BIPARTICIÓN EMBRIONARIA

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a un procedimiento de generación de gemelos homocigóticos por bipartición embrionaria en mamíferos, adecuado para la obtención de gemelos a partir de embriones, se puede aplicar en la producción de animales, especialmente para la reproducción de ganado bovino.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La presión económica y de conservación en la producción animal requiere que los avances tecnológicos en embriología sigan haciendo mejoras en la previsibilidad y la eficiencia en la utilización de embriones (Gray et al., 1991 ) .

En la década del 70 se pensaba que los embriones en fases tempranas de la segmentación no sobrevivirían después de una microcirugía (Willadsen y Godke, 1984). Fue en los años ochenta cuando se demostró que las mórulas y blastocistos de los animales domésticos eran capaces de desarrollarse después de una partición y producir nacimientos viables (Rorie et al, 1987) . Actualmente la partición de embriones permite la producción de gemelos idénticos al dividir el embrión original por métodos microquirúrgicos , con ayuda de un micromanipulador.

Entre las biotecnologías reproductivas, que mayor atención han recibido están la superovulación, transferencia embrionaria, criopreservacíón de gametos y embriones, cultivo in vitro de embriones, así como la micromanipulación embrionaria (bipartición embrionaria) con fines investigativos, o de mejora genética. La bipartición de embriones de mamíferos y el aislamiento de blastómeros es una técnica muy útil para generar gemelos o múltiplos. Se han visto gemelos idénticos de varias especies a lo largo de la historia y el avance en las últimas décadas a una variedad de aplicaciones en la medicina veterinaria y humana es muy importante (illmensee et al., 2005) . La micromanipulación en mamíferos con fines de producir gemelos idénticos se realiza en estadios tempranos del embrión (Navarro, 2003). En la actualidad, existe variación en la micromanipulación embrionaria empleada en animales de granja y/o de laboratorio, para producir gemelos genéticamente idénticos (Merchant et al., 1997), siendo la más importante, la partición embrionaria por microcirugía y la separación y cultivo de blastómeros aislados por métodos enzimáticos y mecánicos (Agca et al. , 1988;

i Rexroad y Powell, 1997). Sin embargo, a pesar de que las técnicas vienen desarrollándose desde hace décadas, aún no se cuenta con resultados óptimos, ni con información que pueda ser replicada sin un equipamiento sofisticado. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Evaluación y selección de receptoras

Se evalúan visualmente y se seleccionan las receptoras teniendo en cuenta las condiciones tales como: condiciones sanitarias óptimas, la edad, el número de partos y la condición corporal . Luego se contrasta con la ecografía para descartar preñez y anormalidades; al mismo tiempo, se clasifican según los cruces .

Sincronización de celo de receptoras

Las receptoras se someten a un protocolo de sincronización del estro con la finalidad sincronizar la ovulación, para esto se aplica progesterona más benzoato de estradiol; prostaglandina F2a como luteolítico más gonadotropina sérica de yegua preñada, EcG; se retira la progesterona, se aplica benzoato de estradiol, luego cuando las receptoras presentan estro, se realiza la transferencia de embriones.

Colecta de embriones

La colecta de la primera inseminación artificial, se realizó utilizando la técnica que a continuación se detalla. Primero se dilata la cérvix para luego fijar el catéter foley en el cuerno derecho y posterior en el izquierdo. Se realiza el lavado de cada cuerno utilizando un medio de colecta, el medio evacuado va a un filtro donde son retenidas las estructuras; acabado el proceso de colecta el filtro es llevado al laboratorio donde es depositado en placas Petri, para posteriormente realizar la búsqueda.

Búsqueda y clasificación de embriones

Se realizó mediante un estereoscopio, a un aumento de 20X, todas las estructuras halladas son trasladadas a una placa de 35 mm la cual contiene medio de mantenimiento para posteriormente acabada la búsqueda realizar la clasificación según la clasificación de la Asociación I nternacional de Transferencia de Embriones IETS (Tabla 1 ). Tabla 1. Clasificación de los embriones, según estado de desarrollo y calidad embrionaria (IETS, 2010).

