durchfallhäufigkeit massiv abgesenkt werden konnten. Beispiel 4: E. coli challenge Versuch 48 Ferkel mit einem Durchschnittsgewicht von 10,5 kg wurden in 4 Gruppen ä 12 Tiere aufgeteilt und in jeweils eine Einstallbox pro Gruppe gebracht; alle erhielten dasselbe Standardfutter ab dem Tag der Einstallung und danach für zehn Tage ebenfalls dieselbe Futterformulierung sowie zusätzlich die in Tabelle 4 angeführten Futterzusätze (Kontrolle; Gruppe 1 : Hefezellwände, unbehandelt; Gruppe 1 : Hefezellwände aus Fermentation mit Pektinzusatz; Gruppe 3: Hefezellwände aus Fermentation mit Pektinzusatz und nachfolgender Säurebehandlung). Nach einer Eingewöhnungsphase von 7 Tagen erfolgte bei jedem einzelnen Tier ein Rektalabstrich zur Statusfeststellung der E. coli Kontamination. Keines der Tiere wurde auf E. coli K 88 positiv getestet. In der Folge wurde über einen Zeitraum von 10 Tagen eine tägliche E. Coli K88 challenge durchgeführt, wobei mittels einer Spritze eine orale Dosis einer E. coli Suspension in Wasser verabreicht wurde. Die dabei eingesetzte Menge von Escherichia coli K 88 war 5,5 ^* 10 ¹⁰ Zellen pro Ferkel. Während des Challenge-Zeitraumes sowie darüber hinaus erhielten die Tiere weiterhin das Standardfutter mit den angeführten Zusätzen. 48 h nach der letzten E. Coli challenge wurde wieder ein Rektalabstrich durchgeführt und mittels Immunoblot mit Kaninchen-Antikörpern gegen E. coli K88 getestet.

Tabelle 4 (mit positiv getesteten Ferkeln)

Aus der Tabelle 4 ist ersichtlich, daß die Prozent positiv getesteten Ferkel bei Einsatz eines Futtermittelzusatzes gemäß der vorliegenden Erfindung (Gruppe 2 und Gruppe 3) auf wenigstens die Hälfte herabgesetzt werden konnte.

Beispiel 5: E.coli challenge Versuch

28 etwa gleich schwere Ferkel wurden unmittelbar nach dem Absetzen in sieben Gruppen aufgeteilt und in jeweils eine Einstall-Box pro Gruppe gebracht. Sie erhielten herkömmliches Absetzfutter, das mit den in Tabelle 5 angeführten Futtermittelzusätzen versetzt war (Konzentration: 0,1 %). Am zweiten und dritten Tag nach dem Absetzen wurde den Ferkeln jeweils 5 ml einer Lösung enthaltend E. coli 0149 oral mittels einer Kunststoffspritze zugeführt (Dosis pro Verabreichung: 1 x 10 Koloniebildende Einheiten (KBE) E. coli 0149, in physiologischer Kochsalzlösung).

Tabelle 5: Futtermittelzusatz (jeweils 0,2 %)

Die Tiere wurden täglich von einem Tierarzt untersucht und die durchschnittliche Konsistenz des Kotes bewertet. Die Bewertung des Kotes war eine numerische mit einem Punktesystem von 1 bis 4: 1 - normaler (fester) Kot; 2 - pastös; 3 - halbflüssig bis flüssig; 4 - gelblich bis wäßrig.

Die nachfolgende Tabelle 6 zeigt die Bewertung der Kotkonsistenz am 1. und 2. Tag nach der zweiten E. coli Gabe.

Tabelle 6

Dem Versuch ist klar entnehmbar, daß jene Tiere, welche ein Produkt aus speziellen Hefen bzw. Hefezellwänden, die mit Pektin im Fermentationsmedium behandelt wurden bzw. zusätzlich noch säurebehandelt wurden, eine bedeutend bessere Kotkonsistenz aufwiesen (Gruppe 3 bis Gruppe 7).

Beispiel 6 Beispiel 6 wurde analog zu Beispiel 5 durchgeführt, jedoch wurden die in Tabelle 7 aufgelisteten Futtermittelzusätze getestet.

Tabelle 7

Aus den Ergebnissen dieses Versuchs kann erkannt werden, daß, auch wenn die Tiere ein Futtermittelzusatz verabreicht wurde, welcher sowohl Hefezellwandprodukte als auch Pektin enthielt oder nur Pektin allein enthielt, welche Produkte jedoch bei der Fer- mentation jedoch keinen Zusatz von Pektinen oder Pektinderivaten im Medium enthalten hatten, diese eine extrem schlechte Stuhlkonsistenz zeigten im Vergleich zu den Tieren, welche einen Futtermittelzusatz gemäß der vorliegenden Erfindung erhielten, bei welchem Hefezellwandprodukte in Anwesenheit von Pektin fermentiert wurden (Gruppe 1 bis Gruppe 4).

