CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se adscribe al campo de la biotecnología y la medicina regenerativa y en concreto se refiere a un procedimiento para la obtención de células pluripotentes inducidas (¡PS) generadas a partir de la reprogramación celular de células somáticas con vectores de expresión que portan el gen de la región E1 o un fragmento del mismo y/o cualquiera de sus variantes. Además la presente invención también se refiere al uso de las células ¡PS, así producidas, en medicina regenerativa, terapia celular y tisular, vehiculización de fármacos y tratamiento de patologías de tipo genético, entre otras aplicaciones. ESTADO DE LA TÉCNICA

La capacidad de las células troncales embrionarias (ESC en sus siglas en inglés: Embrionary Stem Cells) para dar lugar a todo tipo de células somáticas, junto con su capacidad de crecer indefinidamente en cultivo, pone de relieve su potencial en el tratamiento in vivo de diferentes patologías. Sin embargo, hasta la fecha existen muchos inconvenientes técnicos, así como problemas éticos, para la utilización de dichas ESCs en terapia. Por ejemplo, las ESCs no son genéticamente idénticas entre el organismo del que se obtienen y el organismo al que se transfieren, y por lo tanto, pueden dar lugar a complicaciones del tipo de rechazo e inmunogenicidad que limitaría su uso en trasplantes clínicos o en el tratamiento de otras patologías como pueden ser la diabetes, ataxia, cáncer, etc. Además, de los problemas de rechazo e inmunogenicidad, existen los problemas éticos respecto a la obtención de ESCs humanas a partir de embriones humanos. Por estas razones, se ha venido haciendo un esfuerzo considerable en tratar de obtener células troncales pluripotentes a partir del tejidos post-natales. Sin embargo, la generación de ESC autólogas específicas para cada paciente es técnicamente tedioso y se complica aún más también por las cuestiones éticas anteriormente comentadas, limitando así de manera significativa su potencial para ser usadas en trasplantes o en el tratamiento de diferentes patologías. El grupo de investigación del Dr. Yamanaka, en el año 2006 consiguió por primera vez la reprogramación celular de fibroblastos murinos embrionarios (MEFs) y fibroblastos adultos de ratón a un estado similar al de las ESCs, mediante la introducción vía retrovirus individuales para cada uno de los factores, en dichas células fibroblásticas, de cuatro factores transcripcionales: Klf4, Sox2, Oct3/4 y c-Myc (1). Dichas células fueron denominadas células troncales pluripotentes inducidas (iPS) y eran similares a las ESCs, ya que compartían con éstas su similitud morfológica, proliferativa, así como la capacidad de generar teratomas. En estudios posteriores, el mismo grupo de investigación demostró que también el factor Nanog, era necesario para generar iPS de línea germinal (2). Por otra parte, el grupo de investigación del Dr. James A. Thomson observó que el factor de transcripción Klf4 no era un factor esencial para lograr la reprogramación de células somáticas hasta convertirlas en células de tipo iPS, ya que sustituyendo dicho factor Klf4 y el factor oncogénico c-Myc, por los factores LIN28 y Nanog (3), fue capaz de obtener células iPS.

Las células iPS, obtenidas mediante los procedimientos descritos en el estado de la técnica, ofrecen un modelo in vitro válido tanto para el estudio de los mecanismos moleculares de la reprogramación celular, como para su empleo en terapia. Sin embargo, hasta la fecha la obtención de células iPS ha requerido, como se ha indicado previamente, de múltiples vectores virales individuales para obtener el total de factores de transcripción necesarios para la inducción de la reprogramación celular (por lo general Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc). Además, es necesario que cada uno de los vectores virales que portan los cuatro factores transcripcionales se expresen simultáneamente en las células diana para convertirse en células iPS y puedan, posteriormente, dar lugar a una descendencia celular reprogramada con capacidad pluripotente.

Es conveniente mencionar en este sentido que, parte de los factores transcripcionales utilizados en el estado de la técnica para generar células iPS codifican para genes oncogénicos, como por ejemplo, el factor transcripcional c-Myc, haciendo que dichas iPS no sean seguras, como se ha comentado anteriormente. Además, muchas de las células que se infectarán con los virus que portan los factores de transcripción necesarios para obtener las células iPS descritas hasta el momento en el estado de la técnica, integrarán en su genoma sólo uno, dos o tres de dichos factores, lo que dificulta la obtención de una población homogénea de células reprogramadas iPS así como el estudio de las mismas.

Con todos los inconvenientes mencionados, existe una necesitad en el estado de la técnica de desarrollar nuevos procedimientos de obtención de células iPS que, sean más eficientes y con una mínima o nula integración viral en el genoma de las células iPS obtenidas, lo que las haría más seguras, además de eliminar genes que pudieran causar efectos dañinos, tales como el factor c-Myc, por ejemplo, al ser un gen pro- oncogénico.

Una de las posibilidades para resolver dichos problemas o inconvenientes, podría ser, por un lado, la disminución del número de factores de transcripción necesarios para obtener células iPS y, por otro lado, como se ha comentado previamente, la eliminación de factores pro-oncogénicos como puede ser el factor c-Myc, obteniendo células iPS más seguras. En este sentido, la presente invención describe un nuevo procedimiento de obtención de células iPS mediante la reprogramación celular de células somáticas con vectores de expresión que portan en su genoma el locus o región E1 de adenovirus, o un fragmento de la misma o variantes de la misma, preferentemente de adenovirus 5. Dicha región E1 de adenovirus 5 contiene las secuencias génicas que codifican y expresan para los genes E1A y/o E1 B, así como para cualquiera de sus posibles variantes.

La región E1 de adenovirus, preferentemente del adenovirus 5 (n° acceso NCBI: AC_000008.1), es una unidad transcripcional de expresión temprana que codifica, como hemos mencionado previamente, para dos proteínas, E1A (n° acceso NCBI : AP_000197.1) y E1 B (n° acceso NCBI: AP_000198.1 y AP_000199.1). El gen E1A de adenovirus 5 se ha descrito como un gen supresor de tumores (2-4), incluso, hay gran diversidad de ensayos denominados de "viroterapia oncolítica" que proponen el uso de dichos genes y de las proteínas que codifican, como una estrategia viable (5-8), sola o combinada con radioterapia o quimioterapia, debido a su efecto sensibilizador a los tratamientos frente al cáncer (9).

La expresión del gen que codifica para la proteína E1A requiere únicamente de las proteínas de la célula hospedadora y dicha expresión se facilita gracias a la presencia de una región potenciadora situada antes del promotor de la región E1A. Sin embargo, y aunque la proteína E1A es capaz de activar su propio promotor, también es capaz de reconocer la secuencia potenciadora e inhibir su función, por lo que cuando se produce un incremento en los niveles de expresión de la proteína E1A, hay una regulación negativa de la misma. El gen adenoviral E1A codifica para 5 ARNm diferentes: 9S, 10S, 1 1S 12S y 13S. Sólo las regiones 12S y 13S regulan la transcripción de genes virales y celulares en las células infectadas. Las proteínas codificadas por las regiones 12S y 13S difieren exclusivamente en un fragmento de 46 aminoácidos. En este sentido, el análisis de expresión del ARNm de dichas regiones, muestra que los transcritos más expresados son los que corresponden a la proteína E1A-12S (N° de acceso a GenBank: AY368049.1) y a la E1A-13S (N° de acceso a GenBank: AAQ72377.1), aunque existen otras variantes (1 1 S, 10S y 9S) como consecuencia de procesos alternativos de ensamblaje (splicing, en inglés). Las dos proteínas más expresadas, E1A-12S (N° de acceso a GenBank: AY368049.1) y E1A- 13S (N° de acceso a GenBank: AAQ72377.1), actúan como reguladores transcripcionales de otros genes de expresión temprana y, como moduladores de la expresión de los genes de la célula hospedadora, afectando al ciclo celular de dicha célula hospedadora y favoreciendo el proceso de replicación viral.

Así, en la presente invención, se describe el uso de la región o locus E1 de adenovirus (N° acceso GenBank: X02996.1), o un fragmento del mismo o cualquiera de sus variantes, preferentemente de adenovirus 2, adenovirus 5 o adenovirus 12, para la reprogramación de células somáticas dando lugar a la obtención de células iPS. La región E1 de adenovirus comprende las secuencias génicas que codifican para los genes adenovirales E1A (N° acceso NCBI: AP_000197.1) y/o E1 B (N° acceso NCBI: AP_000198.1 y AP_000199.1). y/o cualquiera de sus posibles variantes. Algunos de los variantes de los genes adenovirales E1A y E1 B se pueden encontrar en http:/7publish.uwo.ca/~imymryk _J ^/ E1 A/data. html y en Mymryk JS., Nucleic Acids Research, 1998, Vol. 26, No. 1. En la presente invención se describe también el procedimiento de obtención de dichas células iPS mediante la reprogramación celular de células somáticas con vectores de expresión que portan el locus E1 de adenovirus, o un fragmento del mismo o cualquiera de sus variantes, preferentemente procedentes de adenovirus 2, 5 o 12. Dichos vectores de expresión pueden comprender en su genoma, bien el locus E1 de adenovirus, o un fragmento del mismo o cualquiera de sus variantes, o bien la secuencia génica que codifica y expresa el gen adenoviral E1A (n° acceso NCBI: AP_000197.1), bien la secuencia génica que codifica y expresa el gen E1 B (n° acceso NCBI: AP_000198.1 y AP_000199.1), e incluso las secuencias génicas que codifican y expresan para las variantes de dichos genes E1A y/o E1 B. Por lo tanto, mediante el procedimiento descrito en la presente invención, es posible la obtención de células iPS a partir de la reprogramación celular de células somáticas mediante el uso de una única región génica adenoviral, la región E1 (N° acceso GenBank: X02996.1), o un fragmento del mismo o cualquiera de sus variantes, que codifica y expresa para el gen adenovirales E1A (n° acceso NCBI: AP_000197.1) y/o E1 B (n° acceso NCBI: AP_000198.1 y AP_000199.1), lo que simplifica la metodología y la eficacia en la producción de dichas células iPS, al no tener que coincidir en la misma célula, al azar, los 4 genes de los factores de transcripción que hasta ahora se consideraban necesarios, en el estado de la técnica, para la obtención de células iPS (Oct3/4, Klf4, Sox2 y c-Myc). A partir de aquí y a lo largo de toda la presente invención, a las células iPS obtenidas mediante la reprogramación de células somáticas a través de vectores que expresen en su genoma la región adenoviral E1 de adenovirus o un fragmento de la misma o cualquiera de sus variantes, o cualquiera de los genes que codifica y expresa dicha región, bien, E1A y/o E1 B y/o cualquiera de sus variantes, se les denominará células ¡PS-E1. En la presente invención se puede utilizar la región adenoviral E1 de cualquiera de los adenovirus conocidos, aunque es preferida la región adenoviral E1 de adenovirus 2, 5 o 12.

