"MÉTODO PARA PRODUCIR PROBIÓTICOS AUTÓCTONOS CON ACTIVIDAD INMUNOESTIMULANTE Y SU USO EN PROFILAXIS CONTRA FLAVOBACTERIOSIS EN SALMÓNIDOS"

CAMPO DE LA INVENCIÓN

El campo de la presente invención se refiere al control de enfermedades microbiológicas (tales como Flavobacteriosis producida por el patógeno Flavobacterium psycrophilum) con el uso de probióticos con capacidad inmuno-estimulante en especies subacuáticas tales como salmónidos, su identificación y método para obtenerlos con la mayor capacidad inmuno- estimulante.

ANTECEDENTES

El uso de antibióticos ha sido la principal herramienta terapéutica utilizada en el control de las enfermedades bacterianas en peces .

El desarrollo de los antibióticos en el tratamiento de enfermedades en peces, ha obtenido como contraparte un continuo desarrollo de resistencias por parte del objetivo a tratar, sin hablar de su uso indiscriminado.

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La búsqueda de alternativas en el tratamiento ha llevado a revisar la herramienta de los pro-bióticos como elemento de control de la inmunidad, para asi mejorarla y prepararla para el medio en donde se cria y desenvuelve el pez.

La utilización de pro-bióticos en la industria alimenticia es conocida y aplicada hoy en dia en múltiples usos. Su utilización en el desplazamiento de los cultivos bacterianos o fúngicos en peces es ya conocido como se presenta para el control de Vibrio sp. y Saprolegnia sp. en los documentos (WO2012/105805) y (WO 2012/105804) respectivamente.

Algunos de los autores que partieron con la idea de utilizar probióticos en acuicultura fueron Nikoskelainen y colaboradores (2001) quienes investigaron las propiedades de potenciales probióticos de cinco bacterias ácido lácticas utilizadas en humanos como Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus casei, Lactobacillus bulgaricus, Bifidobacterium lactis y Lactobacillus johnsonii y un probiótico para uso animal Enterococcus faecium. Los investigadores evaluaron a nivel in vitro la capacidad de estas cepas para adherirse y penetrar la barrera mucosa, inhibir el crecimiento y adhesión de patógenos como Vij rio anguillarum, Aeromonas salmonicida y Flavobacterium psychrophylum y resistencia a la bilis de pez. Ellos encontraron que solo dos candidatos (L. rhamnosus y L. bulgaricus) cumplieron con estas capacidades, podrían servir como posibles probióticos para desafíos a nivel in vivo. Siguiendo con este estudio, en años posteriores el mismo autor en (2003) , decidió realizar un estudio con la bacteria L. rhamnosus, el probiótico fue incluido y administrado en la dieta de Trucha Arcoíris (O. mykiss) en 5 diferentes dosis desde 10 ⁴ hasta 10 ¹⁰ UFC/g, por dos semanas observando que a nivel in vitro aumentaba la actividad a nivel celular del estallido respiratorio, a nivel humoral del sistema del complemento mediada por actividad bactericida y a nivel del sistema inmune adaptativo por la activación de Inmunoglobulina (Ig) . El estallido rspiratorio (respiratory burst) también conocido como estallido oxidativo, consiste en la rápida liberación de especies reactivas del oxígeno (ROS) como radicales superóxido y peróxido de hidrógeno (H2O2) , desde diferentes tipos de células como granulocitos y fagocitos cuando estos entran en contacto con diferentes microorganismos, su utilidad es la inactivación de patógenos microbianos. Otro autor que decidió utilizar la misma bacteria (L. rhamnosus) fue Panigrahi et al. (2004), observando que al alimentar Trucha Arcoiris (O. mykiss) con dosis entre 10 ⁹ y 10 ¹¹ UFC/g a nivel in vitro inducen a la activación de algunos parámetros del sistema inmune innato. Este parte del sistema inmune es la primera barrera de defensa contra los microorganismos invasores, que no tiene memoria, no es especifico y está montado en base a respuestas generales de tipo humoral (lisozima, complemento) y celular (fagocitos, neutrófilos) . En el estudio realizado por los autores Lara-Flores et al. (2003), decidieron evaluar en alevines de Tilapia Nilotica {Oreochromis niloticus) , probióticos comerciales para vertebrados terrestres como Streptococcus faecium y Lactobacillus acidophilus y una levadura Saccharomyces cerevisiae, y determinaron que al agregar el 0,1% de estos microorganismos en la dieta mejoraba el crecimiento y mitigaba los efectos de los factores de estrés. Salinas et al. (2008), trabajaron con Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis cepa que ha tenido gran atención en humanos y medicina veterinaria. Estos autores, observaron a nivel in vitro en el intestino proximal de Salmón Atlántico (S. salar) , que esta bacteria lograba adherirse al mucus y las células epiteliales del lumen intestinal, en forma de agrupaciones sobre la superficie de las vellosidades y no generaba alteraciones en la morfología e integridad de la barrera gastrointestinal. Esto contrastaba con lo observado para la bacteria patógena Aeromonas salmonicida, la cual ocasionó daño epitelial e indujo la migración de células del sistema inmune innato al sitio de adhesión. En tanto, al incubar el intestino proximal con el probiótico y luego exponerlo al patógeno, no se observaba daño tisular, sugiriendo de esta manera que el probiótico protege contra la acción del patógeno. En síntesis, las bacterias anteriormente mencionadas fueron escogidas para estudios en acuicultura como posibles candidatos a probióticos debido a que han presentado efectos benéficos en organismos terrestres como lo son el cerdo, aves de corral, y en humanos. Pero esto podría representar un problema a mediana o gran escala a futuro en la industria, ya que son microorganismo exógenos, que al ser introducidos en un hábitat al cual no pertenecen pueden generar un desequilibrio en el medio y podrían convertirse en potenciales patógenos para las especies de cultivo (Cahill, 1990; Ring0 et al., 2003, 2006 y 2008; Skrodenyte-Arbaciauskiene et al. 2006; Hovda et al. 2007 y 2012; Denev et al., 2009).

A raíz de esto se comienza a investigar candidatos a probióticos en la acuicultura provenientes de la microbiota del tracto gastrointestinal de animales sanos o bacterias del mismo medio, idea basada en estudios previamente realizados, donde se establece que la colonización de la microbiota normal en la superficie de la mucosa intestinal provee resistencia a la adhesión de bacterias patógenas y media la estimulación de la respuesta inmune, además, presenta un efecto positivo sobre las funciones de regulación del metabolismo de nutrientes

(Jóborn et al., 1997; Burr y Gatlin, 2005; Skrodenyte- Arbaciauskiene et al., 2006; Gómez y Balcázar, 2008; Denev et al., 2009; Pérez et al., 2010; Bezirtzoglou et al., 2011). Este desafío ha incrementado las investigaciones para mejoramiento de la calidad y competitividad de la producción

(Planas et al., 2006; Denev et al., 2009; Bezirtzoglou et al., 2011) .

En especies salmónidas de importancia comercial, se han logrado aislar e identificar bacterias del tracto gastrointestinal, de estos géneros, se han estudiado para candidatos como posibles probióticos, a las bacterias pertenecientes al denominado grupo de las bacterias ácido lácticas (LAB) , debido a que son encontradas en el tracto gastrointestinal de animales homeotermos como ratones, ratas, cerdos aves de corral y en humanos, en productos lácteos y en algunas superficies de plantas, además son consideradas como bacterias "Generalmente Reconocidas como Seguras" (GRAS) (Ring0 y Gatesoupe, 1998).

Jóborn et al. (1997), ha sido uno de los investigadores que ha encontrado a nivel in vitro que la cepa Kl perteneciente al género Carnobacterium aislada del intestino de Salmón Atlántico (Salmo salar) , fue probada en mucus intestinal y cultivo de fecas de Trucha Arcoiris (O. mykiss) , encontrando que producían sustancias que causaban inhibición en el crecimiento de las bacterias patógenas Vibrio anguillarum y A. salmonicida . Asimismo, a nivel in vivo, la adición de bacterias ácido lácticas en los rotíferos, alimento de larvas de lenguado Scophthalmus maximus, incrementaron el crecimiento y la resistencia contra Vibrios patógenos (Gatesoupe, 1991 y 1994). Balcázar et al. (2008), estudió tres bacterias pertenecientes a Lactococcus lactis (CLFP 101) , Lactobacillus plantarum (CLFP 238) y Lactobacillus fermentu (CFLP 242) previamente aisladas e identificadas en Trucha Arcoiris, se encontró que al probar en mucus intestinal bajo condiciones in vitro, las cepas CLFP 101 y CFLP 242 inhibieron el crecimiento de patógenos como Aeromonas hydrophila , A. salmonicida , Yersinia ruckeri y Vibrio anguillarum mientras que CLFP 238 solo redujo el crecimiento de A. hydrophila y A. salmonicida . Otros géneros estudiados han sido Carnobacterium, Bacillus, Lactobacillus, Lactococcus y Leuconostoc aislados desde el tracto gastrointestinal de Trucha Arcoiris, los cuales a nivel in vitro han logrado inducir la expresión de las citoquinas il-ΐβ y tnf-a sugiriendo que estas bacterias estimulan el sistema inmunológico innato y a nivel celular producen el aumento del estallido respiratorio y actividad de la lisozima, además de la producción de compuestos antibacterianos como bacteriocinas y el mejoramiento en la tasa de crecimiento (Ring0 et al., 2000; Kim y Austin, 2006a y b ; Gatesoupe, 2008; Pérez-Sánchez et al., 2011). A nivel in vivo Vendrell et al., (2008) evaluó los efectos benéficos que podrían producir dos bacterias (Leuconostoc mesenteroides y Lactobacillus plantarum) , aisladas desde el intestino de salmónidos sanos. Estas bacterias fueron incluidas y administradas en el alimento de Trucha Arcoíris, en una densidad de 10 ⁷ UFC/g, por un periodo de 30 días, posteriormente se desafiaron con un patógeno de peces Lactococcus garvieae, encontrando que redujo la mortalidad en un porcentaje menor que solo alcanzó el 30 % con respecto al grupo control.

