Die rheumatoide Arthritis ist eine entzündliche Systemerkrankung, die überwiegend die Gelenke befällt. Eine ältere Bezeichnung für die rheumatoide Arthritis, die noch häufig benutzt wird, ist chronische Polyarthritis. Über eine Million Menschen leiden in Deutschland an rheumatoider Arthritis. Jährlich erkranken rund weitere 2000 Menschen neu daran.

Die Ursache der rheumatoiden Arthritis ist bis heute noch nicht genau bekannt. Man geht davon aus, dass es sich um eine sogenannte Autoimmunerkrankung handelt, bei der es zu einer Fehlsteuerung des körpereigenen Abwehrsystems (des Immunsystems) kommt und dieses Zellen des eigenen Körpers angreift. Die Ursachen für die anfängliche Fehlsteuerung des Immunsystems sind bis heute unbekannt. Seitens der Wissenschaft wird vermutet, dass mehrere Faktoren bei der Entstehung der Krankheit beteiligt sind. Möglicherweise

spielen Infektionen mit Bakterien oder Viren eine Rolle.

Grundsätzlich ist die Erkrankung bis heute nicht heilbar und begleitet den Patienten sein restliches Leben lang.

Zur Behandlung der rheumatoiden Arthritis kommen derzeit bevorzugt langfristig wirkende Medikamente zum Einsatz. Die verwendeten Wirkstoffe werden aufgrund des langsamen Eintretens ihrer Wirkung mit einem schneller wirkendem Medikament kombiniert. Dabei handelt es sich um sogenannte "cortisonfreie Entzündungshemmer", sogenannte nicht steroidale Antirheumatika, NSAR, beziehungsweise non steroidal antiinflammatory drugs, NSAID, die zu den Aspirin- ähnlichen Medikamenten zählen oder um Cortison.

Zu den NSAR gehören unter anderem die folgenden Wirkstoffe Acetylsalicylsäure, Diclofenac, Indomethacin, Piroxicam, Rofecoxib, Cefecoxib sowie Meloxicam, die unter verschiedenen Handelsnamen vertrieben werden.

NSARs wirken entzündungshemmend und schmerzstillend, weil sie die Bildung der Prostaglandine hemmt oder deren Wirkung beeinflußt. Eine typische Nebenwirkung der NSAR ist, dass sie die Magenschleimhaut angreifen, was zu Magen-und Darmerkrankungen, im schlimmsten Fall zu Magen-und Darmblutungen führen kann.

Ein Einfluss auf diese Prostaglandine wird auch anderen Substanzen zugeschrieben. So werden gemäss der EP 0 506 325 Oligomere oder Polymere von L-Guluronsäure und deren Epimer D-Mannuronsäure beschrieben, um die Produktion von Cytokinen wie Interleukinen IL-1, IL-6 und TNF zu hemmen.

IL-1 ist dafür bekannt, dass es die Produktion von Prostaglandinen hemmt. Die verwendeten Polysaccharide wurden dafür aus der Algen Laminaria digitata (Copolymere"G-blocks" die mehr als 90% L-Guluronsäure enthalten), aus den Zellen von Ascophyllum nodosum Fruchtkörpern (Copolymere"M-blocks" die mehr als 95% D-Mannuronsäure enthalten) bzw. aus Kulturen von Pseudomonas aeruginosa (Polymannuronsäure) isoliert.

Das Block-Copolymer Alginsäure, dass aus wechselnden Anteilen von Mannuronsäure und Guluronsäure besteht, wird schon seit langem aufgrund der gelierenden Eigenschaften in der Lebensmittel-und Pharmaindustrie eingesetzt.

Zur medizinischen Verwendung von Alginaten wird in der WO 01/66119 eine weitere Anwendung zur Behandlung von Schleimhautentzündungen im Magen beschrieben.

Die WO 01/56404 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von niedermolekularen Polymannuronaten aus marinen Algen, das gegen Fettleibigkeit und überhöhten Cholesterinspiegel eingesetzt wird.

Zur Zeit werden viele alginathaltige oder alginatähnliche Produkte hergestellt. Die in diesen Produkten enthaltenen Alginate werden durch Extraktion aus Algen oder Mikroorganismen erhalten und sind in der Regel hochmolekular.

Derartige hochmolekulare Blockpolymere haben eine hohe Viskosität und sind in Wasser schwerlöslich. Dadurch ist die Verwendung dieser hochmolekularen Polymere, z. B. in hohen Konzentrationen in Lebensmitteln, sehr eingeschränkt.

Herkömmliche Verfahren zur Herstellung von Polymannuronat oder Polyguluronat mit einem Molekulargewicht im Bereich von 10-900 kDa beinhalten eine saure/alkalische Hydrolyse [Haug, A., Larsen, B. und Smidsrod, 0. (1966) ; Acta Chem. Scand., 20 (1) : 183-190 and Hirst, E. and Rees, D. A. (1965) ; J. Chem.

Soc. ; 8 : 1493-1499], die Hydrolyse unter Druck und Hitze [Kimura, Y., Watanabe, K. und Okuda, H. (1996) ; J.

Ethnopharmacology ; 54 : 47-54] sowie die Hydrolyse unter Verwendung von Enzymen [Romeo. T. and Preston, J. (1986) ; Biochemistry ; 25 (26) : 8385-8391 und Yonemoto, Y. et al. (1991) Fermen. and Bioengin. ; 72 (3) : 152-157].

Bei dem Verfahren der sauer/alkalischen Hydrolyse kommt es im industriellen Maßstab zur Minderung der Produktqualität sowie zur Korrosion im Reaktor. Ferner werden große Mengen an Neutralisierungsreagenzien eingesetzt, und die Handhabung der eingesetzten starken Säuren ist umständlich.

Die Nachteile bei der Hydrolyse unter Druck und Hitze (100- 200°C) sind die lange Reaktionszeit und die hohen Kosten, da der Prozess bei hohen Temperaturen und Drücken ausgeführt wird. Die enzymatische Hydrolyse ist aufgrund der hohen Kosten und der langen Reaktionszeit für den industriellen Maßstab ungeeignet.

Ein enzymatisches Verfahren zur Herstellung von Polysacchariden durch ein in vitro Verfahren wird in der WO 95/24497 beschrieben. Dieses Verfahren ermöglicht jedoch nur den Zugang zu Polymannuronsäure.

Es besteht daher ein Bedarf an einem verbesserten Verfahren zur Herstellung von niedermolekularen Uronsäuren, das sich

durch einfache Handhabung und verbesserte Verfahrensergebnisse auszeichnet.

Seitens der Erfinder wurde überraschenderweise gefunden, dass Monomere von Polyuronsäuren und deren Derivate auf einfache Weise in einem Verfahren hergestellt werden können, das die folgenden Schritte umfasst : a. Fermentieren eines Polyuronsäure produzierenden Bakterienstammes ; b. Isolieren der Polyuronsäure aus dem Überstand der Fermentationsbrühe ; c. Hydrolysieren der Polyuronsäure von Schritt b. ; d. Isolieren des Uronsäuremonomers aus dem Verfahrens- produkt von Schritt c., wobei die Polyuronsäure aus einem Monomeren oder Derivaten davon aufgebaut ist.

Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es erstmals möglich, pyrogenfreie Monomere der Polyuronsäuren und anderer Polysaccharide oder deren Derivate herzustellen.

Bevorzugt ist als Ausgangsmaterial der Polyuronsäure dabei Polymannuronsäure oder Polyguluronsäure. Das nach dem Verfahren hergestellte Monomer ist dabei bevorzugt D-Mannuronsäure, bzw. L-Guluronsäure oder Derivate davon.

Zur Verbesserung des Verfahrens, insbesondere zur Erhöhung der Ausbeuten und der Verbesserung der Aufarbeitung, kann die Polyuronsäure Schutzgruppen in der 2-und/oder 3-Position des Uronsäuremonomers aufweisen. Mit den Schutzgruppen sind die an der Uronsäure vorhandenen Hydroxylgruppen vor unerwünschten Nebenreaktionen geschützt.

Die Schutzgruppen-R2 und-R3, die gleich oder unterschiedlich voneinander sein können, können für-O-C1-C30- <BR> Alkyl,-0- (C=O)-Cl-C3o-Alkyl,-0- (C=0)-Aryl,,-0- (SO2)-C1-C30- Alkyl,-0- (SO2)-Aryl/N-Acylaminverbindungen/-O- (PO) (OH) w (- O-C1-C3o-Alkyl) 2-w und-0- (PO) (OH) w (-0-Aryl) 2-w stehen, wobei w für 0/1 oder 2 stehen kann und der C1-C3o-Alkylrest geradkettig, cyklisch oder verzweigt sein kann und gegebenenfalls mit einem oder mehreren von Amino, Heteroatomen, bevorzugt Halogen, substituiert sein kann, oder R2 und R3 zusammen genommen einen Ring-O- (CH2) n-O-mit n = 1 bis 4 bilden können. Besonders bevorzugt sind die Schutzgruppen, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus C1-C20-Carboxylat, insbesondere Formiat, Acetat, Pyruvat, Lactat, Acyl-, C1-C20-alpha-Aminocarboxylat, Ci-C2o-N-Acyl- Verbindungen wie N-Formyl-, N-Acetyl-, N-Propionyl-, Sulfonat und Phosphat besteht.

Die Säurefunktion des Uronsäuremonomers im Polymer kann dabei ebenso geschützt sein und in Form eines Ester einer C1 bis C20-Carbonsäure oder Aminosäure, eines Alkali-oder gegebenenfalls substituierten quarternären Ammoniumsalzes, vorliegen.

Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Polyuronsäuren werden bevorzugt aus einer pflanzlichen oder mikrobiellen Quelle gewonnen. Dabei kommen u. a. Alginate und insbesondere Zellüberstände von Bakterienkulturen als Quellen in Betracht. Bevorzugt sind die Polyuronsäure produzierenden Bakterienstämme, deren Epimerase-Gen und bevorzugt auch O- Transacetylase-Gen inaktiv ist oder inaktiviert wurde.

Bevorzugt ist der die Polyuronsäure produzierende Epimerase- negative Pseudomonas-Stamm der Spezies Pseudomonas putida.

Für die Herstellung von deacetylierter Polyuronsäure wird

bevorzugt ein Pseudomonas-Stamm verwendet, der sowohl Epimerase-negativ als auch O-Transacetylase-negativ ist.

Zur Steigerung der Ausbeute kann der Epimerase-negative Pseudomonas-Stamm in einem Fermenter kultiviert werden, und die Fermentationsbrühe einer Behandlung zum Abtrennen der unlöslichen Bestandteile unterzogen werden.

Die Behandlung zum Abtrennen der unlöslichen Bestandteile umfasst dabei Filtrieren, insbesondere eine Ultrafiltration, Zentrifugieren und Kombinationen der vorgenannten Verfahren.

Nach der Abtrennung der unlöslichen Bestandteile wird das Filtrat einer Präzipitationsbehandlung, bevorzugt einer alkoholischen Präzipitationsbehandlung, unterzogen. Hierdurch wird eine nahezu vollständige Fällung der Polyuronsäure erzielt, wobei das Polymer nach dem Ausfällen zur weiteren Behandlung durch Lyophilisieren getrocknet werden kann. Die so gewonnene Polyuronsäure kann erneut gelöst und zur Entfernung von Protein-und Desoxyribonukleinsäure- Verunreinigungen mit unspezifischen Proteasen und Desoxyribonukleasen behandelt werden. Niedermolekulare Verunreinigungen können anschließend durch Dialyse und/oder Ultrafiltration entfernt werden. Zur weiteren Behandlung kann die Polyuronsäure dann durch Lyophilisieren getrocknet werden.

Danach wird die Polyuronsäure unter sauren Bedingungen hydrolysiert, wobei die Hydrolyse bevorzugt bei 100-140°C in einer sauren Lösung, bevorzugt verdünnte HCl, bei einem pH- Wert von 1-5 durchgeführt wird.

Wenn eine Polyuronsäure eingesetzt wird, deren Hydroxylgruppen durch eine der oben genannten Schutzgruppen, beispielsweise Carboxylat-, bevorzugt Acetatgruppen in der 2- und/oder 3-Stellung geschützt wird, können diese Schutzgruppen vor der sauren Hydrolyse des Polymers unter alkalischen Bedingungen, bevorzugt schwach alkalischen Bedingungen im Bereich zwischen bei einem pH-Wert von 9 bis 13, abgespalten werden, und dann kann die erhaltene Lösung gereinigt, beispielsweise dialysiert werden, um die Aufarbeitung und Reinigung des Polymers zu erleichtern.

Alternativ dazu können die Schutzgruppen auch an den Polymeren verbleiben oder modifiziert werden, wenn sich dadurch Eigenschaften, insbesondere verbesserte pharmakologische Eigenschaften, ergeben, die bei der späteren Verwendung der Polymere oder Monomere, insbesondere der pharmazeutischen Verwendung, von Vorteil sein können.

Die Erfindung umfasst daher auch Derivate der Uronsäure- Monomere, dargestellt in Formel (I) unten, die in den Positionen 1 bis 4 sowie an der Säuregruppe (R5) substituiert sein können, und deren Verwendung als pharmazeutisch aktiven Wirkstoff in einem Pharmazeutikum oder in einer kosmetischen Zsammensetzung. Bevorzugt sind dabei die Monomere in der 2- oder 3-Position des Zuckerringes mit Substituenten versehen, wobei Ri bis R4 Hydroxyl und die oben für R2 und R3 angegebenen Bedeutungen haben können und R5 für Hydroxyl, ein -O-Alkalimetall,-0- (quarternäres Ammonium), das auch durch ein oder mehrere C1-C20-Alkyl substituiert sein kann,-O-C1- C20-Alkyl, wobei jeweils der C1-C30-Alkylrest geradkettig, cyklisch oder verzweigt sein kann und mit einem oder mehreren Heteroatomen, bevorzugt Halogen, substituiert sein kann, und -NR6R7, wobei R6 und R7 gleich oder unterschiedlich sein

können und für-C1-C3o-Alkyl,- (C=O)-C1-C3o-Alkyl,- (C=0)-Aryl, stehen, steht, wobei die Verbindung der Formel I mit Rubis R5 in der Bedeutung Hydroxyl ausgeschlossen ist, und deren Verwendung, einschließlich des Uronsäuremonomers, als pharmazeutisch aktivem Wirkstoff in einem Pharmazeutikum oder als Inhaltsstoff in einer kosmetischen Zusammensetzung.

