Titre : Procédé de préparation d’un marc de raisin fermenté, marc de raisin fermenté ainsi obtenu et son utilisation dans des compléments alimentaires ou dans des cosméceutiques.

Domaine technique

[0001] La présente invention relève du domaine de la santé. Elle concerne notamment des compléments alimentaires ou nutraceutique ainsi que des cosméceutiques comprenant du marc de raisin fermenté. La présente invention concerne également un procédé de fermentation d’un marc de raisin à l’aide d’un consortium microbien issu du kombucha (scoby).

Technique antérieure

[0002] Le marché mondial des compléments alimentaires est en plein essor avec une croissance supérieure à 100% attendue d’ici 2025, notamment grâce à la prise de conscience de plus en plus importante du lien entre santé et alimentation.

D’après la définition donnée par la Directive 2002/46/CE du Parlement européen « les compléments alimentaires sont des denrées alimentaires dont le but est de compléter le régime alimentaire normal et qui constituent une source concentrée de nutriments ou d’autres substances ayant un effet nutritionnel ou physiologique seuls ou combinés, commercialisés sous forme de doses ».

Le mot « nutraceutique », quant à lui, ne possède pas de définition officielle mais provient de la contraction de « nutrition » et de « pharmaceutique ». En d’autres termes, les termes « nutraceutiques » et « compléments alimentaires » se recoupent.

Les compléments alimentaires intéressent également les laboratoires cosmétiques, avec l’émergence des « cosméceutiques » et plus particulièrement des « dermocosmétiques » et des « nutricosmétiques » et la tendance du « in & out » se définissant par l’importance de nourrir la peau de l’intérieur. Le mot « cosméceutique », qui est un mot valise de « cosmétique » et « produit pharmaceutique », désigne un produit cosmétique contenant un ingrédient bioactif censé avoir des avantages médicaux. Il n’y a cependant pas d’exigence légale pour prouver que ces produits sont à la hauteur de leurs revendications. Les nutricosmétiques (à la croisée de la cosmétique et la nutraceutique) correspondent à des produits comestibles tandis que les produits dermocosmétiques s’appliquent localement sur la peau, le cuir chevelu, les cheveux etc.

Présentés sous forme de dose, les compléments alimentaires ou nutraceutiques existent sous différentes formes galéniques et peuvent être composés de divers ingrédients : vitamines et minéraux, substances à but nutritionnel ou physiologique (acides aminés, oméga-3...), extraits ou métabolites de plantes, ingrédients d’origine animale (huiles de poisson, propolis...), ferments et levures (probiotiques, levure de bière...), fruits et légumes. Les compléments alimentaires se situent entre l’aliment qui nourrit et le médicament qui soigne. En fonction de leur composition, leur rôle peut être nutritionnel ou physiologique. Ainsi, certains compléments alimentaires, au vu de leur grande concentration en nutriments, permettent de pallier les déficiences alimentaires, et permettent notamment de répondre aux besoins spécifiques de certaines populations (femmes enceintes, personnes âgées ...) ou lors de certaines situations (carence en vitamine D lors de l’hiver, en vitamine B12...). Dans d’autres cas, les compléments alimentaires vont aider à diminuer ou atténuer des inconforts de personnes en bonne santé (stress, douleurs articulaires, sommeil difficile...). Les compléments alimentaires ont également un rôle de prévention, en agissant sur la diminution des facteurs de risques de maladies dites chroniques (baisse du cholestérol, renforcement de la densité minérale osseuse...). Les différents actifs présents dans les compléments alimentaires vont permettre un équilibre physiologique et ainsi maintenir en bonne santé les consommateurs.

[0003] Au vu de l’importance croissante de ce marché, il subsiste toujours à ce jour le besoin de développer de nouveaux compléments alimentaires ou cosméceutiques. A cet égard, les Inventeurs se sont notamment intéressés au marc de raisin.

[0004] Le marc de raisin est présent dans de nombreux compléments alimentaires et est particulièrement plébiscité en cosmétique et en phytothérapie. Il possède une grande variété de polyphénols (flavonoïdes, anthocyanes, tanins, acides phénoliques, stilbènes etc.) et est principalement connu pour ses propriétés anti-oxydantes et drainantes. Il a également été décrit comme présentant des propriétés anti-inflammatoires.

Le marc de raisin est un sous-produit obtenu lors de la fabrication du vin.

Dans le cadre de la fabrication du vin blanc, la première étape est une étape de foulage ou pressurage des grappes entières de raisin qui permet d’obtenir le moût de raisin, qui est un jus de raisin épais et sucré, non fermenté. De ce jus épais sont enlevés les tiges, peaux, pépins, rafles etc., à savoir tout ce qui reste de solide après le pressurage des grappes de raisin. La partie liquide ainsi obtenue sert à l’élaboration du vin tandis que la partie solide (= résidus issus du moût) constitue le marc de raisin.

Dans le cadre de la fabrication du vin rouge, une fois que les raisins sont foulés, ils sont placés dans des cuves pour la macération. Pendant la macération les parties solides (pellicules, pulpes, pépins) remontent à la surface et forment le « chapeau de marc ». C’est également pendant la macération que la fermentation alcoolique a lieu. Pour mettre fin à la macération, le jus est récupéré par le bas de la cuve afin de le séparer des parties solides (le chapeau de marc). Que ce soit pour le vin blanc ou le vin rouge, le marc de raisin désigne la totalité des résidus solides obtenus suite au pressurage des raisins, que ce soit avant ou après la fermentation alcoolique. Il présente un aspect sec et friable et a une couleur qui varie entre le jaune et le mauve selon les variétés de raisin utilisés.

[0005] Le kombucha est une boisson traditionnelle, légèrement acide, originaire d’Asie, réputée avoir des effets bénéfiques sur la santé. Le kombucha consiste en un thé sucré qui a été fermenté par une population mixte de bactéries et de levures, appelée « consortium microbien ». Le consortium microbien désigne plus particulièrement un mélange de microorganismes, à savoir des bactéries et des levures, qui vivent en symbiose. Le consortium microbien est encore défini par l’acronyme « SCOBY » (désigné par scoby dans ce qui suit) pour « culture symbiotique de bactéries et de levures » (en anglais « Symbiotic Culture Of Bacteria and Yeasts »).