Además, las bacterias o levaduras aisladas e identificadas en el tracto gastrointestinal de salmónidos, se podrían utilizar en otras especies de peces como es el caso de Reyes-Becerril et al. (2008) quienes administraron en la dieta de juveniles la levadura Debaryomyces hansenii cepa CBS 8339, aislada desde el intestino de trucha arcoíris. A nivel in vitro en segmentos de tejido de tracto digestivo, observaron que la levadura lograba adherirse al mucus intestinal. Se realizaron pruebas para determinar actividad inmunológica en la sangre de peces alimentados con la dieta que contuviera la levadura, evidenciando que a nivel humoral había actividad del complemento y del estallido respiratorio, pero no se produjo actividad de la enzima peroxidasa. A nivel celular, aumentó el porcentaje de células fagocíticas y citotóxicas. En el hígado, se observó actividad enzimática de superoxido dismutasa y catalasa y en este mismo órgano, se expresó significativamente el gen proteina de complemento (c3), mientras que en el intestino y corteza renal, se indujo la expresión de los genes fccr-β, c3 y tnf-a, después de 4 semanas de alimentación. Sin embargo, ningún ensayo in vivo de protección contra patógenos, ha sido reportado.

Tovar-Ramírez et al. (2010) trabajaron con la misma levadura anteriormente descrita y la administraron a larvas de 6 días post eclosión de Dorada (Sparus aurata) , por un periodo de 48 días. Posteriormente, midieron sobre un mix de tejidos que incluía segmentos de páncreas, hígado, corazón, músculo, dorso e intestino, la expresión de catalasa (CAT) , glutatión peroxidasa (GPX) y súper oxido dismutasa (SOD) . Estos autores encontraron que la levadura promovían un mayor crecimiento de la larva e inhibía el estrés oxidativo, al suprimir la expresión de las enzimas, en comparación de las larvas que no recibieron levaduras.

En vista de los antecedentes, gran parte de los estudios utilizan una estrategia que puede considerarse in vitro, pues hacen sus ensayos en base a células sanguíneas extraídas de peces tratados. Estos tratamientos consisten generalmente en suplementar el alimento de los peces con bacterias autóctonas del tracto gastrointestinal de los peces. Las observaciones indican que al extraer sangre y realizarles análisis inmunológicos a nivel humoral como actividad de estallido respiratorio, complemento, lisozima y a nivel celular actividad fagocítica, se promovía la estimulación inmunológica . Similarmente ocurría cuando extraían órganos y median la expresión génica de algunos genes relacionados con la inmunidad innata observando que modulaban la expresión (Gatesoupe, 1991 y 1994; Jóborn et al., 1997; Ring0 et al., 2000; Kim y Austin, 2006a y b; Balcázar et al . , 2008; Gatesoupe, 2008; Pérez-Sánchez et al., 2011). Sin embargo, las investigaciones actuales ponen en duda la pertinencia de estos métodos, dado que la manipulación de los peces para extraer las muestras genera estrés y puede alterar los resultados. Por lo tanto, estas pruebas deben complementarse fuertemente con estrategias más modernas y precisas que puedan evaluar la estimulación del sistema inmune sin alterar a los peces. Los ensayos a nivel in vivo no dan una visión clara del tipo de interacción que se produce entre bacteria-hospedero, ni la función que podría desempeñar cada uno de los componentes bacterianos de la microbiota en el tracto gastrointestinal. Existen antecedentes donde suplementan el alimento con probiótico y después miden la expresión de algunos genes de la inmunidad innata y enzimas relacionadas con el estrés oxidativo y han observado que modulan a la inducción de la expresión significativa de algunos genes, pero no se sabe si es producido por la bacteria probiótica o por otra bacteria que se encuentre en el contenido gastrointestinal (Gómez y Balcázar, 2008; Reyes-Becerril et al., 2008; Pérez et al., 2010; Tovar-Ramírez et al., 2010).

Por otro lado, los estudios de desafío contra patógenos han demostrado que la inclusión de probióticos en el alimento generan protección disminuyendo la mortalidad (Nikoskelainen et al., 2001b; Sharifuzzaman y Austin, 2010). Sin embargo, estos estudios no establecen a ciencia cierta que la protección sea producida por ese probiótico. En general, se observan limitados periodos de persistencia y a veces fallas en la detección del probiótico en el hospedero. Por lo tanto, la protección observada puede deberse a la proliferación de otra bacteria en el tracto gastrointestinal de los peces. Es por esto que es importante que para generar un probiótico, s realicen estudios previos en organismo axénicos para comproba su efecto individual sobre el hospedero.

La bacteria patógena Flavobacterium psycrophilum es el agente causal de la enfermedad del agua fría bacteriana en salmones y el síndrome de alevines en la trucha arco iris, entidades patológicas responsables por las pérdidas económicas sustanciales en la salmonicultura .

Los problemas asociados con epizootias incluyen alta tasa de mortalidad, aumento de la susceptibilidad a otras enfermedades, los altos costos laborales de tratamiento y el enorme gasto en los tratamientos antibióticos. A pesar de la creciente importancia de la enfermedad, la patogénesis de infecciones por F. psychrophilum sólo se ha dilucidado parcialmente, lo que dificulta el desarrollo de medidas preventivas para combatir eficazmente esta enfermedad (Nematollahi et al., 2003).

El estado del arte, señala que las cepas del Flavojbacterium se utilizan principalmente como bio-pesticidas

(WO2013138398 ) o en procesos de extracción de materiales biológicos para la industria alimenticia ( O2013087043) o

(EP2099906) . No hay mención en el estado del arte de su combate a través de producción de algún microorganismo que opere como inmuno-estimulante en alguna especie animal o humana .

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

En un primer aspecto de la presente invención presenta un método de caracterización de un probiótico contrastado en base a su capacidad inmuno-estimulante contra la infección causada por Flavobacterium psycrophilum.

Un segundo aspecto de la presente invención protege el uso de los pro-bióticos en la prevención y profilaxis de la infección causada por Flavobacterium psycrophilum.

Un tercer aspecto de la presente invención protege la composición en donde reside el probiótico a ser utilizado en el tratamiento, prevención y profilaxis de la infección causada por Flavobacterium psycrophilum.

Un cuarto aspecto de la presente invención protege las mezclas especificas de microorganismos que potencian entre si la respuesta en el tratamiento, prevención y profilaxis de la infección causada por Flavobacterium psycrophilum.

Un quinto aspecto de la presente invención protege al microorganismo bacterial Carnobacterium sp. A025 con depósito biológico N° A025-B/00069 a ser utilizado en el tratamiento, prevención y profilaxis de la infección causada por Flavojacteriujn psycrophilum.

Un quinto aspecto de la presente invención protege al microorganismo bacterial Lactococcus sp. B018 con depósito biológico N° B018-B/00070 a ser utilizado en el tratamiento, prevención y profilaxis de la infección causada por Flavobacterium psycrophilum.

Un sexto aspecto de la presente invención protege al microorganismo bacterial Pediococcus B022 con depósito biológico N° B022-B/00071 a ser utilizado en el tratamiento, prevención y profilaxis de la infección causada por Flavobacterium psycrophilum.

Un octavo aspecto de la presente invención protege al microorganismo del tipo levadura Debaryomyces K002 con depósito biológico N° RGM 2143 a ser utilizado en el tratamiento, prevención y profilaxis de la infección causada por Flavobacterium psycrophilum.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Algunas definiciones importantes para entender la presente invención comienzan con el esclarecimiento del término probiótico. Dentro de los pro-bióticos se consideran a microorganismos vivos que se creen saludables para el organismo huésped. Según la definición adoptada en la actualidad por la FAO/OMS, los probióticos son "microorganismos vivos que cuando son administrados en cantidades adecuadas confieren un beneficio para la salud del huésped" . Los probióticos se consumen como parte de los alimentos con especial añadido de los cultivos activos vivos encapsulados en una matriz proteica de soporte, sin restringir esta forma de preparación a otras existentes en el estado del arte. De esta manera, se pretende administrar los microorganismos vivos, adicionándolos en el alimento, con el fin de que contribuyan con el equilibrio de la microbiota intestinal y potencien el sistema inmunológico de los peces de cultivo.

Por otro lado, el término probiótico pretende abarcar a cualquier microorganismo que logre inducir el sistema inmune del hospedero contra una cepa especifica o familia de cepas que provoquen un daño biológico, por competencia o químico al hospedero . 6

En la presente invención se considerará hospedero, huésped, hospedador, hospedante a aquel organismo generalmente multicelular, que alberga a otro en su interior o lo porta sobre si, ya sea en una simbiosis de parásito, un comensal o un mutualista u otra. Para el caso de la presente invención se considerará hospedero a las especies de salmónidos como Salmón Atlántico (Salmo salar), Trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss) y el Salmón Coho (Oncorhynchus kisutch) .

En la presente invención el término "axénico" se refiere a un organismo multicelular que está completamente libre de todo microorganismo. El uso de organismos axénicos es una herramienta importante para el estudio de la interacción patógeno-hospedero, parásito-hospedero o bacteria-hospedero.