Estado de desarrollo Código

Ovocito no fertilizado- 1

UFO

Mórula compacta 4

Blastocisto temprano 5

Blastocisto 6

Blastocisto expandido 7

Blastocisto eclocionado 8

Calidad embrionaria Código

Excelente 1

Bueno 2

Regular 3

Degenerado 4

Bipartición de los embriones

Del grupo de embriones, se selecciona embriones en estadios de mórula y blastocisto, ambas de condición excelente (la clasificación fue realizada acorde a la clasificación propuesta por la Sociedad Internacional de Transferencia de Embriones). Los embriones fueron trasferidos una placa de 60mm donde contiene gotas de 20 ul con medio de fijación para manipulación embrionaria compuesta por TCM-Hepes (Medio de cultivo celular con hepes) suplementado con piruvato de sodio, L- glutamina, SFB (suero fetal bovino), albúmina sérica bovina (BSA) libre de ácidos grasos, donde ambos fueron bipartidos con ayuda de una cuchillas de seccionamiento ultra agudo (15°), los compuestos son utilizados con la finalidad de dar energía al embrión para soportar la manipulación (piruvato y glutamina) y también de sedimentar al embrión en la placa y dejarla inmóvil para que el corte sea rápido y eficiente (SFB y BSA), además a ello el medio de fijación ésta preparado en una solución de TCM-Hepes (Medio de cultivo celular con hepes) para que pueda ser manipulado en condiciones ambientales porque el Hepes regula el pH (pH7.4) de la solución la cual es muy importante. La bipartición fue realizada considerando la partición en dos partes del macizo celular de la mórula y el embrioblasto para el caso del blastocisto. Las mitades fueron trasferidos a placas Petri con medio de restauración celular compuesto de SOF base (Fluido sintético del oviducto), suplementado con piruvato de sodio, L- glutamina, aminoácidos esenciales y no esenciales, EGF (Factor de crecimiento epidermal), SFB (suero fetal bovino), ácido cítrico, myo-lnositol y albúmina sérica bovina (BSA) libre de ácidos grasos. Estos compuestos son utilizados para darle energía al embrión después de ser manipulados (Piruvato, glutamina), además a ello los embriones necesitan de nutrientes para continuar con su desarrollo (Aminoácidos esenciales y no esenciales, EGF, ácido cítrico y myo-lnositol) y para evitar que la estructura celular se pierda se disminuye la concentración de suero.

Posteriormente, las mitades de la mórula fueron transferidos a una pajuela (lo mismo fue realizado con las mitades del blastocisto) con el medio de transferencia compuesto de SOF base (Fluido sintético del oviducto), suplementado con piruvato de sodio, L- glutamina, aminoácidos esenciales y no esenciales, EGF (Factor de crecimiento epidermal), SFB (suero fetal bovino) , ácido cítrico, myo-lnositol y albúmina sérica bovina (BSA) libre de ácidos grasos. Esta solución es utilizada para el desarrollo embrionario y su formulación está compuesta por todos los requerimientos nutricionales que el embrión necesita. En este medio los embriones son transferidos a receptoras evaluadas y seleccionadas , previamente sincronizadas. La confirmación de la preñez se realizó a los 35 días con un equipo de ultrasonido.

Transferencia de embriones

Para la transferencia de los embriones se ubica el cuerpo lúteo por palpación, lo que indicaba ser apta como receptora de embrión. Teniendo los embriones ya identificados según registro y calidad se realizó las transferencias utilizado una pistola de transferencia de embriones, donde la pistola es dirigida al cuerno lipso lateral del cuerpo lúteo (CL) funcional, para que el embrión sea depositado en el tercio craneal del cuerno uterino.

Glosario de Términos

TCM: medio de cultivo celular

Hepes: ácido 4-(2-hidroxietil)-1 -piperazina-etano-sulfónico.

SFB: suero fetal bovino

BSA: albúmina sérica bovina

SOF: fluido sintético de oviducto

EGF: Factor de crecimiento epidermal o epidérmico

CL: cuerpo lúteo MODALIDAD PREFERENTE DE LA INVENCIÓN

Evaluación y selección de receptoras Se evaluó visualmente y con entrevista al ganadero las condiciones sanitarias óptimas, edad (2-10 años), número de partos (0-8 partos) y condición corporal (2.5-4), y luego contrastar con ecografía para descartar preñez y anormalidades; al mismo tiempo, se clasificaron según los cruces. Sincronización de celo de receptoras

Las receptoras fueron sometidas a un protocolo de sincronización del estro, donde el día cero se aplica progesterona 1.38 gr (CIDR®, Pfizer) más benzoato de estradiol 2 mg (Estovet®, Montana); día cinco se aplica prostaglandina F2a como luteolítico 25 mg (Lutalyse®, Pfizer) más 400 Ul de EcG (Folligon®, Intervet); día ocho se retira la progesterona, el día nueve se aplica 1 mg de benzoato de estradiol con la finalidad de sincronizar la ovulación, día diez las receptoras presentan estro, día 17 se realiza la transferencia de embriones.

Colecta de embriones

La colecta se realizó a los siete días de la primera inseminación artificial, utilizando la técnica que a continuación se detalla. Primero se dilata la cérvix para luego fijar el catéter foley en el cuerno derecho y posterior en el izquierdo se realiza el lavado de cada cuerno utilizando medio de colecta comercial (BioLife™, Agtech), el medio evacuado va al filtro (Zona™ Filter, Agtech) donde son retenidas las estructuras; acabado el proceso de colecta el filtro es llevado al laboratorio donde es depositado en placas Petri de 100mm, para posterior realizar la búsqueda.