Bevorzugt ist dabei ein Uronsäure-Monomer oder ein pharmakologisch aktives Derivat davon mit der allgemeinen Formel (I) unten, wobei R1 und R4 für Hydroxy stehen und R2 und R3 ausgewählt werden aus der Gruppe, die aus Hydroxy, Ci- C20-Carboxylat, insbesondere Formiat, Acetat, Pyruvat, Lactat, Acyl-, Cl-C2o-alpha-Aminocarboxylat und C1-C2o-N-Acyl- Verbindungen wie N-Formyl-, N-Acetyl-, N-Propionyl-, N- Lactat-, besteht, und R5 für Hydroxyl,-O-Alkalimetall und -0- (quarternäres Ammonium), das auch durch ein oder mehrere Cl-C2o-Alkyl substituiert sein kann, wobei der C1-C30-Alkylrest geradkettig, cyklisch oder verzweigt sein kann und mit einem oder mehreren Heteroatomen, bevorzugt Halogen, substituiert sein kann, steht,, das als pharmazeutisch aktiver Wirkstoff in einem Pharmazeutikum oder in einer kosmetischen Zusammensetzung verwendet werden kann.

Bevorzugt werden R1 bis R4 aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus dem Hydroxy, Carboxylat einer organischen Säure mit bis zu 20, bevorzugt 10 Kohlenstoffatomen, wie Acetat, Butyrat, Pyruvat-, alpha-Aminosäuren, N-Acylverbindungen wie N-Acetylglucosamin. Besonders bevorzugt sind die Uronsäuremonomere nur in der 2 und/oder 3 Position des Zuckerringes substituiert.

(Ia) (Ib) D-Mannuronsäure D-Guluronsäure Bevorzugt ist die Verwendung des Uronsäure-Monomers oder eines Derivates davon, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich ist, als pharmazeutisch aktivem Wirkstoff zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder als Inhaltsstoff in einer kosmetischen Zusammensetzung, wobei das Uronsäure-Monomer bevorzugt Mannuronsäure, Guluronsäure oder ein pharmakologisch aktives Derivat davon ist. Dabei werden insbesondere pharmakologisch aktive Derivate bevorzugt, die durch Derivatisierung der Polymere oder Monomere der Uronsäure hergestellt werden können. Das Modifizieren der Uronsäuremonomere kann dabei durch enzymatische Modifikation oder durch chemische Derivatisierungsmethoden erreicht werden, wie sie in der anorganischen oder organischen Chemie zum Einsatz kommen.

Im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung als pharmazeutisch aktivem Wirkstoff in einer pharmazeutischen Zusammensetzung werden daher auch Derivate der Uronsäuren erfasst, die an der Säuregruppe durch Salzbildung, Ester-, bzw. Amidbildung mit einem C1 bis C20-Alkylalkohol bzw. -Amin, der geradkettig, verzweigt, cyklisch und/oder ungesättigt sein kann, o. ä. in Derivate überführt sind. Auch hierbei ist die Verwendung von

Schutzgruppen für die Hydroxylgruppen wie oben für R1 bis R4 ausgeführt bevorzugt.

In Lösung liegt das Uronsäuremonomer in der Regel in der Pyranose-Form als Halbacetal zwischen den Cl und C5 vor.

Demzufolge ist das Uronsäuremonomer vorzugsweise zumindest in der 2-und/oder 3-Position für die Anbringung einer Schutzgruppe besonders geeignet, wobei durch Wahl der Schutzgruppe das Löslichkeitsverhalten des Uronsäuremonomers beeinflusst werden kann. Für die Übertragung von Schutzgruppen auf das Uronsäuremonomer in den Positionen 2 und/oder 3 eignen sich z. B. die enzymatischen Modifikationen, die durch Transferasen oder Aldolasen katalysiert werden, bevorzugt durch O-Transacetylase (AlgIJF) und Acetyl-CoA.

Sowohl die chemischen Derivatisierungsmethoden als auch die enzymatischen Modifikationen mit Hilfe der genannten Enzyme kann dabei im erfindungsgemäßen Verfahren auch auf der Ebene der Uronsäurepolymere erfolgen.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Lösung des nach der Abspaltung der Schutzgruppen erhaltenen Uronsäurepolymers nach der Dialyse neutralisiert und die Hydrolyse des Polymers unter sauren Bedingungen, bevorzugt schwach sauren Bedingungen im Bereich zwischen bei einem pH-Wert von 1 bis 5, abgespalten und das monomerenreine Uronsäure-Monomer aus der neutralen Lösung isoliert. Unter monomerenrein wird erfindungsgemäß eine Reinheit von mehr als 99%, bevorzugt 100% eines Monomeren verstanden.

Als Alternative zur Herstellung der monomeren Uronsäure und deren Derivaten können auch Polymere eingesetzt werden, die aus unterschiedlichen Monomeren-aufgebaut sind. Allerdings sind dann solche Polymere bevorzugt, die mehr als 50% eines

Monomers enthalten. So können beispielsweise auch verschiedene Alginate verwendet werden, die dann zur Herstellung der Monomere dienen. Beispielweise können Alginate von Braunalgen mit einem Gehalt an Guluronsäure von 50% und mehr eingesetzt werden. Allerdings müssen diese Monomerenmischungen nach der Hydrolyse einem weiteren Reinigungsschritt unterzogen werden, beispielsweise in Form einer Trennung über säulenchromatographische Verfahren unter Verwendung von chiralen Säulenmaterialien.

Seitens der Erfinder wurde festgestellt, dass das so erhaltene Uronsäuremonomer oder ein Derivat davon günstige Eigenschaften bei der Behandlung verschiedener Krankheiten hervorruft, insbesondere bei Entzündungskrankheiten. Seitens der Erfinder wird vermutet, dass der Wirkmechanismus der Uronsäuremonomere und deren Derivate dabei dem anderer Vertreter der NSAR's bzw. NSAID's vergleichbar sein dürfte.

NSAID's hemmen die Enzyme aus der Gruppe der Cyclooxygenasen, von denen bisher die Enzyme COX-1, COX-2, COX-3, PCOX-la und PCOX-lb bekannt sind. Die Cyclooxygenasen katalysieren die Bildung von Prostaglandinen aus Spaltprodukten der Membranphospholipide. Vorteilhaft bei der Behandlung von Patienten, insbesondere denen, die an Entzündungskrankheiten leiden, mit Uronsäuremonomeren und deren Derivaten, ist die Tatsache, dass dabei keine der bei der Behandlung mit NSAR's bekannten Nebenwirkungen auftreten. Dies ist vermutlich auch durch die Struktur der einfach gebauten Uronsäuremonomere zu erklären. Dies ermöglicht sowohl die Langzeitapplikation als auch die Verabreichung in hohen Dosen, was bei den bisherigen kortisonfreien Entzündungshemmern (NSAR) aufgrund der Nebenwirkungen nicht möglich gewesen ist.

Die Erfindung betrifft daher auch die Verwendung von Uronsäure-Monomeren oder eines Derivates davon entsprechend der Formel (I), wobei R1 bis R5 die oben genannten Bedeutungen haben, als Arzneimittel.