Otra de las ventajas del procedimiento de obtención de células ¡PS-E1 descrito en la presente invención radica en la posibilidad de incorporar en los vectores de expresión utilizados para la obtención de las ¡PS-E1 de la invención, otros genes que pudieran servir como marcadores, o para selección, o incluso para terapia o cualquier otra función conoci da en el estado de la técn ica, en la q ue se em pleen dichas construcciones, ya que al expresar dichos vectores una única región génica, esto hace que quede espacio suficiente en el genoma de los diversos vectores virales utilizados para la obtención de las ¡PS-E1 , para la adición de los otros genes anteriormente mencionados.

Además, como se ha comentado previamente, las células iPS obtenidas en la presente invención no poseen el factor transcripcional c-Myc, descrito en el estado de la técnica como potencialmente oncogénico, lo que hace que las células iPS de la invención sean más seguras que las descritas hasta la fecha. Cabe destacar también, que las células ¡PS obtenidas en la presente invención pueden ser utilizadas en investigación básica y aplicada. En este sentido, en el campo de la investigación básica, pueden ser utilizadas, frente a las células embrionarias y los problemas éticos que las acompañan, para el estudio de genes implicados en desarrollo y envejecimiento, así como para el estudio de las vías de señalización implicadas en dichos procesos celulares y en estudios de diferenciación de las células iPS a diversos linajes celulares. En investigación aplicada, las células iPS de la invención, pueden ser utilizadas en medicina regenerativa, terapia celular y tisular (regeneración de tejidos y de órganos), vehiculización y análisis de nuevos fármacos o cualquier otra sustancia, para el tratamiento de patologías por terapia génica como por ejemplo, cáncer, diabetes, ataxia, etc.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Breve descripción de la invención

La presente invención describe un procedimiento de obtención de células iPS mediante la reprogramación celular de células somáticas con vectores de expresión capaces de expresar la región adenoviral E1 , o un fragmento de la misma o cualquiera de sus variantes. Se puede utilizar la región adenoviral E1 de cualquier adenovirus conocido en el estado de la técnica, siendo preferida la región adenoviral E1 de adenovirus 2, adenovirus 5 o adenovirus 12. Como ejemplo, el N° de acceso a la base de datos GenBank para el locus E1 de adenovirus 5 es X02996.1. A efectos de la presente invención, es preferida la expresión de la región adenoviral E1A (n° acceso NCBI: AP_000197.1) y/o E1 B (n° acceso NCBI: AP_000198.1 y AP_000199.1), y/o cualquiera de sus variantes, siendo más preferida aún la expresión de la región adenoviral E1A (n° acceso NCBI: AP_000197.1). Como se ha mencionado previamente, a las células iPS de la invención se les denominará ¡PS-E1. Otro objeto descrito en la presente invención se refiere a las propias células ¡PS-E1 obtenibles mediante el procedimiento descrito aquí, así como a su uso en el estudio de genes implicados en desarrollo y envejecimiento, en el estudio de las vías de señalización implicadas en dichos procesos celulares, en estudios de diferenciación de las células iPS a diversos linajes celulares; en medicina regenerativa, terapia celular y tisular (regeneración de tejidos y de órganos), vehiculización de fármacos o cualquier otra sustancia, o para el tratamiento de patologías de tipo genético como por ejemplo, cáncer, diabetes, ataxia, etc.

Otro de los objetos descritos en la presente invención hace referencia a cualquier vector de expresión que comprenda al menos una secuencia génica capaz de codificar y expresar para la región adenoviral E1 (N° acceso GenBank: X02996.1), o un fragmento de la misma o cualquiera de sus variantes; específicamente capaz de codificar y expresar para los genes adenovirales E1A (n° acceso NCBI: AP_000197.1) y/o E1 B (n° acceso NCBI: AP_000198.1 y AP_000199.1) y/o cualquiera de sus variantes. En la presente invención se describe también el uso de dichos vectores de expresión para la reprogramación celular de células somáticas y para la obtención de células ¡PS-E1.

Otro de los objetos descritos en la presente invención hace referencia a las composiciones, preferentemente composiciones farmacéuticas que comprenden las células ¡PS-E1 de la invención. Dichas composiciones pueden comprender además, un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Otro de los objetos descritos en la presente invención se refiere al uso de la región E1 de adenovirus (N° acceso GenBank: X02996.1) o un fragmento de la m isma o cualquiera de sus variantes, para la reprogramación celular de células somáticas y para la obtención de células ¡PS-E1. Como se ha mencionado previamente, se puede utilizar la región E1 de cualquier adenovirus conocido en el estado de la técnica, siendo preferida la región E1 de adenovirus 2, adenovirus 5 o adenovirus 12.

Otro de los objetos descritos en la presente invención hace referencia al uso de las células ¡PS-E1 de la invención en la elaboración de un medicamento.

Otro objeto de la presente invención se refiere al uso de las ¡PS-E1 de la invención para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de patologías genéticas, cáncer, diabetes, ataxia, medicina regenerativa y en terapia celular y/o terapia tisular.

Otro objeto descrito en la presente invención se refiere al uso de las células ¡PS-E1 de la invención en el estudio de genes implicados en procesos de desarrollo, envejecimiento y cáncer, vías de señalización celular, diferenciación de las células iPS a diversos linajes celulares, screening de fármacos, vehiculización de sustancias y/o moléculas capaces de ejercer una acción terapéutica y/o preventiva, etc.

Otro de los objetos descritos en la presente invención hace referencia a métodos de tratamiento de patologías genéticas, cáncer, diabetes, ataxia, medicina regenerativa y en enfermedades inmunitarias e inflamatorias, terapia celular y/o tisular, caracterizado por que comprende la administración, a un individuo, de al menos, una dosis efectiva de las células ¡PS-E1 o de la composición de la invención. A efectos de la presente invención, se describen los siguientes términos:

A efectos de la presente invención, el término "región o locus adenoviral E1 o un fragmento de la misma" se refiere a la región E1 de cualquier adenovirus, siendo preferidos los adenovirus 2, 5 y 12, que contiene las secuencias nucleotídicas que codifican y expresan para los genes o proteínas adenovirales E1A y/o E1 B. El n° de acceso donde se puede localizar el genoma completo de adenovirus 5 es AC_000008.1. Dentro del genoma completo de adenovirus 5 se pueden localizar los genes específicos para E1A (n° acceso NCBI: AP_000197.1) y/o E1 B (n° acceso NCBI: AP_000198.1 y AP_000199.1), así como la región completa E1 (N° acceso GenBank: X02996.1). A efectos de la presente invención, dicha región o locus adenoviral E1 también comprende las secuencias génicas que codifican para los variantes de las proteínas E1A y/o E1 B. El término "fragmento" se refiere a una porción de secuencia génica o proteica que codifica para las proteínas presentes en la región E1 , preferentemente para los genes o proteínas E1A y/o E1 B y/o sus variantes.

A efectos de la presente invención, el término "variante/s" se refiere a aquellas secuencias génicas y/o proteicas obtenidas y/o derivadas a partir de un gen o proteína original pre-existente y que presenta al menos una mutación respecto al gen o proteína original, pero conservando su función. A efectos de la presente invención, el término variante se refiere a aquéllas secuencias génicas y/o proteicas que derivan de la secuencia génica o proteica original de los genes adenovirales, E1A y E1 B. Algunas de las variantes d e l a s p r o t e í n a E 1 A y E 1 B s e d e s c r i b e n e n : h ttp : //p u b l i s h . u wo . ca/~ j m y m ry k/ E 1 A/ y en Mymryk JS., Nucleic Acids Research, 1998, Vol. 26, No. 1 , que se incorporan a la presente invención como referencias. Los términos "transfección" o "transfectado/a", "transformación" o "transformado/a" o "transducción" o "transducido/a", según se define en la presente invención se refieren a la introducción de material genético (ácido nucleico) externo en células mediante una de las muchas técnicas posibles conocidas en la técnica. Por ejemplo, el ácido nucleico puede ser i ntroducido en cél ulas de mam ífero mediante técnicas convencionales tales co-precipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, DEAE- dextrano, transfección mediada por lipofectamina, electroporación, microinyección, transducción o transfección viral, etc. Procedimientos adecuados para transformación, transducción y transfección de células pueden encontrarse en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3 ^a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001), así como en cualquier otro libro de texto que incluya técnicas de laboratorio.