Búsqueda y clasificación de embriones Se realizó mediante un estereoscopio (Nikon MZ 745 - Alemán), a un aumento de 20X, todas las estructuras halladas son trasladadas a una placa de 35 mm la cual contiene medio de mantenimiento de embriones (SYNGRO®, Bioniche, Canadá) , el cual comprende ácido hialurónico, un polisacárido lineal de ácido D-glucorónico alternativo y N-acetil-D-glucosamina, para posteriormente acabada la búsqueda realizar la clasificación según la Asociación Internacional de Transferencia de Embriones IETS (según laTabla 1 ). Bipartición de los embriones

Del grupo de embriones, se selecciona embriones en estadios de mórula y blastocisto, ambas de condición excelente (la clasificación fue realizada acorde a la clasificación propuesta por la Sociedad Internacional de Transferencia de Embriones). Los embriones fueron trasferidos una placa de 60mm donde contiene gotas de 20 ul con medio de fijación para manipulación embrionaria compuesta por TCM-Hepes (Medio de cultivo celular con hepes) suplementario con 0,4 mM piruvato de sodio, 0,2 mM de L- glutamina, 30% de SFB (suero fetal bovino), 0,3% de albúmina sérica bovina (BSA) libre de ácidos grasos, donde ambos fueron bipartidos con ayuda de una cuchillas de seccionamiento ultra agudo (BIONICHE, USA), los compuestos son utilizados con la finalidad de dar energía al embrión para soportar la manipulación (piruvato y glutamina) y también de sedimentar al embrión en la placa y dejarla inmóvil para que el corte sea rápido y eficiente (SFB y BSA), además a ello el medio de fijación ésta preparado en una solución de TCM-Hepes para que pueda ser manipulado en condiciones ambientales porque el Hepes regula el pH (pH7.4) de la solución la cual es muy importante. La bipartición fue realizada considerando en dos partes del macizo celular de la mórula y el embrioblasto para el caso del blastocisto. Las mitades fueron trasferidos a placas de 35 mm con medio de restauración celular compuesto de SOF base (Fluido sintético del oviducto), suplementado con 0,4 mM piruvato de sodio, 0,2 mM de L- glutamina, 1 % de aminoácidos esenciales y no esenciales, 10 ng/mL de EGF (Factor de crecimiento epidermal), 10% de SFB (suero fetal bovino), 0,1 mg/mL de ácido cítrico, 0,5 mg/mL de myo-lnositol y 0,3% de albúmina sérica bovina (BSA) libre de ácidos grasos. Estos compuestos son utilizados para darle energía al embrión después de ser manipulados (Piruvato, glutamina), además a ello los embriones necesitan de nutrientes para continuar con su desarrollo (Aminoácidos esenciales y no esenciales, EGF, ácido cítrico y myo-lnositol) y para evitar que la estructura celular se pierda se disminuye la concentración de suero.

Posteriormente, las mitades de la mórula fueron transferidos a una pajuela de 0,25 ce (lo mismo fue realizado con las mitades del blastocisto) con el medio de transferencia compuesto de SOF base (Fluido sintético del oviducto), suplementado con 0,4 mM piruvato de sodio, 0,2 mM de L- glutamina, 1 % de aminoácidos esenciales y no esenciales, 10 ng/mL de EGF (Factor de crecimiento epidermal), 2% de SFB (s(suero fetal bovino), 0,1 mg/mL de ácido cítrico, 0,5 mg/mL de myo-lnositol y 0,3% de albúmina sérica bovina (BSA) libre de ácidos grasos. Esta solución es utilizada para el desarrollo embrionario y su formulación está compuesta por todos los requerimientos nutricionales que el embrión necesita. En este medio los embriones bipartidos son transferidos a receptoras evaluadas y seleccionadas, previamente sincronizadas. La confirmación de la preñez se realizó a los 35 días con un equipo de ultrasonido (Esaote, Italia). Transferencia de embriones

Para la transferencia de los embriones se ubica cuerpo lúteo por palpación (CL > 16mm), lo que indicaba ser apta como receptora de embrión; Teniendo los embriones ya identificados según registro y calidad se realizó las transferencias utilizado una pistola de transferencia de embriones (21 ") con fundas de punta de acero (Agtech, USA) cubierta con camiseta sanitaria, donde la pistola es dirigida al cuerno lipso lateral del cuerpo lúteo (CL) funcional, para que el embrión sea depositado en el tercio craneal del cuerno uterino.

Debido a que en nuestro invento los embriones fueron bisectados manualmente con el uso de microcuchillas y medio de fijación, restauración y transferencia, los cuales se describieron anteriormente, ello produce el efecto de su aplicabilidad con equipamiento mínimo bajo condiciones de campo, sin el uso de micromanipuladores que necesariamente se debe realizar en un laboratorio, en tanto que el presente procedimiento puede ser aplicado directamente en el campo sin necesidad de condiciones especiales y equipos sofisticados, haciendo que los embriones estén en óptimas condiciones capaz de genera r una preñez.

La aplicabilidad de la presente invención sugiere también la posibilidad de usarla como herramienta para lograr múltiples beneficios tales como la obtención de material biológico para séxado e identificación de genes de interés o defectuosos, incremento del porcentaje de preñez, el progreso genético, modelos experimentales, entre otros. En conclusión, la producción artificial de gemelos homocigóticos puede realizarse con equipamiento mínimo y el uso de éstos medios en campo a partir de embriones en estadio de mórula y poder ser aplicado en centros de mejora genética, universidades, institutos, tecnológicos y sobre todo en ganaderos del país.