Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum), ein gram positives Bodenbakterium mit einem hohen G+C Gehalt (54 mol%), wird für die industrielle Produktion von Aminosäuren, insbesondere zur Produktion von L-Glutamat und L-Lysin eingesetzt. Der Syntheseweg dieser Amino- säuren, der Zentralstoffwechsel, welcher die relevanten Vorstufen bereitstellt sowie der Kohlenstoff-Fluss und der Stickstoff-Fluss dieses Organismus ist intensiv un- tersucht worden [1].

Die Zusammensetzung und ernergetische Effizienz der At- mungskette bei coryneformen Bakterien wurde in den letzten Jahren sowohl genetisch als auch biochemisch intensiv untersucht.

Atmende Organismen können ATP durch oxidative Phospho- rylierung synthetisieren. Dabei werden die bei der Oxi- dation von Substraten enstehenden Reduktionsäquivalente (H oder Elektronen) in die membranständige Atmungskette eingeschleust und die Elektronen letztendlich auf Sau- erstoff oder andere terminale Elektronen-Akzeptoren übertragen. Energieerzeugende und energieverbrauchende Stoffwechselwege sind über ATP und das elektrochemische Protonenpotential bzw. das elektrochemische Natrium- ionen-Potential als universelle zelluläre Energieformen miteinander gekoppelt. Die Synthese von ATP kann entwe- der über Substratstufenphosphorylierung oder durch

Elektronentransportphosphorylierung erfolgen. Der Auf- bau des elektrochemischen Protonenpotentials erfolgt durch die Atmungskette oder die Hydrolyse von ATP durch die membranständige FoFl-ATP-Synthase. Die Komponenten der Atmungskette sind Enzyme, die i. d. R. kovalent oder nicht-kovalent gebundene niedermolekulare Gruppen ent- halten, z. B. Flavine (Flavoproteine), Eisen-Schwefel- Zentren (Eisen-Schwefel-Proteine) und Häm-Gruppen (Cy- tochrome). Ein weiterer essentieller Bestandteil von Atmungsketten sind Chinone, d. h. niedermolekulare, membranständige Elektronen-und Protonenüberträger, wie z. B. Ubichinon und Menachinon.

Die Atmungskette von C. glutamicum weist mehrere De- hydrogenasen auf, die für den Elektronentransfer zum Intermembranpool des Menachinon-9 [2] verantwortlich sind sowie mindestens zwei Wege für die Reoxidation des Menachinons aufweist, wobei ein Weg der Reoxidation mit Hilfe der Cytochrom bd-Oxidase erfolgt und der zweite Weg mit Hilfe des Cytochrom bcl Komplexes und der Cy- tochrom aa3 Oxidase erfolgt. Letztere spielen eine be- deutende Rolle für das Wachstum der Organismen, da Mut- anten mit fehlendem bcl-Komplex oder fehlender Cytoch- rom aa3 Oxidase deutliche Wachstumsdefekte aufweisen [2].

Der Cytochrom bcl Komplex wird durch die Gene qcrCAB kodiert [2, 3]. Dem qcrC Gen vorgeschaltet sind die Gene für die Untereinheit II (ctaC) und III (ctaE) der Cy- tochrom aa3 Oxidase [2,3], wobei der Cytochrom bic., Kom- plex und die Cytochrom aa3 Oxidase, codiert durch ctaC- DE, vermutlich einen Superkomplex bilden [2]. Einzel- heiten betreffend die Atmungskette in C. glutamicum mit den entsprechenden Genen sind auch der WO 02/22799 A2 zu entnehmen.

Das u. a. durch die Reaktionen der Atmungskette gewonne- ne ATP ist der universelle Überträger chemischer Ener- gie zwischen energieerzeugenden und energievebrauchen- den Reaktionen und bedient so heterogene Prozesse wie die Synthese von Bausteinen und Makromolekülen. Ener- gieerzeugende und energieverbrauchende Stoffwechselwege können u. a. über den Energiehaushalt der Zelle bzw. ihren ATP-Gehalt gesteuert werden und damit über die Funktionen der Atmungskette.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zu schaffen, mit dem der Stoffwechsel von Zellen reguliert werden kann.

Den Erfindern ist es in überraschender Weise gelungen, das Gen zu identifizieren, das für eine bisher unbe- kannte vierte Untereinheit der Cytochrom aa3-Oxidase codiert. Es ist weiterhin Aufgabe der Erfindung Mikro- organismen bereit zu stellen, deren Stoffwechsel ge- zielt regulierbar ist.

Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Auf- gabe erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen. Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 7 wird die Aufgabe wei- terhin erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeichnen- den Teil des Anspruchs 7 angegebenen Merkmalen. Die Aufgabe wird ebenso ausgehend vom Oberbegriff des An- spruchs 8 und 9 erfindungsgemäß gelöst mit den im kenn- zeichnenden Teil des Anspruchs 8 und 9 angegebenen Merkmalen.