El término "plásmido" o "plásmido de expresión", utilizados indistintamente a lo largo del presente documento, se refiere preferentemente a moléculas de material genético, preferentemente ADN extracromosómico que se replican y transcriben independientes del ADN cromosómico. Los plásmidos se utilizan principalmente por su capacidad de reproducirse de manera independiente del ADN cromosomal así como también porque es relativamente fácil manipularlos e insertar nuevas secuencias genéticas. A efectos de la presente invención se pueden utilizar cualquier plásmido conocido en el estado de la técnica, capaz de portar las secuencias génicas que codifican para la región adenoviral E1 o un fragmento de la misma o variantes de las mismas, específicamente las secuencias génicas que codifican y expresan para los genes o proteínas E1A (n° acceso NCBI: AP_000197.1) y/o E1 B (n° acceso NCBI: AP_000198.1 y AP_000199.1) y/o cualquiera de sus variantes. Ejemplos de plásmidos que pueden ser utilizados en la presente invención son: plásmidos comerciales de Addgene, como por ejemplo los plásmidos: plásmido pWZL hygro 12S E1A (Plasmid #18748); plásmido pBabe 12S E1A (Plasmid #18742) y plásmido pLPC 12S E1A (Plasmid #18740). Otros plásmidos que pueden utilizarse en la presente invención se seleccionar de entre: pSKE1AWT; pLPCX-E1a; pSF-Ad5E1 a; entre otros.

El término "vector" o "vector de expresión", utilizados indistintamente a lo largo del presente documento, se refiere a cualquier vehículo que transporta material genético y permite su introducción en una célula diana. A efectos de la presente invención se puede utilizar cualquier vector capaz de codificar y expresar la región E1 o un fragmento de la misma o cualquiera de sus variantes, transformado o portado por un plásmido según se ha definido previamente. Los vectores utilizados en la presente invención son preferentemente, pero sin limitación, adenovirus, lentivirus, retrovirus, adenoasociados, liposomas, nanopartículas, PEI, fosfato cálcico, o cualquier vector conocido en el estado de la técnica y utilizado para el mismo fin. Ejemplos de otros vectores de expresión que pueden ser utilizados en la presente invención son: Ad di 1 18, Ad di 922; Ad 1101 ; Ad 1102; Ad 1 104; Ad 1 107; ONYX-015, Ad wt 300, entre otros. El término "célula troncal", como se usa aquí, se refiere a una célula que tiene la capacidad de auto-renovación. La célula troncal es una célula troncal pluripotente. El término "pluripotentes" tal como se utiliza aquí se refiere a una célula no diferenciada que mantiene la capacidad para permitir su diferenciación en varios tipos celulares diferentes. El término "célula troncal pluripotente inducida (iPS)" se refiere a una célula troncal pluripotente que ha sido reprogramada o artificialmente derivada de una célula somática no pluripotente.

A efectos de la presente invención el término "célula somática" se refiere a aquellas células diferenciadas que conforman el crecimiento de los tejidos y órganos de un ser vivo, procedentes de células troncales originadas durante el desarrollo embrionario y que sufren un proceso de proliferación celular y apoptosis. Las fuentes de células somáticas, en la presente invención pueden ser células diferentes de las células germinales de origen mamífero (por ejemplo, células de seres humanos, ratones, monos, bovinos, cerdos, ratas, perros, etc). Los ejemplos incluyen células epiteliales queratinizantes (por ejemplo, las células epidérmicas queratinizadas) , células epiteliales mucosas (por ejemplo, células epiteliales de la capa superficial de la lengua), células de las glándulas epiteliales exocrinas (por ejemplo, células de la glándula mamaria), células secretoras de hormonas (por ejemplo, células suprarrenal), células para el metabolismo o almacenamiento (por ejemplo, células hepáticas), células epiteliales intímales (por ejemplo, células endoteliales vasculares), células que tienen cilios (por ejemplo, células epiteliales de vías respiratorias), células de secreción de la matriz extracelular (por ejemplo, fibroblastos), células de constricción (por ejemplo, células de músculo liso), células de la sangre y del sistema inmune (por ejemplo, linfocitos T), neuronas del sistema nervioso autónomo (por ejemplo, neuronas colinérgicas) , células sustentaculares de los órganos sensoriales y neuronas periféricas (por ejemplo, las células satélite), células nerviosas y células gliales del sistema nervioso central (por ejemplo, células astroglía), células progenitoras (células progenitoras de tejido) de los mismos y similares. No hay ninguna limitación en el grado de diferenciación celular o la edad del animal del que se obtienen. La elección de mamífero individual como una fuente de células somáticas no está particularmente limitada, sin embargo, cuando las células iPS obtenidas se van a utilizar para la medicina regenerativa en los seres humanos, es particularmente preferible, desde el punto de vista de la prevención del rechazo de injerto, recoger las células somáticas de un paciente u otra persona con el mismo o sustancialmente el mismo tipo de HLA que la del paciente, para así evitar problemas de rechazo inmunológico.

A efectos de la presente invención, el término "reprogramación" o "reprogramación celular", utilizados indistintamente a lo largo de la presente invención, hacen referencia a un proceso capaz de inducir, a una célula somática parcial o totalmente diferenciada, a un estado de pluripotencia similar al estado que presentan las células troncales embrionarias, a través de la introducción de secuencias génicas específicas capaces de inducir dicho estado de pluripotencia. A efectos de la presente invención, dichas secuencias específicas capaces de producir la reprogramación de células somáticas a células con capacidad pluripotente, específicamente a células iPS, son la/s secuencia/s génicas o proteicas que codifican para la región adenoviral E1 , en la que se encuentran las secuencias génicas que codifican para las proteínas E1A y/o E1 B y/o cualquiera de sus variantes.

A efectos de la presente invención, el término "célula/s empaquetadora/s" se refiere a aquéllas células capaces de sintetizar las proteínas virales necesarias para producir y envolver el ADN viral y producir una partícula capaz de infectar las células diana.

A efectos de la presente invención el término "aditivo o vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a sustancias que forman parte de las composiciones farmacéuticas y que no muestran actividad terapéutica, distintos pues de los principios activos, pero que ayudan a éstos a llevar a cabo su función o a ser almacenados y administrados de forma activa, dentro de una formulación farmacéutica. Los aditivos, vehículos o excipientes, deben estar aprobadas por una agencia reguladora del gobierno federal o un gobierno estatal o enumerado en la Farmacopea Estadounidense o la Farmacopea Europea, u otra farmacopea reconocida generalmente para su uso en animales, y más concretamente en humanos. Dichos vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables son conocidos, en general, por los técnicos en la materia. Ejemplos de vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables pueden seleccionarse de entre cualquiera de las siguientes: agentes tamponantes, tensioactívos, codisolventes, conservantes, disgregantes, diluyentes, emulsionantes, nutrientes capaces de mantener el estado de pluripotencia celular, etc. Más ejemplos de vehículos o excipientes farmacéuticos adecuados se describen, por ejemplo, en "Remington's Pharmaceutical Sciences", de E.W. Martin. Puede encontrarse información adicional sobre dichos vehículos en cualquier manual de tecnología farmacéutica (Farmacia Galénica).

A efectos de la presente invención por "cantidad o dosis terapéuticamente efectiva" se entiende aquélla concentración de la composición, principio activo, células, etc, que es suficiente para producir el efecto terapéutico deseado. La cantidad o dosis terapéuticamente efectiva dependerá de muchos factores, incluyendo, por ejemplo, la severidad de la patología, la receptividad del paciente, la edad, peso, sexo, tolerancia, ... del paciente, método de administración de la composición, etc.

El término "células alimentadoras o feeder" utilizado en la presente invención, se refiere a aquellas células que son diferentes de las células de interés de la invención, es decir, son células que se utilizan para ajusfar las condiciones de cultivo de las células de interés, en el caso particular de la presente invención, las células ¡PS-E1 , y desempeñan un papel auxiliar. Las células alimentadoras o feeder en la presente invención se utilizan para apoyar el crecimiento y la auto-replicación de las células ¡PS-E1.

Descripción de las figuras

Figura 1 . Fotografías tomadas con microscopio de fluorescencia de células fibroblásticas murinas (M EF) obtenidas de ratones transgénicos que expresan la proteína fluorescente GFP bajo el control de promotores de los genes Oct3/4 (MEF- Oct3/4-GFP). A) MEF-Oct3/4-GFP wildtype (control) no infectadas por los vectores retrovirales. B) MEF-Oct3/4-GFP infectadas con un retrovirus vacío que no expresa ninguno de los genes Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc o E1A-12S. C) MEF-Oct3/4-GFP infectadas con un vector retroviral transformado con los 4 plásmidos que expresan cada uno de los cuatro factores Oct3/4, Klf4, Sox2 y c-Myc D) MEF-Oct3/4-GFP infectadas con el vector retroviral que expresa la proteína adenoviral E1A-12S. E) MEFs-Oct3/4-GFP infectadas con el vector retroviral que expresa la proteína E1A-12S y el factor de transcripción Klf4. F) MEFs-Oct3/4-GFP infectadas con el vector retroviral que expresa la proteína E1A-12S y el factor de transcripción Oct3/4. G) MEFs-Oct3/4-GFP infectadas con el vector retroviral que expresa la proteína E1A-12S y el factor de transcripción Sox2. H) MEFs-Oct3/4-GFP infectadas con el vector retroviral que expresa la proteína E1A-12S y los factores de transcripción Klf4, Oct3/4 y Sox2.

Figura 2. Fotografía de un gel de nPCR donde se observa la expresión génica de E1A en las células ¡PS-E1 de la invención. En la izquierda de la fotografía se muestra el peso molecular expresado en pares de bases (pb). Figura 3. Ensayo de actividad fosfatasa alcalina. Fotografías de placas de cultivo de MEF-GFP-wt (A), o MEF-GFP infectados con los vectores retrovirales que expresan cuatro factores Oct3/4-Klf4-Sox2-c-Myc (B) o MEF-GFP infectados con los vectores retrovirales que expresan la proteína adenoviral E1A-12S (C); o MEF-GFP infectados con los vectores retrovirales que expresan el factor Oct3/4 y la proteína adenoviral E1A-12S (D).

Figura 4. Formación de cuerpos embrionarios. La figura muestra fotografías de cuerpos embrionarios obtenidos a partir de cultivos de células mESC (A) y células iPS- E1 de la invención (B).