En materia de regulaciones sanitarias, con el propósito de exportar el producto, no se permite trabajar con bacterias GMO (genéticamente modificadas) , todas tienen que ser nativas de la especie o de especies similares las cuales no conlleven modificaciones genéticas artificiales.

Estas limitantes sanitarias, llevaron al desarrollo de la presente tecnología para poder identificar y probar cuales cepas microbianas son las mayores inmuno-estimulante para organismos de interés acuícola, en este caso salmónidos, aunque la técnica no es excluyente para otras especies.

Después de analizar las estrategias conocidas en el uso de probióticos en el mercado, se detectó que no existían ensayos con probióticos derivados de la microbiota intestinal en modelos axénicos con el fin de identificar que bacterias estimulan el sistema inmune innato del modelo. Este ensayo fue testeado a través de una estrategia de profilaxis, logrando reducir significativamente la mortalidad del modelo de pez frente a la exposición al patógeno, para este caso pero sin ser excluyente el Flavobacterium psycrophilum en Salmónidos.

Método de identificación de un pro-biótico contrastado a favor de su capacidad inmuno-estimulante contra la infección causada por Flavobacteriwn psycrophilum.

El proceso de identificación del probiótico para ser utilizado en la profilaxis contra el patógeno en el salmón, se describe en las siguientes etapas: i.- aislamiento de los microorganismos desde el tracto digestivo de hospederos sanos .

La identificación de las bacterias óptimas para ser utilizadas como probióticos, se basaron en los estudios del contenido microbiano autóctono gastrointestinal de juveniles de las principales especies de salmónidos de centros de cultivo chilenos, como Salmón Atlántico (S. salar), Trucha Arcoiris (O. mykiss) y Salmón Coho (O. kisutch) . Para identificar las especies bacterianas, se extrajo asépticamente mediante disección bajo lupa estereoscópica el tracto gastrointestinal de los individuos. Posteriormente cada tejido fue colocado en un tubo de centrifuga que contuviera solución de NaCl 0,9% (w/v) fría y se homogenizó. Este homogenizado fue sembrado mediante diluciones seriadas en placas de Agar tripticasa soya (TSA) , se incubaron a una temperatura de 17 °C por 10 días en condiciones aeróbicas (Romero y Navarrete, 2006; Navarrete et al. 2009 y 2010) . Dentro de la microbiota intestinal de salmónidos, se pueden encontrar los siguientes géneros: -Janthinobacterium, Rhodoferax, Shewanella, Aeromonas,

Pseudomonas , Bacillus , Photobacterium, Flavobacterium, Exiguobacterium, Vibrio, Haemophilus, Stenotrophomonas, Acinetobacter, Ilyobacter, Fusobacteria , Sporolactobacillus, Bifidobacterium, Stenotrophomonas , Vagococcus , Microbacterium, Enterococcus , Macrococcus , Staphylococcus , Rheínheimera , Ralstonia , Cupriavidus , Microbacterium, Cellulomonas , Serratia , Comamonas , Archaeglobus , Lactococcus , Citrobacter, Kluyvera , Obesumbacterium, Carnobacterium, Pediococcus , Debaryomyces , Rodhotorula (Romero y Navarrete, 2006; Navarrete et al. 2009 y 2010) .

Aunque las bacterias dominantes en salmones corresponden a bacterias Gram negativas del phylum Proteobacterias, este tipo de microorganismos no cuenta con la aprobación de las agencias reguladoras como la FDA (con la administración de alimentos y fármacos) ni de los consumidores. En cambio, tipos bacterianos generalmente asociados a alimentos como las bacterias lácticas (BAL) y algunas levaduras, son consideradas como Gras (Generalmente reconocidas como seguras) . Por esta razón, se focalizó la búsqueda en estos tipos de microorganismos.

Ahora como identificar, aislar y probar los que son de interés para el aumento en la inmunidad innata, para asi generar una formulación que disminuya la mortalidad de especímenes al ser expuestos a un medio hostil, es parte de la presente patente de invención. ii.- caracterización genética de los microorganismos aislados .

Los microorganismos previamente aislados, se les extrajo el DNA y posteriormente se amplificó por PCR el gen 16SrRNA y se secuenció este amplicón (aproximadamente 1500 pb) (producto de PCR) . Esta secuencia permitió identificar cada microorganismo a través del sitio web RDPII®, dando como resultado que la cepa B022 corresponde a Pediococcus sp, la cepa B018 corresponde a la bacteria Lactococcus sp., la cepa A025 corresponde a la bacteria Carnobacterium sp. y la cepa K002 corresponde a la levadura De¿>aryo/nyces sp., tal como se presenta en la figura 1/8. iii.- caracterización de las propiedades benéficas complementarias .

Los aislados fueron testeados en su capacidad para producir enzimas que son importantes en la degradación de nutrientes de los alimentos formulados en acuicultura. Encontrando que hay cepas que contienen amilasa proteasa y a- glucosidasa. Además, pueden crecer en medios que contengan concentraciones de sales de 0,5, 1,5, 2,5 y 3,5%. Esto indica que estos microorganismos poseen la capacidad de tolerar un amplio rango de concentraciones de sal. Esto es importante y particular para el cultivo de salmones, ya que se realiza en 2 fases una con agua dulce (sin sales) y otra en agua salada (alta concentración de sal) . Por lo tanto, esta propiedad de los microorganismos seleccionados, esto permite su uso en fases de agua dulce, estuario y agua de mar.

Específicamente, Lactococcus sp. (B018) presentó actividad amilasa y proteasa, pero no presentó actividad glucosidasa. Carnobacterium sp, (A025) presentó actividad proteasa y algunos actividad glucosidasa, pero carecieron de la actividad de la amilasa. Mientras que Pediococcus sp. (B022), no presentó actividad enzimática de ninguna de las 3 enzimas ensayadas y la levadura Debaryomyees sp. (K002), presentó actividad proteasa, α-glucosidasa y amilasa, convirtiéndose en potencial candidato como probiótico, ya que podrían aportar estas enzimas en el tracto digestivo, ayudando a la digestión y compensando la presencia de los componentes antinutricionales, provenientes de la inclusión de harinas vegetales en el alimento. Además, los aislados presentaron tolerancia a crecer en medio salino en concentraciones de 0,5%, 1,5%, 2,5% y 3,5%, antes mencionadas y presentadas en la siguiente Tabla I.

Tabla I. Actividad enzimática y tolerancia a diferentes concentraciones salinas de los aislados.

Por lo tanto, la bacteria B018 puede complementarse con la bacteria A025, debido a que las dos producen proteasa, pero B018 produce amilasa y A025 produce oí-glucosidasa, de esta manera la combinación producen las 3 enzimas colaborando con la parte de degradación y asimilación de los alimentos. Algo similar ocurre al combinar con la bacteria B022 y la levadura K022. iv.- identificación de la capacidad inmuno-estimulante en modelos axénicos .

Uno de los pasos fundamentales en el desarrollo de esta tecnología fue definir los modelos axénicos a utilizar, que para esta tecnología se concentraron en dos modelos, el primero en pez cebra y el segundo en trucha arcoíris.

El pez cebra Danio rerio, ha surgido como un modelo biológico muy importante en los estudios de biología del desarrollo y genética, en diferentes aspectos de la biología de vertebrados, e incluso como un modelo experimental en las enfermedades humanas y los estudios biomédicos . Las características que hacen a este pez tan atractivo y popular como modelo científico son: su pequeño tamaño, la facilidad de su crianza y mantenimiento, su rápido desarrollo, el breve tiempo que transcurre de una generación a otra, su transparencia óptica en los estados tempranos de su desarrollo, entre otros.

Específicamente, para el desarrollo de esta patente, una de las características fundamentales del pez cebra, es la cantidad de herramientas moleculares que permiten el estudio de la inmunidad innata, además de la facilidad para adaptar protocolos y obtener peces cebra axénicos, con lo cual se facilita la observación de la relación bacteria-hospedero.

Un segundo modelo axénico utilizado en etapas posteriores es la trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) . Este modelo es de suma utilidad porque se comporta sanitariamente en forma similar al objetivo final, el salmón. Por otro lado, este comportamiento similar sanitario, se basa en el hecho de que en esta especie (trucha) puede medirse fácilmente la respuesta en la modulación de genes que tienen que ver con la respuesta inmune innata con la microbiota de salmónidos, lo cual lo hace un candidato ideal para medir la respuesta inmune óptima frente a patógenos que afectan al salmón.

