CAMPO DE LA INVENCIÓN La solicitud hace referencia a un método que permite el almacenamiento, transporte y entrega de propágalos fúngicos en una matriz polimérica que corresponde a microfibras o nanofibras que llevan total o parcialmente encapsulados propágulos infecciosos entre láminas fibrosas o bien adheridos sobre su superficie, en específico a la creación de un material biohíbrido (fibra + hongo) que nos permite incorporar unidades celulares de determinados hongos en fibras, con aplicaciones en la agricultura, horticultura, silvicultura, remediación ecológica y áreas afines.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los fertilizantes constituyen unos de los requerimientos más importantes para el mantenimiento de la fertilidad del suelo. Sin embargo, típicamente los nutrientes aplicados en sus diferentes formas químicas no son totalmente accesibles para las plantas ya que son depositados en sus formas poco solubles en el suelo dando lugar a problemas agroecológicos. En virtud de desarrollar insumos rentables y respetuosos para el medio ambiente los biofertilizantes han ganado un importante interés como sustituto parcial o total de los fertilizantes químicos. Estos biofertilizantes conocidos como inóculos microbianos son formulaciones que contienen uno o más microorganismos que una vez aplicado a las hojas, suelo, raíces o semillas colonizan la rizosfera o el interior de las plantas promoviendo el desarrollo vegetal.

Los hongos son un tipo de organismos utilizados ampliamente como insumo biológico, en busca de soluciones naturales para la nutrición de las plantas, fortalecimiento de los cultivos, control biológico de fitopatogenos y otras formas del mejoramiento del suelo y estado vegetativo. Sin embargo, su eficacia puede estar limitada por la indisponibilidad de portadores adecuados que permitan mantener la viabilidad celular ante la presencia de factores bióticos y abióticos desfavorables que puedan causar una disminución significativa en las poblaciones microbiológicas una vez aplicados al suelo. Formulaciones convencionales de inoculantes fúngicos de interés agrícola se presentan en sistema de entregas incluyen soluciones liquidas, materiales inertes como la arena, arcilla, carbón, vermiculita, perlita, perlas de hidrogeles, polvos comprimidos, gránulos o píldoras y materiales orgánicos como turba y compostas. Sin embargo, la aplicación de muchas de estas formuiaciones a gran escala resulta económicamente prohibitiva, ya que requeriría la propagación no dirigida del inoculo a grandes áreas lo que representa un alto costo por planta.

En invenciones anteriores, se han realizado métodos que permiten la entrega de ingredientes activos en redes de poliméricas fibrosas la solicitud WO201 4182799 “NANOFIBRAS BIOACTIVAS QUE CONTIENE SUSTANCIAS Y USO DE LAS MISMAS”, publicada el 13-11-2014 describe una fibra ultrafina que comprende un cuerpo fibroso a base de cerámica y una sustancia biológicamente activa encapsulada en el cuerpo, sustancialmente encapsulada en el cuerpo o unida a la superficie del cuerpo. En un ejemplo, una fibra ultrafina comprende un núcleo que comprende una sustancia biológicamente activa y una cubierta a base de cerámica que rodea o rodea sustancialmente el núcleo.

La solicitud WO2017040655 “ENTREGA DE AGENTES ACTIVOS QUE UTILIZAN WEBS DE NANOFIBRAS”, publicada el 09-03-2017, describe un sistema de suministro de agente activo que comprende una red de nanofibras y un agente activo transportado por la red de nanofibra. sin embargo, estas dos realizaciones están orientadas a la incorporación de sustancia activas más no a agentes celulares microbiológicos.

Por su parte, la inmovilización de cuerpos celulares en matrices poliméricas fibrosas se ha llevado acabo por métodos que involucran la encapsulación de unidades celulares en polímeros, la solicitud US8367109 “MICROBIOS ENCAPSULADOS DENTRO DE POLÍMEROS RETICULABES", publicada 15- 10-2009, se refiere a películas porosas que comprenden fibras de hidrogel electrohiladas reticuladas. Los microbios viables se encapsulan dentro de las fibras de hidrogel electrohiladas reticuladas. Las fibras de hidrogel electrohiladas reticuladas son insolubles en agua y permeables. La invención también se refiere a métodos para fabricar y usar tales películas porosas.

La solicitud WO2012/064287 “UNA FIBRA POROSA, MÉTODOS DE HACER LO MISMO Y USOS DE LOS MISMOS”, publicada el 18-05-2012, proporciona una fibra porosa que tiene una configuración núcleo-carcasa, en la que los poros de la fibra están configurados para encapsular y, por lo tanto, retener un material biológico en la misma.