Figura 5. Ensayo de fosfatasa alcalina. La figura muestra fotografías de cuerpos embrionarios obtenidos a partir de cultivos de células mESC (A) y células ¡PS-E1 de la invención (B) que muestran tinción del marcador de proximidad al estadio embrionario, fosfatasa alcalina.

Figura 6. Fotografías de inmunocitoquímicas de células ¡PS-E1 de la invención dónde se muestra la expresión de los marcadores de pluripotencia Nanog (A), Oct3/4 (B), Sox2 (C), Lin28 (D) y SSEA1 (E). Figura 7. Niveles de expresión de los marcadores de pluripotencia Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc analizados mediante RT-PCR en las células ¡PS-E1 obtenidas en la presente invención. Las barras negras representan las mESCs, las barras blancas representan las células que portan los 4 factores de transcripción de Yamanaka (Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc) y las barras cuadriculadas representan las células ¡PS-E1 que expresan el gen adenoviral E1A-12S. En el eje Y se expresa el porcentaje de expresión de cada uno de los genes analizados.

Figura 8. Fotografías de tinciones de hematoxilina-eosina donde se muestra la formación de los teratomas obtenidos a partir de las células ¡PS-E1 de la invención. Las regiones seleccionadas indican aquéllas zonas del teratoma capaces de diferenciarse en células procedentes de las tres capas germinales: ectodermo (rosetas neuronales-neuroepitelio), mesodermo (cartílago) y endodermo (epitelio pseudoestratificado).

Figura 9. Análisis de la proliferación celular in vitro de mESCs, células ¡PS-E1 obtenidas mediante la técnica de Yamanaka (Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc) y las células ¡PS-E1 de la invención que expresan el gen adenoviral E1A-12S. Las barras negras representan las mESC, las barras blancas representan las células que portan los 4 factores de transcripción de Yamanaka (Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc) y las barras cuadriculadas representan las células ¡PS-E1 que expresan el gen adenoviral E1A- 12S. En el eje Y se expresa la densidad celular expresada como el número de células/cm ² y en el eje X se expresa el tiempo. Figura 10. Evaluación de los cambios epigenéticos que presentan las células mESC, mMEFs e ¡PS-E1 , medidos mediante el análisis de la expresión de las histonas H3K27me (barras negras), H3Ac (barras con líneas rectas), H3K4me3 (barras con líneas oblicuas) y utilizándose como control el análisis de la expresión de IgG (barra blanca). En el eje Y se expresa en forma de % la expresión de cada histona en cada uno de los genes indicados en el eje X.

Descripción detallada de la invención

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto medio en la técnica a la que pertenece esta invención. Cualquier método y material similar o equivalente a los aquí descritos también se pueden utilizar en la práctica o ensayo de la presente invención. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes pretenden no excluir otras características técnicas anejas a las esenciales que definen la invención tales como, secuencias, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la propia descripción y en parte del conocimiento general existente en el sector. Por otra parte, el término "comprende" incluye como término más general, el término más específico "consiste".

Un primer objeto de la presente invención se refiere a un procedimiento de producción de células pluripotentes inducidas (iPS) a partir de células somáticas que comprende la introducción, mediante cualquier medio conocido en el estado de la técnica para dicho fin, en células somáticas de al menos un vector de expresión, capaz de expresarse en dichas células, vector que comprende al menos un plásmido que comprende una secuencia capaz de codificar y expresar para la región E1 de adenovirus, o un fragmento de la misma o variantes de la misma.

En una realización preferida, el procedimiento de la invención se caracteriza por que el adenovirus se selecciona de entre cualquiera de los siguientes: adenovirus 2, adenovirus 5, adenovirus 12 o cualquier otro adenovirus. La región E1 de adenovirus 5, por ejemplo, comprende las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas indicadas en la base de datos GenBank con el N° acceso: X02996.1.

En otra realización preferida, el procedimiento de la invención se caracteriza por que la región E1 de adenovirus comprende las secuencias génicas que codifican y expresan los genes adenovirales E1A (n° acceso NCBI: AP_000197.1) y/o E1 B (n° acceso NCBI: AP_000198.1 y AP_000199.1) y/o cualquiera de sus variantes, siendo preferida la secuencia génica que codifica y expresa para el gen adenoviral E1A.

En otra realización preferida, el procedimiento de la invención se caracteriza por que el vector de expresión consiste en un vector viral seleccionado entre: adenovirus, lentivirus, retrovirus y adenoasociados. En otra realización preferida, el procedimiento de la invención se caracteriza por que el vector de expresión consiste en un vector no viral seleccionado entre: liposomas, nanopartículas, PEI (polietilenimina) y/o fosfato cálcico.

En otra realización preferida, el procedimiento de la invención se caracteriza por que l as cél u l as so m áti cas so n p refere ntem e nte cé l u l as d e m am ífe ro y m ás preferentemente células humanas.

En otra realización preferida, el procedimiento de la invención se caracteriza por que además comprende cultivar las células en las que se ha introducido el vector de expresión bajo condiciones que permitan la producción de una población de células pluripotentes inducidas (iPS).

En otra realización preferida, el procedimiento de la invención se caracteriza por que comprende, además, el aislamiento de la población de iPS obtenidas.

Otro objeto descrito en la presente invención se refiere a las células pluripotentes inducidas (iPS), obtenibles mediante el procedimiento descrito anteriormente y que se caracterizan por que codifican y expresan al menos uno de los genes adenovirales codificados por la secuencia génica de la región adenoviral E1 , o un fragmento de la misma, o variantes de la misma.

En una realización preferida, las ¡PS-E1 de la invención se caracterizan por que la región E1 adenoviral, o un fragmento de la misma, o variantes de la misma que codifican y expresan dichas células, es procedente de cualquier adenovirus conocido, siendo preferidas las secuencias génicas de la región E1 de los adenovirus 2, adenovirus 5 y adenovirus 12. Como ejemplo de la presente invención, la región E1 adenoviral es preferentemente la región E1 de adenovirus 5 con N° acceso GenBank: X02996.1. En otra realización preferida, las células ¡PS-E1 de la invención se caracterizan por que las secuencias génica de la región adenoviral E1 , o un fragmento de la misma, o variantes de la misma se seleccionan de entre las secuencias génicas: E1A (n° acceso NCBI: AP_000197.1) y/o E1 B (n° acceso NCBI: AP_000198.1 y AP_000199.1) y/o cualquiera de sus variantes, siendo preferida la secuencia génica E1A. En otra realización preferida, las células ¡PS-E1 de la invención son preferentemente células de mamífero y más preferentemente, células humanas.

Otro de los objetos descritos en la presente invención se refieren a los plásmidos caracterizados por que comprenden la secuencia génica adenoviral E 1 , o un fragmento de la misma, o cualquiera de sus variantes.

En una realización preferida de los plásmidos de la invención la secuencia génica adenoviral E1 , o un fragmento de la misma, o cualquiera de sus variantes son procedentes de cualquier adenovirus conocido en el estado de la técnica, siendo preferidas las secuencias génicas adenovirales de la región E1 procedentes de adenovirus 2, adenovirus 5 o adenovirus 12. Como ejemplo de la presente invención, la región E1 adenoviral es preferentemente la región E1 de adenovirus 5 con N° acceso GenBank: X02996.1.

En otra realización preferida de los plásmidos de la invención, la secuencia génica de la región E1 , o un fragmento de la misma, o cualquiera de sus variantes, codifica y expresa para al menos uno de los genes seleccionados entre: E1A (n° acceso NCBI: AP_000197.1) y/o E1 B (n° acceso NCBI: AP_000198.1 y AP_000199.1) y/o cualquiera de sus variantes.

En otra realización preferida de los plásmidos de la invención, dichos plásmidos comprenden la secuencia génica que codifica y expresa para el gen E1A. Otro objeto de la presente invención se refiere a los vectores de expresión que comprenden al menos un plásmido según se ha definido previamente. Dichos vectores de expresión consisten preferentemente en vectores virales seleccionados de entre: adenovirus, lentivirus, retrovirus y adenoasociados. En otra realización preferida de los vectores de expresión de la invención, éstos consisten en vectores no virales seleccionados de entre: liposomas, nanopartículas, PEI y fosfato cálcico.

Otro objeto descrito en la presente invención hace referencia al uso de la región adenoviral E1 , o un fragmento de la misma, o cualquiera de sus variantes, para la reprogramación celular in vitro de células somáticas. En una realización preferida del uso de la región adenoviral E1 , o un fragmento de la misma, o cualquiera de sus variantes, para la reprogramación celular in vitro de células somáticas, se caracteriza porque dicha región procede de cualquier adenovirus conocido en el estado de la técnica, siendo preferidas las secuencias génicas de la región adenoviral E1 procedentes de adenovirus 2, adenovirus 5 o adenovirus 12. Como ejemplo de la presente invención, la región E1 adenoviral es preferentemente la región E1 de adenovirus 5 con N° acceso GenBank: X02996.1.

En otra realización preferida del uso de la región adenoviral E1 , o un fragmento de la misma, o cualquiera de sus variantes, ésta se caracteriza por que codifica y expresa al menos un gen adenoviral seleccionada entre: E1A (n° acceso NCBI: AP_000197.1) y/o E1 B (n° acceso NCBI: AP_000198.1 y AP_000199.1) y/o cualquiera de sus variantes.

En otra realización preferida, el uso de dicha región adenoviral E1 , o un fragmento de la misma, o cualquiera de sus variantes, se caracteriza por que codifica y expresa el gen adenoviral E1A.

En otra realización preferida el uso de dicha región adenoviral E1 , o un fragmento de la misma, o cualquiera de sus variantes para la reprogramación celular in vitro de células somáticas, se caracteriza por que las células somáticas son células de mamífero, preferentemente células humanas.

Otro objeto descrito en la presente invención hace referencia al uso de la región adenoviral E1 , o un fragmento de la misma, o cualquiera de sus variantes, para la obtención in vitro de células pluripotentes inducidas (iPS).