Durch das Verfahren ist es nunmehr möglich, die Synthe- se von ATP durch Elektronentransportphosphorylierung sowie den Aufbau des elektrochemischen Protonenpotenti- als über die Atmungskette gezielt zu beeinflussen und damit eine Steuerung der Synthese von Stoffwechselpro- dukten zu ermöglichen. So kann beispielsweise die mikrobielle Produktion von Stoffwechselprodukten wie beispielsweise Aminosäuren (L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan, L-Arginin), organischen Säuren (Essigsäure, Citronen- säure, Isocitronensäure, Milchsäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure, Ketoglutarsäure, Brenztraubensäure, Apfel- säure), Vitaminen, Nukleosiden, Nukleotiden und ein- oder mehrwertiger Alkohole durch Einstellung einer ge- eigneten Energieladung positiv beeinflußt werden. Wei- terhin können die erfindungsgemäßen Polynukleotide als Hybridisierungssonden zum Auffinden von RNA, cDNA und DNA sowie zur Isolation von Nukleinsäuren, Polynukleo- tiden oder Genen verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Stoffwechselprodukten, dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt : a) Fermentation der das gewünschte Stoffwechselpro- dukt produzierenden Bakterien, in denen man die für die vierte Untereinheit der Cytochtom aa3 O- xidase codierende Gensequenz ctaF abschwächt oder zusammen mit einem Gen oder mehreren Genen aus der Gruppe ctaC, ctaD, ctaE, qcrA, qcrB, qcrC verstärkt.

b) Anreicherung des gewünschten Stoffwechselpro- dukts im Medium oder in den Zellen der Bakteri- en, und c) Isolieren des entsprechenden Stoffwechselpro- dukts.

Die Bezeichnung"abgeschwächt"beinhaltet die Abschwä- chung der Synthese und der Expression im Vergleich zur natürlichen Synthese bzw. Expression der für die vierte Untereinheit der Cytochtom aa3 Oxidase codierenden Gen- sequenz (ctaF). Der verwendete Begriff"natürlich"soll dabei die Eigenschaften umfassen, die genetisch nicht veränderte Mikroorganismen, d. h. Wildtypstämme aufwei- sen. Weiterhin ist unter der Bezeichnung"abgeschwächt" die vollständige Deletion der für die vierte Unterein- heit der Cytochtom aa3 Oxidase codierenden Gensequenz ctaF zu verstehen.

Durch die"Abschwächung"der ctaF Gensequenz kann keine aktive Cytochrom aa3 Oxidase gebildet werden. Die Reoxidation des Menachinons über den Weg des Cytochrom bc1 Komplexes und die Cytochom aa3 Oxidase ist damit nicht mehr möglich. Die Reoxidation kann nur noch über den Weg der Cytochrom bd-Oxidase erfolgen. Durch diese "Abschwächung"kann die Funktion der Atmungskette ge- zielt gesteuert werden und so auch der davon abhängige Stoffwechsel in gewünschter Weise beeinflußt werden.

Unter dem Begriff"verstärkt"ist im Rahmen der vorlie- genden Erfindung eine Erhöhung der Genexpression eines Gens oder mehrerer Gene aus der Gruppe ctaC, ctaD, ctaE, ctaF, qcrA, qcrB, qrcC gegenüber dem entspre-

chend nicht genetisch veränderten Mikroorganismus zu verstehen. Eine besonders vorteilhafte Ausführung des Verfahrens umfaßt dabei die Verstärkung aller Gene der vorgenannten Gruppe.

Zur Erzielung einer erhöhten Genexpression (Überexpres- sion) kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene er- höht werden. Ferner kann die Promotor-und/oder Regula- tionsregion und/oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, entspre- chend so verändert werden, daß die Expression mit er- höhter Rate erfolgt. In gleicher Weise wirken Expressi- onskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens einge- baut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zu- sätzlich möglich die Expression im Verlaufe der fermen- tativen Herstellung der Stoffwechselprodukte zu stei- gern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der mRNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Weiterhin kann auch die Stabilität der exprimierten Polypeptide selbst erhöht sein oder durch die Verhinderung des Ab- baus des Proteins verstärkt werden. Alternativ kann ferner eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.

Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al. [17], bei Guerrero et al. [18], oder Tsuchiya und Morinaga [19].

Durch die Verstärkung eines Gens oder mehrerer Gene aus der Gruppe ctaC, ctaD, ctaE, ctaF, qcrA, qcrB, qrcC

wird eine positive Beeinflussung der Atmungskette, ins- besondere der durch das ctaF codierten Cytochtom aa3 Oxidase erreicht. Diese wird sowohl in ihrer Stabilität als auch in ihrer Wirkungsweise zusammen mit anderen Komponenten der Atmungskette durch die Ausbildung ihrer vierten Untereinheit beeinflußt. So kommt es, wie wei- ter unten beschrieben, beispielsweise zu deutlichen Wachstumsdefekten, wenn das ctaF Gen deletiert wird.

Durch die"Verstärkung"der Gene aus der oben genannten Gruppe kann gezielt die Reoxidation des Menachinons über den Cytochrom bc1 Komplex und die Cytochrom aa3 Oxidase gefördert werden.

Die erfindungsgemäß hergestellten genetisch veränderten Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinu- ierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Herstellung der Stoffwechselprodukte kultiviert werden.

Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmetho- den ist im Lehrbuch von Chmiel [20] oder im Lehrbuch von Storhas [21] beschrieben.

Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschrei- bungen von Kulturmedien verschiedenener Mikroorganismen sind beispielsweise in [22] enthalten.

Unter"produzierenden Bakterien"sind im Sinne der vor- liegenden Erfindung Corynebacterium glutamicum-Stämme oder homologe Mikroorganismen zu verstehen, die durch klassische und/oder molekulargenetische Methoden derart verändert sind, daß ihr Stoffwechselfluß verstärkt in die Richtung der Biosynthese der gewünschten Stoffwech-

selprodukte läuft. Beispielsweise sind bei diesen Bak- terien ein oder mehrere Gen (e) und/oder die korrespon- dierenden Enzyme, die an entscheidenden und entspre- chend komplex regulierten Schlüsselpositionen des Stoffwechselweges (Flaschenhals) stehen, in ihrer Regu- lation verändert oder sogar dereguliert. Die vorliegen- de Erfindung umfaßt hierbei sämtliche bereits bekannten Produktionsstämme, bevorzugt der Gattung Corynebacteri- um oder homologer Organismen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner die Übertragung eines Gens oder mehrerer Gene aus der Grup- pe ctaC, ctaD, ctaE, ctaF, qcrA, qcrB, qrcC in ein Wirtssystem. Dies schließt auch die Übertragung eines erfindungsgemäßen Genkonstrukts oder Vektors in ein Wirtssystem ein. Diese Übertragung von DNA in eine Wirtszelle erfolgt nach gentechnischen Methoden. Als bevorzugtes Verfahren sei hier die Transformation und besonders bevorzugt die Übertragung von DNA durch Elektroporation genannt.

Als besonders geeignet haben sich homologe Mikroorga- nismen erwiesen. Unter homologen Mikroorganismen sind Organismen zu verstehen, die alle einer verwandten Fa- milie angehören. Erfindungsgemäß sind hierunter Coryne- bacterianeae zu verstehen, in die die aus coryneformen Bakterien isolierten Gensequenzen der oben beschriebe- nen Gruppe eingebracht werden bzw. in denen das ctaF Gen abgeschwächt wird. Stellvertretend für einen geeig- neten homologen Mikroorganismus sei das Bakterium Cory- nebacterium glutamicum und bevorzugt der Stamm ATCC13032 genannt. Als Kulturmedium ist je nach Anfor- derungen ein Komplexmedium wie z. B. LB Medium oder

auch ein Mineralsalzmedium, wie z. B. CGXII-Medium ge- eignet. Nach entsprechender Kultivierung kann die Bak- teriensuspension geerntet und zur weiteren Untersu- chung, beispielsweise zur Transformation oder zur Iso- lierung von Nukleinsäuren nach gängigen Methoden einge- setzt werden. Diese Vorgehensweise kann analog auch auf andere coryneforme Bakterienstämme angewendet werden.

Dabei werden als Wirtssysteme Bakterien der Gattung Co- rynebacterium bevorzugt. Innerhalb der Gattung Coryne- bacterium wird besonders die Art Corynebacterium gluta- micum und innerhalb der Gattung Brevibacterium beson- ders die Art Brevibacterium flavum bevorzugt. Zu den Vertretern dieser Gattungen zählen zum einen Stämme, die in ihren Eigenschaften als Wild Typ charakterisiert sind. Hier sind beispielsweise Corynebacterium glutami- cum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC 14752, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebac- terium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium me- lassecola ATCC 17965, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, zu nennen.

Darüber hinaus schließt die vorliegende Erfindung auch produzierende Bakterienstämme ein, die sich beispiels- weise als Aminosäureproduktionsstämme auszeichnen. Die- se können z. B. ausgehend von Wildtypstämmen durch klassische (chemische oder physikalische) oder gentech- nische Methoden hergestellt werden. Beispiele für er- findungsgemäß geeignete Stämme sind u. a. Corynebacte- rium glutamicum ATCC 21586, Corynebacterium glutamicum KY 10150, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032ApanBC.

Ferner sind erfindungsgemäß auch diejenigen Produkti- onsstämme geeignet, die dem Fachmann allgemein aus mikrobiellen Herstellungsverfahren bekannt sind. Die vorliegende Erfindung wird durch die ausgewählten Bei-

spiele an Mikroorganismen näher charakterisiert, jedoch nicht limitiert.

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Ver- fahren zum Auffinden von RNA, cDNA und DNA, um Nuklein- säuren, beziehungsweise Polynukleotide oder Gene zu isolieren, dadurch gekennzeichnet, daß man die für die vierte Untereinheit der Cytochrom aa3 Oxidase codieren- de Gensequenz ctaF als Hybridisierungssonde einsetzt.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen gene- tisch veränderten Mikroorganismus in dem die für die vierte Untereinheit der Cytochrom aa3 Oxidase (ctaF) codierende Gensequenz abgeschwächt ist.

Ebenso umfaßt die vorliegende Erfindung einen Mikroor- ganismus enthaltend ein Gen oder mehrere Gene aus der Gruppe ctaC, ctaD, ctaE, ctaF, qcrA, qcrB, qrcC in replizierbarer Form, welche im Vergleich zum Wild Typ Mikroorganismus verstärkt sind.

Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprü- chen angegeben.

Die Figuren zeigen modellhaft die, an der Atmungskette beteiligten Komponenten, mit den zugehörigen Genen so- wie experimentelle Ergebnisse der durchgeführten Metho- den mit dem ctaF Gen : Es zeigt : FIG. 1. Darstellung der Genomregion von C. glutamicum mit der Genregion für den bc1 Komplex (qcrABC) und die

Cytochrom aa3 Oxidase (ctaCE) und dem ctaF Gen ohne ctaD. Die DNA Regionen, die in den Stämmen 13032Aqcr und 13032Acta deletiert wurden, sind ebenso einge- zeichnet wie die Fragmente in den Plasmiden pJC1-qcrBst und den entsprechenden Derivaten sowie im Plasmid pBM20-QXA.

FiG. 2 : SDS-Polyacrylamid Gel Analyse des Cytochrom bc1 Komplexes und des Cytochrome aa3 Einzel Komplexes sowie des Superkomplexes aus C. glutamicum, aufgereinigt durch Affinitäts Chromatographie mit StrepTactin Sepha- rose mittels QcrBst (Derivat des Cytochrom b mit C-terminaler Strep-Tag II) oder CtaDst (Derivat der Un- tereinheit I der Cytochrom aa3 Oxidase mit einem C-terminalen Strep-Tag II). Die Proteine wurden denatu- riert, mit Hilfe eines 8-16% Tris-HCl Gradienten-Gels (Biorad) aufgetrennt und mit Coomassie Blau gefärbt.

Spur 1, Cytochrom aa3 Oxidase (7.2 ug Protein) aufge- reinigt aus Stamm SQ-DSt ; Spur 2, Cytochrome bc1-aa3 Su- perkomplex aufgereinigt aus Stamm AC-Dst (4.7 pg) ; Spur 3, Cytochrom bcl-aa3 Superkomplex aufgereinigt aus Stamm AQ-Bst (5. 7 JLg) ; Spur 4, Cytochrome, bc1@ Komplex aufgereinigt aus Stamm AC-Bst (4.3 µg).

FiG. 3 : Absolute Redox-Differenzspektren von reduzier- ten intakten Zellen von C. glutamicum ATCC13032 (Wild Typ), 13032ActaD, und 13032ActaF. Die Zellen wurden vor Aufnahme der Spektren bei Raumtemperatur in 100 mM Tris-HCl Puffer (pH 7.5) resuspendiert, auf eine op- tische Dichte von 200 bei 600 nm eingestellt und durch Zugabe von Dithionit reduziert. Relevante Unterschiede

der einzelnen Cytochrom-Muster sind durch Pfeile mar- kiert. X = Wellenlänge (nm) ; Y = Absorption FIG. 4 : Sequenzvergleich des CtaF Proteins mit unter- schiedlichen Spezies anderer Actinomyceten. Mutmaßliche Transmembran Helices werden durch Linien und Ziffern markiert. Aminosäuren, die in mindestens 5 Sequenzen identisch sind, werden mit schwarzer Schattierung mar- kiert. Konservierte Aminosäure-Austauschbereiche werden grau schattiert dargestellt. Die Bezeichnungen der Bak- terien wurden wie folgt abgekürzt : Cgl, C. glutamicum (NCgl2114) ; Cdi, C. diphtheriae (NC-002935) ; Mtu, Myco- bacterium tuberculosis (Rv2199c) ; Mbo, M. bovis (NC-002945) ; Mle, M. leprae (ML0876) ; Sco, Streptomcy- ces coelicolor (NP626410) ; Tfu, Thermobifida fusca (Tfus_p_278).

Fig. 5 : Sequenzprotokoll SeQ ID No 1 : CtaC Aminosäuresequenz SeQ ID No 2 : ctaC codierende Nukleotidsequenz SeQ ID No 3 : CtaD Aminosäuresequenz SeQ ID No 4 : ctaD codierende Nukleotidsequenz SeQ ID No 5 : CtaE Aminosäuresequenz SeQ ID No 6 : ctaE codierende Nukleotidsequenz SeQ ID No 7 : CtaF Aminosäuresequenz SeQ ID No 8 : ctaF codierende Nukleotidsequenz SeQ ID No 9 : QcrA Aminosäuresequenz SeQ ID No 10 : qcrA codierende Nukleotidsequenz

SeQ ID No 11 : QcrB Aminosäuresequenz SeQ ID No 12 : qcrB codierende Nukleotidsequenz SeQ ID No 13 : QcrC Aminosäuresequenz SeQ ID No 14 : qcrC codierende Nukleotidsequenz SeQ ID No 15 : P20 Aminosäuresequenz SeQ ID No 16 : p20 codierende Nukleotidsequenz SeQ ID No 17 : P24 Aminosäuresequenz SeQ ID No 18 : p24 codierende Nukleotidsequenz SeQ ID No 19 : P29 Aminosäuresequenz SeQ ID No 20 : p29 codierende Nukleotidsequenz Im Folgenden sollen die verwendeten Methoden beschrie- ben werden.