Beispiel 7: Challenge Versuch mit Masthühnerküken

120 vier Tage alte Masthühnerküken wurden in 12 Gruppen ä 10 Tiere aufgeteilt und ihnen oral jeweils 10 ⁴ KBE S. typhimurium S3, eines nicht-pathogenen Stammes, gelöst in physiologischer Kochsalzlösung verabreicht; die Tiere erhielten ein übliches Starterfutter, welchem jeweils 0,2 % eines Futtermittelzusatzes, wie in Tabelle 8 angeführt, beigefügt war. Nach einer Woche wurden die Tiere geschlachtet und das Caecum auf die Präsenz von S. typhimurium untersucht. Hierbei wurde der Inhalt des Caecum mit steriler Peptonlösung aufgeschlämmt und eine Verdünnungsreihe (1 :10) hergestellt, die dann für die weitere Bestimmung von S. typhimurium herangezogen wurde.

Tabelle 8

Tabelle 9 zeigt Anzahl der Tiere die positiv auf S. typhimurium im Caecum getestet wurden.

Tabelle 9

Gruppe 1 10

Gruppe 2 9

Gruppe 3 8

Gruppe 4 9

Gruppe 5 2

Gruppe 6 4

Gruppe 7 3

Gruppe 8 8

Gruppe 9 9

Gruppe 10 8

Gruppe 11 10

Gruppe 12 10 Die Ergebnisse des vorliegenden Versuchs zeigen, daß jene drei Gruppen, welchen Hefezellwandprodukte mit Pektinzusatz in der Fermentationslösung verabreicht wurden (Gruppe 5 bis Gruppe 7), bedeutend seltener auf S. typhimurium im Caecum getestet wurden.

Beispiel 8: Challenqe Versuch mit Masthühnerküken

600 Tagesküken der Rasse Ross mit einem Anfangsgewicht von etwa 37,4 g wurden in vier Gruppen ä 150 Tiere aufgeteilt und jeweils in Käfige für 25 Tiere mit Holzboden und Maschendraht, um eine Migration bzw. Vermischung der Tiere hintanzuhalten, auf- geteilt. Die klimatischen Bedingungen und das Beleuchtungsprogramm waren computergesteuert und wurden automatisch entsprechend den Standardanforderungen für Küken reguliert und täglich überprüft.

Nach dem Einsetzen in die Käfige wurden den Tieren experimentelle Fütterungen ohne Kokzidiostatika zur Verfügung gestellt. Es wurde ein 2-Phasen-Fütterungssystem durchgeführt, mit einem Starterfutter von Tag 1 bis Tag 14 und einem Wachstumsfutter von Tag 15 bis Tag 35. Futter und Wasser wurden den Tieren ad libitum zur Verfügung gestellt und die Fütterung wurde händisch durchgeführt.

A - Vergleichsgruppe (kein Futtermittelzusatz)

B - Zellwandprodukt 0,1 % (fermentiert auf Pektin) + Probiotikamischung 1)

C - Zellwandprodukt 0,1 % (fermentiert auf Pektin)

D - Zellwandprodukt 0,1 % (fermentiert auf Pektin) + Probiotikamischung 2) Probiotikamischung 1 : Eubacterium sp. (DSM 11798), Lactobazillus reuteri (DSM 21288), Lactobacillus salivarius (DSM 16351 ) und Lactobacillus sobrius (DSM 21285) Probiotikamischung 2: Enterococcus faecium (DSM 19764), Bifidobacterium thermo- philium (DSM 19765), Pediococcus acidilactici (DSM 16210) und Enterococcus faecium (DSM 3530)

Die klinische Beobachtung wurde zwei Mal pro Tag durchgeführt und alle Merkmale aufgezeichnet. Am Beginn und am Tag 14 wurde das Gewicht der Tiere durch Grup- penwägung gemessen und am Tag 35 wurde jedes Tier einzeln gewogen. Die abgegebene Futtermenge wurde regelmäßig aufgezeichnet. Alle Tiere wurden durch den Tierarzt regelmäßig überwacht. Das Ergebnis des Versuchs ist in Tabelle 10 gezeigt. Tabelle 10:

Aus Tabelle 10 kann ersehen werden, daß jene Tiere, welche ein Zellwandprodukt, das auf Pektin fermentiert wurde und zusätzlich eine probiotische Mischung erhielten (Gruppe B und Gruppe D), die geringste Sterblichkeit und außerdem das höchste Endgewicht aufwiesen. Beispiel 9: Futtermittelversuch mit Wolfsbarschen