Pour préparer le kombucha, le scoby est mis au contact d’un thé (thé noir ou thé vert, peu importe) qui a été préalablement sucré. Les levures et bactéries du scoby vont se développer sur le thé sucré et permettre respectivement une fermentation alcoolique et une fermentation acétique. Brièvement, les levures du scoby utilisent le sucre pour produire de l’alcool et du dioxyde de carbone, et les bactéries du scoby utilisent l’alcool produit pour produire de l’acide acétique. En parallèle les bactéries acétiques synthétisent aussi à partir des sucres de la cellulose qui se retrouve en majeure partie dans la pellicule en surface du scoby. De nombreux métabolites d’intérêt sont également produits par les microorganismes du scoby tels que des vitamines, de l’acide gluconique, de l’acide glucuronique etc.

Dans sa forme la plus courante le scoby a l’aspect d’une pellicule/membrane gélatineuse de quelques centimètres d’épaisseur. Lorsque le scoby est mis en contact avec le thé, il flotte généralement à l’interface thé-air du récipient comprenant le thé. Lors de la fermentation, le scoby s’adapte à la taille du récipient de sorte à recouvrir l’ensemble de la surface du thé. La durée de la fermentation est d’environ 10 à 15 jours à température ambiante. A l’issue de la fermentation, il s’est formé un nouveau scoby sur l’ensemble de l’interface thé-air. Le scoby utilisé en début de fermentation est nommé « mère de kombucha » tandis que le scoby formé en fin de fermentation est nommé « bébé de kombucha ». Le bébé de kombucha se forme au-dessus de la mère de kombucha (en effet la nouvelle pellicule/membrane pousse à l’interface avec l’air). Il est facile de séparer le bébé kombucha de la mère de kombucha (par exemple manuellement). Le bébé de kombucha pourra à son tour être utilisé, seul ou en association avec la mère de kombucha, pour initier une nouvelle fermentation d’un thé sucré et deviendra ainsi une mère de kombucha. Comme tous les organismes vivants, les SCOBYs se ressemblent mais ne sont pas identiques. Habités par des millions de micro-organismes, leur composition en bactéries et levures peut varier (notamment en fonction des régions, de la température, du thé utilisé, de la dimension du réacteur etc.) et donner un résultat différent sur le kombucha obtenu.

Objet et résumé

[0006] Un des buts de la présente invention est de développer de nouveaux compléments alimentaires ou cosméceutiques à base de marc de raisin.

A cet égard les Inventeurs ont eu deux idées originales, à savoir :

- préparer un marc de raisin fermenté,

- utiliser un consortium microbien de kombucha pour effectuer la fermentation du marc de raisin.

En effet, les Inventeurs ont émis l’hypothèse qu’un consortium microbien de kombucha pourrait être capable de transformer les composés d’intérêt présents dans le marc de raisin afin de potentialiser leurs propriétés biologiques.

[0007] Un autre but de l’invention est donc de développer de nouveaux compléments alimentaires ou cosméceutiques à base de marc de raisin fermenté.

[0008] Encore un autre but de l’invention est de mettre au point un procédé de fermentation d’un marc de raisin à l’aide d’un consortium microbien de kombucha.

Comme déjà indiqué, les Inventeurs ont imaginé utiliser un consortium microbien de kombucha pour faire fermenter le marc de raisin.

Cependant rien ne laissait supposer que le marc de raisin soit un substrat fermentescible. En effet, comme indiqué précédemment, dans le cas de la fabrication du vin rouge, le marc de raisin est obtenu après la fermentation alcoolique, ce qui peut laisser penser qu’il est déjà épuisé en éléments nutritifs pour les microorganismes (vitamines, composés azotés, sels minéraux ...) et qu’en outre il puisse comprendre des inhibiteurs de fermentation.

Il est donc du mérite des Inventeurs d’avoir eu l’idée d’utiliser du marc de raisin pour le soumettre à une fermentation à l’aide d’un consortium microbien de kombucha.

[0009] La présente invention a pour objet un procédé de préparation d’un marc de raisin fermenté, caractérisé en ce qu’il comporte les étapes suivantes :

- préparation d’une infusion de marc de raisin par mise en contact de marc de raisin avec de l’eau et éventuellement une source de sucre choisie parmi le saccharose, du sirop de glucose ou un moût de raisin concentré ;

- mise en contact de l’infusion de marc de raisin avec un scoby (encore appelé « consortium microbien de kombucha ») et éventuellement du kombucha ; - fermentation de l’infusion de marc de raisin pendant une durée allant de 5 à 35 jours, et de préférence de 7 à 12 jours.

[0010] Le marc de raisin utilisé dans le procédé de l’invention peut provenir de tout type de cépage (cépages de raisins de cuve ou de raisins de table). Le cépage est une variété de vigne qui donne un raisin spécifique.

Le marc de raisin est un produit particulièrement intéressant car il est riche en polyphénols et contient également du sucre, de la vitamine C ainsi que certaines vitamines du groupe B. En fonction du procédé utilisé, la teneur en sucre peut être assez élevée, c’est pourquoi il ne sera pas forcément nécessaire de rajouter du sucre lors de l’étape de préparation de l’infusion de marc de raisin.

Selon un mode de réalisation de l’invention, le marc de raisin provient d’un cépage noir choisi dans le groupe comprenant le Cabernet Franc, le Cabernet Sauvignon, le Malbec, le Syrah, la Négrette, le Merlot et le Grenache Noir.

Selon un autre mode de réalisation de l’invention, le marc de raisin provient d’un cépage blanc choisi dans le groupe comprenant le Chardonnay, le Sauvignon blanc, le Grenache blanc, le Chenin, le Gewurztraminer et le Riesling.

Selon un mode de réalisation préféré de l’invention, le marc de raisin provient de producteurs de la région d’Occitanie, tels que les cépages Cabernet franc, Cabernet Sauvignon, Malbec, Négrette.

[0011] Comme indiqué précédemment le marc de raisin se présente sous la forme d’un résidu solide. Lorsque le marc de raisin est séparé du liquide, il contient environ 50 à 65% d’humidité. Un tel résidu de marc, comprenant une teneur en eau d’environ 50-65% d’humidité, est appelé « résidu frais ».