1. Kultivierung der verwendeten Mikroorganismen In Tab. 1 und Tab. 2 sind die verwendeten Organis- menstämme und Plasmide aufgelistet.

Corynebacterium glutamicum wurde bei 30°C entweder in Luria Bertani (LB) Medium (Sambrook et al. 1989) oder in Brain Heart Infusion (BHI) Medium (Difco Laborato- ries, Detroit, USA) mit 2% (w/v) Glucose oder in CGXII Minimal Medium mit 4% Glucose als Kohlenstoff-und Energiequelle (Keilhauer et al. 1993) kultiviert. Falls erforderlich wurde Kanamycin (25 yg/ml) zugegeben.

Escherichia coli (E. coli) wurde bei 37°C in LB Medium

kultiviert. Gegebenenfalls wurde Kanamycin (50 yg/ml) oder Ampicillin (100 yg/ml) zugegeben.

Für die Präparation rekombinanter DNA wurde Enzyme der Firma Roche Diagnistics oder New England Biolabs einge- setzt. Die eingesetzten Oligonukleotide wurde von MWG Biotech (Ebersber) bezogen und sind in Tab. 2 aufge- listet. Klonierungsverfahren wurden nach bekannten Standardverfahren durchgeführt [8].

2. Aufreinigung des Cytochrom bc1 Komplexes Die Aufreinigung des Cytochrom jbcj. Komplexes, ein QcrB Derivat mit C-terminaler Strep Tag II [6] wurde wie folgt durchgeführt : Das gesamte ctaE-qcrCAB Genkluster mit der vermeintlichen Promotorregion wurde mittels PCR (Polymerase Chain Reaction) amplifiziert (Expand High Fidelity PCR System, Roche Diagnostics). Dabei wurde ein reverser Primer mit Codons für StrepTag II (WSHPQFEK) und zwei vorangestellten Alanin Codons ein- gesetzt. Das daraus erhaltene 5,0-kb Fragment wurde in den E. coli-C. glutamicum Shuttle Vektor pJC1 hineinklo- niert, wobei die durch Primer induzierten XbaI und SalI Restriktionsschnittstellen verwendet wurden. Das resul- tierende Plasmid pJC1-qcrBst kodiert für ein QcrB Deri- vat mit zehn zusätzlichen Resten am C-Terminus (berech- netes Molekulargewicht 61,1 kDa). Zur Aufreinigung des Cytochrom aa3 Komplexes wurde in ähnlicher Weise ein CtaD Derivat mit einem C-terminalen StrepTag II herge- stellt mit dem Unterschied, daß nur die monocistroni- schen ctaD Gene mit ihrem nativen Promotor mittels PCR amplifiziert wurden. Das resultiernde 2,0-kb Fragment wurde über die XbaI Schnittstelle in den Vektor pJC1 hineinkloniert, so daß daraus das pJC1-ctaDst Plasmid

resultierte. Das modifizierte CtaD Protein enthielt zehn zusäzliche Reste am C-Terminus (berechnetes Mole- kulargewicht 66,3 kDA). Jedes der beiden Plasmide wurde in C. glutamicum 13032Acta und 13032Aqcr mittels Elektroporation [8] eingebracht.

3. Membran-Isolation 10 g Zellmasse (Feuchtgewicht) wurden in 15 ml 100 mM Tris/HCl, pH 7,5 mit 5 mM MgS04 und 10 mg/1 Lysozyme suspendiert. Nach 45 min Inkubation bei 37°C wurde der Protease Inhibitor Phenylmethansulfonylfluorid (1 mM) zugegeben. Es wurde ein Zellaufschluß durchgeführt, in dem die Suspension 5 mal bei 207 MPa durch eine French- Press (SLM Aminco) geleitet wurde. Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation bei 27000 x g für 20 min entfernt.

Der Überstand (zellfreier Extrakt) wurde für 90 min bei 150000 x g erneut zentifugiert. Der Rückstand mit der Cytoplasmamembran wurde in 10 mM Tris/HCl bei pH 7,5 resuspendiert (60-80 mg Protein/ml) und erneut für 90 min bei 150000 x g zentrifugiert. Die Membransubstanz wurde in einem kleinen Volumen des verwendeten Puffers mit 10% (v/v) Glycerin resuspendiert und bei-20°C ge- lagert.

4. Aufreinigung der Protein Komplexe Die gewaschene Membransubstanz wurde auf eine Protein- konzentration von 5 mg/ml in 100 mM Tris-HCl, enthal- tend 50 yg/ml Eiweiß Avidin (Sigma), eingestellt. Zur Isolation der Membranproteine wurde eine 10% ige (w/v) wässrige Lösung von n-Dodecyl-ß-D-Maltosid (Biomol) zu- gegeben, so daß sich eine Endkonzentration von 2 g Do- decylmaltosid/g Protein einstellte. Nach 45 Minuten

Inkubation auf Eis unter langsamem Rühren wurde die Probe für 20 min bei 180000 x g ultrazentrifugiert. Der Überstand wurde auf eine StrepTactin Sepharose Säule gegeben mit einem Säulenvolumen von 2 ml (IBA, Göttin- gen) und mit 100 mM Tris-HCL Puffer (pH 7,5) und 0,025% (W/v) Dodecylmaltosid equilibriert. Die Säule wurde mit 9 ml eines Puffers aus 100 mM Tris-HCl Puffer (pH 7,5), 100 mM NaCl, 2 mM MgS04 und 0,025% (w/v) Dodecyl- maltosid gewaschen. Spezifisch gebundene Proteine wur- den mit dem selben Puffer und zusätzlich 2,5 mM D-Desthiobiotin (Sigma) und 10% (v/v) Glycerin eluiert.

