Gegenstand der Erfindung:

Gegenstand der Erfindung ist ein enzymatisches Verfahren zur Herstellung von Aminogruppen tragenden, multizyklischen Ringsystemen .

Stand der Technik:

Diamino-dianhydro-dideoxy-hexitole sind als bifunktionelle Amine interessante Zwischenprodukte für chemische Umsetzungen. Vom 2, 5-Diamino-l, 4 : 3, 6-Dianhydro-2, 5-Dideoxy-D-Hexitol sind drei

Stereoisomere beschrieben (z.B. Bashford, V. G. and Wiggins, L. F. (1950) . Anhydrides of polyhydric alcohols . XIII. The amino derivatives of 1, 4:3, 6-dianhydromannitol , -sorbitol , and L- iditol and their behavior towards nitrous acid. Journal of the Chemical Society 1950 371-374.) : 2, 5-Diamino-l, 4 : 3, 6-Dianhydro- 2, 5-Dideoxy-D-Mannitol (I), 2, 5-Diamino-l, 4 : 3, 6-Dianhydro-2, 5- Dideoxy-D-Glucitol (II) und 2, 5-Diamino-l, 4 : 3, 6-Dianhydro-2, 5- Dideoxy-L-Iditol (III) . Die drei Stereoisomere unterscheiden sich in der Chiralität an der Position 2 und 5. Die Aminogruppen können hier in der endo, endo (I), endo, exo (II) oder exo, exo (III) Position stehen, bezogen auf die Sesselform der annelierten fünfgliedrigen Ringe.

Erfolgreich dargestellt wurden diese Moleküle bisher aus den entsprechenden 1:4,3:6 Dianhydrohexitolen

1, 4 : 3, 6-Dianhydro-D-Mannitol, trivial Isomannid (IV)

1 , 4 : 3 , 6-Dianhydro-D-Glucitol , trivial I sosorbid (V)

1,4:3, 6-Dianhydro-L-Iditol, trivial Isoidid (VI)

über

1.) Veresterung der Hydroxylgruppen (spez. Mesylierung oder Tosylierung) und

2.) Nucleophile Substitution der Säuregruppen mit Azid und nachfolgender Reduktion zum Diamin.

(Vgl. z.B.: Bashford, V. G. and Wiggins, L. F. (1950) . Anhydrides of polyhydric alcohols . XIII. The amino derivatives of 1 , 4:3, 6-dianhydromannitol , -sorbitol , and L-iditol and their behavior towards nitrous acid Journal of the Chemical Society 1950 371-374.; Thiem, J. and Bachmann, F. (1991) . Synthesis and properties of polyamides derived from anhydro- and dianhydroalditols Makromolekulare Chemie 192 2163-2182.) .

Reaktionsschema 1 stellt dies exemplarisch am Beispiel (IV) dar.

Reaktionsschema 1:

Verschiedene Modifikationen der dargestellten Route wurden getestet, jedoch alle ohne Erfolg:

A) Die Substitution wurde statt mit Azid direkt mit Ammoniak durchgeführt (Montgomery, R. and Wiggins, L. F. (1946) . Anhydrides of polyhydric alcohols . V. 2 , 5-Diamino-l , 4 , 3 , 6- dianhydromannitol and -sorbitol and their sulfanilamide derivatives Journal of the Chemical Society 1946 393-396.; Kiessing, US 4535158; Kiessing, DE3028288) . Hierbei konnten nur sehr geringe Ausbeuten an Diamin erzielt werden.

B) Die Substitution erfolgte mit primären Aminen statt mit Azid. Auch hier waren die Ausbeuten gering und zudem wurden nur alkylierte Varianten der Diamine dargestellt (Hayashi, H.; Ueno, H.; Suzuki, F. (1992) Synthesis of stereoisomers of 1,4:3,6- dianhydrohexitol nitrate derivative, KF-14124. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2 (10) , 1187-92.; Kiessing, US 4535158; Kiessing, DE3028288) . C) Als Alternative zur Reduktion wurde das Diazid mit Ketonen zum Imin umgesetzt und anschließend reduziert (De Coster, G., Vandyck K., Van der Eycken, E., Van der Eycken, J. Elseviers, M. and Röper, H. (2002) D-Isomannide in synthesis : asymmetric Diels-Alder reactions with novel homochiral bis-imine Cu2+- catalysts. Tetrahedron: Asymmetry 13 (2002) 1673-1679) . Auch hier wurden allerdings nur alkylierte Varianten der Diamine erhalten .

All diese Routen gehen von den Stereoisomeren-reinen

Anhydrohexitolen aus (IV bis VI), die in den einzelnen Reaktionsschritten unterschiedliche Reaktivität zeigen, und führen zu Stereoisomeren-reinen Produkten (I-III) . Dabei kommt es über die Azid- Route zu einer Inversion der Stereochemie, aus dem endo, endo Diol (IV) wird zum Beispiel das exo, exo Diamin (III) (Cope, A. C. and Shen, T. Y. (1956) . Stereochemistry of 1 , 4 : 3, 6-dianhydrohexitol derivatives Journal of the American Chemical Society 78, 3177-3182.), so dass in der hier gebrauchten Bezeichnung z.B. zur Synthese des 2,5-Diamino- 1, 4 :3, 6-Dianhydro-2, 5-Dideoxy-L-Iditols (III) 1, 4 : 3, 6-Dianhydro- D-Mannitol (IV) als Ausgangstoff verwendet werden muss.