Ein Versuch mit Wolfsbarschen wurde am Aqua Center for applied animal nutrition in Thailand durchgeführt. Wasserqualitätsparameter, insbesondere Temperatur, gelöster Sauerstoff, Nitrite, Nitrate und Ammonium wurden wöchentlich überprüft. Jeweils 35 Jungfische mit einem Gewicht von 18 ± 1 g wurden in einen 300 I Versuchstank mit kontinuierlicher Belüftung gegeben und für eine Woche an die Bedingungen des Versuchs akklimatisiert. Während der Versuchsdauer von 56 Tagen erhielten die Fische bezogen auf ihr Gewicht 5 % Futter täglich, wobei dies in drei Portionen verabreicht wurde. Während in den ersten sechs Wochen der Versuchsdauer optimale Bedingungen eingehalten wurden, wurden die Fische für die letzten beiden Wochen unter Streß gesetzt, nämlich durch Entfernung des Tankdeckels, was einerseits zur Belastung durch direkte Sonneneinstrahlung und andererseits zu erhöhtem Infektionsdruck führte. Der Gesamtversuch wurde in einem sogenannten complete block design (CBD) durchgeführt, mit sieben Versuchsgruppen und jeweils vier Wiederholungen pro Versuchsgruppe. Das Ergebnis des Versuchs ist in Tabelle 11 gezeigt.

• Gruppe 1 - Kontrolle

• Gruppe 2 - Futter mit 0,5% Zusatz an Hefeprodukt, fermentiert mit Zusatz von Pektin

• Gruppe 3 - Futter mit 0,2% Zusatz an Hefeprodukt, fermentiert mit Zusatz von Pektin Gruppe 4 - Futter mit 0,2% Zusatz an Hefeprodukt, fermentiert mit Zusatz von Pektin und säurebehandelt

Gruppe 5 - Futter mit 0,5% Zusatz an Hefeprodukt, fermentiert ohne Zusatz von Pektin

Gruppe 6 - Futter mit 0,2% Zusatz an Hefeprodukt, fermentiert ohne Zusatz Pektin

Gruppe 7 - Futter mit Zusatz an Pektin.

Tabelle 11

Aus Tabelle 11 ist ersichtlich, daß die Gruppen 2 bis 4, welche ein mit einem Hefeprodukt, welches mit Pektinen fermentiert wurde, versetztes Futter erhielten, das höchste Endgewicht zeigten und daß auch die Mortalität im Vergleich zu den Vergleichsgruppen deutlich herabgesetzt war.

Beispiel 10: Fütterungsversuch mit Garnelen (- Litopenaeus vannamei)

Der Versuch wurde im Aquarium durchgeführt, wobei junge Garnelen (0,4 g bis 0,5 g) als Versuchstiere verwendet wurden. Die Anzahl der Tiere war 21 Garnelen pro Aquarium. Die verschiedenen auf Hefe basierenden Produkte wurden dem Futter mit einer Konzentration von 0,2 % zugefügt. Das standardisierte Versuchsdesign umfaßte 8 Versuchsgruppen mit jeweils drei Wiederholungen.

Die Garnelen wurden über einen Zeitraum von 7 Tagen einem Streßtest ausgesetzt, wobei die Wasserzirkulation für 2 h pro Tag herabgesetzt wurde; Wassererneuerung erfolgte nur für jeweils 1 h am Vormittag und 1 h am Nachmittag.

Die Wasserqualität wurde wöchentlich auf Temperatur, Salzgehalt, pH, Ammonium, Nitrite, Nitrate untersucht. Vor Versuchsbeginn erhielten alle Tiere dasselbe Standardfutter in einer Menge von 10 % ihres Körpergewichtes pro Tag. Die Mortalität wurde täglich aufgezeichnet. Das Ergebnis des Versuchs ist in Tabelle 12 gezeigt. Tabelle 12

Aus Tabelle 12 kann ersehen werden, daß jenen Gruppen von Tieren, welche ein He- feprodukt, das auf einem Pektinderivat fermentiert wurde, zugefüttert wurde, nicht nur das höchste Endgewicht und größte Wachstum aufwiesen, sondern daß auch die Mortalität im Vergleich zu Kontrollgruppen herabgesetzt war.

Anlage zu neuer PCT-Anmeldung

Anmelder: Erber Aktiengesellschaft et al .

Liste gemäß Regel 13bis, Absatz 4 der Ausführungsordnung zum Vertrag über die internationale Zusammenarbeit auf dem Gebiet des Patentwesens

Sämtliche der in der vorliegenden neuen PCT-Anmeldung genannten Mikroorganismen wurden bei der DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, 38123 Braunschweig, Deutschland (DE) , hinterlegt .

Eingangsnummer Eingangsdatum

DSM 3530 01.10.1985

DSM 11798 17.09.1997

DSM 14153 08.03.2001

DSM 16210 06.02.2004

DSM 16211 06.02.2004

DSM 16284 10.03.2004

DSM 16351 15.04.2004

DSM 19764 05.10.2007

DSM 19765 05.10.2007

DSM 21285 14.03.2008

DSM 21286 14.03.2008

DSM 21288 14.03.2008

DSM 21443 09.05.2008

DSM 21913 10.10.2008

DSM 22708 22.06.2009

DSM 22709 22.06.2009

DSM 22710 22.06.2009