Le résidu frais de marc de raisin peut également être congelé à une température d’environ

- 20°C. Ce résidu est alors appelé « résidu congelé ».

Il est également possible de faire sécher le résidu frais de marc de raisin au soleil ou à la chaleur jusqu’à ce que la teneur en eau du résidu solide soit d’environ 10%. Un résidu de marc comprenant une teneur en eau d’environ 10% est appelé « résidu sec » de marc.

Selon un mode de réalisation de l’invention, le marc de raisin utilisé au départ du procédé peut se présenter sous la forme d’un résidu solide frais, congelé ou sec. La mise en contact dudit marc de raisin (sous forme de résidu solide frais, congelé ou sec) avec de l’eau permet d’obtenir une infusion de marc de raisin.

[0012] Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé de l’invention, l’infusion de marc de raisin est préparée selon le procédé comprenant les étapes suivantes :

- éventuellement, dans une étape préalable, ajout d’une source de sucre, choisie parmi le saccharose, du sirop de glucose ou un moût de raisin concentré, dans une eau préalablement chauffée à une température allant de 30°C à 40°C, pour atteindre une concentration allant de 30 à 50 g/L de sucre par litre d’eau,

- ajout de marc de raisin dans une eau préalablement chauffée à une température allant de 70°C à 90°C, ladite eau étant éventuellement celle préparée à l’étape précédente (à savoir une eau comprenant une source de sucre), pour obtenir une infusion présentant une concentration allant de 20 à 150 g/L, de préférence de 50 à 80 g/L de matière sèche « marc de raisin » par litre d’eau, ladite eau comprenant éventuellement une source de sucre,

- maintien de la température de l’infusion à une température allant de 70°C à 90°C, pendant une durée allant de 10 à 20 minutes,

- filtration de l’infusion de marc de raisin pour la séparer du marc restant sous forme solide,

- refroidissement de l’infusion de marc de raisin filtrée à une température allant de 20 à 35°C,

- éventuellement, ajout, dans l’infusion de marc de raisin, d’une source d’azote choisie parmi un sel d’ammonium ou de l’azote organique, en une quantité allant de 0,2 à 0,8 g/L de source d’azote par litre d’infusion de marc de raisin.

L’apport d’azote organique pourra par exemple être réalisé par ajout de dérivés de levure. L’étape d’ajout de marc de raisin dans l’eau préalablement chauffée est de préférence effectuée sous agitation mécanique.

[0013] Selon encore un autre mode de réalisation du procédé de l’invention le marc de raisin utilisé au départ du procédé peut être un extrait de marc de raisin.

[0014] Le scoby est tel que précédemment défini et désigne un consortium microbien de kombucha. Les expressions « consortium microbien issu du kombucha », « consortium microbien de kombucha », « scoby de kombucha », « scoby » sont équivalentes et désignent un scoby « mère de kombucha » et/ou un scoby « bébé de kombucha ».

Selon un mode de réalisation de l’invention, le scoby utilisé dans le procédé de l’invention peut être acheté dans le commerce ou peut être celui décrit dans le document Villarreal- Soto et al. ¹ . Les bactéries majoritaires présentes dans le scoby de Villarreal-Soto et al. sont Komagataeibacter espèce rhaeticus, Gluconacetobacter et Gluconobacter, tandis que les levures majoritaires sont Brettanomyces et Schizosaccharomyces.

Selon encore un autre mode de réalisation avantageux, le scoby utilisé dans le procédé de préparation du marc de raisin fermenté de l’invention est préparé par les Inventeurs. Ce scoby est plus particulièrement celui obtenu à l’issue du procédé de préparation d’un kombucha mis au point par les Inventeurs dont les détails sont donnés dans le paragraphe ci-après.

[0015] Selon un mode de réalisation avantageux du procédé de l’invention, outre le scoby qui est mis au contact de l’infusion de marc de raisin, il peut être avantageux de mettre également l’infusion de marc de raisin au contact d’un kombucha. En effet, le kombucha contient des levures et des bactéries vivantes en suspension et acidifie le milieu.

Le « kombucha » désigne la boisson précédemment définie, à savoir le thé fermenté avec le scoby. Au sens de la présente demande le « kombucha » sans autre précision désigne donc toujours le « kombucha de thé ».

Le kombucha utilisé dans le procédé de l’invention peut être acheté dans le commerce ou peut également être préparé par les Inventeurs. Le procédé de préparation du kombucha comprend les trois étapes suivantes :

- préparation d’une infusion de thé sucrée, de préférence un thé noir, et plus préférentiellement encore un thé noir de Ceylan,

- mise en contact de l’infusion de thé sucrée avec un scoby, du vinaigre de cidre et éventuellement du kombucha,

- fermentation de l’infusion de thé sucrée pendant une durée allant de 14 à 20 jours afin d’obtenir le kombucha.

Ces étapes ont été optimisées par les Inventeurs de la façon décrite ci-après.

La première étape du procédé, qui est celle de la préparation de l’infusion de thé sucrée, comprend les étapes consistant à :

- chauffer un volume d’eau nécessaire à une température allant de 30 à 40°C puis ajouter une quantité nécessaire de saccharose afin d’obtenir une concentration d’eau sucrée allant de 60 à 80 g/L, et de préférence de 70 g/L ;

- augmenter la température de l’eau sucrée jusqu’à 70 à 90°C, puis ajouter une quantité nécessaire de thé (sous forme solide) afin d’obtenir un thé d’une concentration allant de 10 à 30 g/L ;

- laisser infuser le thé pendant 10 à 20 minutes en le remuant de façon régulière ;

- laisser refroidir l’infusion de thé jusqu’à une température inférieure ou égale à 35°C ;

- filtrer l’infusion de thé pour la séparer du thé restant sous forme solide.

Dans une seconde étape du procédé de préparation du kombucha sont ensuite mélangés, dans un récipient destiné à faire la fermentation, l’infusion de thé sucrée obtenue à l’étape précédente, du vinaigre de cidre, un scoby et éventuellement du kombucha.

Les proportions, en pourcentage en poids, de ces différents ingrédients sont respectivement les suivantes : infusion de thé : 95% ; vinaigre de cidre : 1% ; scoby : 2% ; kombucha : 2%.