Die beschriebenen Reaktionswege haben den Nachteil, dass sie entweder sehr ineffizient sind (Substitution des Ditosylats mit Ammoniak, Montgomery, R. and Wiggins, L. F. (1946) . Anhydrides of polyhydric alcohols . V. 2, 5-Diamino-l , 4 , 3, 6-dianhydromannitol and -sorbitol and their sulfanilamide derivatives Journal of the Chemical Society 1946 393-396.) oder sich nur sehr schwer im großtechnischen Maßstab umsetzen lassen, wie z. B. die Substitution mit Azid. Außerdem erhält man ausgehend von einem reinen Stereoisomer als Ausgangsstoff genau nur ein Stereoisomer als Produkt. Dies ist insofern wichtig, als dass nur das Isosorbid (V) in großen Mengen und billig zur Verfügung steht und sich von diesem über die beschriebene Route nur Produkt (II) darstellen lässt. Interessant wäre es aber von diesem einen verfügbaren Ausgangsstoff (V) ausgehend, alle drei Amine (I-III) großtechnisch darstellen zu können.

Die Darstellung der Diamine (I) bis (III) aus der Diulose (VII) konnte bisher noch nicht gezeigt werden. Dargestellt werden konnten allein das am Stickstoff alkylierte Derivat des endo/endo-ständigen Diamins(I) (Limberg, G.; Thiem, J. (1994), Synthetic Approach to N-Alkylated 2, 5-Diamino-2, 5- didesoxy-1 , 4 ; 3, 6-dianhydroalditols by Reductive Alkylation. Synthesis; 1994 (3) 317-321.) .

Es gibt in der Natur verschiedene Wege und damit Enzymklassen, Amine zu synthetisieren. Beispiele dieser Enzyme sind Transaminasen (auch Aminotransferasen genannt, EC 2.6.1.x), Aminosäuredehydrogenasen (EC 1.4.1.x) und Ammoniumlyasen (EC 4.3.1.x) . Die typischen Produkte der Aminbildung sind dabei α-Aminosäuren ausgehend von α-Ketocarbonsäuren bzw. α-ß-ungesättigten Carbonsäuren (Lyasen) . In jüngerer Zeit wurden zudem auch sog. Aminoalkoholdehydrogenasen beschrieben (US6432688, WO0023608) .

Transaminasen sind Pyridoxalphosphat (PLP) -abhängige Enzyme, die Aminogruppen von einem Molekül unter Bildung einer Oxo-Gruppe auf die Oxo-Gruppe eines zweiten Moleküls unter Bildung einer Aminogruppe übertragen. Damit hat jede Transaminase zumindest zwei Substrate: Den Aminodonor (in vivo typischerweise eine α- Aminosäure) und den Aminoakzeptor (siehe Schema) . Für diese beiden Substrate besitzen Transaminasen in der Regel aber eine sehr hohe Spezifität.

Wenn die Aminogruppe sich an einem chiralen Zentrum befindet, so ergeben die Reaktionen von Transaminasen typischerweise bevorzugt ein Enantiomer. Daher werden Transaminasen häufig zur chiralen Auflösung von racemischen Gemischen verwendet (z.B. Matcham, G. W. and Bowen, A. R. S. Biocatalysis for chiral intermediates : Meeting commercial and technical challenges. Chimica Oggi, 1996, 14(6), 20-24., US6344351, EP404146) . Eine spezielle Gruppe der Transaminasen sind die ω-Transaminasen . Diese haben den Vorzug, Aminogruppen auf Oxo- Gruppen übertragen zu können, die nicht durch benachbarte Carboxylgruppen aktiviert sind. Interessanterweise scheinen diese Enzyme aber vorrangig (S) -spezifisch zu sein (Shin und Kim, 2001, Comparison of the ω-Transaminase from Different Microorganisms and Application to Production of Chiral Amines Biosci. Biotechnol. Biochem. 65 (8) : 1782-88) . Transaminasen sind sehr zahlreich und eine Reihe von Substraten und Produkten von Transaminasen sind beschrieben worden. So sind vor allem lineare aliphatische Ketone und aromatische Ketone aminiert worden. Einige wenige Transaminasen sind beschrieben worden, die monozyklische aliphatische Amine bilden können (Lynne A. Lucher, Yu-Ming Chen and James B. Walker (1989) Reactions Catalyzed by Purified L-Glutamine :Keto-Scyllo-Inositol Aminotransferase, an Enzyme Required for Biosynthesis of Aminocyclitol Antibiotics . Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1989, p. 452-459; Bum-Yeol Hwang, Hwa-Jin Lee, Yung-Hun Yang, Hwang-Soo Joo, and Byung-Gee Kim (2004) Characterization and Investigation of Substrate Specificity of the Sugar Aminotransferase WecE from E. coli K12. Chemistry & Biology, Vol. 11, p. 915-925) . Es konnte hingegen noch nicht die Aminierung von annelierten multizyklischen aliphatischen Ketonen und speziell nicht von Ketonen in multizyklischen cis- verknüpften aliphatischen Ringsystemen erreicht werden.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein breit einsetzbares Verfahren bereitzustellen, mit welchem mindestens eine Aminogruppen tragende, multizyklische Ringsysteme hergestellt werden können. Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, stereochemieunabhängige Synthesen bezüglich Edukten und/oder Produkten durchführen zu können.