En ambos casos los métodos se pueden ver limitados al intentar encapsular unidades celulares de grandes dimensiones como pueden ser esporas fúngicas con tamaños de 40-150 pm.

En otras realizaciones, se han incorporado estructuras microbiológicas mediante la adherencia del material biológico de interés en nanofibras con aplicaciones agrícolas e industriales, la solicitud WO2017/006345 “UN PORTADOR DE POLÍMERO DE NANOFIBRA DE PESO ULTRA LIGERO PARA USO EN APLICACIONES AGRÍCOLAS E INDUSTRIALES”, publicada el 12-01-2017, describe un soporte de polímero de nanofibras ultraligero para uso en aplicaciones agrícolas e industriales. El método propuesto para preparar el material de soporte de polímero de nanofibras ultraligero puede ser una solución eficaz para proporcionar un soporte de polímero ligero soluble en agua de agentes bioactivos / microorganismos para su uso en microorganismos agrícolas e industrialmente importantes y sus productos y biomoléculas relacionadas.

Sin embargo, las realizaciones mencionadas parten de mezclas uniformes entre el material polimérico y el ingrediente biológico para la producción del material biohibrido, hecho que pone en riesgo el estado dormintancia de determinados sistemas biológicos y en consecuencia la viabilidad celular de los sistemas biológicos de Interés como es el caso de las esporas de los hongos micorrizicos arbusculares. Por tanto, existe la necesidad de un método que permita la elaboración de un sistemas de entrega de baja densidad, poco volumen y gran área superficial para Incorporación de unidades fúngicas Interés agrícola, ecológico e Industrial sin entrar en conflicto con a las dimensiones de las estructuras biológicas que se pretende Incorporar, permitiendo preservar la viabilidad celular y liberación controlada de Inoculantes mlcotlcos con diferentes estrategias de aplicación de modo que se pueda obtener el máximo provecho de sus características funcionales asociadas al crecimiento, protección y desarrollo vegetativo.

La solicitud Lo que se propone es un método que da lugar a un material biohibrido (fibra + hongo) que nos permite Incorporar unidades celulares de determinados hongos en fibras, ya que se entiende que realizaciones previas (permiten la Incorporación de sustancias químicas y otros agentes biológicos) no son las adecuadas para este grupo específicos de microorganismos.

DESCRIPCION DE LA INVENCIÓN

La terminología presentada en este documento tiene como objetivo describir ejempllflcaclones particulares y no pretender ser limitativas de la Invención presentada. El término “o” es utilizado para Indicar la manera en que puede llevarse a cabo dos o más alternativas planteadas. El sustantivo “como” y las formas conjugadas del verbo “poder” se utiliza en este documento referirse a cómo pueden estar constituido los elementos de la Invención y la manera que puede llevarse a cabo realizaciones particulares de forma ejemplificativa sin restringirse en absoluto su alcance. El adjetivo “biodegradable” en esta realización hace referencia a materiales que tienen la capacidad de descomponerse, de forma segura y relativamente rápida por medios biológicos en las materias primas de la naturaleza y desaparecer en el medio ambiente. El adjetivo “biocompatible” hace referencia a un material que no provoca ningún efecto indeseable local o sistémico sobre un cuerpo biológico o medio biológico sobre el cual se utiliza, en este caso hongos, plantas y seres humanos.

La presente invención se basa en un método para producir una matriz polimérica fibrosa como sistema de entrega de propágulos fúngicos, es decir estructuras micoticas independientes capaces de propagarse. Los propágulos fúngicos en este documento corresponden a hongos de interés agrícola como pueden ser ejemplares del genero Trichoderma y del grupo de las micorrizas.

A partir de esta realización, el sistema de entrega se caracteriza por estar constituido por nanofibras o microfibras elaboradas con polímeros biodegradables y biocompatibles, los cuales pueden ser sintéticos o naturales, como pueden ser la celulosa, quitosano, alginato cálcico, quitina, colágeno, alcohol polivinilico (PVA), oxido de polietileno (PEO), carboximetilcelulosa (CMC) y polivinilpirrolidona (PVP). La realización incluye soluciones poliméricas uniformes constituidas por polímeros independientes o mezcla de varios polímeros disueltos en agua, en algún solvente orgánico o mezcla de solventes. La fabricación del material fibroso constituido por nanofbras o microfibras se puede realizar por técnicas como electrohilatura, auto-ensamblaje, separación de fases-térmica inducida, polimerización, síntesis sonoquimica, síntesis por plantilla, inducción plasmática, hilatura centrífuga e escritura electrohidrodinamica.