L’ajout de kombucha est facultatif et provient du commerce la première fois que le kombucha est préparé par les Inventeurs. Il pourra cependant également s’agir du kombucha préparé par les Inventeurs lorsque le procédé de préparation du kombucha sera reproduit dans un second temps.

L’ajout de vinaigre de cidre permet de baisser le pH du mélange afin d’empêcher les contaminations microbiennes en début de fermentation. Par la suite, au cours de l’étape de fermentation, le pH baisse naturellement empêchant ainsi tout microorganisme extérieur au scoby de se développer.

Le scoby provient du commerce la première fois que le kombucha est préparé par les Inventeurs. Il pourra cependant également s’agir du scoby obtenu à l’issue du procédé de préparation du kombucha lorsque le procédé de préparation du kombucha sera reproduit dans un second temps par les Inventeurs.

Dans la troisième étape du procédé de préparation du kombucha, la fermentation est effectuée à une température allant de 20 à 30°C, pendant une durée allant de 14 à 20 jours. De préférence la durée de la fermentation est de 15 à 17 jours. De préférence, la fermentation est effectuée à l’abri de la lumière.

A l’issue de la fermentation, le kombucha est séparé du scoby. Ce scoby s’entend aussi du scoby qui s’est formé pendant l’étape de fermentation (le bébé de kombucha) que du scoby qui a servi à initier la fermentation (la mère de kombucha). Comme déjà indiqué il est facile de séparer le bébé kombucha de la mère de kombucha. Le scoby utilisé pour initier une nouvelle fermentation pourra être le bébé de kombucha seul ou le bébé de kombucha avec la mère de kombucha.

Comme indiqué dans le paragraphe ci-dessus, le scoby obtenu à l’issue du procédé de préparation du kombucha pourra être utilisé dans le procédé de préparation du marc de raisin fermenté. Ainsi, selon un mode de réalisation avantageux du procédé de l’invention, le scoby mis au contact de l’infusion de marc de raisin est le scoby (bébé de kombucha) récupéré à l’issue des 14 à 20 jours de fermentation, et de préférence des 15 à 17 jours de fermentation.

Ce scoby est proche de celui identifié dans la publication de Villareal-Soto et al. ¹ précédemment mentionnée.

Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé de préparation du marc de raisin fermenté de l’invention, le kombucha de 14 à 20 jours de fermentation, et de préférence de 15 à 17 jours de fermentation, est également mis au contact de l’infusion de marc de raisin.

[0016] Selon un mode de réalisation avantageux du procédé de l’invention :

- le scoby provient d’un kombucha de 14 à 20 jours de fermentation, de préférence de 15 à 17 jours de fermentation,

- le kombucha est un kombucha de 14 à 20 jours de fermentation, de préférence de 15 à 17 jours de fermentation,

- l’infusion de marc de raisin présente une concentration allant de 20 à 150 g/L, de préférence de 50 à 80 g/L de matière sèche « marc de raisin » par litre d’eau, ladite eau comprenant éventuellement une source de sucre choisie parmi le saccharose et/ou un moût de raisin concentré.

[0017] Concernant la durée de l’étape de fermentation du procédé de préparation du marc de raisin fermenté selon l’invention, elle est variable car elle dépend à la fois des produits utilisés (marc de raisin, scoby et éventuellement sucre et/ou kombucha) mais également des conditions de température, d’humidité etc..

Selon encore un mode de réalisation préféré, l’étape de fermentation du marc de raisin est effectuée à l’abri de la lumière.

Selon encore un autre mode de réalisation préféré, l’étape de fermentation est effectuée en conditions statiques, sous agitation ponctuelle.

Selon un autre mode de réalisation du procédé de l’invention, la fermentation est effectuée à une température qui varie de 20°C à 30°C.

[0018] Selon encore un mode de réalisation de l’invention, le procédé de préparation du marc de raisin fermenté est caractérisé en ce que, à l’issue de la fermentation, le scoby est retiré de l’infusion de marc de raisin fermentée afin de récupérer l’infusion de marc de raisin fermentée sans le scoby. L’infusion de marc de raisin fermentée, débarrassée du scoby, est dénommée « kombucha de marc de raisin ».

Le « kombucha de marc de raisin » désigne donc dans la présente demande une infusion de marc de raisin fermentée avec un scoby et de laquelle le scoby a été retiré. Le kombucha de marc de raisin ne sera jamais appelé simplement « kombucha » afin de ne pas le confondre avec le kombucha classique, à savoir le kombucha de thé.

Comme déjà indiqué à propos de la préparation du kombucha, le scoby qui est retiré en fin de fermentation de l’infusion de marc de raisin fermenté s’entend aussi bien du scoby qui s’est formé pendant l’étape de fermentation (le bébé de kombucha) que du scoby qui a servi à initier la fermentation (la mère de kombucha).

A titre indicatif, l’augmentation de la masse de scoby en fin de fermentation (par rapport à la masse de scoby avant le début de la fermentation) est de 50% à 90%.

[0019] Selon un autre mode de réalisation de l’invention, le procédé est caractérisé en ce que l’infusion de marc de raisin fermentée, de laquelle le scoby a été retiré, est centrifugée ou filtrée.

[0020] Selon encore un autre mode de réalisation de l’invention, le procédé est caractérisé en ce que l’infusion de marc de raisin fermentée, de laquelle le scoby a été retiré, éventuellement centrifugée ou filtrée, est évaporée ou lyophilisée afin d’obtenir un extrait sec brut de marc de raisin fermenté, encore dénommé « extrait sec brut de kombucha de marc de raisin ». Selon un mode de réalisation préféré de l’invention, l’infusion de marc de raisin fermentée est centrifugée ou filtrée avant d’être évaporée ou lyophilisée.

Les extraits secs bruts ainsi obtenus peuvent notamment être conservés par congélation.

[0021] Avantageusement, selon un autre mode de réalisation de l’invention, il est possible de procéder à une extraction supplémentaire de l’extrait sec brut obtenu, congelé ou non, afin d’éliminer les microorganismes restants provenant du scoby tout en conservant les activités biologiques des extraits secs bruts de kombucha de marc de raisin et en augmentant leur efficacité du fait de la concentration en molécules actives.