5. Protein Identifizierung durch Peptid-Massen- Fingerprinting Die durch SDS-PAGE aufgetrennten und mit Coomassie Blue gefärbten Proteine wurden nach bekannter Methode [9] durch Peptid-Massen-Fingerprinting nach Verdau mit Trypsin (Promega) oder mit Cyanogen Bomid [10] identi- fiziert. Peptidmassen Datenbanken wurden eingesetzt, um lokal einen Ausschnitt des 3312 C. glutamicum Poteins zu suchen. Diese Datenbank wurde durch die Degussa AG (Frankfurt) zur Verfügung gestellt.

6. Enzym Untersuchung Die N, N, N', N'-Tetramethyl-p-Phenylendiamin (TMPD) Oxi- dase Aktivität wurde spektrophotometrisch bei 562 nm in Luft gesättigtem 100 mM Tris-HCl Puffer (pH 7,5), der 200 AM TMPD enthielt, bei 25°C gemessen. Für die Be- rechnung der Aktivität wurde ein Extinktions Koeffi- zient von 10,5 mM-lczri 1 eingesetzt [4]. Eine Einheit der Enzymaktivität entspricht der Menge von 1 cymol TMPD welches in einer Minute oxidiert wird.

7. Differenz-Spektroskopie Dithionit-reduzierte minus Ferricyanid-oxidierte Diffe- renzspektren wurden bei Raumtemperatur mit einem Jasco V560 Spektrophotometer, welches mit einem Silicium- Photodioden-Detektor für trübe Proben ausgestattet war, durchgeführt [11]. Dabei wurde eine Küvette mit einem 5 mm breiten Detektionsfenster eingesetzt. Die Proteinkonzentration wurde mit dem Bicinchoninsäure (BCA) Protein-Assay [14] und Rinderserum-Albumin als Standard durchgeführt. Der Häm-Gehalt wurde aus den Differenz Spektren durch folgende Wellenlängepaare und Absorptionskoeffizienten (mM~1cml) bestimmt : Häm a, As 630-600 nm = 11, 6 [12] ; Häm b, AE562-577nm= 22 ; Häm c As 552- 540nm = 19, 1 [13].

Ausführungsbeispiele : a. Isolation des Cytochrom bc1-aa3 Superkomplexes Zur Aufreinigung des bcl Komplexes und der Cytochrom aa3 Oxidase wurden Membranen der komplementierten Stäm- me AQ-Bst und AC-DST isoliert und die nach Solubilisie- rung mit Dodecylmaltosid erhaltenen Proteine der Affi- nitätschromatographie mit StrepTactin Sepharose unter- zogen. Nach dem Waschen wurden die spezifisch gebunde- nen Proteine mit Desthiobiotin eluiert und mittels SDS- Page analysiert. Überraschenderweise wiesen die Prote- inmuster der beiden Stämme AQ-Bst (Fig. 2, Spur 3) und AC-DST (Fig. 2, Spur 2) eine hohe Ähnlichkeit auf mit 8 Proteinbanden und scheinbar identischem Molekularge- wicht. Die in Fig. 2 bis auf das 17-kDA-Protein (P17) dargestellte Identität der Proteine wurde mit Hilfe des Peptid-Mass-Fingerprinting wie oben beschrieben und ei-

ner MALDI (matrix-assisted laser desorption ionizati- on) -TOF (time of flight) Massensprektrometrie nachge- wiesen. Für die Proteinbanden mit einem Molekularge- wicht von 52 kDa bzw. 29 kDa wurde nachgewiesen, daß sie aus jeweils zwei unterschiedlichen Proteinen beste- hen. Insgesamt konnten 10 Proteine nachgewiesen werden.

Neben den bereits bekannten Untereinheiten des bcl Kom- plexes (QcrA, QcrB, QcrC) bzw. der Cytochrom aa3 Oxida- se (CtaC, CtaD, CtaE) wurden 4 weitere Proteine mit einem Molekulargewicht von 29 kDa (P 29), 24 kDa (P24), 20 kDa (P20) und 19 kDa (P19) nachgewiesen. Diese kön- nen jeweils den Proteinen NCgl2611 (Cgl2664), NCgl2177 (Cgl2226), NCgll970 (Cgl2017) und NCgl2114 (Cgl2194) zugeordnet werden. Diese NCgl-Nummern entsprechen der Nomenklatur der öffentlich zugänglichen NCBI (National Center for Biotechnology Information) bzw. die in den Klammern verwendeten Nummern der Nomenklatur der DDBJ (DNA Data Bank of Japan) Datenbanken. Der Fachmann weiß, daß das komplette Genom von C. glutamicum aus allgemein zugänglichen Datenbanken identifizierbar ist (wie z. B. NCBI) und durch Techniken der Genklonierung, z. B. unter Einsatz der Polymerasekettenreaktion (PCR) klonierbar ist. b. Aufreinigung der Cytochrom aa3 Oxidase als Einzel- komplex Um die Cytochrom aa3 Oxidase als Einzelkomplex und nicht als Superkomplex zusammen mit dem bcl Komplex aufzureinigen, wurde das Plasmid pJC1-ctaDst in C. glu- tamicum 13032Aqcr transferiert. Der daraus resultieren- de AQ-Dst-Stamm wies infolge der fehlenden Qcr Gene dieselben Wachstumsdefekte wie der 13032Aqcr Stamm auf