En una realización preferida del uso de la región adenoviral E1 , o un fragmento de la misma, o cualquiera de sus variantes, para la obtención in vitro de células pluripotentes inducidas (iPS), se caracteriza porque dicha región procede de cualquier adenovirus conocido en el estado de la técnica, siendo preferidas las secuencias génicas de la región adenoviral E1 procedentes de adenovirus 2, adenovirus 5 o adenovirus 12. Como ejemplo de la presente invención, la región E1 adenoviral es preferentemente la región E1 de adenovirus 5 con N° acceso GenBank: X02996.1. En otra realización preferida del uso de la región adenoviral E1 , o un fragmento de la misma, o cualquiera de sus variantes, ésta se caracteriza por que codifica y expresa al menos un gen adenoviral seleccionado entre: E1A (n° acceso NCBI: AP_000197.1) y/o E1 B (n° acceso NCBI: AP_000198.1 y AP_000199.1) y/o cualquiera de sus variantes.

En otra realización preferida, el uso de dicha región adenoviral E1 , o un fragmento de la misma, o cualquiera de sus variantes, se caracteriza por que codifica y expresa el gen adenoviral E1A. En otra realización preferida el uso de dicha región adenoviral E1 , o un fragmento de la misma, o cualquiera de sus variantes para la obtención in vitro de células pluripotentes inducidas (iPS) se caracteriza por que las células somáticas son células de mamífero, preferentemente células humanas. Otro objeto descrito en la presente invención se refiere al uso de los vectores de expresión y de los plásmidos de expresión descritos previamente, para la reprogramación celular in vitro y/o para la obtención in vitro de células ¡PS-E1.

Otro objeto descrito en la presente invención se refiere a una composición que comprenda las ¡PS-E1 de la invención, siendo dicha composición, preferentemente una composición farmacéutica y más preferentemente, una composición farmacéutica que comprenda al menos un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

La composición farmacéutica de la invención, si se desea, puede contener también, cuando sea necesario, aditivos para aumentar, controlar o dirigir de otro modo el efecto terapéutico deseado de las células ¡PS-E1 de la invención, los cuales comprenden dicha composición farmacéutica, y/o sustancias auxiliares o sustancias farmacéuticamente aceptables, tales como agentes tamponantes, tensioactivos, codisolventes, conservantes, nutrientes y/o sustancias capaces de mantener la pluripotencia, etc. También, para estabilizar la suspensión celular, es posible añadir quelantes de metales. La estabilidad de las células ¡PS-E1 en el medio líquido de la composición farmacéutica de la invención puede mejorarse mediante la adición de sustancias adicionales, tales como, por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico, etcétera. Dichas sustancias farmacéuticamente aceptables que pueden usarse en la composición farmacéutica de la invención son conocidas, en general, los técnicos en la materia y se usan normalmente en la elaboración de composiciones celulares. Ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se describen, por ejemplo, en "Remington's Pharmaceutical Sciences", de E.W. Martin. Puede encontrarse información adicional sobre dichos vehículos en cualquier manual de tecnología farmacéutica (Farmacia Galénica).

Otro de los objetos descritos en la presente invención hace referencia al uso de las células ¡PS-E1 de la invención en la elaboración de un medicamento. Otro de los objetos descritos en la presente invención hace referencia a las células ¡PS-E1 de la invención para ser usadas como medicamento.

Otro objeto de la presente invención se refiere al uso de las ¡PS-E1 de la invención para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de patologías inmunológicas, inflamatorias, genéticas , cáncer, diabetes , ataxia, medici na regenerativa y en terapia celular y/o terapia tisular.

Otro objeto descrito en la presente invención hace referencia a las células ¡PS-E1 de la invención para su uso en el tratamiento de patologías inmunológicas, inflamatorias, genéticas, cáncer, diabetes, ataxia, medicina regenerativa y en terapia celular y/o terapia tisular

Otro objeto descrito en la presente invención se refiere al uso de las células ¡PS-E1 de la invención en el estudio de genes implicados en procesos de desarrollo y envejecimiento, vías de señalización celular, diferenciación de las cél ulas i PS a diversos linajes celulares, screening de fármacos, vehiculización de sustancias y/o moléculas capaces de ejercer una acción terapéutica y/o preventiva, etc.

Otro de los objetos descritos en la presente invención hace referencia a métodos de tratamiento de patologías genéticas, cáncer, diabetes, ataxia, medicina regenerativa y en enfermedades inmunitarias e inflamatorias, terapia celular y/o tisular, caracterizado por que comprende la administración, a un individuo, de al menos, una dosis efectiva de las células ¡PS-E1 o de la composición de la invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

Ejemplo 1. Producción de vectores retrovirales

Para la obtención de los vectores de expresión utilizados en la reprogramación celular de células somáticas para la obtención de células ¡PS-E1 , se ha partido de cultivos en placas Petri de 100 mm de diámetro, de células empaquetadoras 293T-Phoenix, a partir de aquí y a lo largo del presente documento se les identificará como células 293T. Las células 293T están transfectadas, de forma estable, con los genes del virus de ratón de la leucemia de Moloney (MLV) gap, pol y env, pero no contienen las secuencias necesarias para la encapsidación de dicho virus. La línea celular 293T utilizada en la presente invención genera partículas virales con envuelta ecotrópica que imposibilita la transducción de células humanas, por lo que sólo serán capaces de infectar células de roedores.

Dichas células empaquetadoras 293T se cultivaron en presencia de medio de cultivo DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Médium, GIBCO-Invitrogen, Grand Island, New York, USA), 10% suero (Fetal Calf Serum), 1 % glutamina y 1 % penicilina- estreptomicina, hasta que estuvieron, aproximadamente, en un 80% de confluencia, porcentaje que maximiza la eficiencia de la futura transfección de dichas células con los plásmidos de interés, que portan cada uno de los factores de transcripción (Oct3/4, Klf4, Sox2 y c-Myc), descritos en el estado de la técnica, que son necesarios para obtener las células iPS, así como el plásmido que porta la secuencia génica adenoviral E1A-12S. En los ejemplos descritos en el presente documento se utilizó, a modo de ejemplo para la obtención de las células ¡PS-E1 , pero sin limitarse, la secuencia génica que codifica para la proteína adenoviral E1A (n° acceso al GenBank: AY368049.1), aunque también puede utilizarse la secuencia génica que codifica para la proteína adenoviral E1 B e incluso las secuencias génicas que codifican para los variantes de cualquiera de las proteínas adenovirales E1A y/o E1 B.

Para cada una de las placas de cultivo con células 293T usadas para la obtención de los vectores de expresión descritos en la presente invención, se preparó 1 mL de medio de cultivo DMEM (GIBCO-Invitrogen, Grand Island, New York, USA) libre de suero al que se le añadió 20 de cada uno de los plásmidos de expresión por separado. Los plásmidos de expresión utilizados han sido obtenidos de la base de datos Addgene (www.addgene.org):

Plásmido 13366: pMXs-Oct3/4

Plásmido 13367: pMXs-Sox2.

Plásmido 13370: pMXs-Klf4.

Plásmido 13375: pMXs-c-Myc. Además de los plásmidos comerciales mencionados previamente, también se utilizó el plásmido pLPC-E1A-12S (Addgene), capaz de expresar el gen E1A de adenovirus 5, específicamente el gen E1A-12S. Por tanto, en la presente invención se han utilizado vectores de expresión, específicamente vectores retrovirales, obtenidos a partir de los plásmidos mencionados previamente, siendo capaces de expresar los factores de transcripción Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc, así como la proteína adenoviral E1A-12S.

Además de los 20 μg de cada uno de los plásmidos de expresión utilizados se añadieron 75μΙ_ de polietilenimina o PEI (1 mg/ml_). Las diferentes mezclas de 1 mL obtenidas con cada uno de los diferentes plásmidos de expresión mencionados previamente, junto con el PEI correspondiente, se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con cada uno de los plásmidos por separado. A continuación, cada una de dichas mezclas, se añadieron gota a gota a las placas Petri de cultivo que contenían las células empaquetadoras 293T. Se obtuvieron todas las combinaciones posibles de células 293T transfectadas con los plásmidos descritos previamente. Es decir, se obtuvieron células 293T transfectadas con los cuatro plásmidos comerciales que portaban los cuatro factores de transcripción por separado, células 293T transfectadas únicamente con el plásmido pLPC-E1A-12S, que expresa únicamente la proteína E1A-12S, o incluso con todas las posibles combinaciones una a una o una a dos o una a tres, del plásmido pLPC-E1A-12S, con el resto de plásmidos que expresan los factores de transcripción Oct3/4, Klf4 y Sox2.

Posteriormente, las células 293T transfectadas con los plásmidos descritos, se mantuvieron en cultivo hasta aproximadamente 48 horas para que la transfección se produjese adecuadamente. Transcurrido dicho tiempo se observó el efecto citopático indicador de que la transfección se ha llevado a cabo adecuadamente. Posteriormente, se procedió a la recogida del sobrenadante de los cultivos, donde se encuentran las partículas virales, para ser filtrado con una membrana de 0'45μηι de poro (Nalgene).

Así, mediante el procedimiento descrito en el presente ejemplo se obtienen vectores retrovirales capaces de expresar las proteínas Oct3/4 o Sox2 o Klf4 o c-Myc o E1A- 12S y/o cualquiera de sus combinaciones, al estar transfectadas con los plásmidos de expresión mencionados previamente.

Ejemplo 2. Generación de células iPS.

Una vez obtenidos los sobrenadantes donde se localizan los distintos vectores retrovirales que portan los genes de los factores de transcripción de Yamanaka o el gen que codifica para la región adenoviral E1A, preferentemente para la proteína E1A- 12S, descritos en la presente invención, se procedió a la reprogramación celular de células somáticas con dichos vectores retrovirales, para comprobar si dichas células somáticas son capaces de transformarse en células iPS al ser infectadas con los vectores retrovirales que expresan únicamente el gen adenoviral E1A-12S y analizando si dichas células ¡PS-E1 obtenidas en la presente invención presentan las características morfológicas y genéticas similares a las que presentan las células iPS conocidas en el estado de la técnica.

