Verfahren zur Herstellung von Gemcitabin-Hydrochorid und Zwischenprodukte

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Gemcitabinderivaten oder Gencitabin-Hydrochlorid (2 ' -Desoxy-2 ' ,2 ' -difluorocytidin-Hydrochlorid), sowie 4-[(l,l-Dimethyl)amidino]-2-trimethylsilyloxy-pyrimidin 4c und 2-[4-(2- Trimethylsilyloxy)pyrimidyl] -1,1,3 ,3 -tetramethylguanidin. 4d als Zwischenprodukte des Verfahrens.

Pyrimidin- und Purin-Nukleoside, so auch Gemcitabinderivate oder Gencitabin- Hydrochlorid [CAS-Nummer 95058-81-4, J. Org. Chem. 53, 2406 (1998); Biochemistry 37, 5528 - 5535 (1998)], haben als wirksame und selektive Cytostatika eine grosse Bedeutung in der Therapie von Tumoren erlangt.

Zur Darstellung von Cytidinen der Formel 2 wird Cytosin Ia oder N ⁴ -Acetyl- cytosin Ib durch Erhitzen mit Silylierungs-Reagenzien wie Hexamethyldisilazan (HMDS) werden in die entsprechenden persilylierten basischen Derivate 2a und 2b überfuhrt (siehe Schema 1) Bei der elektrophilen N^Substitution von silyliertem Cytosin 2a bei der Silyl- Hilbert- Johnson Reaktion oder bei der nukleophilen Verdrängung einer austretenden Gruppe durch den N^Stickstoff des silylierten Cytosins 2a spielt die Basizität des heterozyklischen Rings, d.h. die Elektronendichte am N ^! -Stickstoff eine große Rolle. Diese Basizität des N^Stickstoffs des silylierten Cytosins 2a nimmt beim silylierten N ⁴ -acetat 2b im Vergleich zu 2a ab, was für die Synthese von Cytidin oder Cytidin- Analoga bei der Silyl-Hilbert- Johnson Reaktion ausgehend von peracylierten Zuckern in Gegenwart von Lewis Säure Katalysatoren wie Trimethylsilyltriflat oder Zinntetraachlorid (SnCl ₄ ) von Vorteil ist! Die verringerte Basizität von 2b führt nämlich zu einer verminderten Bildung von σ-Komplexen zwischen dem basischen N^-Stickstoff in 2b und der Lewis

Säure und damit zu einer reduzierten Bildung der unerwünschten N ³ -Nukleoside und so insgesamt zu einer erhöhten Ausbeute an den erwünschten N ¹ - Nucleosiden! (H.Vorbrüggen und C.Ruh-Pohlenz, Handbook of Nucleoside Synthesis, Wiley-Interscience Publication, New York, 2001) Bei der nukleophilen Verdrängung einer austretenden Gruppe wie z.B. 1- Halogen, 1-O-Mesylat, 1-O-Tosylat, 1-O-Benzolsulfonat, 1-O-Triflat oder 1- Nonaflat einer 3.5-bis-O-geschützten (O-acylierten- oder O-silylierten) D- Ribofuranose ist jedoch eine verstärkte Basizität bzw. Nukleophilie der silylierten Cytosine erwünscht, um selbst unter milden Reaktionsbedingungen mit äquivalenten Mengen der eingesetzten silylierten Cytosin-Derivate eine Nukleosid-Bildung zu erreichen.

Um die Basizität bzw. Nukleophilie des persilylierten Cytosins 2a zu erhöhen wurde deshalb Cytosin Ia mit einem leichten überschuss an Dimethyl- formamid-di(isopropyl)acetal bei 9O ⁰ C in Gegenwart von katalytischen Mengen an Trifluoressigsäure in das N ⁴ - [(Dimethylamino)methylen] -cytosin 3c überführt. (R.S.Hosmane; NJ.Leonard J.Org. Chem. 1981, 46, 1457). Bei vorsichtiger Reaktionsfuhrung kann auch das preiswerte DMF-dimethylacetal eingesetzt werden, ohne dass schon eine Methylierung des ^-Stickstoffs in 3a einsetzt. (D.L.Helfer, R.S.Hosmane, NJ.Leonard, J.Org.Chem. 1981, 46, 4803) Ferner lässt sich Cytosin 1 mit dem N,N-Dimethylformamidinium Methyl- sulfonat, das durch Reaktion von DMF mit Dimethylsulfat leicht zugänglich ist (HBredereck, F. Effenberger, G.Simchen, Chem.Ber. 1963, 96, 1350), in Gegenwart eines tert.Amins wie Triäthylamin zu 3c umsetzen. (Schema 1) Bei der anschliessenden Silylierung von 3c mit Silylierungsmitteln wie Hexa- methyldisilazan (HMDS), HMDS-Trimethylchlorsilan (TCS) oder mit Bis(trimethylsilyl)acetamid (BSA) z.B. in Xylol-Pyridin oder Acetonitril wird 3c in die anscheinend bisher noch nicht beschriebene silylierte Verbindung 4- [(l,l-dimethyl)amidino]-2-trimethylsilyloxy-pyrimidin 4c umgewandelt, die