Zur Verwendung als Arzneimittel gehört die Verwendung der Uronsäuremonomere, insbesondere D-Mannuronsäure und L- Guluronsäure, Mischungen davon oder deren pharmakologisch aktiven Derivaten als pharmazeutisch wirksame Substanz bei der Behandlung von Störungen des Immunsystems einschließlich der Wirkung als Immunsuppressivum, rheumatischen Erkrankungen, Nierenerkrankungen, Entzündungen des Urogenitalsystems, Multipler Sklerose, Allergien, Alzheimer sowie Herz-und Gefäßerkrankungen.

Die rheumatischen Erkrankungen umfassen insbesondere rheumatische Arthritis, juvenile Arthritis, systemisches und Lupus erythematodes.

Die Nierenerkrankungen umfassen Glomerulonephritis, Glomerulosklerose und Nierenvenenthrombose.

Die Störungen des Immunsystems umfassen Abstoßungsreaktionen bei Transplantationen und Autoimmunerkrankungen.

Die Uronsäuremonomere lassen sich zur Kombinationstherapie mit Substanzen, die hepatotoxische Nebenwirkungen aufweisen, einsetzen.

Die Epimerisierung z. B. von D-Mannuronsäure durch Epimerasen der Leber liefert Glucuronsäure. Die Glycoside der Glucuronsäure, die Glucuronide, können im tierischen Stoffwechsel viele körpereigene (z. B. Steroidhormone und

Bilirubin) sowie körperfremde Stoffe, besonders die phenolisch aufgebauten Verbindungen (z. B. Pharmaka), nach Kopplung an Glucuronsäure (sog. Glucuronidierung bzw. Bildung sog. Glucuronsäure-Konjugate) durch den Harn ausscheiden.

Aufgrund dieser detoxifizierenden Eigenschaften können die Uronsäuremonomere, insbesondere Guluronsäure nach Epimerisierung, auch zur Krebsprävention eingesetzt werden.

Weitere Belege für die präventive Wirkung von NSAID's bei der Krebsprävention sind in letzter Zeit durch intensive Untersuchungen des Wirkmechanismusses dieser Stoffe erbracht worden. Es konnte gezeigt werden (Nature Reviews Cancer 1 ; 2001, P. 11-21), daß die NSAR/s bzw. NSAID's nicht nur die oben beschriebene Gruppe der Cyclooxygenasen hemmen, sondern auch bei der Induktion der Apoptose und damit bei der Krebsprävention eine aktive Rolle spielen. Dies wird durch Applikation von hohen Dosen der NSAID's erreicht, die z. B. die Aktivität der IKB Kinase ß (IKKß) hemmt, welche in den NF-xB Signaltransduktionsweg eingreift. Es sind auch bereits NSAID's bekannt, die den Proliferationsaktivierungsfaktor (PPAR) des Subtyps a und y in den Peroxisomen aktivieren.

Desweiteren können die NSAIDs die Transkriptionsrate des Anti-Apoptose Gens BCL-XL verringern, wodurch sich das Verhältnis von BAX : BCL-XL in der Zelle erhöht.

Die gute Verträglichkeit der Uronsäuremonomere oder der Derivate davon bei höherer Dosierung und Langzeitapplikationen ermöglicht nicht nur den speziellen Einsatz zur Krebsprävention sondern generell auch den präventiven Einsatz der Uronsäuremonomere bei gesunden Individuen, um Erkrankungen vorzubeugen und damit die Lebenserwartung des Individuums zu erhöhen. Diese vorbeugende Applikation ist besonders für die Personengruppen geeignet,

die ein erhöhtes Erkrankungsrisiko aufweisen, sei es durch außergewöhnliche Belastungen des Körpers in der Jugend oder durch eine genetische Veranlagung für bestimmte Krankheiten, wie z. B. Krebs, insbesondere Brustkrebs oder Parkinson.

Seitens der Erfinder wird vermutet, dass die Haupttargets für die Bindung von D-Mannuronsäure der Mannose-Rezeptor (MR) und der Rezeptor Endo180 aus der Mannose-Rezeptorfamilie sind.

Mögliche akzessorische Rezeptoren für dieses Molekül sind vermutlich der Toll-ähnliche Rezeptor 2 (TLR2), der Toll- ähnliche Rezeptor 4 (TLR4), der CDllb/CD18 (Mac-1 oder CR3) und P-Selectin.

Die Mannose-Rezeptorfamilie ist eine Untergruppe der C-Typ Lectin-Superfamilie (W. I. Weis, et al. ; 1998) und umfasst vier Mitglieder : den Mannose-Rezeptor (MR), den M-Typ Phospholipase-A2-Rezeptor (PLA2R), den DEC-205/gp200-MR6 und den Endo180, wobei MR und Endo180 multifunktionale Rezeptoren sind. Bisher ist nur gezeigt worden, dass der MR und Endo180 Monosaccharide binden (L. East und C. M. Isacke ; 2002). Die C- Typ Lectin-Superfamilie ist eine große Gruppe von Transmembranrezeptoren und löslichen Proteinen. Mitglieder aus der Mannose-Rezeptorfamilie sind einzigartig innerhalb dieser Superfamilie, da sie allein multiple C-Typ Lectin- ähnliche Domänen (CTLD s) innerhalb eines einzelnen Polypeptidrückgrates enthalten. Zusätzliche zu den CTLD's sind alle Rezeptoren in dieser Familie durch eine N-terminale Cystein-reiche Domäne, an die sich eine einzelne Fibronectin- Typ II (FNII) Domäne anschließt, charakterisiert. Die Rezeptoren enden alle in kurzen cytoplasmatischen Domänen, die Motive für die Wechselwirkung mit der zellulären Endocytose-Maschinerie enthalten (L. East und C. M. Isacke ; 2002).

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele weiter erläutert.

Beispiel 1 Verfahren zur Herstellung von Mannuronsäure aus gereinigtem bakteriellen Polymannuronat Eine 0, 5% ige Polymannuronat-Lösung wurde hergestellt und auf eine Endkonzentration von 0,1 M NaOH eingestellt. Diese Lösung wurde 3 h bei 20°C gerührt, um die Acetylgruppen zu entfernen. Anschließend wurde ein pH-Wert von 10 mit HC1 eingestellt und eine Dialyse gegen 100-faches Volumen destilliertes Wasser durchgeführt. Das so deacetylierte Polymannuronat wurde nun vollständig hydrolysiert. Hierzu wurde der pH-Wert auf 2,3 mit HCl eingestellt und eine Inkubation von 4 h bei 135°C durchgeführt. Nach der anschließenden Neutralisierung mit Salzsäure wurde die Probe lyophilisiert und der erhaltene Rückstand für weiterführende Experimente zur Verfügung gestellt. Der Rückstand wurde mittels TLC und Anionenaustauscherchromatographie analysiert.

Jüngste Untersuchungen der Erfinder zeigen, dass die Behandlung mit D-Mannuronsäure im Gegensatz zu NSAR kein nephrotisches Syndrom induzierte, was bei der Behandlung mit NSAR oftmals als Nebenwirkung zu beobachten war. Entsprechend ist so die pharmazeutische Wirksamkeit der D-Mannuronsäure erhöht, da die Verabreichung auch in höheren Dosen und über längere Zeiträume erfolgen kann, ohne dass die beschriebenen Nebenwirkungen auftreten. Weitere Untersuchungen der Erfinder werden hierzu durchgeführt.