Así, para la generación de las células ¡PS-E1 descritas en la presente invención se realizaron diferentes combinaciones empleando distintas líneas celulares somáticas y distintas combinaciones de expresión de factores de transcripción (Klf4, Oct3/4, Sox2 y c-Myc) y la proteína E1 A-12S, reproduciendo la técnica empleada por Yamanaka y sus colaboradores (1).

Las células somáticas utilizadas en la presente invención para la obtención de células ¡PS-E1 son: fibroblastos embrionarios murinos control o wild-type (MEF-wt), fibroblastos embrionarios murinos (MEF) obtenidos de ratones transgénicos que expresan la proteína fluorescente GFP bajo el control de un promotor inducible por el gen Klf4 (MEF-KIÍ4-GFP) y fibroblastos embrionarios murinos (MEF) obtenidos de ratones transgénicos que expresan la proteína fluorescente GFP bajo el control de un promotor inducible por el gen Oct3/4 (MEF-Oct3/4-GFP). Se parte de una siembra de aproximadamente 50,000 células/pocilio en placas Petri de 6 pocilios previamente tratadas con gelatina. La siembra de dichas células se realizó 48 horas antes de la infección con los vectores retrovirales obtenidos y descritos previamente en el Ejemplo 1. Dichas células se cultivaron en medio de cultivo DMEM que contiene un 10% de suero fetal bovino (FBS) inactivado mediante tratamiento con calor y 50 U de penicilina/estreptomicina. Antes de proceder a la infección de los cultivos de las células somáticas mencionadas, se añadió polibreno (concentración final 4mg/ml_) al sobrenadante que contenía los vectores retrovirales, con el fin de incrementar la eficiencia de la infección. Transcurrido dicho tiempo se infectaron los cultivos de las células somáticas con los diferentes vectores retrovirales mencionados previamente, durante un tiempo aproximado de entre 4 a 16 horas. Transcurrido dicho tiempo se les cambió el medio de cultivo por medio de cultivo fresco DMEM. De 48 a 72 horas después de la infección con los vectores retrovirales que expresan los factores de transcripción de Yamanaka (Klf4, Oct3/4, Sox2 y c-Myc) o la proteína adenoviral E1A, dichas células se traspasaron a otras placas de cultivo que contenían una capa de células alimentadoras o feeder, sustituyendo el medio de cultivo utilizado hasta ahora por medio de cultivo específico para ESCs.

El medio de cultivo específico para las ESCs está formado por: GMEM (Gibco- Invitrogen), 10% suero de ternero fetal (FCS), 1 % aminoácidos no esenciales (Gibco- Invitrogen), 1 % piruvato sódico, 1 % glutamina, 0.1 mM (concentración final) β- mercaptoetanol, 1000 U/mL (concentración final) de factor inhibidor de leucemia-LIF (Millipore).

Las células somáticas MEF infectadas con los vectores retrovirales, según se ha descrito previamente, se mantuvieron en cultivo en el medio específico para crecimiento de ESCs durante 15 días, observándose, trascurrido dicho tiempo la aparición de colonias que presentaban una morfología similar a la de las células ESCs. Los clones que expresaban GFP fueron aislados, disgregados y expandidos para su conservación y posterior caracterización. Brevemente, los clones fueron recogidos con una micropipeta de 10μΙ y transferidos a placas de cultivo que contenía 25μΙ de tripsina/EDTA. Los clones se disgregaron con tripsina y se transfirieron a placas de cultivo que contienen en el fondo una capa de gelatina. Para expandir los clones, éstos se disgregaron mediante pipeteo y posteriormente, se lavaron con tampón PBS, se tripsinizaron con 50μΙ de tripsina/EDTA y se traspasaron a nuevas placas de cultivo con medio fresco. Una de las ventajas del uso de células MEF-GFP para la obtención de células ¡PS-E1 , según se describe en la presente invención, es la facilidad que proporcionan dichas células para observar los clones obtenidos después de ser infectadas con los vectores retrovirales, mediante microscopía de fluorescencia, al expresar la proteína fluorescente GFP. Así, se tomaron imágenes de los cultivos de las células MEF-Klf4- GFP y MEF-Oct3/4-GFP infectadas con los vectores retrovirales descritos en la invención, durante los días 14 y 21 tras la infección retroviral, empleando un microscopio invertido de fluorescencia (Olympus IX 81 equipado con una cámara Olympus XC50).

En la Figura 1 se muestran algunos de los clones positivos obtenidos mediante la infección de las células somáticas MEF con los distintos vectores retrovirales que expresan la proteína E1A exclusivamente, o en conjunto con diferentes factores de transcripción, Oct3/4, Klf4, Sox2, juntos o separados. Como se puede observar en el apartado D de la Figura 1 , los clones obtenidos de las células infectadas con los vectores retrovirales que portan el plásmido pLPC-E1A-12S y que expresan únicamente la proteína adenoviral E1A-12S, muestran una enorme similitud morfológica con las ESCs e iPS descritas en el estado de la técnica, al crecer en forma de ovillo y mostrar un característico color verde. Además, la morfología de dichas células (Figura 1 D) es similar a la morfología de las células infectadas con los vectores retrovirales y que expresan los 4 factores de transcripción (Oct3/4, Klf4, Sox2 y c-Myc), hasta ahora implicados en la generación de iPS (Figura 1 C). Por lo tanto, la Figura 1 pone de manifiesto que mediante el procedimiento descrito en la presente invención se pueden generar células iPS, únicamente infectándolas con vectores retrovirales capaces de expresar el gen adenoviral E1A-12S sólo o incl uso en combinación con otros genes ya conocidos en el estado de la técnica y que son capaces de generar dichas células iPS, como es el caso de Oct3/4 (Figura 1 F) o Sox2 (Figura 1 G) o en combinación con varios de dichos genes Klf4, Oct3/4 y Sox2 (Figura 1 H).

Expresión celular del gen E1A

Para evaluar si la expresión génica de E1A permanece activada en las células ¡PS-E1 , pudiendo así interferir en los procesos de diferenciación y embriogénesis, se realizaron estudios de PCR anillada y secuenciación. La detección de la expresión del gen E1A fue analizada en primer lugar por PCR anillada, como otros autores han descrito (10-12), con el objetivo de amplificar adecuadamente la baja expresión del gen adenoviral E1A en células infectadas. En primer lugar, el ADN genómico de células 293T (control positivo para la expresión de E1A) y células ¡PS-E1 se extrajo con el kit de extracción Nucleospin Tissue Extraction Kit (Macherey-Nagel) siguiendo el protocolo de extracción descrito por el fabricante. Las amplificaciones de PCR se llevaron a cabo en un volumen final de 10 μΙ conteniendo tampón de PCR 1X (Bioline), 1 ,5 mM de MgCI2 (Bioline), 0,2 mM de mezcla de deoxinucleosidotrifosfatos (Invitrogen), 0,3 U de BIOTAQ DNA polimerasa (Bioline), 200 nM de cada uno de los cebadores utilizados y que se describen en la Tabla 1 (Sigma; secuencias diseñadas con el Software Oligo 7 (Molecular Biology Insights, Inc) y 100 ng de ADN, en un termociclador 2720 Thermal Cycler (Applied Biosystems) durante 35 ciclos. Tras un paso previo de desnaturalización de 2 minutos a 94°C, cada ciclo consistió en una fase de desnaturalización de 20 segundos a 94°C, una fase de anillamiento de 30 segundos a 61 °C y una fase de extensión o elongación de 30 segundos a 72°C. A continuación, los productos obtenidos de esta PCR primaria se sometieron a una segunda amplificación siguiendo las mismas condiciones que la primaria. Los productos finales de la PCR anillada se visualizaron en un gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio en un transiluminador de ultravioleta G: Box (Syngene) y las imágenes fueron procesadas por el software Gen5 10.9 Data Analysis Software (Biotek). El producto primario de PCR presentaba 383 pares de bases (pb) y el segundo 103 pb. Los productos obtenidos de la PCR primaria fueron secuenciados con el secuenciador 3500xL Genetic Analyzer (Applied Biosystems) y las secuencias se analizaron con el software BioEdit v7.1.3 (Ibis Biosciences), comparándose con la secuencia de GenBank de la región 12S de E1A de adenovirus 5.

La Figura 2 muestra el resultado obtenido de la PCR anillada. Las células ¡PS-E1 descritas en la presente invención mostraron expresión del gen E1A, lo cual fue corroborado por los estudios de secuenciación que mostraron la existencia de una gran homología (>80%) en la secuencia amplificada en la PCR primaria entre las células control (células 293T) y las células ¡PS-E1. Tabla 1. Secuencias de los cebadores utilizados en el análisis de la expresión del gen E1A.

Ejemplo 3. Análisis de la pluripotencialidad de las iPS obtenidas en la invención

Ensayo de actividad de la Fosfatasa Alcalina.

Para poner de manifiesto la pluripotencialidad de las células ¡PS-E1 obtenidas mediante el procedimiento descrito en la presente invención, se ha llevado a cabo un análisis de la expresión de genes implicados en el desarrollo embrionario. Es conocido que la ESCs son un tipo celular proveniente de la masa celular interna (\CM-inner cell mass, en sus siglas en inglés) de embriones y que en dicha masa celular interna se expresan multitud de genes imprescindibles para el futuro desarrollo del embrión, entre estos genes se encuentran, por ejemplo los genes: SSEA-1 , 3 y 4, Oct3/4 y el gen de la fosfatasa alcalina. Cuando las células comienzan a diferenciarse, los niveles de expresión de los genes marcadores de pluripotencia, como por ejemplo, SSEA-1 , 3 y 4 y Oct3/4, disminuyen, sirviendo por tanto las proteínas que codifican dichos genes como marcadores de pluripotencia celular.