nach mehrfachen Abdampfen mit abs. Xylolen unter reduziertem Druck rein erhalten wurde. (Schema 1 )

Analog wurde Cytosin Ia durch Umsetzung mit den O-Dimethyl, O-Diäthyl- oder O-Di(isopropyl)acetalen des 1,1,3,3-Tetramethylharnstoffs (H.Meerwein, W.Florian, N.Schön, G. Stopp,. Liebigs Ann.Chem. 1961, 641, 1; H.Neubauer, G.Eilingsfeld, M. Seefelder, H.Weidinger, Chem.Ber. 1964, 97, 1232) bzw. mit den Reaktionsprodukten aus 1,1,3,3-Tetramethylharnstoff mit Phosgen oder POCI ₃ in Gegenwart von tert. Basen wie Triäthylamin oder N,N-Diisopropyl- äthylamin in das noch nicht beschriebene N ⁴ -Guanidyl-Cytosin 3d umgewandelt, das sich analog mit Silylierungsmitteln in die entsprechende silylierte Verbindung 2-[4-(2-trimethylsilyloxy)pyrimidyl]-l,l,3,3-guanidine 4d überfuhren Hess. (Schema 1)

a. R = H; b. = Ac a. R = H; SiMe ₃ ; b. = Ac

für G = NMe, c. G = H; d. G = NMe ₂

Schema 1

Gegenstand .der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Gemcitabinderivaten der allgemeinen Formel 6 oder Gemcitabin- Hydrochlorid 7,

worin A, B = H ₅ F, Cl, Br bedeuten,

bei dem a.) Cytosin mit Amid- oder Harnstoff-acetalen zu den N ⁴ -Amidinen- oder Guanidinen der allgemeinen Formeln 3c und 3d

c. G = H; d. G = NMe "2 ₀

worin G = H oder -NMe ₂ und R'= niederes Alkyl, Methyl, Ethyl, n- Propoyl, iso-Propyl oder Butyl, bedeuten, umgesetzt, b.) danach mit Silylierungsmitteln zu den Pyrimidin-Derivaten der allgemeinen Formel 4c oder 4d silyliert,

c) dass anschließend Zucker der allgemeinen Formel 5,

worin R = Ac, Bz, ToI, -Si Me _3; -Si Et ₃ A, B = H, F, Cl, Br

X = F, Cl, Br, 1-O-Mesylat, 1-O-Tosylat, 1-O-Benzolsulfonat, 1-O-Triflat oder 1-Nonaflat bedeuten, in unpolaren Lösungsmitteln in Gegenwart von äquivalenten Mengen einer tertären Base umsetzt, und durch Verseifung in die Gemcitabinderivaten der allgemeinen Formel 6 und gegebenenfalls durch anschließende Salzbildung ins Gemcitabinhydrochlorid 7 überfuhrt werden.

Besonders betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung von neuen nukleophilen O-silylierten Cytosin-derivaten der allgemeinen Formel 4 indem man Cytosin Ia erstens mit Amid- oder Hamstoff-acetalen zu den N ⁴ -Amidinen- oder Guanidinen der allgemeinen Formeln 3c und 3d umsetzt und 3c oder 3d dann mit Standard-Silylierungsmitteln wie einem Gemisch von Hexamethyldisilazan (HMDS) mit Trimethylchlorsilan bzw Bis- trimethylacetamid (BSA) zu den neuen reaktiven Pyrimidin-Derivaten der allgemeinen Formel 4c oder 4d silyliert.