Para la evaluación de la estimulación de la inmunidad innata, se definió la observación de la expresión de ciertos genes que se ven afectados en la interacción con los microorganismos, estos genes codifican para:

-Algunas citoquinas pro-inflamatorias, tal como interleuquina l-β (il 1-/3)

-Factor de necrosis tumoral alfa (tnf-a)

-Mieloperoxidasa [rapo)

-Lisozima ( yz)

-Proteina de fase aguda, como la proteina del suero amiloide (saa)

-Proteina del Complemento (c3)

-Oxido Nítrico Sintetasa inducible (inos)

-Un péptido antimicrobiano, Hepcidina (hep)

En modelo pez cebra:

Se testearon los diferentes aislados (A025, B022, B018 y K002) por separado en pez cebra (Danio rerio) axénico, determinando que promovían la expresión de los genes mpo, lys y c3. Mieloperoxidasa (mpo) codifica para una enzima que se encuentra presente en los neutrófilos y macrófagos (células fagocíticas) . Esta enzima se encarga de catalizar la producción de compuestos bactericidas como peróxido de hidrógeno implicado en estallido respiratorio. Lisozima (lys), esta enzima se encuentra en los fagocitos, es una enzima con propiedades bactericidas, la cual tiene la capacidad de adherirse a la pared celular de los patógenos que presentan pared celular compuesta por peptidoglicano, generando en éstos la lisis. La Proteina del Complemento (c3) , está implicada una serie de cascadas biológicas que derivan en la amplificación de las respuestas de defensa contra patógenos entre ellas fagocitosis, lisis de células extrañas, opsonización y formación de los complejos de ataque a la membrana del patógeno. En alevines de trucha arcoiris (O. mykiss) axénica, hospedero original se observó que las bacterias lácticas inducen la expresión de lys, anteriormente observado por estar expresado en pez cebra y otros genes como il-ΐβ, tnf-a, inos y hep. Las citoquinas proinflamatorias {il-ΐβ y tnf-a) son producidas por células fagociticas, son mediadores de las respuestas de defensa del hospedero e inducen la expresión de otros genes como proteínas de fase aguda. Estas citoquinas a su vez tienen la capacidad de inducir en los macrófagos y neutrófilos la producción de la enzima óxido nítrico sintetasa inducible (inos), la cual se encarga de transformar el aminoácido L-arginina en óxido nítrico, que al combinarse con el oxígeno molecular o con el anión superóxido, genera especies reactivas del oxígeno (ROS) para inhibir el crecimiento de patógenos. Hepcidina (hep) en la trucha arcoiris, es un péptido antimicrobiano que forma parte del sistema inmunitario innato y por lo tanto, constituye la primera línea de defensa contra las infecciones, también se encarga del control de la homeostasis del hierro actuando tanto a nivel celular como sistémico (Crowhurst et al., 2002; Mathew et al., 2002; Magnadóttir, 2006; Alvarez-Pellitero, 2008; Castro et al., 2008; Lieschke y Trede, 2009; Rombout et al. , 2011) .

Con respecto a la exposición de cepas específicas y su inducción genética en el hospedero se puede decir que: La cepa A025 indujo la expresión de una gran cantidad de genes entre ellos la citoquina il-ΐβ (5,803 veces, p ≤ 0,05), mpo (81,7 veces, p < 0,05) y c3 (5,4 2veces, p < 0,05).

La cepa B022 perteneciente al género Pediococcus tuvo un comportamiento similar al observado en la cepa A025 (Carnobacterium sp) por tanto indujo la expresión de il-ΐβ (5,468 veces, p < 0,05) y mpo (38,8 veces, p < 0,05).

La cepa B018, logró inducir la expresión significativa de mieloperoxidasa (mpo), 8,2 veces con respecto al gen control (p ≤ 0,05), lisozima (lys), 1,6 veces (p ≤ 0,05) y proteina del complemento (c3) , 13,1 veces (p ≤ 0,05).

La levadura K002 al igual que la bacteria B018 indujo la expresión de los genes mieloperoxidasa {mpo), 2,2 veces con respecto al gen control (p ≤ 0,05) y lisozima (lys), 2,6 veces (p ≤ 0,05), tal como se muestra en la figura 3/8.

Para la interpretación de los datos, se consideró el nivel de significancia de la expresión de algunos genes de la inmunidad innata modulada por la interacción de la bacteria de la microbiota de los salmónidos (Lactococcus B018) inoculada en larvas de pez cebra (D. rerio) axénicas, a partir del valor-p (p-value) (<0,05).

De acuerdo a los antecedentes y resultados obtenidos se postuló la posibilidad de combinar distintos tipos de microorganismos. En un primer grupo, se encontraría la cepa B022 y K002, ya que en conjunto podrían promover en el hospedero original la estimulación de los genes il-ΐβ, mpo, lis y c3. En el segundo grupo se encontrarían, las cepas A025 y B018, que en conjunto podrían promover los mismos genes observados en el primer grupo tal como se ve representado en la figura 4/8 y figura 5/8.

En modelo trucha arcoiris

De acuerdo a lo observado en pez cebra, se decidió analizar la interacción que podía realizar la bacteria de la microbiota de salmónidos en trucha arcoiris (O. mykiss) anéxica, en el hospedero original, con el fin de verificar si la respuesta obtenida es similar en cuanto a la inducción de genes relacionados con la defensa y el sistema inmune innato. En este organismo se logró observar una fuerte inducción de la expresión de los genes lys, que habían sido observados anteriormente en pez cebra. Además, se observó la expresión de algunos de los genes visualizados en pez cebra, tales como: il l-β, tnf- , inos y hep; como se presenta en la tabla III. Para la interpretación, se consideró el nivel de significancia de la expresión de algunos genes de la inmunidad innata modulada por la interacción de la bacteria de la microbiota de los salmónidos (Lactococcus B018) inoculada en alevines de trucha arcoiris (O. mykiss) axénicos, a partir del valor-p (p-value) (<0, 05) .

Tabla III

tnf-a 18,7 3, 216-69, 376 0 OK

Μρσ 1, 543 0, 135-23, 176 0, 421

Lyz 1/5 0, 898-2, 567 0, 001 OK

Saa 1, 314 0, 563-2, 511 0, 127 c3 3, 189 0,234-23, 993 0,273

Inos 4,2 2,371-7, 831 0 OK

Hep 1,4 0, 698-2, 250 0, 017 OK

Esta tabla presenta los resultados de expresión significativa del RT-PCR cuantitativo para los genes de la inmunidad innata il-ΐβ, tnf-a, mpo, lys, saa, c3, inos y hep modulados por la bacteria Lactococcus-B018 , inoculada en alevines de trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss) axénico. El factor de enlongación (ef-lot) fue usado como gen control (Housekeeping) . v.- producción de los probioticos

Es importante tener en cuenta cuando se trabaja con probioticos, que estos logren sobrepasar diferentes condiciones que podrían afectar su viabilidad. Primero deben superar los diferentes factores que puedan afectar su fisiología, al ser expuestos a los diferentes procesos industriales para fijarse en el alimento. Estos procesos pueden ser la congelación, secado exposición a oxígeno, cambios drásticos de temperaturas, altas concentraciones de ácido láctico en el medio de cultivo entre otras. Además, deben resistir el paso por el tracto digestivo hasta llegar al lugar de actividad (intestino) , prevaleciendo ante la acidez y enzimas digestivas y de esta manera puedan producir los mencionados efectos benéficos en el hospedero.

Es por esto, que es importante establecer alternativas procedimentales para mantener la viabilidad de los microorganismos a utilizar, para ello se ha utilizado la microencapsulación . De esta manera, una de las metodologías que se propone utilizar de preferencia en la presente patente es la del spray-drying o pulverización, sin excluir otras tecnologías que logren mantener la viabilidad de los mismos microorganismos . Para el logro de este proceso específico se necesitó:

*Crecimiento de microorganismos :

De acuerdo a los resultados obtenidos en alevines de pez cebra (D. rerio) y Trucha Arcoíris (O. mykiss) axénicos, se decidió trabajar con cuatro microorganismos los cuales fueron Lactococcus sp (B018), Carnobacterium sp (A025) y Pediococcus sp (B022) , estas bacterias además fueron escogidas porque pertenecen a las denominadas Bacterias Acido Lácticas (BAL) , Por otro lado, también se decidió trabajar con una levadura, Debaryomyces sp (K002). Se escogieron estos microorganismos porque son considerados como Gras (Generalmente reconocidas como seguras) de acuerdo a la FDA (Food and Drugs Administration) ente internacional que regula calidad de los alimentos, tanto para personas como para animales.

Las bacterias A025 depósito biológico N° A025-B/00069, K002 depósito biológico N° RGM 2143 y B018 depósito biológico N° B018-B/00070, fueron sembradas en placas de TSA (agar soya tripticasa) , B022 depósito biológico N° B022-B/00071 fue sembrada en MRS (Man, Rogosa y Sharpe Agar) . Se incubaron a 28°C, en condiciones aeróbicas, dos días antes de la inoculación en tubos. Previo a esto para cerciorarse que los cultivos se encontraba puros, se observó primero que no hubieran morfologías de colonia distintas, al tener la certeza que se encontraban puros los cultivos, se tomó una colonia aislada de cada placa, se extrajo por hervido DNA de las bacteria, posteriormente se realizó PCR del gen 16SrRNA y RFLP utilizando las enzimas de restricción ó endonucleasa de restricción ALUI (Navarrete et al., 2010). Para la levadura se amplificó el ITS y RFLP utilizando la enzima de restricción HaelII. Verificada la pureza de cada cepa, se procedió a tomar una colonia de cada cultivo y se dejó creciendo en el medio líquido (TSB para A025, K002 y B018) y caldo MRS (B022) . Se dejaron incubando toda la noche (overnight u ON) . Se dejaron 2 tubos por cada microorganismo con 40 mi de cada medio inoculado, en agitación continua a temperatura ambiente. Posteriormente, cada tubo sirvió como inoculo para inocular 2 matraces de 2 litros que contuvieran 1 litro de medio líquido para cada microorganismo. Estos matraces se dejaron en agitación continua por 42h a 30 °C. Transcurrido el tiempo, bajo campana se procedió a alicuotar los cultivos en tubos de 50 mi, con el fin de separar el medio líquido de las bacterias, para ello se centrifugaron los tubos a 5000 g x 10 min a 17 °C. Se descartaba el medio y el pellet era resuspendido en 2 mi de PBS previamente estéril. Todas las alícuotas se colectadas hasta alcanzar un volumen total de 70 mi.

Para determinar la concentración de microorganismos obtenida, se procedió a sacar una alícuota del colectado y se realizó un recuento directo bajo microscopio usando cámara Petroff-Hausser . Al alcanzar una concentración de 1 x 10 ¹² microorg/ml, tal como se presenta en la figura 8/8, se procedió a la aspersión de las bacterias en 1 kg de alimento.