En la presente invención se ha llevado a cabo el análisis de la expresión de la proteína fosfatasa alcalina, ya que su expresión se utiliza como marcador o indicador de proximidad al estadio embrionario de las células. Para el ensayo de la fosfatasa alcalina se utiliza como sustrato el naftol-AS-BI-fosfato. El naftol liberado tras la catálisis reacciona con una sal de diazonio (Fast Red Violet LB base). Tras la reacción, los núcleos se contrastan con hematoxilina y las células con actividad fosfatasa alcalina se tiñen de color morado. Como se puede observar en la Figura 3 no se detectó expresión de la enzima fosfatasa alcalina en las células control MEF-wt (Figura 3A) y sí fue detectada en las células infectadas con los vectores retrovirales que portaban cada uno de los cuatro factores Oct3/4, Flk4, Sox2 y c-Myc (Figura 3B) y en las células MEF infectadas con el vector retroviral que expresa la proteína adenoviral E1A-12 (Figura 3C). Estos resultados pone de manifiesto que las células ¡PS-E1 obtenidas en la presente invención presentan una mayor expresión del marcador de proximidad al estadio embrionario, fosfatasa alcalina, que incluso las células iPS del estado de la técnica que expresan los 4 factores de transcripción de Yamanaka.

Formación de cuerpos embrionarios. La formación de los cuerpos embrionarios a partir de las células ESCs murinas y de las células ¡PS-E1 obtenidas mediante el procedimiento descrito en la invención, se indujo mediante la siembra de 50 gotas de cada una de las suspensiones celulares mencionadas previamente (1000 células por gota) en la tapa de una placa de cultivo celular de 100 mm de diámetro, con la posterior adición del tampón PBS. A continuación, se incuba a 37°C en una atmósfera con un 5% de C0 ₂ . Después de 48 h, se recogieron las células con medio condicionado (medio de cultivo estándar de ESC murinas suplementado con MEK 1 μΜ (Merck) e inhibidores de la Θ8Κ3β 3μΜ (Stemgent)) y se transfirieron a una placa de Petri para permitir el crecimiento de los cuerpos embrionarios en suspensión durante 5-7 días a 37°C y 5% de C0 ₂ . Posteriormente, los cuerpos embrionarios se transfirieron a placas de cultivo recubiertas con 0.1 % de gelatina, donde se adhirieron al cabo de aproximadamente 2- 3 días. Los cuerpos embrionarios obtenidos se visualizaron mediante el microscopio de fluorescencia Olympus 1X81 XC50 equipado con cámara Olympus y las imágenes fueron procesadas usando software cell ^A D.

En la Figura 4 se observa que la morfología de los cuerpos embrionarios formados a partir de las células ¡PS-E1 obtenidas en la presente invención (Figura 4B) es similar a la morfología de los cuerpos embrionarios formados a partir de células mESC (Figura 4A). Además, también se analizó la expresión del marcador de proximidad al estadio embrionario, fosfatasa alcalina, en los cuerpos embrionarios obtenidos a partir de las células ¡PS-E1 de la invención. Como se puede observar en la Figura 5B, los cuerpos embrionarios obtenidos a partir de las células ¡PS-E1 de la invención muestran un incremento en la expresión del marcador de proximidad al estadio embrionario, fosfatasa alcalina, respecto a la expresión que muestra dicho marcador en os cuerpos embrionarios obtenidos a partir de células mESC (Figura 5A). Análisis de la expresión de marcadores de pluripotencia mediante inmunocitoquímica.

Otra de las técnicas utilizadas en la presente invención para analizar la expresión de los marcadores de pluripotencia mencionados previamente, ha sido la detección de los mismos en las células iPS de la invención mediante técnicas de inmunocitoquímica. Brevemente, se sembraron 50000 células/pocilio de ¡PS-E1 de la invención y células mESC en placas Petri que presentaban en el fondo del pocilio un cubreobjetos de vidrio recubierto de gelatina. Después de 24 h, en cultivo, las células fueron fijadas con paraformaldehído al 4% durante 20 min a temperatura ambiente y se posteriormente se lavaron tres veces con PBS. En el último lavado, se añadieron 50μΙ de cloruro de amonio 1 M (Panreac) por pocilio con el fin de eliminar los residuos restantes de paraformaldehído. Posteriormente, las células se permeabilizaron con 10ΟμΙ/pocillo de 0,5% PBS/Triton X100 (Biorad) y se incubaron 10 min a temperatura ambiente. A continuación, las células se lavaron y se incubaron en presencia de los anticuerpos primarios utilizados y diluidos en tampón PGBA (0.1 % de gelatina) (Sigma) con un 10%FBS (Gibco), 1 % de suero de albúmina bovino (Sigma) y 0.05% azida sódica (Sigma), en PBS a 4°C durante la noche. La inmunotinción se realizó con el kit Mouse Embrionic Stem Cell Marker Panel Kit (Abcam), que contiene los anticuerpos policlonales de conejo anti-Oct4 (1 :200), anti-Nanog (1 :25), anti-Sox2 (1 :50) y anti-Lin 28 (1 : 1000), y el anticuerpo monoclonal de ratón anti-SSEA1 (1 : 10). A continuación, las células fueron lavadas e incubadas a temperatura ambiente durante 20 min. con el anticuerpo secundario (Alexa488 anti-conejo o anti-ratón (1 :1000; Invitrogen)) que contiene PGBA. Después del lavado, los cubreobjetos se montaron sobre portaobjetos de vidrio en presencia del medio de montaje DAPI-Mowiol. Las imágenes se obtuvieron mediante el microscopio confocal Fluoview FV1000 (Olympus) y se procesaron con el software FV1000 Software y con Adobe Photoshop SC 5.01 (Adobe Systems).

Como se puede observar en la Figura 6, las células ¡PS-E1 obtenidas en la presente invención expresan los marcadores de pluripotencia Nanog (Figura 6A), OCT-4 (Figura 6B), SOX-2 (Figura 6C), así como los marcadores del estado embrionario Lin28 (Figura 6D) y SSEA1 (Figura 6E). Análisis de la expresión de los marcadores de pluripotencia mediante RT-PCR.

Con el objetivo de comprobar, mediante otras metodologías diferentes a las descritas previamente el grado de pluripotencia de las células ¡PS-E1 obtenidas mediante el procedimiento de la presente invención, se llevó a cabo un análisis de la expresión génica mediante RT-PCT cuantitativa, de los marcadores de pluripotencia Oct3/4, Sox2, KLF4 y c-Myc (Figura 7).

En primer lugar se procedió a la extracción del ARN de las células ¡PS-E1 obtenidas en la presente invención mediante el kit comercial NucleoSpin RNA II (Macherey- Nagel) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Posteriormente, se empleó el sistema Superscript first-strand synthesis (Invitrogen) para retrotranscribir 1 μg de ARN, cuantificado previamente usando un Nanodrop (Termo Scientific) y siguiendo el protocolo del fabricante. El análisis de la expresión génica se llevó a cabo mediante una RT-PCR empleando el sistema Opticon (MJ Research, I nc, MA, USA) . Las condiciones empleadas fueron 95°C 15min a 95°C, seguidos de 40 ciclos de elongación: 15s a 94 °C, 30s a 55 °C y 30s a 72°C. Los reactivos empleados fueron: 2 X Quantitect SYBR Green (Qiagen), 20ng ADNc y 100μΜ de los cebadores utilizados en un volumen final de reacción de 25μί. Las muestras se prepararon por triplicado y los datos se normalizaron frente a la expresión del gen H2AZ. Los datos fueron procesados con el software SDS2.2.2 (Life Technologies). Los cebadores empleados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2. Secuencias de los cebadores utilizados para el análisis de la expresión de los marcadores de pluripotencia.

Secuencias de los

Gen

cebadores

H2AZ SEQ ID Nos. 5 y 6

c-Myc SEQ ID Nos. 7 y 8

Klf4 SEQ ID Nos. 9 y 10

Oct4 SEQ ID Nos. 11 y 12

Sox2 SEQ ID Nos. 13 y 14 En la Figura 7 se observa que los porcentajes de expresión de los marcadores de pluripotencia Oct3/4, Sox2 y KLF4, analizados mediante RT-PCR que presentan las células ¡PS-E1 descritas en la presente invención (barras cuadriculadas), son mayores que los que presentan tanto las células troncales embrionarias (ESCs) (barras negras), utilizadas como control, como las células iPS obtenidas mediante los cuatro factores de transcripción descritos por Yamanaka (barras blancas). Por tanto, se concluye que las células ¡PS-E1 obtenidas mediante el procedimiento descrito en la presente invención, muestran altos niveles de expresión génica de los marcadores de pluripotencia. Dichos resultados, junto con los resultados obtenidos previamente en los ejemplos mostraros en la presente invención, ponen de manifiesto que las células de la invención son células iPS.

Ejemplo 4. Evaluación de la capacidad de diferenciación in vivo de las células ¡PS-E1 de la invención.

Todos los procedimientos mostrados en el presente ejemplo se realizaron de acuerdo con la Política Española de Protección Animal RD1201/05.

Para la evaluación de la capacidad de diferenciación in vivo de las células ¡PS-E1 de la invención se procedió a la inducción de teratomas en ratones. Para ello, se utilizaron ratones BALB/c nu/nu (Harían Ibérica) de seis a ocho semanas de edad a los que se les inyectó, vía subcutánea, 2x10 ⁵ células mESC o células iPS de la invención disueltas en 200μΙ de solución Matrigel 1 : 10 en PBS (Basement Membrane Matrix, High Concentration (HC), BD Bioscience, España) (n=8 tumores por grupo). Cuando los tumores alcanzaron un volumen de 100 mm ³ , los tejidos de los teratomas se extrajeron y se fijaron en paraformaldehído al 4% durante la noche para posteriormente incluirlos en parafina.