und bildete sowohl Wild-Typ CtaD als auch Strep-Tagged CtaD. Das Eluat der StrepTactin Affinitätschroma- tographie enthielt vier Proteine (Fig. 2, Spur 1), die als CtaD, CtaC, CtaE und P19 identifiziert wurden. Es wurde eine TMPD Oxidaseaktivität der isolierten Cytoch- rom aa3 Oxidase von 0,34 U/mg ermittelt sowie ein Turn- Over Wert von 1,1 TMPD oxidiert/aa3 s-1. In Folge des fehlenden Cytochrom cl wurde eine 10-fach geringere Oxidaseaktivität gegenüber der Aktivität des Superkom- plexes ermittelt. c. Beweis der vierten Untereinheit der Cytochrom aa3 Oxidase Um die Bedeutung der Proteine P29, P24, P20 und P19 für die Atmungskette und die Bildung des bcl-aa3-Superkom- plexes nachzuweisen, wurden die entsprechenden Gene aus dem Chromosom von C. glutamicum deletiert. Die daraus entstandenen Stämme wurden mit AC2611, AC2177, AC1970 und AC2114 bezeichnet. Die ersten drei Stämme wiesen keine deutlichen Unterschiede im Wachstumsverhalten oder in der Bildung des a-, b-, und c-Typ Cytochroms auf. Offenbar sind die Proteine P29, P24, und P20 nicht essentiell für die Bildung und die Aktivität des bol- aa3-Abzweigs der Atmungskette bzw. die Funktion und die Interaktion des kcl-aa3 Superkomplexes.

Im Gegensatz dazu führte die Deletion des Gens NCgl2114, welches für das P19 Protein codiert, zum Phä- notyp des 13032Acta Stammes. So war das Wachstum deut- lich beeinträchtigt, Cytochrom a war nahezu nicht im Spektrum der Dithionit-reduzierten Zellen vorhanden und der Gehalt an Cytochrom war deutlich geringer als im

Wild Typ (Fig. 3). Das P19 Protein ist daher essentiell für die Bildung einer aktiven Cytochrom aa3 Oxidase.

Das Protein P19 wurde nur bei der Aufreinigung des Su- perkomplexes oder der isolierten Cytochrom aa3 Oxidase nachgewiesen, nicht jedoch bei der Aufreinigung des isolierten bcl Komplexes (Fig. 2). Das Protein P19 wird auf Grund der Interaktion mit den Untereinheiten der Cytochtom aa3 Oxidase mit aufgereinigt und kann daher zur bisher noch nicht bekannten vierten Untereinheit der Cytochtom aa3 Oxidase aus C. glutamicum gezählt werden.

Das Protein P19 besteht aus 143 Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von 15,5 kDA. Es weist drei hydrohobe Regionen auf, und zwar im Bereich der Aminosäuren 7-27, 40-60, sowie 97-130, wodurch drei oder vier Trans- membranhelices gebildet werden. Die erste Transmembran- helix dient vermutlich als Teil eines Signalpeptids.

Der in Fig. 4 dargestellte Sequenzvergleich zeigt, daß das für das P19 Protein codierende Gen ctaF mit korres- pondierenden Genen aus der Gruppe der Actinomycetales Homologien aufweist : C. diphtheriae 68% Identität ; My- cobakterien 38-39% Identität ; S. coelicolor 39% Identi- tät und Thermobifida fusca 33% Identität. Bei all die- sen Organismen sind die korrenpondierenden Gene den Genclustern des ctaC oder des ctaD nachgeschaltet. Im Fall von S. coelicolor und T. fusca werden diese kor- renspondierenden Gene zusammen transkribiert. Daraus kann geschlossen werden, daß die mit dem P19 Protein homologen Sequenzen die vierte Untereinheit der Cytoch- rom aa3 Oxidase in Actinomyceten repräsentieren.