Im folgenden Anwendungsbeispiel soll die Wirksamkeit von D-Mannuronsäure bei der Behandlung von an Arthritis

erkrankten Ratten verdeutlicht werden. Als Referenzsubstanz wird der Wirkstoff Indomethacin (im folgenden nur als Indomethacin bezeichnet) verwendet, der bereits seid langem als NSAR bekannt und als Amuno"und Indomet-ratiopharm° auf dem Markt erhältlich ist.

Anwendungsbeispiel 1 Arthritis wurde bei Lewis Ratten (125-150 g Körpergewicht) durch eine 0.1 ml intradermale Injektion mit 0.3 mg hitzegetöteten Mycobacterium tuberculosis in Freund s Incomplete Adjuvanz in die rechte Pfote induziert. Nach 14 Tagen wurden die Tiere mit einem Pfotenvolumen, dass mindestens um 0.37 ml größer ist (gemessen mit Hilfe eines Plethysmographen) als ursprünglich, in drei verschiedene Versuchsgruppen aufgeteilt.

Die erste Behandlung der Versuchsgruppen erfolgte 15 Tagen nach der Induktion. Die erste Versuchsgruppe ist nicht behandelt worden. Der zweiten Versuchsgruppe wurden 40 mg/kg D-Mannuronsäure intraperitoneal verabreicht. Der dritten Versuchsgruppe wurde Indomethacin in einer Konzentration von 2 mg/kg in einer Suspension aus 0. 5% Methylcellulose und 0. 025% Tween 80 verabreicht.

Die Behandlung mit D-Mannuronsäure bzw. Indomethacin wurde bis zum 25. Tag als letztem Versuchstag täglich wiederholt.

Während dieser Zeit wurden im zweitägigen Rhythmus Volumenmessungen der Pfoten sowohl der behandelten rechten Pfote als auch der unbehandelten kontralateralen Pfote (negativ Kontrolle) durchgeführt. Zusätzlich wurden einige Tiere für histologische Untersuchungen der kontralateralen Pfote getötet.

Fig. 1 zeigt den Effekt von Indomethacin (Adjuvant + Indo) und D-Mannuronsäure (Adjuvant + M2000) verglichen mit der unbehandelten Kontrolle (Adjuvant). Nach nur 10 Behandlungstagen war das Pfotenvolumen der mit D-Mannuronsäure behandelten Tiere im Verhältnis zu der unbehandelten Pfote um 57% gesunken. Die entzündungshemmende Wirkung der Behandlung mit D-Mannuronsäure ist somit vergleichbar mit der Wirkung bei der Behandlung mit Indomethacin, bei der das Pfotenvolumen (paw oedema) um 60% gesunken war (P < 0.01).

Zusätzlich wurden sowohl die Pfoten von Tieren aus der zweiten und dritten Versuchsgruppe als auch Tiere, bei denen die Arthritis nicht induziert worden war, histologisch untersucht. Dazu wurden die hinteren Extremitäten unter dem Kniegelenk abgetrennt, enthäutet und in 1% Formaldehyd-Lösung fixiert. Die Extremitäten wurden entkalkt, zerschnitten und mit Hematoxylin zur Purpurrot-Färbung des Zellkerns und mit Eosin zur Rosa-Färbung des Collagens und des Cytoskeletts der Zellen angefärbt. Die Gelenkverbindungen der tarsalen und metatarsophalangealen Gelenke wurden mikroskopisch untersucht. In jedem Gelenk wurden das Synovium, der Knorpel und das Weichgewebe auf synoviale Hyperplasie, Entzündungen, Ödeme sowie Knochen-und Knorpelabbau untersucht.

Anhand dieser Untersuchungen sollte der entzündungshemmende Effekt der D-Mannuronsäure histologisch verdeutlicht werden.

Die Ergebnisse sind in den Fig. 2a-2c (im Uhrzeigersinn) dargestellt.

Die unbehandelte Versuchsgruppe 1 (Fig. 2a) zeigt 25 Tage nach der Induktion der Arthritis deutliche morphologische Merkmale einer Arthritis in zahlreichen Gelenken (Fig. 2b).

Eine signifikante zelluläre Infiltration der Gelenke war bereits am 14 Tag, ohne ein Anzeichen von Knochen-oder Knorpelabbau sichtbar (Ergebnisse nicht dargestellt).

Am 25 Versuchstag werden schwere Entzündungen im Hartgewebe des Knochens, dem Gelenk und dem umliegenden Weichgewebe sichtbar. Die Schädigung des Weichgewebes wird durch extensive Infiltration von Neutrophilen und Macrophagen sowie Knorpel-und Muskelabbau deutlich. Der unter dem Knorpel liegende Knochen ist in den meisten Gelenken durch eine Vielzahl von Osteoclasten stark abgebaut worden.

Die Pfoten von Lewis-Ratten aus der 2. Versuchsgruppe (Behandlung mit D-Mannuronsäure Fig. 2c) zeigten sowohl eine verringerte entzündliche Zellinfiltration als auch eine verringerte Anzahl von Osteoclasten im unter dem Knorpel liegenden Knochen. Auch die Schädigung durch das Ödem und der Knochenabbau in den Pfoten sind weitestgehend reduziert.

Diese Ergebnisse galten auch für die 3. Versuchsgruppe, die mit Indomethacin behandelt worden war. Die Behandlung mit D-Mannuronsäure als auch Indomethacin erhält das Hyalin im Gelenksknorpel, und es ist eine saubere Trennlinie zwischen Gelenkknorpel und verkalktem Knorpel zu erkennen.

Durch Mittelung der Ergebnisse der histologischen Untersuchungen aller Versuchstiere in den einzelnen Gruppen konnte ein Durchschnittswert für den histologischen Schaden (Histological damage score) ermittelt werden, der es erlaubt, die Ergebnisse der Gruppen darzustellen (Fig. 3) Der Vergleich der Versuchsgruppen 2. (behandelt mit D-Guluronsäure) und 3. (behandelt mit Indomethacin) mit der

Versuchsgruppe 1. (unbehandelt) zeigte deutlich geringere histologisch detektierbare Gewebsschädigungen in den Versuchsgruppen 2. und 3.

Ein weiteres Ergebnis der Versuche spiegelt sich in den Gewichtsveränderungen der Versuchstiere wieder. Diese Gewichtsmessungen sind vom 15. bis zum 25. Versuchstag durchgeführt worden. Die Versuchsgruppe 1. (unbehandelt) wies einen deutlichen Gewichtsverlust gegenüber Lewis-Ratten auf, bei denen keine Arthritis induziert worden ist.

Dagegen ist der Gewichtsverlust bei den Tieren aus den Versuchsgruppen 2. (behandelt mit D-Guluronsäure) und 3.

(behandelt mit Indomethacin) deutlich geringer (Ergebnisse nicht dargestellt).

Anwendungsbeispiel 2 Anhand des folgenden Beispiels wird demonstriert, dass die entzündungshemmende Wirkung von D-Mannuronsäure bei langfristiger Verabreichung keine der bekannten Nebenwirkungen von NSAIDs aufweist.