L’extraction supplémentaire de l’extrait sec brut obtenu pourra par exemple être effectuée avec de l’éthanol ou avec un solvant de polarité similaire.

A cet égard, le procédé de l’invention est encore caractérisé en ce qu’il peut comprendre en outre les étapes suivantes :

- solubilisation de l’extrait sec brut de kombucha de marc de raisin dans de l’éthanol,

- agitation de la solution éthanolique,

- filtration de la solution éthanolique,

- évaporation de la solution éthanolique filtrée jusqu’à obtention d’un extrait sec éthanolique, encore dénommé « extrait sec éthanolique de kombucha de marc de raisin ».

Selon un mode de réalisation du procédé de l’invention, l’agitation est effectuée pendant une durée allant de 40 à 80 minutes. De même, il pourra être avantageux de procéder à deux filtrations successives de la solution éthanolique préalablement agitée.

Les expressions « extraits secs de kombucha de marc de raisin », « extraits de kombucha de marc de raisin », « extraits secs de marc de raisin fermentés » ou « extraits de marc de raisin fermentés », sans autres précisions, désignent dans la présente demande des extraits secs bruts ou des extraits secs éthanoliques ou alors les deux. Un extrait sec désigne donc dans la présente demande un extrait sec brut et/ou un extrait sec éthanolique. Les extraits de kombucha de marc de raisin obtenus selon le procédé de l’invention présentent des propriétés biologiques extrêmement intéressantes et améliorées par rapport aux propriétés biologiques du marc de raisin non fermenté.

Les extraits de marc de raisin fermentés obtenus selon le procédé de l’invention présentent notamment des propriétés anti-oxydantes, anti-inflammatoires et anti-diabétiques prometteuses.

[0022] La présente invention a encore pour objet un marc de raisin fermenté susceptible d’être obtenu selon le procédé de préparation de l’invention.

Le « marc de raisin fermenté » désigne dans la présente demande :

- une infusion de marc de raisin fermentée de laquelle le scoby n’a pas été retiré,

- le kombucha de marc de raisin (à savoir l’infusion de marc de raisin fermentée de laquelle le scoby a été retiré) et/ou,

- les extraits secs (brut ou éthanolique) de marc de raisin fermentés.

[0023] Les propriétés mises en avant par les Inventeurs pour le marc de raisin fermenté (à savoir des propriétés anti-oxydantes, anti-inflammatoires et anti-diabétiques) les rendent particulièrement intéressants pour leur utilisation dans des compléments alimentaires ou nutraceutiques mais également dans le domaine de la cosmétique, et plus particulièrement dans des nutricosmétiques ou des produits dermocosmétiques.

Ainsi, un autre objet de l’invention réside dans l’utilisation d’un marc de raisin susceptible d’être obtenu ou obtenu selon le procédé de préparation de l’invention, dans des compléments alimentaires, lesdits compléments alimentaires pouvant se trouver sous la forme d’un solide ou d’un liquide.

A titre d’exemple d’un complément alimentaire sous forme solide on pourra citer les comprimés, gélules, capsules, sachets, poudres etc. .

A titre d’exemple d’un complément alimentaire sous forme liquide, on pourra citer des solutions buvables, sirops, ampoules, monodoses à boire, poudres à diluer mais également des boissons de kombucha de marc de raisin.

Encore un autre objet de l’invention réside dans l’utilisation d’un marc de raisin susceptible d’être obtenu ou obtenu selon le procédé de préparation de l’invention, dans des nutricosmétiques ou dans des produits dermocosmétiques.

Les nutricosmétiques sont plus particulièrement définis comme des compléments alimentaires absorbés par voie orale pour améliorer l’apparence et la santé de la peau, des ongles et des cheveux. Ils peuvent se présenter sous les mêmes formes qu’un complément alimentaire (forme solide ou liquide).

Les produits dermocosmétiques, comme leur nom l’indique, se trouvent sous une forme adaptée pour une application cutanée (peau, cuir chevelu, cheveux etc.). Ils peuvent se présenter sous la forme d’une crème, d’un gel, d’une lotion, d’un shampoing etc.

Lorsque le marc de raisin fermenté est utilisé dans des compléments alimentaires, nutraceutiques, nutricosmétiques ou produits dermocosmétiques, il peut encore être associé à d’autres ingrédients tels que des vitamines, minéraux, acides gras etc.

Brève description des dessins

[0024] D’autres caractéristiques, détails et avantages apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après, et à l’analyse des dessins annexés.

Fig. 1

[0025] [Fig. 1] illustre respectivement le profil HPLC-DAD (280 nm caractéristique des composés phénoliques) d’un extrait sec brut de marc de raisin fermenté du cépage Cabernet Franc (au 12 ^e jour de fermentation) (chromatogramme du haut) et d’un extrait sec brut de marc de raisin non fermenté (JO fermentation) du cépage Cabernet Franc (chromatogramme du bas).

Fig. 2

[0026] [Fig. 2] illustre respectivement le profil HPLC-DAD (280 nm caractéristique des composés phénoliques) d’un extrait sec éthanolique de marc de raisin fermenté du cépage Cabernet Franc (au 12 ^ème jour de fermentation) (chromatogramme du haut) et d’un extrait sec éthanolique de marc de raisin non fermenté (JO fermentation) du cépage Cabernet Franc (chromatogramme du bas).

Fig. 3

[0027] [Fig. 3] illustre l’activité anti-inflammatoire, par mesure du pourcentage d’inhibition de l’enzyme 15 lipoxygénase (15-LOX) d’un extrait sec éthanolique de marc de raisin fermenté du cépage Cabernet Franc (au I2 ^ème jour de fermentation) (histogramme de droite) et d’un extrait sec éthanolique de marc de raisin non fermenté (J0 fermentation) du cépage Cabernet Franc (histogramme de gauche) dissous à 50 pg/mL.

Fig. 4

[0028] [Fig. 4] illustre l’activité antioxydante, par mesure du pourcentage d’inhibition de l’oxydation du radical 2,2-diphényl 1-picrylhydrazyle (DPPH), d’un extrait sec éthanolique de marc de raisin fermenté du cépage Négrette (au I2 ^ème jour de fermentation) (histogramme de droite) et d’un extrait sec éthanolique de marc de raisin non fermenté (J0 fermentation) du cépage Négrette (histogramme de gauche) dissous à 50 pg/mL.