Tab. 1 : Verwendete Bakterienstämme und Plasmide Stamm/Plasmid Relevante Charakteristik Quelle ATCC13032 Wild Typ, Biotin-auxotroph 13032Acta In-frame Deletion der ctaD Gene, [2] codierend für Untereinheit I der Cytochrom aa3 Oxidase 13032#qcr Deletion der qcrCAB Gene codierend, [2] für die drei Untereinheiten des bc, Komplexes #C-Dst 13032Acta mit pJC1-ctaDst Diese Arbeit AC-Bst 13032Acta mit pJC1-qcrBst Diese Arbeit AQ-Bst 13032#qcr mit pJC1-qcrBst Diese Arbeit AQ-Dst 13032Aqcr mit pJC1-ctaDst Diese Arbeit AQ-Bst-C67S 13032#qcr mit pJCl-qc. rBst-C67S Diese Arbeit AQ-Bst-C177S 13032#qcr mit pJC1-qcrBst-C177S Diese Arbeit #Cg1970 In-frame Deletion des Gens NCg11941 Diese Arbeit ACg2114=ActaF In-frame Deletion des Gens NCgl2114 Diese Arbeit ACg2177 In-frame Deletion des Gens NCg12145 Diese Arbeit #Cg2611 In-frame Deletion des Gens NCg12574 Diese Arbeit Plasmide pJCl KanR ; E. coli-C. glutamicum Shuttle [16] Vektor pJC1-ctaDst KanR ; Expressions Plasmid für Diese Arbeit Strep-tagged CtaD ; ctaD exprimiert durch eigenen nativen Promotor und 10 zusätzlichen Codons am 3-Ende (AAWSHPQFEK) pJC1-qcrBst KanR ; Expressionsplasmid für Strep-Diese Arbeit Tagged QcrB ; ctaE-qcrCAB exprimiert mit eigenem nativen Promoter ; qcrB mit 10 zusätzlichen Codons am 3@- Ende (AAWSHPQFEK) pBM20-QXA AmpR ; pUC-BM20 Derivativ mit 2.0-kb Diese Arbeit XbaI-ApaI Fragment aus pJCl-qcrBst ; verwendet für Site-directed Muta- genese Tab. 2 : Verwendete Oligonucleotide Primer Sequenz (5'-3') Primer für die Konstruktion von pJC1-ctaDst and pJCl- qcrBst ctaDst-for ACTTCTAGATGACTGAACCTGGCAGCGACC ctaDst-rev TGATCTAGATTACTTCTCGAACTGTGGGTGGGACCAAGCTGCGCG GCTGGAGTCAGATGCAAG qcrBst-for ACTTCTAGATAGGGTTGAGCATTTTGTC qcrBst-rev AGTGTCGACTTACTTCTCGAACTGTGGGTGGGACCAAGCTGCGTT CTTGCCCTCATTCTTGTC Primer für die Konstruktion von Deletionsmutanten ACgl970-1 GACTCTAGAATCTTCGCAGCATCGGTTCC ACg1970-2 CCCATCCACTAAACTTAAACACGTGTGGGAGGAACCAGCCAC ACgl970-3 TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGCTGCGTGCTGCAGATTCTGCG ACgl970-4 GATGTCGACGTTGTTGATGCCCAGGCACTG ACg2114-1 GACTCTAGATAACCCAATTCACGGCAACTC ACg2114-2 CCCATCCACTAAACTTAAACAGTACATGAGTTTTGCTGAAGACTTC ACg2114-3 TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGCTCAACCTTCAGTACGGCGTGC ACg2114-4 GATGTCGACCTTCCGGGAACTTTTCGTA ACg2177-1 GACTCTAGAGGATTCCCGTGCGGCTGGTCT ACg2177-2 CCCATCCACTAAACTTAAACATTTACACCCGAGACTACGTACCA ACg2177-3 TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGCCATTCGGTCCGGGATACCGC ACg2177-4 GATGTCGACGGTTCTAACGATTTTCGCCGTC ACg2611-1 GACTCTAGATAGCCAACGCTTCGCCCAAGTCATG ACg2611-2 CCCATCCACTAAACTTAAACACTTCACGGATTCGTCCTCCATTGG ACg2611-3 TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGGAGGTCGGCGGAGACACTGCAG ACg2611-4 GTCGTCGACAGCTGCGGTGCGCTCAGCG

TAB. 3 : Aufreinigung des Cytochrom bc1-aa3- Superkomplexes aus Membranen von C. glutamicum AQ-Bst und AC-Dst Die Chinol Oxidase Aktivität wurde mittels DMNH2 (2,3- Dimethyl-1, 4-Naphtoquinone in reduzierter Form) als Substrat durch Messung der Sauerstoffaufnahme mittels einer Clark-Sauerstoffelektode bestimmt. Eine Einheit (U) entspricht 1 µmol O2-Aufnahme pro Minute. Die Turn- over Nummer (TN) wurden berechnet als Elektronentrans- fer pro Cytochrom aa3 pro Sekunde. Die in den Klammern angegebenen Werte wurde berechnet als Elektronentrans- fer pro Cytochrom b pro Sekunde. N. d. = nicht bestimmt Aufreinigungsschritt Protein Chinol Oxidase Aktivität mg U U/mg TN (s-l) Aus- beute (%) Membranen aus 44.7 32.3 0.72 n.d. 100 Stamm AQ-Bst Dodecylmaltosid Extrakt 15.3 14.5 0.95 314 45 StrepTactin Sepharose 0.64 1.7 2.70 220 5.4 Eluat Membranen aus 42.3 33. 5 0.79 n. d. 100 Stamm AC-Dst Dodecylmaltosid Extrakt 17.9 15.2 0.85 365 45 StrepTactin Sepharose 0.50 1.5 2.96 93 4.4 Eluat (152)

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