Para realizar la aspersión de las bacterias en 1 kg de alimento, se debe previamente dividir el alimento en porciones de 200g para lograr una distribución homogénea de partículas sobre una superficie plana. Cada 200 g fueron distribuidos sobre el mesón a manera de generar una monocapa y que no quedaran grumos. Al haber extendido uniformemente el alimento se procedía a aspersar 14 mi de la bacteria dividido en dos tiempos. El primero se distribuía 7 mi y se procedía a homogenizar moviendo lo pellets y agitándolos para promover su mezcla. Para la segunda aspersión, se realizó el mismo procedimiento anteriormente descrito para finalizar con la fijación de las bacterias agregando 5,3 mi de aceite 100% de soya. Al haber inoculado la bacteria en el alimento, este era almacenado a 4 °C para su posterior administración a los peces .

Previo a la administración del alimento con el probiótico se debió determinar la carga microbiana por gramo, para ello bajo campana, evitando contaminación, se tomaron tres alícuotas del alimento cada una con 1 g y se procedió a la maceración del alimento con un mortero previamente estéril. El alimento macerado era colocado en un tubo de 15 mi que contuviera 10 mi de PBS, para posteriormente ser homogenizado utilizando vortex, y se realizaban diluciones seriadas hasta - 3 en una relación 1:10. Se sembraban por rastrillo 100 ul de cada muestra por triplicado en placas de TSA y eran incubadas a 28 °C por 48 h. Transcurrido el tiempo se procedía al conteo de UFC de cada placa y se realizaba un promedio, al alcanzar una densidad de 1 x 10 ufc/g de alimento se procedía a la alimentación de los peces.

Para determinar la densidad bacteriana y la presencia del probiótico en el intestino, la primera semana después de haber comenzado el periodo de alimentación, se procedió a tomar 3 peces década grupo, los peces se anestesiaron con BENZOCAINA ^® (BZ-20) , en una relación 900 μΐ en 6 L de agua, posteriormente se tomaba cada pez y se masajeaba con cuidado en la zona abdominal hasta obtener contenido intestinal y depositarlo en un tubo de centrifuga de 2 mi estéril y previamente pesado para sacar la diferencia de peso. Bajo campana, evitando cualquier contaminación externa se procedió a agregarle a cada tubo 1 mi de PBS estéril y a homogenizar la muestra con ayuda de un vortex, luego se realizaron diluciones seriadas hasta -3 y se sembraron por triplicado 100 μΐ de cada muestra en una relación 1:10. Se sembraban por rastrillo en placas de TSA y fueron incubadas a 28 °C por 48 h. Se observó que las bacterias lácticas (A025 y B018) logran una carga de 7 x 10 ⁷ UFC/g en contenido intestinal. Mientras que B022 logra una carga de 4 x 10 ⁸ UFC/g y K002 alcanza 2 x 10 ⁸ UFC/g.

* Encapsulación :

Se prepararon soluciones al 10% p/v de proteína de leche, maltodextrina, o en combinación con proteína y carbohidrato en agua destilada y luego se homogenizó. Posteriormente, se adicionó la suspensión bacteriana y se mantuvo en agitación (hielo) en un sistema floculador. Finalmente, fueron secadas en el equipo spray-drying, bajo diferentes condiciones de atomización. En el equipo Mini Spray Dryer B-290 se llevó acabo la atomización y obtención de las macropartículas según los parámetros mencionados en la Tabla II. Tabla II. Parámetros de atomización.

Parámetro

Temperatura entrada

130

(°C)

Temperatura salida (°C) 70-80

Aspirador (m ³ /h) 30-35

Velocidad de

2-5

alimentación (mL/min)

Presión de atomización

40-54

(mbar )

Flujo de aire (L/h) 500-1300

La morfología de las micropartículas se determinó mediante microscopía electrónica de superficie y microscopía óptica, obteniendo registros fotográficos. Para una determinación más exacta del tamaño, se utilizó un analizador de potencial zeta. El control de estabilidad, se determinó mediante visualización microscópica el cambio de apariencia de las micropartículas luego de 2 meses a 23°C.

La viabilidad microbiana se determinó realizando el recuento de microorganismos determinando las unidades formadoras de colonia (UFC) , antes y después del secado por atomización, usando la técnica de la microgota en placas de agar de TSA (Agar Soya Tripticása) . Brevemente, se prepararon diluciones -1 hasta -6, en PBS lx y se procedió a sembrar en las placas de agar, luego fueron incubadas por 48 h a 37°C para realizar el recuento final.

Para determinar si las partículas resistían las condiciones adversas intestinales, se realizaron controles de liberación de las partículas en tampones gástrico e intestinal, para ello los tampones se prepararon en agua destilada acidificado con HC1 o alcalinizado con NaOH, hasta lograr los pH requeridos. En los tampones gástrico (pH 3.0) e intestinal (pH 10.0), se adicionaron 2,5 g de micropartículas conteniendo las bacterias. Se mantuvo en agitación constante por 2h y se fueron tomando muestras a los tiempos 0, 10, 30 y 120 min. Luego se verificó la viabilidad microbiana como se describió anteriormente.

^♦ Inclusión en alimento:

Para realizar la aspersión del microencapsulado de microrganismos , primero se resuspendió el microencapsulado en 70 mi de PBS (buffer fosfato salino) y luego se aspersaron en 1 kg de alimento, el cual se debe previamente dividir en porciones de 200g para lograr una distribución homogénea de partículas sobre una superficie plana. Cada 200 g fueron distribuidos sobre el mesón a manera de generar una monocapa y que no quedaran grumos. Al haber extendido uniformemente el alimento se procedía a aspersar 14 mi de la bacteria dividido en dos tiempos . El primero se distribuía 7 mi y se procedía a homogenizar moviendo lo pellets de alimento y agitándolos para promover su mezcla. Para la segunda aspersión, se realizó el mismo procedimiento anteriormente descrito para finalizar con la fijación de las bacterias agregando 5,3 mi de aceite 100% de soya. Al haber inoculado la bacteria en el alimento, este era almacenado a 4 °C para su posterior administración a los peces .

Previo a la administración del alimento con el probiótico se debió determinar la carga microbiana por gramo, para ello bajo campana, evitando contaminación, se tomaron tres alícuotas del alimento cada una con 1 g y se procedió a la maceración del alimento con un mortero previamente estéril. El alimento macerado era colocado en un tubo de 15 mi que contuviera 10 mi de PBS, para posteriormente ser homogenizado utilizando vortex, y se realizaban diluciones seriadas hasta - 3 en una relación 1:10. Se sembraban por rastrillo 100 μΐ de cada muestra por triplicado en placas de TSA y eran incubadas a 28 °C por 48 h. Transcurrido el tiempo se procedía al conteo de UFC de cada placa y se realizaba un promedio, al alcanzar una densidad de 1 x 10 ⁸ ufc/g en alimento se procedía a la alimentación de los peces. El límite inferior de la densidad bacteriana requerida para lograr una respuesta a nivel inmunológico es de de 1 x 10 ⁷ ufc/g en alimento, la presente invención abarca este rango e inferiores tales como 1 x 10 ⁵ ufc/g de alimento. El límite superior no tiene rangos a excepción de la concentración toxica para el pez la cual todavía no está determinada.

Para determinar la densidad bacteriana y la presencia del probiótico en el intestino, la primera semana después de haber comenzado el periodo de alimentación, se procedió a tomar 3 peces década grupo, los peces se anestesiaron con BENZOCAINA ^® (BZ-20), en una relación 900 μΐ en 6 L de agua, posteriormente se tomaba cada pez y se masajeaba con cuidado en la zona abdominal hasta obtener contenido intestinal y depositarlo en un tubo de centrifuga de 2 mi estéril y previamente pesado para sacar la diferencia de peso. Bajo campana, evitando cualquier contaminación externa se procedió a agregarle a cada tubo 1 mi de PBS estéril y a homogenizar la muestra con ayuda de un vortex, luego se realizaron diluciones seriadas hasta -3 y se sembraron por triplicado 100 μΐ de cada muestra en una relación 1:10. Se sembraban por rastrillo en placas de TSA y fueron incubadas a 28 °C por 48 h. Se observó que las bacterias lácticas (A025 y B018) logran una carga de 7 x 10 ⁷ UFC/g en contenido intestinal. Mientras que B022 logra una carga de 4 x 10 ⁸ UFC/g y K002 alcanza 2 x 10 ⁸ UFC/g.

Para demostrar su capacidad como probiótico del Lactococcus B0P1-8, salmones tratados a través del alimento con el probiótico en una concentración para cada cepa de 1 x 10 ⁹ ufc/g de alimento fueron enfrentados a un patógeno de agua dulce de interés en su control para la industria, este es el caso de la bacteria Gram Negativa F. psycrophylum (figura 6/8) .

Claramente el efecto del alimento con el probiótico y sin el probiótico generó una diferencia real en la tasa de mortalidad de los individuos. El mecanismo de cómo el probiótico logra su efecto se basa en el efecto inmuno- estimulante del probiótico sobre el salmón y como este responde de manera cruzada al patógeno expuesto (la respuesta cruzada corresponde que puede responder a otros patógenos similares, bajo el mismo mecanismo del aumento de la respuesta inmunoestimulante inespecifica) , para este caso F. psycrophylum. Esto podría deberse a que las bacterias ácido lácticas (LAB) , grupo al que pertenecen las bacterias Lactococcus sp. (B018); Pediococcus sp. (B022) y

Carnobacterium sp. (A025), presentan una gran tasa de colonización en el tracto gastrointestinal, de lo que se infiere un mayor campo de fijación o adherencia a la superficie epitelial del intestino de los peces y de este modo mayor exposición para la activación de la respuesta no especifica como la actividad del complemento y Lisozima, inhibiendo cruzadamente el crecimiento de patógenos .