Fig. 5

[0029] [Fig. 5] illustre l’activité antidiabétique, par mesure du pourcentage d’inhibition (IC50 pg/mL) pour les enzymes alpha-amylase (voir les deux histogrammes les plus à gauche) et alpha glucosidase (voir les deux histogrammes les plus à droite), d’un extrait sec éthanolique de marc de raisin fermenté d’un mélange de Cabernet franc, Cabernet Sauvignon et Malbec (au 5 ^ème jour de fermentation) (voir les histogrammes gris foncé : J5 fermentation) et d’un extrait sec éthanolique de marc de raisin non fermenté d’un mélange de Cabernet franc, Cabernet Sauvignon et Malbec (voir les histogrammes gris clair : J0 fermentation). Les extraits ont été dissous à 50 pg/mL.

Description des modes de réalisation

[0030] Les dessins et la description ci-après pourront non seulement servir à mieux faire comprendre la présente invention, mais aussi à contribuer à sa définition, le cas échéant. Dans les exemples ci-dessous il est fait référence aux Figues 1 à 5. Exemples

[0031] Exemple 1

[0032] Préparation de marcs de raisin fermentés

[0033] Quatre marcs de raisin provenant respectivement des cépages noirs Cabernet Franc, Malbec, Négrette et Syrah sont respectivement fermentés selon le procédé de l’invention. Le procédé de préparation décrit dans cet exemple est notamment effectué par addition de kombucha dans l’infusion de marc de raisin. La première étape décrite ci- dessous concerne la préparation du kombucha.

[0034] Préparation d’un kombucha de 15 jours de fermentation

Une quantité de 1 L de kombucha est préparée à partir d’une infusion de thé noir de Ceylan selon le protocole suivant.

Afin de tenir compte de l’évaporation pendant l’infusion et le refroidissement, une quantité d’eau légèrement supérieure à 1 L est chauffée à environ 35°C puis 70 g de saccharose sont ajoutés afin d’obtenir une eau sucrée d’une concentration d’environ 70 g/L. La température est augmentée à 80°C (+/- 2°C) puis une quantité de 10 g de thé noir est ajoutée afin d’obtenir une concentration d’environ 10 g/L de thé. Le thé, contenu dans un sac en gaze, est laissé à infuser pendant environ 15 minutes, en le remuant de façon régulière, puis le sac de gaze comprenant le thé est retiré afin d’obtenir l’infusion de thé. L’infusion de thé est ensuite laissée à refroidir à une température inférieure à 30°C (de préférence environ 25°C).

Dans un récipient de type bêcher en verre sont ajoutés les ingrédients suivants :

- 970 mL d’infusion de thé noir sucrée telle qu’obtenue à l’étape ci-dessus décrite,

- 10 mL de vinaigre de cidre,

- 20 g de scoby,

- 20 mL de kombucha.

La première fois que le kombucha est préparé, les Inventeurs ont acheté un scoby de thé noir sur le site www.je-mange-vivant.com. De même le kombucha utilisé (dans la préparation du kombucha) est un kombucha de thé noir commercialisé par la société Germline.

Le récipient est recouvert d’une gaze.

La fermentation est effectuée pendant une durée de 15 jours, à l’abri de la lumière et à une température d’environ 25°C.

A l’issue de la fermentation on obtient environ 850 mL de kombucha. Une partie de ce kombucha sera utilisée dans le procédé de préparation du marc de raisin fermenté tandis qu’une autre partie dudit kombucha sera conservée pour être utilisée dans la préparation d’un nouveau kombucha. Ce kombucha sera dénommé dans ce qui suit « kombucha de 15 jours de fermentation ».

De même, à l’issue de la fermentation on obtient environ 100 g de scoby. Le bébé de kombucha (nouveau scoby) est séparé de la mère de kombucha (scoby d’origine). Une partie du nouveau scoby sera utilisée dans le procédé de préparation du marc de raisin fermenté tandis qu’une autre partie sera conservée pour être utilisée dans la préparation d’un nouveau kombucha. Ce scoby sera dénommé dans ce qui suit « scoby provenant d’un kombucha de 15 jours de fermentation ».

Le scoby provenant du kombucha de 15 jours de fermentation comprend en majorité les bactéries Komagataeibacter rhaeticus, Gluconacetobacter et Gluconobacter et les levures Brettanomyces et Schizosaccharomyces. Ce scoby est proche de celui identifié dans le document Villarreal-Soto et al. ¹ .

[0035] Préparation de l’infusion de marc de raisin

Le procédé de l’invention décrit ci-dessous est réalisé avec un marc de raisin provenant du cépage Cabernet Franc. Cependant le même procédé est appliqué avec les marcs de raisin provenant respectivement des cépages Malbec, Négrette et Syrah. Les marcs de raisin Cabernet Franc, Malbec, Négrette et Syrah se présentent sous la forme d’un résidu solide très friable.

Dans cet exemple on utilise plus particulièrement des résidus secs de marc de raisin.

Une quantité de 1 ,2 L d’eau est chauffée à environ 35°C puis une quantité de 50 g de saccharose est ajoutée afin d’obtenir une eau sucrée d’une concentration d’environ 40 g/L. La température est augmentée à environ 80°C (+/- 2°C) puis une quantité de 150 g de marc de raisin sec est ajoutée dans un sac de gaze de sorte à obtenir relation matière sèche-eau d’environ 70 g de marc de raisin sec par litre d’eau.

Le marc de raisin mis au contact de l’eau sucrée est laissé à infuser pendant environ 15 minutes à une température d’environ 80°C avec une agitation continue automatisée à 1200 rpm dans un bêcher de 2 litres. L’infusion de marc de raisin est séparée du sac de gaze comprenant le résidu insoluble de marc de raisin.

L’infusion de marc de raisin ainsi obtenue est laissée à refroidir à une température inférieure à 30°C (de préférence environ 25°C). Une quantité d’environ 0,5 g/L de sulfate d’ammonium ((NH ₄ ) ₂ SO ₄ ) est ajoutée dans l’infusion de marc de raisin refroidie.