Beschreibung der Erfindung

Überraschenderweise wurde gefunden, dass eine enzymatische, durch Transaminasen katalysierte Umsetzung von multizyklischen Ketonverbindungen zu Enantiomerenmischungen multizyklischer Aminoverbindungen führt.

Dies ist für den Fachmann nicht vorhersehbar und wie oben aufgeführt völlig unerwartet, da diese enzymatischen Reaktionen in der Regel hochgradig stereospezifisch sein sollten und Enzyme in der Regel eine sehr hohe Substratspezifität aufweisen. Des Weiteren wurde völlig überraschend gefunden, dass dieses Enantiomerenverhältnis durch den pH Wert während der Reaktion beeinflusst werden kann.

Überdies hinaus wurde völlig überraschend gefunden, dass die Transaminasen unterschiedlichste stereochemische Strukturen der multizyklischen Edukte als Substrat akzeptieren.

Mit erfindungsgemäßem Verfahren hergestellte Amine eignen sich insbesondere zur Herstellung von Epoxiden, Polyurethanen oder Polyamiden

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Aminierung mindestens einer Ketogruppe in einem mindestens eine Ketogruppe aufweisenden multizyklischen Ringsystem zu einer Aminogruppe unter Verwendung mindestens eines Enzyms E mit Transaminase-Aktivität .

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Aminogruppen tragenden, multizyklischen Ringsystems wird nachfolgend beispielhaft beschrieben, ohne dass die Erfindung auf diese beispielhaften Ausführungsformen beschränkt sein soll. Sind nachfolgend Bereiche, allgemeine Formeln oder Verbindungsklassen angegeben, so sollen diese nicht nur die entsprechenden Bereiche oder Gruppen von Verbindungen umfassen, die explizit erwähnt sind, sondern auch alle Teilbereiche und Teilgruppen von Verbindungen, die durch Herausnahme von einzelnen Werten (Bereichen) oder Verbindungen erhalten werden können. Werden im Rahmen der vorliegenden Beschreibung Dokumente zitiert, so soll deren Inhalt vollständig zum Offenbarungsgehalt der vorliegenden Erfindung gehören. Alle angegebenen Prozent (%) sind, wenn nicht anders angegeben, Massenprozent.

Unter einem „multizyklischen Ringsystem" sind Substanzen zu verstehen, die aus mindestens zwei miteinander kovalent verbundenen ringförmigen Molekülen aufgebaut sind.

Unter einem „Wildtyp" einer Zelle wird vorzugsweise eine Zelle bezeichnet, deren Genom in einem Zustand vorliegt, wie er natürlicherweise durch die Evolution entstanden ist. Der Begriff wird sowohl für die gesamte Zelle als auch für einzelne Gene verwendet. Unter den Begriff „Wildtyp" fallen daher insbesondere nicht solche Zellen bzw. solche Gene, deren Gensequenzen zumindest teilweise durch den Menschen mittels rekombinanter Verfahren verändert worden sind. Der Begriff „Überexpression" beschreibt die Erhöhung der intrazellulären Aktivität oder Konzentration eines oder mehrerer Enzyme oder Proteine in einem Organismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene, des offenen Leserahmens (ORFs) bzw. der ORFs um mindestens eine Kopie erhöht, einen starken Promotor funktionell mit dem Gen verknüpft oder ein Gen oder Allel oder ORF verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert. In E. coli werden exemplarisch lac, tac und trp als starke Promotoren genannt. Als „Transaminierung" soll generell die Umwandlung eines Ketons zu einem Amin verstanden werden; anders als in der herkömmlichen Verwendung sollen nicht nur alpha-Ketonsäuren sondern generell alle Ketone als Edukte verstanden werden. Als „homologe Expression" oder „homologe Überexpression" soll die Überexpression eines Proteins, welches vorher bereits in dem Mikroorganismus vorhanden war, verstanden werden. Als „heterologe Expression" oder „heterologe Überexpression" soll die Expression bzw. Überexpression eines Proteins, welches vorher nicht in dem Mikroorganismus vorhanden war, verstanden werden .