Insbesonders betrifft die Erfindung Verfahren zur Darstellung von Gemcitabin 6 indem man man Zucker der allgemeinen Formel 5, vorzugsweise für A ₅ B = F; X = OSO ₂ CH ₃ , OTf, ONf und R = Bz mit äquivalenten oder überschüssigen Mengen der neuen silylierten Cytosin-Derivate 4c oder 4d in unpolaren Lösungsmitteln wie Toluol. Xylol oder Anisol möglichst in Gegenwart von

äquivalenten Mengen einer tert. Base wie Triäthylamin oder äthyldiisopropylamin (Hünigsbase) unter leichtem Erwärmen oder Rühren zu geschützten Gemcitabin-Zwischenprodukten umsetzt, die bei der Verseifung mit methanolischem Ammoniak rohes Gemcitabin 6 ergeben. Die Verseifung der geschützten Cytidine mit wässrigem methanolischem Ammoniak entfernt nicht nur die 3',5'-O-Benzoat-Schutzgruppen sondern auch die N ⁴ -Amidyl-Gruppe oder die N ⁴ -Guanidyl-Gruppe, wobei die gewünschten freien Cytidine 6 erhalten werden. Umsetzung von rohem 6 mit wässriger Salzsäure ergibt dann kristallines Gemcitabin-Hydrochlorid 7.

Weiter sind Gegenstand der Erfindung auch die Zwischenprodukte im erfindungsgemäßen Verfahren, nämlich 4-[(l,l-Dimethyl)amidino]-2- trimethylsilyloxy-pyrimidin 4c und 2-[4-(2-Trimethylsilyloxy)pyrimidyl]- 1,1,3,3-tetramethylguani-din. 4d, Verfahren zur Herstellung der Verbindungen 4c und 4d, sowie deren Verwendung für Umsetzungen mit 3,5-geschützten Zuckern der allgemeinen Formel 5 zu den entsprechenden geschützten 2'- Desoxycytidinen und schließlich Gemcitabinderivaten oder Gencitabin- Hydrochlorid. Beide Verbindungen 4c und 4d, sind sehr gute nukleophile Reagenzien und eignen sich vielfältig als Synthone innerhalb der präparativen organischen Chemie.

Das Verfahren zur Herstellung der Verbindungen 4c und 4d zeichnet sich dadurch aus, dass die Umwandlung der 4-Amino-Gruppe im Cytosin Ia in das 4-Amidinocytosin 3c oder das 4-Guanidino-cytosin 3d erfolgt, einer sich anschließende Silylierung zu 4c und 4d, was tatsächlich die Basizität und Nukleophilie und damit die Reaktionsfähigkeit der betreffenden silylierten Cytosin-Derivate 4 verglichen mit 2a dramatisch erhöht. Deshalb kann man

nukleophile Reaktionen mit 4 unter viel milderen Bedingungen durchführen als mit 2a. Es entfallt ferner die Notwendigkeit, bei einer anschliessenden Nukleosid-Synthese mit 4 einen bis zu 30-fachen überschuss an 4 einsetzen zu müssen wie bei Anwendung von persilyliertem Cytosin 2a als Reaktand und Lösungsmittel.

Die neuen silylierten Cytosin- Analoga 4c und 4d reagieren mit 3,5-geschützten Zuckern der allgemeinen Formel 5, die reine oder angereicherte 1-α-Anomere darstellen, zu den geschützten entsprechenden 2'-Deoxycytidinen. Die Reaktion mit 5 wird mit äquivalenten Mengen oder einem geringen überschuss der silylierten Cytosin-Basen 4c und 4d und in unpolaren Lösungsmitteln wie 1,2- Dichloräthan, Toluol, Xylol oder Anisol bei Temperaturen durchgeführt, die durchschnittlich mindestens 30° niedriger liegen als bei Umsetzungen mit persilyliertem Cytosin 2a. Gegebenenfalls werden tert. Basen wie Triäthylamin, N,N-Disopropyläthylamin usw. sowie Katalysatoren wie Cäsiumtriflat oder Cäsiumnonaflat zugesetzt Die anschließende Verseifung des erhaltenen geschützten Cytidins mit methanolischem wässrigen Basen, beispielsweise Ammoniak entfernt nicht nur die Schutzgruppen in 3 '-und 5 '-Stellung sondern auch die N ⁴ -Amidyl- oder IS^-Guanidyl-Reste und ergibt direkt die freien Cytidine 6. (Schema 2).