Composición alimenticia con los probióticos

La ruta de inoculación de los probióticos al salmón es por vía oral a través del alimento.

Esto implica la posible utilización de cualquier alimento conocido para salmón inoculado con el probiótico en cualquiera de sus formas. Esto quiere decir, que puede ser inoculado en forma de polvo sólido como asperjado en como una suspensión microbiológica activa o en cualquier forma en la cual la bacteria pueda generar una respuesta no especifica a través del sistema gastrointestinal del salmón.

Dentro de los alimentos para salmones conocidos y comercializados en Chile, tales como BIO AR®, SKRETTING®, EWOS®, entre otros, que pueden ser inoculados se utilizó la dieta comercial E OS®-transfer calibre 5, con una tasa de 2,3% de la biomasa por día.

La composición bioquímica de esta dieta, es tal como se presenta en la tabla IV.

Tabla IV. Composición química de la dieta EWOS®-transfer (% alimento seco) , para Trucha Arcoíris, O. mykiss. % Materia Seca

Proteíaa Cruda % min 51

Lípidos % min l8

Humedad % Max 10

Cenizas % Max 12

Fibra Cruda % Max 1,5

Uso de los pro-bióticos en el tratamiento, prevención y profilaxis de la infección causada por Flavobacterium psycrophilvm.

El uso de estos probioticos en contra de Flavobacterium psycrophilum, se ve claramente en las figura 6/8, 7/8 y tabla 5 de la presente memoria descriptiva.

Por otro lado, este producto puede ser utilizado ampliamente en especies tales como Salmón Atlántico (S. salar), Trucha Arcoiris (O.mykiss) y Salmón Coho (O. kisutch) .

Los diferentes tipos de cultivo salmón desde etapas en lt hasta engorda pueden utilizar presente probiótico en alimentación que le corresponde.

Este probiótico puede ser utilizado en cultivos abiertos (proceso de engorda) o cerrados (recirculación), en agua dulce, agua de mar y/o estuario.

Las diferentes cepas de microorganismos pueden ser mezcladas en relaciones que van desde las cepas puras utilizadas individualmente, hasta mezclas 10% / 90%, 20% / 80%, 30% / 70%, 40% / 60%, 50% / 50% (1:1) entre 2 cepas o mezclas entre 3 y/o las 4 cepas en cualquier proporción adecuada para la mejor respuesta inmune frente a un microorganismo patógeno.

DESCRIPCIÓN DE FIGURAS

Figura 1/8

La presente figura presenta dos fotografías, la fotografía de la izquierda representa un gel de agarosa para un RFLP (polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción del gen 16SrRNA) de las bacterias de la microbiota de salmónidos A025 ( Carnobacterium sp.), B018 {Lactococcus sp.), B022 {Pediococcus sp.) utilizando la enzima de restricción Alu I.

LB: estándar de peso molecular.

A025: corresponde a un patrón electroforético de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) del DNA genómico mediante enzimas de restricción Alu I que consta de 5 bandas, la primera ubicada en 800 pb, la segunda en 220 pb, la tercera en 200 pb; la cuarta en 180 pb; y la quinta en 40 pb, para un total de 1440 pb.

B018: corresponde a un patrón electroforético de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) del DNA genómico mediante enzimas de restricción Alu I que consta de 5 bandas, la primera ubicada en 400 pb, la segunda en 250 pb, la tercera en 240 pb, la cuarta en 230 pb y la quinta en 200 pb; dando un total de 1320 pb. B022: corresponde a un patrón electroforático de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) del DNA genómico mediante enzimas de restricción Alu I que consta de 5 bandas, la primera ubicada en 480 pb, la segunda en 340 pb, la tercera en 200 pb, la cuarta en 180 pb y la quinta en 100 pb, para un total de 1300 pb.

La fotografía de la derecha presenta un gel de agarosa para un RFLP (polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción) de la levadura cepa K002 (Debaryomyees sp) , utilizando la enzima de restricción Hae III.

LB: estándar de peso molecular. K022: corresponde a un patrón electroforético de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) del DNA genómico mediante enzimas de restricción Hae III que consta de 4 bandas, la primera ubicada en 480 pb, la segunda en 150 pb, la tercera en 140 pb y la cuarta en 80 pb; y posee un marcador de resistencia a gentamicina (5 μg/ml) y ampicilian (100 μg/ml) .

Figura 2/8 Esta figura presenta dos diagramas, el diagrama de la izquierda representa los resultados estadísticos de la expresión significativa en un RT-PCR cuantitativo en tiempo real, para los genes de inmunidad innata ίΐ-ΐβ, tnf-α, mpo, lys, saa, c3, inos y hep, modulados por Lactococcus B0P18, bacteria de la microbiota del tracto digestivo de salmónidos, inoculada en pez cebra (D. rerio) axénico. Los datos fueron normalizados con log 10. En el eje de la abscisa presenta la expresión relativa los diferentes genes en logaritmo 10, para mejorar la escala.

En el eje de las ordenadas se ven los diferentes tipos de expresiones genéticas y sus errores estadísticos .

A. - expresión de genes de MPO

B. - expresión de genes de Lys

C- expresión de genes de C3

Esto fue medido al sexto día post-incubación .

El esquema de la derecha presenta los resultados estadísticos de la expresión significativa en un RT-PCR cuantitativo en tiempo real, para los genes de inmunidad innata il-ΐβ, tnf-a, rapo, lys, saa, c3, inos y hep, modulados por Lactococcus B0P18, bacteria de la microbiota del tracto digestivo de salmónidos, inoculada en trucha arcoíris (O. mykiss) axénico. Los datos fueron normalizados con log 10.

En el eje de la abscisa presenta la expresión relativa de los diferentes genes en logaritmo 10, para mejorar la escala.

En el eje de las ordenadas se ven los diferentes tipos de expresiones genéticas y sus errores estadísticos.

D.- expresión de genes de iNOS

B.- expresión de genes de Lys

E.- expresión de genes de HEP

F . - ^■ expresión de genes de IL 1-β

G.- ^■ expresión de genes de TNF-OÍ

Esto fue medido al sexto día post-incubación. Figura 3/8

Esta figura presenta los resultados de expresión significativa del RT-PCR cuantitativo para los genes de la inmunidad innata il-ΐβ, tnf-a, mpo, lys, y c3 modulados por Carnobacterium sp (A025), Lactococcus sp (B018), Pediococcus sp (B022) y Debaryomyces sp (K002) microorganismos de la la microbiota del tracto digestivo de salmónidos, inoculados en larvas de pez cebra (Danio rerio) axénico, tercer día post inoculación. Los datos fueron normalizados con logio-

En el eje de la abscisa presenta la expresión relativa de los diferentes genes en logaritmo 10, para mejorar la escala. En el eje de las ordenadas se ven los diferentes tipos de expresiones genéticas y sus errores estadísticos.

Figura 4/8 Esquema de combinación 1:1 de bacterias K002 / B022 con concentracióes de acuerdo a su expresión génica de C3, Lys, il-lb y mpo.

Figura 5/8

Esquema de combinación 1:1 de bacterias B018 / A025 de acuerdo a su expresión génica de c3 Lys, il-lb y mpo.

Figura 6/8

Esta figura presenta los resultados gráficos en el porcentaje de mortalidad de salmónidos enfrentados a la bacteria patógena Flavohacterium psycrophylum, en peces con y sin tratamiento con el probiotico Lactococcus BOPl-8.

En el eje de la abscisa presenta la escala de tiempo en días de exposición de los salmones a Flavohacterium psycrophylum.

En el eje de las ordenadas se ve el porcentaje de mortalidad de los salmones expuestos a Flavohacterium psycrophylum. ti.- % de mortalidad dieta Control sin el probiotico Lactococcus BOPl-8. I . - % de mortalidad dieta con el probiotico Lactococcus

BOPl-8.

Figura 7/8

Esta figura presenta el porcentaje de sobrevida de los peces con las dietas conteniendo los candidatos probióticos y que pueden lograr frente al desafio con el patógeno Flavohacterium psycrophilum.

La linea punteada con triángulos representa el porcentaje de sobrevida con la dieta 1:1, B018 + A025.

La linea punteada con cruces representa el porcentaje de sobrevida con la dieta 1:1, B022 + K002. La linea punteada con cuadrados representa el porcentaje de sobrevida con la dieta control. En el eje de la abscisa presenta la escala de tiempo en días de exposición de los salmones a Flavobacterium psycrophylum. En el eje de las ordenadas se ve el porcentaje de mortalidad de los salmones expuestos a Flavobacterium psycrophylum.

Figura 8/8

Esta figura representa uno fotografía de una placa de agar donde se ven las unidades formadoras de colonias (UFC) de la bacteria Lactococcus sp (B018) por gramo de alimento.