In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann das Ringsystem jedes multizyklische Ringsystem sein, welches über mindestens eine Ketogruppe verfügt. Es kann eine Substanz sein, aufgebaut aus mehreren substituierten oder unsubstituierten, gesättigten oder ungesättigten, aliphatischen oder aromatischen Ringen; insbesondere handelt es sich um Substanzen, deren Ringe über eine molekulare Brücke verbunden sind oder in denen mindestens ein Atom am Aufbau von mindestens zwei Ringen gleichzeitig beteiligt ist. Die Ringe können reine Kohlenstoffringe oder Heterozyklen oder Mischungen aus beiden sein. Bevorzugtes

Heteroatom in Heterozyklen ist Sauerstoff. Bevorzugt sind die Ringe, die ausschließlich Kohlenstoffatome aufweisen. Als bevorzugte Substituenten am Ringsystem kommen kurzkettige (1 bis 5 C-Atome) , gegebenenfalls weiter substituierte, Alkyreste oder Alkoxyreste in Frage.

Bevorzugt werden im erfindungsgemäßen Verfahren solche multizyklischen Ringsysteme eingesetzt, die cis-verknüpfte Ringe aufweisen . Die Anzahl der Ringe im Ringsystem liegt vorzugsweise bei zwei oder drei Ringen. Besonders bevorzugt werden Ringsysteme mit zwei Ringen eingesetzt.

Die Ringgröße eines das Ringsystem aufbauenden Einzelringes beträgt vorzugsweise 3 bis 9, bevorzugt 4 bis 7, besonders bevorzugt 5 Atome. Die Ketogruppe kann mit einem Ringkohlenstoff oder mit einem Substituentenkohlenstoff, d.h. mit einem Kohlenstoffatom, das nicht Bestanteil eines Ringes im Ringsystem ist, verbunden sein. Bevorzugt ist die Ketogruppe im erfindungsgemäßen Verfahren mit einem Ringkohlenstoff verbunden. Besonders bevorzugt ist der Kohlenstoff der Ketogruppe Bestandteil eines der Ringe.

Bevorzugt werden in dem erfindungsgemäßen Verfahren als multizyklisches Ringsystem Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe :

eingesetzt

In dem erfindungsgemäßen Verfahren können Ketogruppen tragende, multizyklische Ringsysteme aller möglichen Herkunft eingesetzt werden .

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Ketogruppen tragendes, multizyklisches Ringsystem eingesetzt, welches durch Oxidation mindestens einer sekundären Hydroxylgruppe eines multizyklischen Ausgangsringsystems zu einem Keton erhalten wird (Verfahrensschritt A) .

Dies lässt sich beispielhaft durch Reaktionsschema 2 verbildlichen, wobei mit A gekennzeichnete Verfahrensschritte die Oxidation mindestens einer sekundären Hydroxylgruppe zu einer Ketogruppe darstellen, mit B gekennzeichnete Verfahrensschritte die Transaminierung. Wie gezeigt können Schritte A und B getrennt nacheinander aber auch abwechselnd ablaufen .

Reaktionsschema 2:

Bevorzugt steht in dem in Verfahrensschritt A eingesetzten mindestens eine sekundäre Hydroxylgruppe aufweisenden multizyklischen Ausgangsringsystem mindestens eine der sekundären Hydroxylgruppen endo-ständig zu dem multizyklischen

Ausgangsringsystem. Gleichermaßen bevorzugt steht mindestens eine der sekundären Hydroxylgruppen exo-ständig zu dem multi zyklischen Ausgangsringsystem.

Bevorzugt werden in Verfahrensschritt A als multizyklisches

Ausgangsringsystem eingesetzt mindestens eine Verbindung ausgewählt aus der Gruppe:

Isomannid,

Isosorbid,

Isoidid,

Zur Oxidation der sekundären Hydroxylgruppe in dem multizyklischen Ausgangsringsystem können sämtliche bekannten oxidierenden Verfahren eingesetzt werden, so z.B. elektrochemische, homogen oder heterogen katalytische oder enzymatische . Bevorzugt werden hier Verfahren der heterogen oder homogenen Katalyse eingesetzt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens wird die Oxidation der sekundären

Hydroxylgruppe in dem multizyklischen Ausgangsringsystem durch ein Enzym F mit Alkoholdehydrogenase-Aktivität katalysiert, besonders bevorzugt stammt F aus Pichia carsonii , Pichia guillermondii oder Pichia jadinii.

In dem Verfahren kann jedes Enzym mit Transaminase-Aktivität verwendet werden, das das eingesetzte multizyklische Ringsystem als Substrat akzeptiert. Vorzugsweise verwendet man bei diesen Verfahren Glutamin-Scyllo- Inositol Transaminasen (EC Nummer: 2.6.1.50), bevorzugt aus Mikroorganismen der Gattungen Bacillus, Micromonospora oder Streptomyces, besonders bevorzugt Bacillus circulans und Streptomyces griseus.