Dazu werden die Biokompatibilität, die pharmakologisch toxikologischen sowie die inhibitorischen Eigenschaften von D-Mannuronsäure im Vergleich zu den NSAIDs Dexamethason, Piroxicam und Diclofenac auf die Aktivität der Matrix Metalloproteinase Typ 2 (MMP-2) untersucht.

Um die Verträglichkeit und die MMP-2 Aktivität einschätzen zu können, wird zunächst eine Fibrosarcoma Zellinie (WEHI 164) mit einer Anfangsdichte von 2*104 Zellen/Kammer in RPMI-1640 Basismedium (5% CO2, 37°C, Feuchtigkeits-gesättigte Atmosphäre) herangezogen. Dem Basismedium werden unter

anderem 5% Fetales-Kälber Serum, 100 U/ml Penicillin und 100 ug/ml Streptomycin zugesetzt.

Für die Dosis-Wirkungsanalyse werden D-Mannuronsäure sowie die Arzneimittel Dexamethason, Piroxicam und Diclofenac in unterschiedlichen Dosierungen (10 bis 200 ug/ml) zu Übernachtkulturen der zuvor beschriebenen Zellinie gegeben.

Für die Kontrollansätze werden unbehandelte Zellkulturen verwendet (alle Versuchsansätze dreifach). Die behandelten (Versuchsgruppe) und unbehandelten (Kontrollgruppe) Zellen werden über Nacht unter den oben beschriebenen Bedingungen kultiviert. Danach werden mit den Gruppen kolorimetrische Untersuchungen und eine Zymoanalyse durchgeführt.

Für die kolorimetrischen Untersuchungen werden die Zellen aus den oben beschriebenen Übernachtkulturen drei mal mit eiskalter Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und anschließend in 5% Formaldehyd-Lösung fixiert. Die fixierten Zellen werden drei mal mit eiskalter Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und danach mit 1% Kristallviolett- Lösung gefärbt. Die gefärbten Zellen werden wiederum gewaschen, dann lysiert und in 33% Essigsäurelösung solubilisiert. Die Färbeintensität wird anschließend bei 580 nm ausgelesen.

Zur Detektion von Gelatinase (Collagenase Typ IV oder MMP-2) und MMP-9 wird nach einer modifizierten Methode von Heussen und Dowdle gearbeitet (gelatin zymography). Die Proben aus den einzelnen Versuchsansätzen werden in einer Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel Elektrophorese (SDS- Page) unter nicht reduzierenden Bedingungen für 3 Stunden bei konstant 80 Volt analysiert, wobei das Gel 2 mg/ml Gelantine enthält. Um das SDS aus dem Gel zu entfernen wird das Gel

nach der Elektrophorese dreimal in 2, 5% TritonX100-Lösung gewaschen. Danach wird das Elektrophoresegel bei 37°C Übernacht im 0,1 M Tris-HCl Gelatinase-Aktivierungspuffer (pH 7,4) der 10 mM CaCl2 enthält, inkubiert und danach mit 0,5% Coomassie-Blau Lösung gefärbt. Nach intensivem Entfärben erscheinen die proteolysierten Bereiche im Gel als klare Banden gegenüber einem blauen Hintergrund.

Für die quantitative Auswertung sowohl der Oberfläche als auch der Intensität der lysierten Bereiche als Maßstab für die Enzymaktivität wird ein UVI Pro-Gel-Dokumentationssystem auf der Basis von Graustufenvergleichen verwendet. Die sich daraus ergebenden Werte für die Graustufen von behandelten Zellkulturen werden mit denen von unbehandelten Zellkulturen verglichen und als"relative Expression"der gelatinolytischen Aktivität ausgedrückt.

Für die pharmazeutisch-toxikologischen Untersuchungen werden 28 weibliche Sprague-Dawley Ratten mit einem Gewicht von 160- 200 g eingesetzt. Sie werden vor den Experimenten für 1 Woche bei 202°C, einer Feuchtigkeit von-55%, einem 12 stündigen Hell-Dunkel-Zyklus und unbegrenzter Wasser und Futterversorgung gehalten.

Eine Bestimmung der Serum-und Urin-Determinanten dient der Untersuchung der Nebenwirkungen von D-Mannuronsäure auf die Nierenfunktion, wie sie bei NSAIDs häufig auftreten. Dafür werden die Nierenfunktionen der Versuchstiere nach 12 Injektionen von D-Mannuronsäure (30mg/kg/48h) in die Bauchhöhle anhand von Messungen des Serum-Kreatinin- (S.

Creat) -Gehaltes, des Harnstoffstickstoffes (BUN), der Proteinsekretion durch den Harn (U. Pro), des Harnstoffgehaltes (U. Urea) als auch der Plasmakonzentration

von Triglyceriden (S. Trig) und Cholesterol (S. Chol), bestimmt.

Für die histologischen Untersuchungen werden die gefärbten Gewebsschnitte vom Nierengewebe mit einem Lichtmikroskop untersucht. Das Nierengewebe wird dazu zuvor in 10% Formalin- Lösung fixiert und anschließend in Paraffin eingebettet. Mit einem Ultramikrotom werden Schnitte des Gewebes hergestellt, die mit Hämatoxilin-Eosin und Schiff-Reagens gefärbt werden.

Glomeruläre Läsionen werden dann auf einer Skala von 0-3 (0, negative ; 1, leicht ; 2, mittel ; 3, stark) anhand folgender Parameter eingeordnet : Hyperzellularität, glomeruläre Infiltration durch polymorphkernige neutrophile Granulozyten (PMN), hydropische Veränderungen des kapillaren Netzwerkes innerhalb des Nierenkortexes und die Bildung von tubulären Zylindern.

Für die Untersuchungen auf ulzerogene Effekte im Magen von Ratten werden ihnen 14 intraperitoneal Injektionen von D-Mannuronsäure-Lösung in einer Konzentration von 30 mg/kg/48h verabreicht. Nach Beendigung des Versuches werden die Tiere getötet und der Magen sowie der Zwölffingerdarm herausseziert. Die Bewertung der Ergebnisse erfolgte auf Basis von wenigstens einem gastrischem Ulkus oder einer hämorrhagischen Erosion.

Die Veränderungen der Körpertemperatur wird während zwölfmaliger Injektion von D-Mannuronsäure-Lösung in einer Konzentration von 30 mg/kg/48h kontinuierlich mit Hilfe von Thermoelementen verfolgt. Die Ergebnisse der Temperatur- messungen werden mit denen von unbehandelten Tieren verglichen.

Für die statistischen Analysen der einzelnen Versuchsergebnisse wird der Student's T-test verwendet (P<0, 05).

Die Ergebnisse der Proliferationsversuche mit einer Fibrosarcoma Zellinie (WEHI 164) sind in Fig. 4 dargestellt.

Der Vergleich der Zellzahl bei den Zellkulturen, die mit D-Mannuronsäure behandelt worden sind mit denen, die mit steroidalen und nichtsteroidalen Medikamenten (Dexamethason, Piroxicam und Diclofenac) behandelt worden sind, zeigt die gute Verträglichkeit von D-Mannuronsäure bei hohen Dosierungen und eignet sich daher im Vergleich zu anderen entzündungshemmenden Medikamenten auch für langfristige Applikationen. Die Ergebnisse der Dosis-Wirkungsanalyse Fig.