EJEMPLO DE APLICACIÓN

Pruebas experimentales i) Aislación e identificación de las bacterias del tracto gastrointestinal de salmónidos :

Los juveniles de Salmón Atlántico (Salmo salar) , Salmón Coho (Oncorhynchus kisutch) y Trucha Arcoíris (Oncorhynchus ykiss) con peso promedio entre 15 y 30g, fueron obtenidos desde diferentes pisciculturas en Chile, los peces nunca han sido tratados con antibióticos, probioticos, inmunoestimulantes o agentes inhibitorios. A cada individuo se le extrajo asépticamente disectando el tracto gastrointestinal y cada sección (estómago, ciego pilórico e intestino) , se colocaron de manera separada en PBS (buffer fosfato salino IX, 8 g NaCl 0.2 g KC1 1,44 g Na ₂ HP0 ₄ 0, 24 g KH ₂ P0 ₄ , 1 L) . Cada sección se homogenizó, se extrajo posteriormente el DNA con fenol/cloroformo, se amplificó la región de 16S rRNA por PCR, posteriormente los amplicones se secuenciaron . Además, se realizó el conteo y cultivo de bacterias, para ello se sembraron en diluciones seriadas del homogenizado, se sembraron 100 μΐ por rastrillo en placas de agar soya tripticasa (TSA) , las placas se incubaron por 10 dias a 17°C bajo condiciones aeróbicas. Se contaron las colonias y se calculó el número de colonias por gramo de contenido intestinal .

Algunas de las bacterias que se lograron identificar y prevalecían en el tracto gastrointestinal de las tres especies salmonídeas fueron tres cepas pertenecían al género Carnobacterium cuyos códigos asignados fueron A025, 2A7 y 39L, dos cepas pertenecientes al género Lactococcus cuyos códigos fueron A0P1-7 y B018, además, una cepa perteneciente al género Pediococcus, cuyo código es B022. Además, 6 bacterias Gram negativas como: Providencia sp. (Dll), Psycro£>acter sp. (D13) , Pectobacteríu sp. (B10) , Shewanella sp. (18), Aeromonas hp. (Ae hp) y Pseudomona sp. (Pl) . ii) Modulación de la expresión de genes de la inmunidad innata en pez cebra (D. rerio) axénico inducido por microbiota gastrointestinal de salmónidos:

Obtención de pez cebra axénico .

Para generar e investigar peces cebra (D. rerio) axénicos, se colocaron 2 machos y una hembra adultos, esto con el fin de asegurar el éxito de la fertilización de las ovas. Los peces fueron colocados en acuarios acrílicos de 1,5 L, estos contienen un canastillo en su interior el cual separa a los reproductores de las ovas, evitando el canibalismo de los adultos hacia éstas (Mullins et al. 1994; Lawrence 2007) . El acuario contenia agua dulce y aireación constante, a una temperatura de 28 °C. Los peces reproductores fueron alimentados 2 veces al día a saciedad con Artemia y SUPERVIT ^® , en el momento de generar la reproducción la alimentación fue suspendida por un periodo de 6-8 horas.

Para tener la mayor cantidad de ovas, se colocaron 8 acuarios con reproductores y se mantuvieron en un incubador con fotoperiodo controlado (14 horas luz/10 horas oscuridad) . Los reproductores eran colocados durante la noche y en horas de la mañana, los acuarios que contenían ovas se separaban del resto y se extraían los reproductores. Los acuarios que contenían las ovas eran trasladados al laboratorio. Con una pipeta pasteur plástica desechable se extraían las ovas con mucho cuidado y eran colocadas en una caja Petri, la cual debía contener 30 mi de medio E3 estéril (Medio referencia para pez cebra) . Las ovas fueron lavadas con cambios consecutivos de medio, evitando la presencia de partículas visibles como fecas y otros detritos.

Al segundo día, post fertilización (dpf ) , las ovas fueron lavadas con yodo 0,1% por 30 seg, se lavaron con abundante medio E ₃ . Seguidamente, las ovas fueron lavadas 2 veces en solución de yodo 0,1%. El primer lavado debía contener yodo 0,1% por 1,5 min y el segundo yodo 0,1% 40 seg. Entre cada lavado las ovas se lavaban con abundante medio E3. A continuación, las ovas se dejaron en un mix de antibiótico el cual tenía 200 μς/τΐ de ampicilina, 200 ]ig de ceftazidima, 5 μg/ml kanamicina, 20 g/ml cloranfenicol y 2 g/ml azul metileno. Las ovas se dejaron en el mix de antibiótico por un periodo de 4 horas, a una temperatura de 28 °C, transcurrido el tiempo se cambió el mix de antibiótico, por un mix de antibiótico fresco para evitar la presencia de bacterias resistentes . Se dejaron incubando a 28 °C hasta el siguiente día .

Al tercer día, se indujo la eclosión, donde las larvas de pez cebra fueron pasadas primero por un lavado de yodo 0,1%, luego un lavado con mix de antibióticos. Posteriormente, las larvas se dejaron incubando en mix de antibiótico a 28 °C por un periodo de 4 horas. Transcurrido el tiempo, se volvió a realizar este mismo procedimiento de lavados con yodo y mix de antibiótico. Por último, las larvas se lavaron con medio E3, eliminando el antibiótico o algún componente químico que pudiera alterar la respuesta inmunológica . Seguidamente, las larvas se dividieron en grupos en placas de 6 pocilios que contuvieran 5 mi de medio E ₃ estéril.

Preparación de microorganismos .

Los microorganismos escogidos para ser postulados como candidatos a probióticos fueron seleccionados porque sus familias son reconocidas como generalmente seguras (GRAS) ya que se han propuesto para su uso en alimentos. Además, porque pertenecen a las denominadas bacterias ácido lácticas (LAB) o levaduras benéficas, las cuales han sido de gran interés como potenciales probióticos en diversos sistemas de producción (Lara-Flores et al., 2003; Vázquez et al., 2005) . Una tercera razón, es porque se ensayó su total inocuidad en alevines de Salmón Atlántico (Salmo salar) determinando que no indujo mortalidad y fueron reconocidas como seguras para el hospedero a una concentración de 10 ⁹ microorganismos por mi.

Las bacterias A025, B0P18 y K002 fueron sembradas en TSA y B022 fue sembrada en MRS, se incubaron a 28°C, dos días antes de la inducción a eclosión. Un inoculo a partir de una sola colonia de cada cultivo fue tomada y se dejó creciendo en medio liquido por 16h, con agitación continua y a 28 °C. Transcurrido el tiempo, se procedió a sacar una alícuota de cada medio observando la concentración microotg/ml que presentaron en microscopio y utilizando placas Petroff- Hausser. Al obtener el volumen que se necesitaba de cada una dé las placas con los microorganismos que debían alcanzar una concentración entre 10 ⁷ y 10 ⁸ microorg/ml, se procedió a inocular las larvas del pez cebra con los microorganismos.

Ensayos de Monoasociacion.

Los ensayos de monoasociacion consisten en obtener organismo axénico al cual con fines experimentales se le inocula con un microorganismo conocido. La mono asociación se entiende por: 1 metazoo con 1 microorganismo.

Las larvas fueron divididas en 3 grupos de 15 individuos cada uno, posteriormente eran colocadas en cada pocilio con 5 mi de medio E ₃ estéril. Cada grupo tratado fue inoculado con 100 μΐ de cada microorganismo (Lactococcus sp. (B018); Carnobacterium sp. (A025) ; Pediococcus sp. (B022) y Debaryomyces sp (K002) .

En paralelo se incubó un grupo control, el cual no se inoculó y se mantuvo axénico (Germ Free-GF) . La experiencia se extendió hasta el sexto dpf. En ese día se sacrificaron todas las larvas dejando al menos por grupo 3 larvas para determinar si los peces se encontraban axénicos (Germ free) y se verificó la carga bacteriana en cada grupo inoculado. Para ello se procedió al recuento bacteriano, utilizando diluciones seriadas y siembra en placa. Análisis de expresión génica.

Se utilizó Trizol® para la extracción total de RNA. Una cantidad de 6 μΐ de RNA fue utilizada para la transcripción inversa para la síntesis de cDNA. Los partidores para los genes de la inmunidad innata a estudiar son dados en la siguiente tabla V.

^Partidores usados para la detección de genes de la inmunidad innata en larvas de pez cebra (Danio rerio) axénicas.

La subunidad ribosomal 18S fue usada como gen control (Housekeeping) . No se observó amplificación en el control negativo (mix sin cDNA) . Los datos obtenidos fueron analizados utilizando el programa REST ^® . La expresión de genes se genera con respecto a la comparación entre grupo control y el grupo tratado .

Como resultado en la cepa B018 {Lactococcus sp.), se obtuvo la expresión de los genes mpo, lys y c3 (Figura 7/8). Mieloperoxidasa {mpo) codifica para una enzima que se encuentra presente en los neutrófilos y macrófagos (células fagocíticas) . Esta enzima se encarga de catalizar la producción de compuestos bactericidas como peróxido de hidrógeno implicado en estallido respiratorio. Lisozima (lys) , esta enzima se encuentra en los fagocitos, es una enzima con propiedades bactericidas, la cual tiene la capacidad de adherirse a la pared celular de los patógenos que presentan pared celular compuesta por peptidoglicano, generando en éstos la lisis. La Proteina del Complemento (c3) , está implicada una serie de cascadas biológicas que derivan en la amplificación de las respuestas de defensa contra patógenos entre ellas fagocitosis, lisis de células extrañas, opsonización y formación de los complejos de ataque a la membrana del patógeno (Crowhurst et al., 2002; Mathew et al., 2002; agnadóttir, 2006; Alvarez-Pellitero, 2008; Castro et al., 2008; Lieschke y Trede, 2009; Rombout et al., 2011) .

• Modulación de la expresión de genes de la inmunidad innata en trucha arcoiris (O. ykiss) axénica inducido por microbiota:

Obtención de Trucha arcoiris axénica.