Besonders bevorzugte Enzyme mit Transaminase-Aktivität in dem erfindungsgemäßen Verfahren umfassen, bevorzugt bestehend aus, Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 und SEQ ID NO: 33.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens ist das Enzym mit Transaminase-Aktivität ausgewählt aus der Gruppe der funktionalen Äquivalenten der Gruppe bestehend aus funktionalen Äquivalente der Enzyme ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Enzymen umfassend, bevorzugt bestehend aus, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 und SEQ ID NO: 33, bei denen bis zu 25%, bevorzugt bis zu 20%, besonders bevorzugt bis zu 15% insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber der korrespondierenden SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 bzw. SEQ ID NO: 33 durch Deletion, Substitution, eine Insertion oder eine Kombination aus Deletion, Substitution und Insertion verändert worden sind, wobei die funktionalen Äquivalente noch mindestens 50%, bevorzugt 65%, besonders bevorzugt 80% , insbesondere mehr als 90 % der enzymatischen Aktivität des Enzyms umfassend, bevorzugt bestehend aus, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 bzw. SEQ ID NO: 33 besitzen. In diesem Zusammenhang soll unter enzymatische Aktivität von SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 bzw. SEQ ID NO: 33 die Fähigkeit verstanden werden, die Diulose (VII) zu den entsprechenden Diaminen Diaminoisosorbid (II) und Diaminoisoidid (III) zu transaminieren . Als Enzyme mit Transaminase-Aktivität E können im erfindungsgemäßen Verfahren auch „funktionale

Äquivalente" oder „funktionale Derivate" eingesetzt werden. „Funktionale Äquivalente" oder Analoga der konkret offenbarten Enzyme sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung davon verschiedene Polypeptide, welche weiterhin die gewünschte biologische Aktivität, wie z.B. Substratspezifität, besitzen. So versteht man beispielsweise unter „funktionalen Äquivalenten" Enzyme, die die Diulose (VII) zu den entsprechenden Diaminen transaminieren und die mindestens 50 %, bevorzugt 60 %, besonders bevorzugt 75 %, ganz besonders bevorzugt 90 % der Aktivität eines Enzyms mit der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4,

SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 bzw. SEQ ID NO: 33 aufgeführten Aminosäuresequenz aufweist. Enzym E und seine funktionale Äquivalente sind außerdem vorzugsweise zwischen pH 4 bis 10 stabil und besitzen vorteilhaft ein pH-Aktivitätsoptimum zwischen pH 5 und 8 sowie ein Temperatur-Aktivitätsoptimum im Bereich von 20 ⁰ C bis 80 ⁰ C Unter „funktionalen Äquivalenten" können insbesondere auch Mutanten verstanden werden, welche in wenigstens einer

Sequenzposition der oben genannten Aminosäuresequenzen eine andere als die konkret genannte Aminosäure aufweisen, aber trotzdem eine der oben genannten biologischen Aktivitäten besitzen. „Funktionale Äquivalente" umfassen somit die durch eine oder mehrere Aminosäure-Additionen, -Substitutionen, -

Deletionen und/oder -Inversionen erhältlichen Mutanten, wobei die genannten Veränderungen in jeglicher Sequenzposition auftreten können, solange sie zu einer Mutante mit dem erfindungsgemäßen Eigenschaftsprofil führen. Funktionale Äquivalenz ist insbesondere auch dann gegeben, wenn die Reaktivitätsmuster zwischen Mutante und unverändertem Polypeptid qualitativ übereinstimmen, d.h. beispielsweise gleiche Substrate mit unterschiedlicher Geschwindigkeit umgesetzt werden. Beispiele für geeignete Aminosäuresubstitutionen sind folgender Tabelle zu entnehmen:

Unter „funktionalen Äquivalenten" können erfindungsgemäß insbesondere auch Mutanten verstanden werden, welche in wenigstens einer Sequenzposition der oben genannten Aminosäuresequenzen eine andere als die konkret genannte Aminosäure aufweisen aber trotzdem eine der oben genannten biologischen Aktivitäten besitzen. „Funktionale Äquivalente" umfassen somit vorzugsweise auch die durch eine oder mehrere Aminosäure-Additionen, -Substitutionen, -Deletionen und/oder - Inversionen erhältlichen Mutanten, wobei die genannten Veränderungen in jeglicher Sequenzposition auftreten können, solange sie zu einer Mutante mit dem erfindungsgemäßen Eigenschaftsprofil führen. Funktionale Äquivalenz ist insbesondere auch dann gegeben, wenn die Reaktivitätsmuster zwischen Mutante und unverändertem Polypeptid qualitativ übereinstimmen, d.h. beispielsweise gleiche Substrate mit unterschiedlicher Geschwindigkeit umgesetzt werden. „Funktionale Äquivalente" im obigen Sinne können auch „Präkursoren" der beschriebenen Polypeptide sowie „funktionale Derivate" und „Salze" der Polypeptide sein. „Präkursoren" können dabei natürliche oder synthetische Vorstufen der Polypeptide mit oder ohne der gewünschten biologischen Aktivität sein. Unter dem Ausdruck „Salze" versteht man sowohl Salze von Carboxylgruppen als auch Säureadditionssalze von Aminogruppen der erfindungsgemäßen Proteinmoleküle. Salze von Carboxylgruppen können in an sich bekannter Weise hergestellt werden und umfassen anorganische Salze, wie zum Beispiel Natrium-, Calcium- , Ammonium-, Eisen- und Zinksalze, sowie Salze mit organischen Basen, wie zum Beispiel Aminen, wie Triethanolamin, Arginin, Lysin, Piperidin und dergleichen. Säureadditionssalze, wie zum Beispiel Salze mit Mineralsäuren, wie Salzsäure oder