5 zeigen den Effekt von D-Mannuronsäure, Dexamethason, Piroxicam und Diclofenac behandelten Zellkulturen auf die gelantinolytischen Aktivität von MMP-2. Der inhibitorische Effekt von D-Mannuronsäure auf die Aktivität von MMP-2 zeigt einen möglichen Wirkungsmechanismus der D-Mannuronsäure bei der Bekämpfung von entzündlichen Reaktionen auf.

Die Ergebnisse bei der Bewertung der Nebenwirkungen auf die Nierenfunktion anhand der Serum und Urin Determinanten (Figur 6) zeigen, dass die Verabreichung von D-Mannuronsäure keine signifikanten Effekte auf die untersuchten Parameter (Serum- Kreatinin-Gehalt, Harnstoffstickstoffgehalt, Proteinsekretion durch den Harn, Harnstoffgehalt, Plasmakonzentration von Triglyceriden und Cholesterol) hat. Die histologischen Untersuchungen von Ratten, die mit D-Mannuronsäure behandelt worden sind, zeigen keine Veränderungen der Nierenhistologie (Ergebnisse nicht dargestellt).

Auch die Körpertemperatur hat sich durch die Verabreichung von D-Mannuronsäure nicht verändert (Ergebnisse nicht dargestellt). Dahingegen ist bei einigen NSAIDs wie Paracetamol, Dipyron und Aminophenazon eine dosisabhängige Verringerung der Körpertemperatur im Stand der Technik bekannt. Die Verabreichung von D-Mannuronsäure hat auch nicht zur Ausbildung von Läsionen in der Magenschleimhaut der Versuchstiere geführt.

Anwendungsbeispiel 3 Dieses Beispiel verdeutlicht den therapeutischen Effekt von D-Mannuronsäure bei Nierenerkrankungen anhand von künstlich induzierten nephrotischen Syndromen bei Ratten.

40 Sprague-Dawley Ratten, die bereits unter dem Anwendungsbeispiel 1 beschrieben worden sind, werden in 5 Gruppen aufgeteilt : N = unbehandelte Kontrollgruppe (n=8) ; P = erkrankte aber unbehandelte Patientengruppe (n=8) ; T1 und T2 = Patientengruppe, die mit D-Mannuronsäure (T1) bzw.

Piroxicam (T2) behandelt werden (n = 2 x 8) und eine unbehandelte Kontrollgruppe, die D-Mannuronsäure verabreicht bekommt (H).

Die nephrotischen Syndrome werden durch eine intravenöse Injektion von Adriamycin (7, 5 mg/kg Adriablastina ; Farmitalia, Mailand, Italien) durch die Schwanzvene induziert. Sechs Tage nach der Induktion wird mit der Behandlung der Gruppen T1 und T2 begonnen. Die Versuchstiere der Gruppe T1 bekommen D-Mannuronsäure in einer Dosis von 30 mg/kg Körpergewicht verabreicht, während die Versuchstiere der Gruppe T2 0,3 mg/kg Piroxicam verabreicht bekommen. T1 und T2 bekommen 14 Tage lang jeden Tag 5 Injektionen der oben beschriebenen Zusammensetzung. Zusätzlich bekommen sie 9

Injektionen der gleichen Art, die alle 48 Stunden verabreicht werden, so dass die Behandlung nach 28 Tagen beendet wird.

Für die weiteren Untersuchungen werden die Tiere 43 Tage nach dem Beginn der Behandlung getötet. Die Bestimmung der Nebenwirkungen auf die Nierenfunktion werden anhand der Serum und Urin-Determinanten (Serum-Kreatinin-Gehalt, des Harnstoffstickstoffgehaltes, der Proteinsekretion durch den Harn, des Harnstoffgehaltes als auch der Plasmakonzentration von Triglyceriden und Cholesterol) bestimmt, wie es bereits im Ausführungsbeispiel 2 beschrieben worden ist. Auch die histologischen Untersuchungen auf glomeruläre Läsionen erfolgten nach der bereits beschriebenen Methode im Anwendungsbeispiel 1.

Die Ergebnisse der Untersuchungen werden in den Figuren 7 und 8 dargestellt. Dabei kann festgestellt werden, dass die Behandlung des nephrotischen Syndroms bei Ratten durch D-Mannuronsäure vergleichbare Effekte zeigt, wie das bereits auf dem Markt befindliche Piroxicam. Die Proteinsekretion durch den Harn (U. Prot) liegt bei den mit D-Mannuronsäure behandelten Tieren (T1) deutlich niedriger als bei der unbehandelten Patientengruppe (P) und der Gruppe, die mit Piroxicam behandelt worden ist (T2) (Fig. 7). Die histologischen Untersuchungen des Nierengewebes anhand der oben genannten Parameter zeigen im Vergleich zur unbehandelten Patientengruppe (P) eine deutliche Verringerung der glomerulären Veränderungen in der Versuchsgruppe, die mit D-Mannuronsäure behandelt worden ist, (Fig. 8).

Anwendungsbeispiel 4 Anhand dieses Beispiels soll der Gebrauch des entzündungshemmenden Wirkstoffes D-Mannuronsäure zur Behandlung von T-Zell-vermittelten Autoimmunerkrankungen am

Beispiel des Einflusses auf multiple Sklerose abgeschätzt werden. Dies wird anhand der Behandlung der Autoimmun- Encephalomyelitis (EAE) bei Ratten demonstriert, die durch das Myelin-Basis-Protein (MBP) induziert wird und als Tiermodell für multiple Sklerose (MS) dient.

Zur Induktion von EAE werden sechs Wochen alten, weiblichen Lewis-Ratten 50 pg MBP in 0, 2 ml CFA (Complete Freund s Adjuvant), daß 500 ug Mycobacterium tuberculosis enthält, in die hintere Pfote injiziert.

Für die klinische Bewertung von EAE werden die Ratten täglich gewogen und auf neurologische Besonderheiten hin untersucht.

Die Beurteilung und Einteilung erfolgt nach folgenden Kriterien : 0 = keine Erkrankung ; 1 verringerte Schwanzbewegungen oder leicht schwerfällige Gangart ; 2 = Atonie des Schwanzes und/oder mäßig schwerfällige Gangart ; 3 = Querlähmung (Paraplegie) ; 4 = Paraplegie mit Vorderarmschwäche ; 5 = im sterbenden Zustand oder bereits tot. Die Daten werden als"durchschnittliches klinisches Bild" (mean clinical score) dargestellt.

Für die Behandlung werden zwei Versuchsgruppen gebildet. Die erste Gruppe (n = 7) bekommt D-Mannuronsäure in Salzlösung gelöst und täglich intraperitoneal in Dosen von 40 mg/kg Körpergewicht injiziert (EAE-Gruppe). Die zweite Gruppe (n = 8) bekommt reine Salzlösung injiziert (EAE-Kontrollgruppe).

Beiden Gruppen werden insgesamt 18 Injektionen (i. p. ) der beschriebenen Lösungen verabreicht. Dabei wird mit den Injektionen einen Tag vor der Immunisierung begonnen (Tag-1) und bis zum 16. Tag nach der Immunisierung fortgefahren (Tag +16).