[0036] Fermentation de l’infusion de marc de raisin

Dans un récipient de type bêcher en verre sont ajoutés les ingrédients suivants :

- 980 mL d’infusion de marc de raisin obtenue à l’étape ci-dessus décrite,

- 20 mL du kombucha de 15 jours de fermentation (obtenu à l’étape ci-dessus décrite),

- 20 g de scoby provenant d’un kombucha de 15 jours de fermentation (obtenu à l’étape ci- dessus décrite).

Le récipient est recouvert d’une gaze.

La fermentation de l’infusion de marc de raisin est effectuée pendant une durée de 12 jours, à l’abri de la lumière et à une température d’environ 25°C, sans agitation.

A l’issue de la fermentation on obtient environ 850 mL d’infusion de marc de raisin fermentée. Le scoby est retiré de l’infusion afin de récupérer l’infusion de marc de raisin fermentée sans le scoby. L’infusion de marc de raisin fermentée sans le scoby est le kombucha de marc de raisin, et plus particulièrement le kombucha de marc de raisin Cabernet Franc.

Les kombucha de marc de raisin Malbec, Négrette et Syrah sont obtenus de la même façon que le kombucha de marc de raisin Cabernet Franc.

[0037] Les quantités ci-dessus définies sont ajustées pour préparer 20 à 50L de kombucha de marc de raisin.

Plusieurs géométries de cuve peuvent être utilisées avec des rapports hauteur/diamètre variant de 0,7 à 1 ,4. Les dispositifs d’agitation peuvent fonctionner en intermittence ou en continu.

Les fermentations peuvent être réalisées avec ou sans apport d’air par microbullage dans le liquide par un dispositif de type céramique ou bulleur à aquarium.

[0038] Préparation des extraits secs bruts de marc de raisin fermentés

Chacune des infusions de marc de raisin fermentée obtenue à l’étape précédente (quantité obtenue = 850 mL) est centrifugée à 10000 rpm pendant 10 minutes.

Le surnageant présent à la surface de chacune des infusions à l’issue de la centrifugation est prélevé. Un échantillon de chacun de ces surnageants, d’environ 300 mL, est déposé dans un ballon de 500 mL pour évaporation à 35°C / 30 rpm jusqu’à un vide de 10 mbar ± 2 mbar.

Les extraits secs bruts obtenus sont d’aspect bruns et visqueux et présentent chacun une masse d’environ 2 à 3,5 g à partir des 300 mL du surnageant. Ce rendement varie en fonction du cépage et des conditions de fermentation (paramètres du procédé, cépage, durée...).

Une partie des extraits secs bruts ainsi obtenus est stockée à une température de -20°C jusqu’à leur utilisation pour les analyses de leurs activités biologiques.

Une autre partie des extraits secs bruts est transformée en extraits secs éthanoliques.

A titre indicatif, une quantité d’environ 10 à 20 g d’extrait sec brut est obtenue par litre de kombucha de marc de raisin évaporé. Ce rendement varie en fonction du cépage et des conditions de fermentation (paramètres du procédé, cépage, durée...). [0039] Préparation des extraits secs éthanoliques de marc de raisin fermentés

Les extraits secs bruts utilisés pour préparer les extraits secs éthanoliques peuvent être des extraits secs bruts frais (non congelés) ou alors des extraits congelés. Si l’extrait sec brut a été congelé, il faut commencer par le décongeler.

Une quantité de 20 mL d’éthanol absolu est ajoutée à 1g d’extrait sec brut (frais ou décongelé). Le mélange obtenu est agité pendant environ 1 heure à l’aide d’une plaque magnétique. Le mélange éthanolique obtenu à l’issue de l’agitation est récupéré puis est filtré deux fois avec du papier filtre 0,22 m. La solution éthanolique obtenue à l’issue des deux filtrations est évaporée à 35°C à une vitesse de rotation de 200-250 rpm/min jusqu’à l’obtention d’un extrait sec (éthanolique).

Les extraits secs éthanoliques sont d’aspect brun/rouge et peu visqueux. Ils présentent chacun une masse d’environ 100 à 300 mg.

Pour les extraits secs éthanoliques les rendements varient de 10 à 30% par rapport à l’extrait sec brut.

[0040] Exemple 2

[0041 ] Profil chimique et étude des activités biologiques des extraits secs de marc de raisin fermentés

[0042] Le profil chimique et les activités biologiques des extraits secs (bruts et éthanoliques) ont été étudiées in vitro via:

- l’étude de leurs profils phénoliques par HPLC-DAD,

- leur activité anti-inflammatoire 15-LOX,

- leur activité antioxydante DPPH,

- leur activité antidiabétique (alpha-glucosidase et alpha-amylase).

Les études ont été effectuées sur les extraits secs (brut et éthanolique) de kombucha de marc de raisin de Cabernet Franc, Malbec, Négrette et Syrah ou sur leurs mélanges. Les résultats obtenus sont semblables pour les 4 types de cépage ainsi que pour leurs mélanges.

Par ailleurs, les extraits secs (brut et éthanolique) de kombucha de marc de raisin de Cabernet Franc ont été comparés avec des extraits secs (brut et éthanolique) de marc de raisin non fermenté.

[0043] Préparation des extraits secs (brut et éthanolique) de marc de raisin non fermenté L’infusion de marc de raisin est préparée selon le procédé décrit précédemment (voir paragraphe « Préparation de l’infusion de marc de raisin »), avec ajout de sulfate d’ammonium à l’issue du refroidissement.

Les extraits secs de marc de raisin non fermenté sont préparés à partir de l’infusion de marc de raisin (non fermentée) selon un protocole identique à celui décrit précédemment pour les extraits secs brut et éthanolique de marc de raisin fermenté à partir de l’infusion de marc de raisin fermentée. Ainsi les extraits secs brut de marc de raisin non fermenté sont préparés dans un premier temps à partir de l’infusion de marc de raisin non fermentée, puis les extraits secs éthanoliques sont préparés à partir des extraits secs brut.

Les extraits secs brut de marc de raisin non fermenté sont d’aspect brun/rouge et visqueux. Ils présentent chacun une masse d’environ 10 à 20 g à partir d’un litre d’infusion de marc.