Schwefelsäure und Salze mit organischen Säuren, wie Essigsäure und Oxalsäure sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung. „Funktionale Derivate" erfindungsgemäßer Polypeptide können an funktionellen Aminosäure-Seitengruppen oder an deren N- oder C- terminalen Ende mit Hilfe bekannter Techniken ebenfalls hergestellt werden. Derartige Derivate umfassen beispielsweise aliphatische Ester von Carbonsäuregruppen, Amide von Carbonsäuregruppen, erhältlich durch Umsetzung mit Ammoniak oder mit einem primären oder sekundären Amin, N-Acylderivate freier Aminogruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen, oder O-Acylderivate freier Hydroxygruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen.

"Funktionale Äquivalente" können natürlich auch Polypeptide sein, welche aus anderen Organismen zugänglich sind, sowie natürlich vorkommende Varianten. Beispielsweise lassen sich durch Sequenzvergleich Bereiche homologer Sequenzregionen festlegen und in Anlehnung an die konkreten Vorgaben der Erfindung äquivalente Enzyme ermitteln.

„Funktionale Äquivalente" umfassen ebenfalls Fragmente, vorzugsweise einzelne Domänen oder Sequenzmotive, der erfindungsgemäßen Polypeptide, welche z.B. die gewünschte biologische Funktion aufweisen.

„Funktionale Äquivalente" können außerdem Fusionsproteine sein, welche eine der oben genannten Polypeptidsequenzen oder davon abgeleitete funktionale Äquivalente und wenigstens eine weitere, davon funktionell verschiedene, heterologe Sequenz in funktioneller N- oder C-terminaler Verknüpfung (d.h. ohne gegenseitigen wesentliche funktionelle Beeinträchtigung der Fusionsproteinteile) aufweisen. Nichtlimitierende Beispiele für derartige heterologe Sequenzen sind z.B. Signalpeptide oder Enzyme.

Erfindungsgemäß können „funktionale Äquivalente" Homologe zu den konkret offenbarten Enzymen sein. Diese besitzen wenigstens 60 %, vorzugsweise wenigstens 75% insbesondere wenigsten 85 %, wie z.B. 90%, 95% oder 99% Homologie zu einer der konkret offenbarten Aminosäuresequenzen, berechnet nach dem Algorithmus von Pearson und Lipman (Pearson WR, Lipman DJ. Improved tools for biological sequence comparison . Proc Natl Acad Sei U S A. 1988 Apr;85 (8) :2444-8) . Eine prozentuale Homologie eines erfindungsgemäßen homologen Polypeptids bedeutet insbesondere prozentuale Identität der Aminosäurereste bezogen auf die Gesamtlänge einer der hier konkret beschriebenen Aminosäuresequenzen.

Im Falle einer möglichen Proteinglykosylierung umfassen erfindungsgemäße „funktionale Äquivalente" Enzyme des oben bezeichneten Typs in deglykosylierter bzw. glykosylierter Form sowie durch Veränderung des Glykosylierungsmusters erhältliche abgewandelte Formen.

Homologe der erfindungsgemäßen Enzyme können durch Mutagenese erzeugt werden, z.B. durch Punktmutation oder Verkürzung des Enzyms . Homologe des erfindungsgemäßen Enzyms können durch Screening kombinatorischer Banken von Mutanten, wie z.B.

Verkürzungsmutanten, identifiziert werden. Beispielsweise kann eine solche Bank von Protein-Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf Nukleinsäureebene erzeugt werden, wie z.B. durch enzymatisches Ligieren eines Gemisches synthetischer Oligonukleotide . Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die zur Herstellung von Banken potentieller Homologer aus einer degenerierten Oligonukleotidsequenz verwendet werden können. Die chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem DNA-Syntheseautomaten durchgeführt werden, und das synthetische Gen kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Die Verwendung eines degenerierten Gensatzes ermöglicht die Bereitstellung sämtlicher Sequenzen in einem Gemisch, die den gewünschten Satz an potentiellen Protein-Sequenzen kodieren. Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind dem Fachmann bekannt (z.B. Ike Y, Ikuta S, Sato M, Huang T, Itakura K. Solid phase synthesis of polynucleotides . VIII. Synthesis of mixed oligodeoxyribonucleotides by the phosphotriester solid phase method. Nucleic Acids Res. 1983 Jan 25; 11 (2) : 477-88) . Im Stand der Technik sind mehrere Techniken zum Screening von Genprodukten kombinatorischer Banken, die durch Punktmutationen oder Verkürzung hergestellt worden sind, und zum Screening von cDNA-Banken auf Genprodukte mit einer ausgewählten Eigenschaft bekannt. Diese Techniken lassen sich an das schnelle Screening der Genbanken anpassen, die durch kombinatorische Mutagenese erfindungsgemäßer Homologer erzeugt worden sind. Die am häufigsten verwendeten Techniken zum Screening großer Genbanken, die einer Analyse mit hohem Durchsatz unterliegen, umfassen das Klonieren der Genbank in replizierbare Expressionsvektoren, Transformieren der geeigneten Zellen mit der resultierenden Vektorenbank und Expremieren der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, unter denen der Nachweis der gewünschten Aktivität die Isolation des Vektors, der das Gen kodiert, dessen Produkt nachgewiesen wurde, erleichtert. Recursive-Ensemble-Mutagenese (REM) , eine Technik, die die Häufigkeit funktioneller Mutanten in den Banken vergrößert, kann in Kombination mit den Screeningtests verwendet werden, um Homologe zu identifizieren (Arkin AP, Youvan DC. An algorithm for protein engineering: simulations of recursive ensemble mutagenesis . Proc Natl Acad Sei U S A. 1992 Aug 15; 89 (16) : 7811-5) .

Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Enzyme lassen sich durch die dem Fachmann bekannten Verfahren herstellen, hierzu zählen z.B. die Produktion in Zellkulturen oder Mikroorganismen oder die in-vi tro-Translation . Hierfür sind insbesondere Nukleinsäuresequenzen (einzel- und doppelsträngige DNA- und RNA-Sequenzen, wie z.B. cDNA und mRNA) nötig. Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der

Nukleinsäuresequenzen, die für ein Enzym mit erfindungsgemäßer Transaminase-Aktivität oder eines seiner funktionalen

Äquivalente kodieren. Bevorzugt sind Nukleinsäuresequenzen, welche für die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 und SEQ ID NO: 33 oder charakteristische Teilsequenzen davon kodieren. Die entsprechenden Nukleinsäuren lassen sich leicht durch Rückübersetzung der SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 und SEQ ID NO: 33 gemäß dem genetischen Code ermitteln. Hierbei ist eine sogenannte Kodon-Optimierung, d.h. eine Anpassung der Kodons an die häufig benutzten Kodons von insbesondere hoch expremierten Genen des geplanten Wirtsorganismus, in dem die Nukleinsäure exprimiert werden soll. Nukleinsäuresequenzen sind durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen, wie z.B. durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise nach der

Phosphoamiditmethode (Koster H, Blocker H, Frank R, Geussenhainer S, Kaiser W. Total synthesis of a structural gene for the human peptide hormone angiotensin II. Hoppe Seylers Z Physiol Chem. 1975 Oct; 356 (10) : 1585-93) erfolgen. Auch Nukleinsäuresequenzen kodierend für eines der obigen Polypeptide und deren funktionalen Äquivalenten, welche z.B. unter Verwendung künstlicher Nukleotidanaloga zugänglich sind, können in erfindungemäßem Verfahren eingesetzt werden. Ebenso können Nukleinsäuren, welchen mit oben genannten kodierenden Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisieren eingesetzt werden. Unter dieser Eigenschaft versteht man die Fähigkeit eines PoIy- oder Oligonukleotids unter stringenten Bedingungen an eine nahezu komplementäre Sequenz zu binden, während unter diesen Bedingungen unspezifische Bindungen zwischen nicht-komplementären Partnern unterbleiben. Dazu sollten die Sequenzen zu 70-100%, vorzugsweise zu 90-100%, komplementär sein. Die Eigenschaft komplementärer Sequenzen, spezifisch aneinander binden zu können, macht man sich beispielsweise beim Screening von genomischen oder cDNA-Banken, in der Northern- oder Southern- Blot-Technik oder bei der Primerbindung in PCR oder RT-PCR zunutze. Üblicherweise werden dazu Oligonukleotide ab einer Länge von 30 Basenpaaren eingesetzt. Unter stringenten Bedingungen versteht man beispielsweise in der Northern-Blot- Technik die Verwendung einer 50 - 70 ⁰ C, vorzugsweise 60 - 65 ⁰ C warmen Waschlösung, beispielsweise 0,Ix SSC-Puffer mit 0,1 % SDS (2Ox SSC: 3M NaCl, 0,3M Na-Citrat, pH 7,0) zur Elution unspezifisch hybridisierter cDNA-Sonden oder Oligonukleotide. Dabei bleiben, wie oben erwähnt, nur in hohem Maße komplementäre Nukleinsäuren aneinander gebunden. Die Einstellung stringenter Bedingungen ist dem Fachmann bekannt und ist z.B. in Ausubel et al . , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. beschrieben. Solche Polynukleotide lassen sich gegebenenfalls mit geeigneten Primern mittels PCR vermehren und anschließend isolieren. Darüber hinaus können solche Polynukleotide auch auf chemischem Wege synthetisiert werden . Besonders bevorzugt wird im erfindungsgemäßen Verfahren zur Bereitstellung des Enzyms E eine Nukleinsäuresequenz umfassend SEQ ID NO: 1 verwendet.

Gegenstand der Erfindung sind außerdem Expressionskonstrukte, enthaltend unter der genetischen Kontrolle regulativer

Nukleinsäuresequenzen eine für ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz, sowie Vektoren, umfassend wenigstens eines dieser Expressionskonstrukte.