Am 21. Tag nach der Immunisierung werden 4 Ratten aus jeder Gruppe die Lymphknoten entnommen und in Hank's-Lösung gegeben. Danach werden sie durch ein Maschensieb gepresst, um eine Lymphknoten-Zellsuspension zu erhalten. In Wachstumsversuchen wird die Reaktion der Zellsuspension auf MBP und dem Mitogen ConA getestet. Um das MBP spezifische T-Zell Wachstum zu messen, werden die Zellen der Lymphknoten gewaschen und in Mikrotiterplatten Kulturen mit einer Konzentration von 2*105 Zellen/Kammer angeimpft. Zu den Zellen werden 5 oder 10 pg/ml MBP oder 2 ug/ml Con A gegeben.

Die Versuchsansätze werden jeweils 4-fach durchgeführt und zu jedem Versuchsansatz werden zusätzlich 200 ul Stimulationsmedium gegeben, das 1 mM L-Glutamin, 5*10-5 M 2-Mercaptoethanol (ME) und 1% frisches gen-identisches Serum, das mit und ohne Antikörper angesetzt worden ist, enthält.

Nach 72 h Kultivierung bei 37°C und unter 5% COz, wird den Kulturen 5-Bromo-2-desoxyuridin (BrdU) zugeführt. 2 Stunden nach der Zugabe wird das Zellwachstums in den einzelnen Versuchsansätzen mit einem Standard Zellwachstums ELISA-Kit (Boehringer Mannheim, Deutschland) quantifiziert. Die resultierende Farbentwicklung ist dabei proportional zur Konzentration von BrdU in den DNS synthetisierenden Zellen der einzelnen Zellkulturen. Die Absorption wird mit einem optischen Densitometer bestimmt.

Die Ergebnisse zeigen, daß D-Mannuronsäure den Krankheitsverlauf von EAE zu beeinflussen vermag. Die ersten neurologischen Besonderheiten treten 10 Tage nach der Immunisierung von EAE (Fig. 9) auf und erreichen ihr Maximum 13 Tage nach der Immunisierung. Auch das mittlere Körpergewicht reduziert sich ab dem 12. Tag nach der Immunisierung in der EAE-Kontrollgruppe stärker als in der EAE-Gruppe (Fig. 10). Drei Ratten aus der EAE-Gruppe haben

keinerlei Symptome von EAE während der Beobachtungszeit entwickelt, während alle Versuchstiere aus der EAE-Kontrollgruppe deutliche Symptome von EAE aufzeigen (durchschnittliches klinisches Bild >4 ; Fig. 9). Am 11. und 19. Tag nach der Immunisierung ist das durchschnittliche klinische Bild der EAE-Gruppe deutlich geringer als das der EAE-Kontrollgruppe. Bei den Wachstumsversuchen auf die Reaktion der Zellsuspension auf MBP und dem Mitogen ConA zeigte die EAE-Gruppe im Vergleich zur EAE-Kontrollgruppe ein verringertes Wachstum bei MBP Zugabe (Fig. 11). Hingegen sind die Reaktionen der Zellsuspensionen auf das Mitogen Con A in beiden Gruppen nahezu gleich.

Anwendungsbeispiel 5 Die Absenkung des IL-6 Spiegels im Blutserum von Ratten ist ein weiteres Beispiel, dass die entzündungshemmende Wirkung von D-Mannuronsäure belegt.

Der Versuchsaufbau und Ablauf entspricht dem in Anwendungsbeispiel 3 beschriebenem. Auch hier ist das nephrotische Syndrom der Ratten die Folge einer Injektion von Adriamycin. D-Mannuronsäure und Piroxicam wurden den Versuchstieren (Patientengruppen wurden mit D-Mannuronsäure (T1) und Piroxicam (T2) behandelt) 6 Tage nach Ausbruch der Krankheit in gleichen Mengen verabreicht, wie in Anwendungsbeispiel 3 beschrieben. Die Behandlung wird auch hier nach 28 Tagen beendet. Für die weiteren Untersuchungen sind die Tiere 43 Tage nach dem Beginn der Behandlung getötet worden und das Serum wurde mit Hilfe des IL-6 ELISA Kit's auf die Menge an vorhandenem IL-6 im Serum untersucht.

Die Ergebnisse zeigen (Figur 12), dass die mit D-Mannuronsäure behandelte. Gruppe (T1) eine deutlich verringerte IL-6 Menge im Blut aufweist als die unbehandelte (P) oder mit Piroxicam behandelte Gruppe (T2). Das zeigt, dass D-Mannuronsäure die Menge an hergestelltem IL-6 während entzündlicher Reaktionen im Körper der Ratte deutlich verringern konnte.

Anwendungsbeispiel 6 Mit Hilfe des APO-BRDUTM Apoptose-Nachweis Kit s von Roche (Kat. Nr. 88-6671-88 ; CA, USA) ist der Einfluss von D-Mannuronsäure auf die Zellapoptose untersucht worden.

Dazu wurden die Zellen für 24 Stunden mit jeweils 80 pg/ml D-Mannuronsäure, Dexamethason und Piroxicam behandelt. Neben diesen drei Gruppen wurde eine weitere Kontrollgruppe untersucht, die mit unbehandelt geblieben ist. Nach Ablauf der 24 Stunden sind sie in 4% Paraformaldehy fixiert worden und mit 0, 1% Triton X-100 permeabilisiert worden. Mit diesen Zellen wurde das APO-BRDUTM Apoptose Kit durchgeführt. Die Zellkerne sind mit Fluorescein und Propidiumiodid gefärbt worden. Die Zellzahl als auch die Zellphase in der sie sich befinden wurde mit Hilfe eines Durchflusszytometers (FACSCalibar) von Becton Dickinson (USA) untersucht. Die Ergebnisse werden in Prozent an apoptotischen Zellen ausgedrückt.

In Figur 13 sind die Ergebnisse der Durchflusszytometrie zu sehen. Die einzelnen Graphen stellen auf der linken Seite von links oben nach links unten gesehen die folgenden Kontrollansätze dar : (1) negativ Kontrolle der nicht-apoptotischen Zellen, die mit dem Testkit mitgeliefert

werden ; (2) positiv Kontrolle der apoptotischen Zellen, die mit dem Testkit mitgeliefert werden ; (3) nicht mit Dexamethason, Piroxicam oder D-Mannuronsäure behandelte Fibrosarcoma Zellen (WHI 164). Die einzelnen Graphen auf der rechten Seite stellen von rechts oben nach rechts unten gesehen die folgenden Versuchsansätze dar : (4) mit Dexamethason behandelte Zellen ; (5) mit Piroxicam behandelte Zellen ; und (6) mit D-Mannuronsäure behandelte Zellen.

Die Apoptoserate der Versuchsansätze zeigen im Vergleich zu den Kontrollansätzen bei Behandlung mit D-Mannuronsäure eine Apoptoserate von 17, 42%, bei Behandlung mit Dexamethason von 20, 92% und bei Behandlung mit Piroxicam von 28, 15%. Die Ergebnisse zeigen bei der Behandlung mit D-Mannuronsäure eine verringerte Apoptoserate, die sogar etwas über die von mit Dexamethason und Piroxicam behandelten Zellen hinausgeht.