Im Falle der 2.2-Difluorzucker 5 mit A = B = F lässt sich nach Umsetzung von 4c oder 4d mit 5, anschließender Verseifung der Schutzgruppen und Behandlung mit 4 N HCl das kristalline 2'-Desoxy-2',2'-difluorocytidin-Hydro- chlorid leicht darstellen. (Vergl. T-S.Chou, P.C.Heath, L.E.Patterson, L.M.Poteet, R.E.Lakin, A.H.Hunt, Synthesis 1992, 565)

Schema 2

Die anschliessende Behandlung von Gemcitabin 6 mit Salzsäure führt zum kristallinen 2 ' -Desoxy-2 ' ,2 ' -difluorocytidin-Hydrochlorid (Gemcitabin- Hydrochlorid) 7.

Experimentelle Beispiele.

Beispiel 1

Herstellung von 4-[(l,l-diniethyl)amidino]-2-trimethylsilyloxy-pyrimidin 4c. Kristallines, reines N ⁴ -[(Dimethylamino)methylen]cytosin 3c, Schmpt. 244- 245°, (4,98 g; 30 mmol) (cf. R.S.Hosmane, NJ.Leonard, J.Org.Chem. 1981, 46, 1457) wurde in 100 ml abs Acetonitril suspendiert und während ca. 30 min. unter lebhaftem Rühren und Ausschluss von Feuchtigkeit ein gekühltes Gemisch von Hexamethyldisilazan (2,1 ml; 10 mmol) und Trimethylchlorsilane (1,26 ml, 10 mmol) so zugetropft, dass die Reaktionstemperatur nicht über 30 ⁰ C stieg, wobei nach kurzer Zeit farbloses kristallines Ammoniumchlorid ausfiel. Nach ca 5 h Rühren bei Raumtemperatur wurde unter Ausschluss von Feuchtigkeit das Ammoniumchlorid abfiltriert, das Ammoniumchlorid mit abs. Acetonitril gewaschen und das Filtrat im Vakuum eingedampft. Der Rückstand ergab nach zweimaligem Abdampfen mit abs Xylol (2,2 g; 92,4 %) an reiner Trimethylsilylverbindung 4c.

Beispiel 2

Herstellung von 2-(4-ρyrimidyl-2-on)-l,1.3,3-tetramethyl-guanidin. 3d. Cytosin (3,33g, 30 mmol) wurde in abs DMF (50 ml) und abs. äthanol (25ml) unter Feuchtigkeitsausschluss und lebhaftem Rühren langsam mit einem leichten überschuss an 1,1,3,3-Tetramethylharnstoff-diäthylacetal (Me ₂ N) ₂ C(OEt) ₂ (cf. H.Neubauer, G.Eilingsfeld, M.Seefelder, H.Weidinger, Chem.Ber. 1964, 97, 1232) versetzt, sodass die Reaktionstemperatur von 30° nicht überschritten wurde und das Reaktionsgemisch noch 24 h bei 60° gerührt. Nach Abdampfen der Lösungsmittel bei ca. 0,5 Torr wurde der Rückstand aus Isopropanol umkristallisiert, wobei 1,95g (93 %) an 3d erhalten wurden.

Beispiel 3

Herstellung von 2- [4-(2-trimethylsilyloxy)pyrimidyl] - 1 , 1 ,3 ,3 -tetramethylguani- din. 4d.

2-(4-Pyrimidyl-2-on)-l,l,3,3-tetramethylguanidin 3d (2,09 g; 10 mmol) wurde in abs. Acetonitril (100 ml) suspendiert und während ca. 30 min. unter lebhaftem Rühren und Ausschluss von Feuchtigkeit ein gekühltes Gemisch von Hexamethyldisilazan (2,1 ml, 10 mmol) und Trimethylchlorsilan (1,26 ml ml, 10 mmol) so zugetropft, dass die Reaktionstemperatur nicht über 30 ⁰ C stieg, wobei nach kurzer Zeit kristallines Ammoniumchlorid ausfiel. Nach ca 6 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde unter Ausschluss von Feuchtigkeit das Ammoniumchlorid abfiltriert, die Kristalle mit abs. Acetonitril gewaschen und das Filtrat im Vakuum eingedampft. Der Rückstand ergab nach zweimaligem Abdampfen mit abs Xylol 2,60g (92,5 %) der Trimethylsilylverbindung 4d.