Les extraits secs éthanolique de marc de raisin non fermenté sont d’aspect brun/rouge et visqueux. Ils présentent chacun une masse d’environ 100 à 300 mg à partir de 1 g d’extrait sec brut de marc de raisin.

[0044] Profils phénoliques par HPLC-DAD

Les profils phénoliques des extraits secs brut et éthanolique des kombucha de marc de raisin ont été analysés par HPLC-DAD en phase inverse. La détection des composés a été réalisée à une longueur d’onde de 280 nm.

Afin de les analyser, les extraits secs ont été dissous à 20 mg/ml dans un mélange eau/acétonitrile.

La phase mobile est constituée de A : Eau acidifiée (acide acétique, pH 2.65) et B : mélange d’eau acidifiée-acétonitrile (20 :80 v/v) avec un débit d’élution de 1 ,2 ml/min.

Les échantillons ont été élués par le gradient de 12% B à 30% B pendant 35 min, de 30% B à 50% pendant 5 min, de 50% B à 88% B pendant 5 min et enfin de 88% B à 12% B pendant 15 min. La colonne utilisée est C18 (Phenomenex), 25 cm x 4,6 mm de granulométrie 5 pm.

Les extraits secs bruts et éthanoliques plus particulièrement étudiés dans cet exemple sont ceux provenant du cépage Cabernet Franc.

L’extrait sec brut de marc de raisin de 12 jours de fermentation est comparé avec l’extrait sec brut de marc de raisin non fermenté (Figure 1 ).

Les effets de la fermentation sur le profil HPLC-DAD sans extraction à l’éthanol sont illustrés à la Figure 1. « J0 fermentation » signifie que l’extrait est un extrait de marc de raisin non fermenté.

Le chromatogramme proche de la ligne de base est celui de l’extrait sec brut de marc de raisin non fermenté (J0 fermentation) tandis que celui du haut est celui de l’extrait sec brut de marc de raisin fermenté au jour J12. Il ressort nettement de la Figure 1 la formation de nouveaux composés pendant l’étape de fermentation.

De la même façon, l’extrait sec éthanolique de marc de raisin de 12 jours de fermentation est comparé avec l’extrait sec éthanolique de marc de raisin non fermenté (voir Figure 2).

Les effets de la fermentation sur le profil HPLC-DAD avec extraction à l’éthanol sont illustrés à la Figure 2. Le chromatogramme proche de la ligne de base est celui de l’extrait sec éthanolique de marc de raisin non fermenté (JO fermentation) tandis que celui du haut est celui de l’extrait sec éthanolique de marc de raisin fermenté au jour J12. Il ressort nettement de la Figure 2 la formation de nouveaux composés pendant l’étape de fermentation.

[0045] Activité anti-inflammatoire15-LOX

Les extraits secs (bruts et éthanoliques) de kombucha de marc de raisin ont été solubilisés dans du DMSO pur puis dilués, de sorte à atteindre une concentration de 50 pg/mL et 1 % de DMSO, et ont été testés pour leur activité inhibitrice de l’enzyme 15 lipoxygénase.

L’extraits sec éthanolique de marc de raisin fermenté plus particulièrement étudié dans cet exemple (au 12 ^ème jour de fermentation) provient du cépage Cabernet Franc (1 g/L) et est comparé avec l’extrait sec éthanolique du même marc de raisin non fermenté (JO fermentation).

Les résultats obtenus sont illustrés à la Figure 3. Il ressort clairement de cette figure l’activité anti-inflammatoire améliorée de l’extrait éthanolique de marc de raisin fermenté versus l’extrait éthanolique de marc de raisin non fermenté.

[0046] Activité antioxydante DPPH

L'activité antioxydante du kombucha de marc de raisin a été évaluée par la détermination de l'activité anti-radicalaire avec la méthode au radical « 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle » ou DPPH.

Elle s’exprime par le pourcentage d’inhibition de l’oxydation des radicaux DPPH présents dans le milieu réactionnel par l’extrait éthanolique dissous dans du DMSO à 50 pg/mL.

Les résultats obtenus sont illustrés à la Figure 4 pour le cépage Négrette. Il ressort clairement de cette figure l’amélioration de l’activité antioxydante de l’extrait éthanolique de marc de raisin après fermentation (au I2 ^ème jour de fermentation) par rapport l’extrait éthanolique de marc de raisin non fermenté (J0 fermentation).

[0047] Activité antidiabétigue

Les extraits secs éthanoliques de kombucha de marc de raisin d’un mélange de Cabernet franc, Cabernet Sauvignon et Malbec au 5 ^ème jour de fermentation (J5 fermentation) ont été dilués dans du DMSO pur, de sorte à atteindre une concentration de 50 pg/mL. Ces extraits ont été comparés aux extraits éthanoliques de marc de raisin non fermentés (J0 fermentation) d’un mélange de Cabernet franc, Cabernet Sauvignon et Malbec et ont été testés pour leur activité inhibitrice respectivement de l’enzyme alpha glucosidase (voir Figure 5, les deux histogrammes du côté droit) et de l’enzyme alpha amylase (voir Figure 5, les deux histogrammes du côté gauche). Les histogrammes gris foncé représentent l’extrait sec éthanolique de kombucha de marc de raisin au 5 ^ème jour de fermentation tandis que les histogrammes gris clair représentent l’extrait sec éthanolique de marc de raisin non fermenté (JO fermentation). Il ressort clairement de la Figure 5 l’amélioration de l’activité antidiabétique de l’extrait éthanolique de marc de raisin au 5 ^ème jour de fermentation par rapport à l’extrait éthanolique de marc de raisin non fermenté, et ceci pour les deux enzymes (alpha glucosidase et alpha amylase). Liste des documents cités

Littérature non-brevet

[0048] À toute fin utile, l’élément non-brevet suivant est cité :

- nplcitl : Villarreal-Soto SA, Bouajila J*, Pace M, Leech J, Cotter PD, Souchard JP, Taillandier P. Beaufort S. Metabolome-microbiome signatures in the fermented beverage, Kombucha. International Journal of Food Microbiology 2020, 333, 16 November 2020, 108778 (1).