La realización también hace una referencia a método el cual se incorporan propágulos de hongos que pueden haber sido tratados con alguna técnica como la desecación, congelación o liofilización y presentarse en forma de geles, polvos comprimidos, pastillas o capsulas y en donde la incorporación de las unidades fúngicas puede llevarse a cabo con la encapsulación total o parcial de las mismas entre laminas fibrosas o bien sobre la superficie de las misma durante la síntesis de las fibras en dirección al flujo dispensador, perpendicular o angular a este. De la misma manera, se hace referencia a un sistema en entrega que permite mantener los propágulos viables hasta su liberación para ser aplicado con diferentes estrategias de inoculación durante la siembra, el transplante o en el tratamiento de semillas en los distintos campos de la agricultura, silvicultura, horticultura y restauración ecológica.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

Figura 1. Raíz micorrizada de semilla recubierta con inoculante incorporado de fibras de PEO. Se observan múltiples vesículas (V) e hifa interna (H).

Figura 2. Imagen del SEM de fibras de óxido de polietileno (PEO) sin el inoculante micorrízoco.

Figura 3. Imagen del SEM con el inoculante adherido a la fibra.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Los parámetros aquí planteados en estos ejemplos no son restrictivos y pueden ser variables. Se hacen referencia para ilustrar una realización con la invención planteada.

Realización practica 1. Preparación de solución polimérica.

Se elaborarán soluciones de alcohol polivinílico (PVA), (Mw 85, 000-124; 000; 99 + % hidrolizado) al 5%-10%, oxido de polietileno (PEO) (Mw 200,000), al 3%- 10% y polivinilpirrolidona (PVP), (Mw 1 , 300,000) al 15% -20%. Se elaboró una solución de alcohol polivinílico (PVA), (Mw 85,000-124,000; 99 + % hidrolizado), entre 5%-10%. Los polímeros son disueltos en agua destilada en un baño termostático con agitación a 85°C durante 1 hora para obtener una solución uniforme. Las soluciones resultantes se esterilizan en autoclave a 121 °C y 15 Ib de presión por 15 minutos y luego se almacenan a 4°C hasta su uso. Realización practica 2. Elaboración de las fibras poliméricas e incorporación del inoculante micorrízico.

El proceso de elaboración del material fibroso es realizado utilizando la técnica de hilatura por centrifugación (centrifuga! spinning). Las soluciones poliméricas elaboradas previamente son depositadas en el núcleo hilador gradualmente y las fibras son producidas utilizando agujas hipodérmicas de 27G x 1/2” hasta generar una cantidad densa de fibras en las barras verticales colectoras. Los parámetros para hilatura por centrifugación se establecieron como los siguientes: distancia al colector, 15 cm; humedad relativa del medio, 35%; temperatura del entorno 21 °C.

Las láminas fibrosas son colectadas y se les fueron adheridas sobre su superficie un inoculante en polvo del hongo endomicorrízico arbuscular Rhizophagus irregularis anteriormente conocido como Glomus intraradices. El proceso se genera hasta obtener una lámina fibrosa compuesta por tres láminas de fibras superpuestas.

Realización practica 3. Pruebas de i Afectividad micorrízica.

Para verificar la capacidad infectada de los propágalos micorrízicos adheridos en el andamio fibroso se realiza un recubrimiento multicapa sobre semillas de frijol rojo ( Phaseolus vulgaris L) previamente desinfectadas por inmersión en una solución acuosa de 10% de hipoclorito de sodio durante 5 minutos y luego se realizan tres lavados sucesivos con agua destilada. Las semillas tratadas son sembradas en macetas de plástico (1/2 galón) a 5 cm de profundidad con un sustrato previamente esterilizado de turba Sphagnum canadiense, perlita y dolomita. Se realiza un control negativo con las mismas directrices y un control positivo correspondiente a un método convencional de inoculación en donde ías plantas reciben 4 g del inoculante a 2 cm por debajo de una semilla sin recubrimiento. Después de 30 días las plantas tratadas son cosechadas y es separado el sistema radicular del resto de las plantas para detectar la presencia de estructuras micorrizicas en las raíces utilizando la tinción de azul de triptano al 0.05% en lactoglicerol. Para cuantificar el porcentaje de micorrízación radicular se utiliza el método de intercepción de cuadrantes el cual arrojo un porcentaje de infectividad del 58.30% para el control positivo y un 60.0% para el PVP lo cual demuestra que la capacidad infectividad de los propágulos no se vio afectada al estar adheridos a las fibras poliméricas y contener entre un 85%-75% menos del inoculo fúngico con respecto al método de inoculación convencional.