Beispiel 4

Herstellung von 1 -O-Trimethylsilyl-2-desoxy-2,2-difluoro-3 ,5-di-O-benzoyl-D- ribofuranose

Zu 1 -Hydroxy-2-desoxy-2,2-difluoro-3 ,5-di-O-benzoyl-D-ribofuranose (3 ,78g, 10 mmol) wurde bei -78 ⁰ C in trockenem Methylenchlorid (20 ml) eine gekühlte Mischung von Triäthylamin (1,53 ml; 11 mmol) und Trimethylchlorsilan (2,1 ml; 10 mmol) in Methylenchlorid unter strengem Ausschluss von Feuchtigkeit und Rühren zugegeben und die Reaktionsmischung noch 3h bei -78° gerührt. Nach Zugabe von abs. Toluol (75 ml) wurde unter Ausschluss von Feuchtigkeit das Triäthylamin-Hydrochlorid abfiltriert und mit trockenem Aceton gewaschen, das Filtrat im Vakuum auf 25 ml eingeengt und diese Lösung weiter verwendet. (Vergl. Beispiel 5)

Beispiel 5

Herstellung von Gencitabin-Hydrochlorid (2'-Desoxy-2',2'-difluorocytidin- Hydrochlorid) 7

1 -O-Trimethylsilyl-2-desoxy-2,2-difluoro-3 ,5-di-O-benzoyl-D-ribofüranose (ca. 10 mmol) (cf. Beispiel 4) in absolutem Toluol (25 ml) wurde bei -2O ⁰ C mit Nonaflylfluorid (2,15 ml; 12 mmol) versetzt. Nach ca. 5 h Rühren bei -10 ⁰ C wurden unter Feuchtigkeitsausschluss unter leicht vermindertem Druck 10 ml Methylenchlorid abgedampft, wobei das gebildete Trimethylsirylfluorid (Kp. 17 ⁰ C) entfernt wurde. Anschliessend fügte man bei -10 ⁰ C 4-[(l,l- dimethyl)amidino]-2-trimethylsilyloxypyrimidin 4c (2,86 g; 12 mmol) in abs. Toluol (5 ml) hinzu und rührte die Reaktionsmischung noch 10 h bei 0°. Nach Zugabe von methanolischem Ammoniak (50 ml), der ca 1 ml H ₂ O enthielt, wurde die Reaktionsmischung 16 h bei Raumtemperatur gerührt und dann unter verminderten Druck abgedampft.

Nach Lösen des Rückstandes in Wasser (100 ml) wurde zweimal mit jeweils 100 ml Essigester extrahiert und die wässrige Phase mit Aktivkohle entfärbt. Nach Zugabe von 2 N HCl (50 ml) wurde die Reaktionsmischung im Vakuum auf 50 ml eingeengt und Aceton (ca. 200 ml) zugegeben, bis fast reines 2'- Desoxy-2',2'-difluorocytidin-Hydrochlorid 7 (2,19 g; 73 %) auskristallisierte

Beispiel 6

Herstellung von Gencitabin-Hydrochlorid (2'-Desoxy-2',2'-difluorocytidin- Hydrochlorid) 7

Zu einer Lösung von lα-O-Methansulfonyl-2-desoxy-2,2-difluoro-3,5-di-O- benzoyl-D-ribofuranose (4,65 g, 10 mmol) in abs. Toluol (20 ml) wurde bei Zimmertemperatur 2-[4-(2-trimethylsilyloxy)pyrimidyl]- 1 , 1 ,3 ,3-tetramethylgu- nidin 4d (2,86 g, 12 mmol) in abs. Toluol (20 ml) gegeben und die Reaktionsmischung 16h unter Ausschluss von Feuchtigkeit bei 50 ⁰ C gerührt. Nach Aufarbeitung wie im Beispiel 5 beschrieben, wurde 2'-Desoxy-2',2'-difluoro- cytidin-Hydrochlorid 7 (2,1 g; 70 % ) erhalten.