La diferenciación de dichos tejidos en células de las tres capas germinales se evaluó mediante tinción con hematoxilina y eosina. Las muestras fueron evaluadas en un microscopio Olympus 1X81 XC50 equipado con cámara Olympus y las imágenes fueron procesadas usando software cell ^A D.

En la Figura 8 se puede observar que los teratomas obtenidos son capaces de diferenciarse en células procedentes de las tres capas germinales: ectodermo (rosetas neuronales-neuroepitelio), mesodermo (cartílago) y endodermo (epitelio pseudoestratificado).

Ejemplo 5. Análisis de la proliferación celular in vitro de las ¡PS-E1 de la invención.

Para analizar la proliferación de las células ¡PS-E1 de la invención respecto a las células mESC, se sembraron en los medios de cultivo apropiados 5000 células/pocilio en placas de 96 pocilios que tenían el fondo recubierto con gelatina. La proliferación celular se determinó mediante el ensayo de azul de Alamar (13). La densidad celular se monitorizó a los tiempos de 0, 24, 48, 72 y 120 h después de la siembra.

Brevemente, alícuotas de 10μΙ de solución stock de azul de alamar (Invitrogen) se añadió a cada pocilio que contenía 100 μΙ de medio de cultivo y se incubaron con las células durante 4 horas a 37°C y 5% C0 ₂ . Transcurridos los tiempos de incubación, se procedió a la lectura de la fluorescencia en un lector de placas a 530/590 nm de excitación/emisión (Biotek Synergy HT) y los resultados se muestran mediante el software Gen5 10.9 Data Analysis Software (Biotek). Como se puede observar en la Figura 9 la proliferación de las células ¡PS-E1 de la invención (barras cuadriculadas) es mayor que las células troncales embrionarias (ESCs) utilizadas como control (barras negras) y similar a la mostrada por las células iPS obtenidas mediante los cuatro factores de transcripción descritos por Yamanaka (barras blancas). Por tanto, se concluye que las células ¡PS-E1 obtenidas mediante el procedimiento descrito en la presente invención muestran similares niveles de proliferación in vitro que las células iPS del estado de la técnica. Dichos resultados, junto con los resultados obtenidos previamente en los ejemplos mostraros en la presente invención, ponen de manifiesto que las células de la invención son células iPS.

Ejemplo 6. Evaluación de los cambios epigenéticos en las ¡PS-E1 de la invención.

Para el análisis de los cambios epigenéticos mostrados por las células iPS de la invención, se realizaron, por triplicado, experimentos de inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) utilizando el kit HighCell# ChIP kit (Diagenode, Lieja, Bélgica) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células ¡PS-E1 cultivadas fueron fijadas con formaldehído al 1 % durante 10 min a temperatura ambiente, seguido de un enfriamiento con 125 mM de glicina durante 5 min. A continuación se procedió al lisado de las células en presencia de tampón de lisis e inhibidores del proteasoma. Posteriormente, las células se sonicaron para obtener fragmentos de DNA de aproximadamente 200-600 pb. La inmunoprecipitación se realizó durante una noche en agitación a 4°C con 50 μg de cromatina utilizando 5 μg de anticuerpos H3K27me3, H3K4me3, y H3 acetilados o un anticuerpo IgG no específico de conejo, como un control. Se guardaron y almacenaron 5μg de la solución que contenía la cromatina para su posterior análisis mediante técnicas de PCR. Después de la incubación durante la noche, el complejo formado por el ADN-proteína-anticuerpo se eluyó y las uniones se revirtieron mediante la adición de tampón de elución que contiene proteinasa K seguido por la incubación de las muestras durante 4 horas a 65°C. La extracción del DNA se realizó mediante el método fenol:cloroformo:alcohol isoamílico, se precipitó en etanol y se resuspendió en agua. La cuantificación del DNA precipitado mediante PCR se realizó utilizando el kit de amplificación de PCR en tiempo real SYBR green (Roche) utilizando las secuencias de los cebadores mostrados en la Tabla 3:

Tabla 3. Secuencias de los cebadores utilizados para los experimentos de inmunoprecipitación de cromatina.

Los experimentos de RT-PCR en tiempo real de la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) se utilizaron para analizar comparativamente los niveles de modificación de la expresión de genes específicos activos de histonas (H3K4me3 y H3Kac) y genes específicos represivos de histonas (H3K27me3) mediante los marcadores de pluripotencia Oct4, Sox2 y Nanog en células mESC, MEFs y células ¡PS-E1 de la invención. El gen de la beta-actina se utiliza como control interno de la técnica.

Los niveles de H3K27me3 en las células iPS de la invención y en las ESC fueron bajos, mientras que los niveles de expresión de H3K4me3 y H3Kac fueron muy abundantes en las regiones promotoras de los genes de pluripotencia Oct4, Sox2 y Nanog y en el gen control beta-actina (Figura 10 A y B). Por el contrario, las células MEF, muestran un fuerte enriquecimiento de la histona H3K4me27 en comparación con las modificaciones mostradas para las histonas activas (Figura 10 C). Por lo tanto, los patrones de modificación de histonas detectados por los cuatro genes analizados fueron muy similares en las células ¡PS-12S de la invención y en las células ESC.

Varios estudios basados en análisis de expresión mediante PCR-inmunoprecipitación de los promotores de los genes de pluripotencia Oct4, Nanog y Sox2 en ESC murinas, también detectaron una hiperacetilación e hipermetilación de los dos marcadores de activación H3K9ac y H3K4me3, respectivamente, y una fuerte hipometilación para los dos marcadores represivos H3K9me3 y H3K27me3 marcas (14-17). En la presente invención se muestran evidencias de la existencia de un alto grado de similitud en los perfiles de modificación de histonas entre las células ¡PS-12S de la invención y las células ESC, apoyando su carácter pluripotente.

Además, en la presente invención se muestra que las células ESC e ¡PS-E1 de la invención, muestran un patrón casi idéntico de las modificaciones mostradas en los genes marcadores de pluripotencia Oct4, Sox2 y Nanog. Por lo tanto, las similitudes observadas entre las células ESC e ¡PS-E1 de la invención, a nivel de cromatina, muestran datos adicionales que soportan la pluripotencia de las células ¡PS-E1 de la invención. BIBLIOGRAFIA

L Takahashi, K; Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 2006, 126: 663-676

2. Pereira, D.S., Rosenthal, K.L. and Graham, F.L. Identification of adenovirus E1A regions which affect MHC class I expression and susceptibility to cytotoxic T lymphocytes. Virology. 1995; 211 : 268-277.

3. Frisch, S.M. Antioncogenic effect of adenovirus E1 a in human tumor cells. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 1991 ; 88: 9077-9081.

4. Frisch, S.M; Antioncogencity effect of adenovirus E1a in human tumor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 1991 ; 88: 9077-9081.

5. Satoh, M. et al. Oncolytic virotherapy for prostate cáncer by E1A, E1 B mutant adenovirus. Urology. 2007; 70(6): 1243-8.

6. Xiao, L; et al.. Potent anti-tumor effects of a dual specific oncolytic adenovirus expressing apoptin in vitro and in vivo. Molecular Cáncer. 2010; vol. 9.

7. Liu, C; et al. Evaluation of continuous low dose rate versus acute single high dose rate radiation combined with oncolytic viral therapy for prostate cáncer.

International Journal of Radiataion Biology. 2010; vol. 86(3), p. 220-229.

8. Fang, L; et al. Truncated minimal-E1 a gene with potency to support adenoviral replication mediates antitumor activity by down-regulating Neu expression and preserving Rb function. Chemico-biologial Interactactions. 2009; 181 (1): 1-7.

9. Martín-Duque, P. et al. In vivo radiosensitizing effect of the adenovirus E1A gene in murine and human malignant tumors. International Journal of Oncology. 1999; 15(6): 1 163-1168.

10. Gustafsson, B., Huang, W., Bogdanovic, G., Gauffin, F., Nordgren, A., Talekar, G., Ornelles, D.A., Gooding, L.R. (2007). Adenovirus DNA is detected at increased frequency in Guthrie cards from children who develop acute lymphoblastic leukaemia. Br J Cáncer 97, 992-994.

1 1. Honkaniemi, E. , Talekar, G., Huang, W., Bogdanovic, G. , Forestier, E., von Doblen, U., Engvall, M., Ornelles, D.A., Gooding, L.R., Gustafsson, B. (2010). Adenovirus DNA in Guthrie cards from children who develop acute lymphoblastic leukaemia. Br J Cáncer 102, 796-798. 12. Vasconcelos, G.M., Kang, M., Pombo-de-Oliveira, M.S., Schiffman, J.D., Lorey, F., Buffler, P., Wiemels, J.L. (2008). Adenovirus detection in Guthrie cards from paediatric leukaemia cases and controls. Br J Cáncer 99, 1668-1672.

13. O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. (2000). Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. Eur J Biochem 267, 5421-5426.

14. Hattori N, Nishino K, Ko YG, Hattori N, Ohgane J, Tanaka S, Shiota K. (2004). Epigenetic control of mouse Oct-4 gene expression in embryonic stem cells and trophoblast stem cells. J Biol Chem. Apr 23;279(17): 17063-9.

15. Kimura AP, Liebhaber SA, Cooke NE. Mol Endocrinol. (2004).

Epigenetic modifications at the human growth hormone locus predict distinct roles for histone acetylation and methylation in placental gene activation. Mol Endocrinol. 18(4): 1018-32.

16. Azuara V, Perry P, Sauer S, Spivakov M, J0rgensen HF, John RM, Gouti M , Casanova M , Warnes G, Merkenschlager M , Fisher AG. (2006) .

Chromatin signatures of pluripotent cell lines. Nat Cell Biol. 8(5):532-8.

17. O'Neill LP, VerMilyea MD, Turner BM. (2006). Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations. Nat Genet. 38(7):835-41