Todas las manipulaciones se realizaron bajo campana de flujo laminar, utilizando materiales previamente esterilizados. Las 500 ovas de Trucha Arcoiris (O. mykiss) con 290 UTAS (Unidades térmicas acumuladas, o grados de temperatura acumulados por día) , previo a su aclimatación fueron desinfectadas lavándolas con Buffodine®, en una relación 1:100 de agua tratada para reducir dureza a 60 mg/1 de CaCC>3 y autoclavada. Posteriormente, las ovas se lavaron con abundante agua tratada. Seguido a la desinfección las ovas se colocaron en una caja para mantención de ratón axénico previamente adaptada para colocar una batea metálica semejando la de cultivo de trucha. Allí se dejaron con aireación continua, e incubaron a una temperatura de 10 ± 1 °C en oscuridad. Este mismo procedimiento de lavado e higienización se realizó durante 4 dias seguidos. Al quinto día, se comenzó a dar el proceso de eclosión de manera natural. Los alevines fueron retirados del resto del grupo y se pasaron por un lavado con Buffodine® en una relación 1:1000. Se dejaban en esta solución por 1 min y posteriormente se lavaron con abundante agua tratada. Seguidamente, se colocaban en un mix de antibióticos que contenia 400 g/ml de ampicilina, 400 g de ceftazidima, 10 μg/ml kanamicina, 20 μg/ml cloranfenicol .

Se mantuvieron los alevines con tratamiento yodo- antibiótico durante un periodo de 30 dias. Se verificó la ausencia de microorganismos en base a toma de muestras realizadas diariamente y recuento en placas; además cada tercer día se muestrearon alevines, los cuales eran homogenizados en PBS para su posterior análisis de recuento bacteriano. De esta forma, se eliminó la carga bacteriana por completo y se pudo realizar la inoculación de las bacterias especificas en los ensayos de monoasociación .

Ensayos de Monoasociación

Antes de realizar la inoculación de cada microorganismo, los alevines fueron lavados con yodo en una relación 1:1000 por 1 min y se lavaron con abundante agua, se dejaron incubando por un periodo de 6 horas a 10°C. Los alevines fueron divididos en 2 grupos, dejando un grupo control (GF) y el otro para inocular por separado los microorganismos a ensayar (pertenecientes a la microbiota de salmónidos) . Transcurrido el tiempo y siguiendo el protocolo de preparación de las bacterias del punto anterior. Se inoculó la cepa B018, en una concentración de 10 bact/ml. Al sexto día después de haber sido inoculada la bacteria, se realizó el sacrificio donde se tomaron por cada grupo 16 alevines. Los alevines fueron colocados en tubos de 50 mi, que contuviera 30 mi de agua previamente tratada y se les agregó 3 μΐ de BENZOCAINA ^® (BZ-20), como anestésico. Posteriormente, cuando los alevines no presentaron movimiento se tomaron con unas pinzas metálicas previamente esterilizadas, 4 alevines los cuales fueron colocados sobre una placa petri. Con un bisturí se realizó un primer corte a nivel de branquias y posteriormente se realizaba un segundo corte a nivel de ano. Los troncos se colocaron en un tubo que contuviera 4 mi de TRIZOL. Las cabezas y aletas caudales eran eliminadas. De esta manera se obtuvieron 4 grupos de troncos de los dos grupos de estudio (control y B018) . Las muestras fueron almacenadas a -80 °C.

Para determinar la presencia del microorganismo inoculado, se sacrificaron alevines del grupo control (GF) y alevines del grupo tratado, para análisis de recuento en placas. Al tener la certeza que el grupo control preservó su condición axénica y que los grupos tratados conservaron su condición de monoasociados, se procedió a realizar los análisis de RT-PCR.

Análisis de expresión génica

El factor de enlongación (EF-la) fue usado como gen control (Housekeeping) y no se observó amplificación en el control negativo (mix sin cDNA) . Los datos obtenidos fueron analizados utilizando el programa REST ^® .

Se observó que en trucha arcoíris, logró inducir la expresión de los genes lys, anteriormente observado por estar expresado en pez cebra y otros genes como il-ΐβ, tnf-ot, inos y hep (Figura2/8). Las citoquinas proinflamatorias {il-ΐβ, tnf- a) que se expresaron al interactuar el hospedero con B018, son producidas por células fagociticas e inducen la expresión de otros genes como proteínas de fase aguda o citoquinas anti- inflamatorias. Estas citoquinas a su vez tienen la capacidad de inducir en los macrofagos y neutrófilos la producción de la enzima óxido nítrico sintetasa inducible (inos), la cual se encarga de transformar el aminoácido L-arginina en óxido nítrico, que al combinarse con el oxígeno molecular o con el anión superóxido, genera especies reactivas del oxígeno (ROS) para matar o inhibir el crecimiento de patógenos.

Además, B018 logró inducir la expresión de Hepcidina en la trucha arcoiris. Este gen además de ser un péptido antimicrobiano que forma parte del sistema inmunitario innato y por lo tanto, constituye la primera línea de defensa contra las infecciones, también se encarga del control de la homeostasis del hierro actuando tanto a nivel celular como sistémico (Cro hurst et al., 2002; Mathe et al., 2002; Magnadóttir, 2006; Alvarez-Pellitero, 2008; Castro et al., 2008; Lieschke y Trede, 2009; Rombout et al., 2011).

Por lo tanto, se infiere que esta cepa logra estimular el sistema inmunológico innato promoviendo la protección frente a la posible llegada de un patógeno.

• Prevención de infecciones producidas por el agente patógeno Flavóbacterlvim psycrophilvun al ser inoculado de manera controlada en el alimento, Lactococcus sp. (B018) y CamoJacterium sp (A025) (Dieta 1) y

Pediococcus sp. (B022) en combinación con Debaryomyces sp. (K002) (Dieta 2) , microorganismos de la microbiota gastrointestinal que fueron capaces de modular el sistema inmune innato en trucha arcoíris (.O.zaykiss) axénica

Persistencia del microorganismo en el tracto digestivo Se evaluó la persistencia de los microorganismos seleccionados en el tracto digestivo de salmones, para esto, se administraron dietas suplementadas con los microorganismos elegidos y dieta control (sin microorganismos añadidos) , por un periodo de 7 días . Luego fueron tomadas muestras de heces de los peces cada 3-4 días desde el dia 0 hasta el día 28.

Este ensayo se realizó administrando tres diferentes dietas a salmones (salmo salar) de 25 gr. Se requirió de 150 peces los cuales fueron divididos en tres grupos de 50 peces cada uno.

• Al grupo 1 se le administró alimento comercial adicionado con Carnobacterlum cepa 2A-5 (lxlO ⁹ bacterias/gr alimento) y Lactococcus, cepa B018 (lxlO ⁹ bacterias/gr alimento) .

• Al grupo 2 se le administró alimento comercial adicionado con Pedlococcus B022 (lxlO ⁹ bacterias/gr alimento) y Debaryomyces, cepa K002 (lxlO ⁹ levaduras/gr alimento) .

• Al grupo 3 se le administró alimento comercial sin adición de microorganismos.

La cantidad de alimento a administrar diariamente correspondió al 2% del peso de los peces. Durante 10 días consecutivos se administró a los grupos 1, 2 y 3 las dietas señaladas anteriormente. Luego de este periodo todos se comenzaron a alimentar con la dieta normal (dieta comercial) .

Se extrajeron muestras de heces los días 0, 4, 8, 11, 14, 17, 22 y 28. Estas muestras fueron colectadas en forma estéril y se plaquearon en placas con medio TSA en diluciones seriadas para posteriormente realizar recuento de colonias. Las heces extraídas de los peces con la dieta 2 fueron plaqueadas en placas de MRS (para favorecer el crecimiento del Pediococcus) y placas con TSA con adición de antibióticos (para favorecer el crecimiento de levaduras) . Las heces además fueron sometidas extracción de DNA con kit MOBIO para luego realizar PCR del gen 16SrRNA para las bacterias, e ITS para el caso de la levadura. Luego se realizó RFLP para cada marcador, digiriendo las muestras con enzima AluI para bacterias y HaelII en el caso de levaduras.

Ensayo de desafio de las bacterias probióticas frente a un patógeno (Flavobacterium psycrophilum)

Se evaluó la capacidad de los microorganismos candidatos a probióticos para proteger al salmón frente a una infección inducida de Flavobacterium psycrophilum.

El diseño fue el siguiente: se utilizaron 150 alevines de salmón (Salmo salar) de 25 gr. Estos peces fueron separados en 3 grupos de 50 individuos. Se suministró al grupo 1 una dieta suplementada con los probióticos, al grupo 2 una dieta con y al grupo 3 una dieta sin bacterias agregadas (control) durante los 21 días que duró el ensayo. En el día 8, 15 peces de cada uno de los 3 grupos fueron infectados mediante inyección intraperitonial con el patógeno Fiavojacterium psycrophilum (1x10 ^a bacterias por pez) . Además como control negativo, se mantuvo un estanque con peces sometidos a dieta control a los cuales se les inyectó sólo el medio de cultivo. Durante todo el ensayo se realizó un registro de la mortalidad diaria en los distintos grupos, para determinar el nivel de protección frente al patógeno.

Se confirmó la muerte de los peces debido a infección por Flavojbacteriujn con un análisis visual de los individuos muertos .

Análisis Estadísticos

Con los datos de mortalidad y sobrevivencia se calcularon proporciones al dia final del estudio. Las diferencias en los porcentajes de sobrevivencia, se analizaron utilizando el test de Chi cuadrado (X ² ) en tablas de contingencia de 2x2 comparando cada dieta con el grupo control.

Para evaluar el efecto protector se observó la sobrevivencia del grupo tratado con probióticos versus un grupo control (no tratado) . Se pudo observar que los peces alimentados con Dietas 1 y 2, tuvieron un notable incremento en la sobrevida (87 y 73%) siendo estas diferencias estadísticamente significativas del control, p=0, 00287 y p=0, 02811, respectivamente. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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