Vorzugsweise umfassen solche erfindungsgemäßen Konstrukte 5'- stromaufwärts von der jeweiligen kodierenden Sequenz einen Promotor und 3 ' -stromabwärts eine Terminatorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der kodierenden Sequenz.

Unter einer „operativen Verknüpfung" versteht man die sequentielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Beispiele für operativ verknüpfbare Sequenzen sind

Targeting-Sequenzen sowie Enhancer, Polyadenylierungssignale und dergleichen. Weitere regulative Elemente umfassen selektierbare Marker, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und dergleichen. Geeignete regulatorische Sequenzen sind z.B. beschrieben in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) . Unter einem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt sind insbesondere solche zu verstehen, bei welchen das Gen für eine erfindungsgemäße Transaminase mit einem oder mehreren Regulationssignalen zur Steuerung, z.B. Erhöhung, der

Genexpression operativ oder funktionell verknüpft wurden. Ein bevorzugtes Nukleinsäurekonstrukt enthält vorteilhafterweise auch eine oder mehrere der schon erwähnten "Enhancer" Sequenzen, funktionell verknüpft mit dem Promotor, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3 ' -Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können in einer oder mehreren Kopien im Konstrukt enthalten sein. Im Konstrukt können noch weitere Marker, wie Antibiotikaresistenzen oder Auxotrophien komplementierende Gene, gegebenenfalls zur Selektion auf das Konstrukt enthalten sein. Das Nukleinsäurekonstrukt wird zur Expression in einem Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen Vektor, wie beispielsweise einem Plasmid oder einem Phagen inseriert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Unter

Vektoren sind außer Plasmiden und Phagen auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, also z.B. Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus, und lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden. Weitere

Vektorenund Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors , A laboratory Manual (Eds. Pouwels P. H. et al . Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen werden. In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann der das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt oder die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthaltende Vektor auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Vektor wie einem Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurekonstrukt oder der erfindungsgemäßen Nukleinsäure bestehen .

Bevorzugt werden die in dem erfindungemäßen Verfahren verwendeten Enzyme in Mikroorganismen hergestellt. Mikroorganismen werden in der Regel in einem flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von Zuckern, eine Stickstoffquelle meist in Form von organischen Stickstoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat, Spurenelemente wie Eisen-, Mangan-, Magnesiumsalze und gegebenenfalls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0 ⁰ C und 100 ⁰ C, bevorzugt zwischen 10 ⁰ C bis 60 ⁰ C unter Sauerstoffbegasung angezogen. Dabei kann der pH der Nährflüssigkeit auf einen festen Wert gehalten werden, das heißt während der Anzucht reguliert werden oder nicht. Die Anzucht kann ,,batch"-weise, „semi batch"-weise oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe können zu beginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kontinuierlich nachgefüttert werden. Eine Aufreinigung der Enzyme kann mit bekannten chromatographischen Verfahren erzielt werden. Dazu zählen z.B. die Gelfiltration, die An- und Kationenaustausch-Chromatographie und die hydrophobe Interaktionschromatographie. Es können auch andere übliche Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisation, Aussalzen, Dialyse und native Gelelektrophorese eingesetzt werden. Weitere geeignete Verfahren werden z.B. in Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York beschrieben. Vorteilhaft kann es sein, zur Isolierung des rekombinanten Proteins Vektorsysteme oder Oligonukleotide zu verwenden, die die cDNA um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide oder Fusionsproteine kodieren, die z.B. einer einfacheren Reinigung dienen. Derartige geeignete Modifikationen sind beispielsweise als Anker fungierende sogenannte "Tags", die oft auch als Antigene von Antikörpern erkannt werden können, wie z.B. His-Tags, Strep-Tags, myc-Tags, Flag-Tags, MBP-Tags und GST-Tags. Diese Anker können zur Anheftung der Proteine an einen festen Träger, wie z.B. einer Polymermatrix, dienen, die beispielsweise in einer Chromatographiesäule eingefüllt sein kann, oder an einer Mikrotiterplatte oder an einem sonstigen Träger verwendet werden kann.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren in Anwesenheit der zur Herstellung der Enzyme E und/oder F benötigten Organismen durchgeführt, d.h. während der Kultivierung und Wachstum der Organismen, die E und/oder F produzieren, kann die Transaminierung am multizyklischen Ringsystem und/oder gegebenenfalls die Oxidation am Ausgangsringsystem stattfinden. Das Edukt kann direkt zur Anzucht gegeben werden oder nach Anzucht. Der eingesetzte Organismus zur Herstellung der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Enzyme kann immobilisiert oder frei in der Kultur beweglich sein. Dieser eingesetzte Organismus kann ein Prokaryont oder Eukaryont sein. Dabei kann es sich um Säugetierzellen (wie etwa Zellen aus dem Menschen) , um pflanzliche Zellen oder um Mikroorganismen wie Hefen, Pilze oder Bakterien handeln. Vorzugsweise wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren ein Mikroorganismus als Organismus eingesetzt.

Besonders bevorzugt wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren ein Organismus eingesetzt, der ausgewählt wird aus der Gruppe: mindestens einem Mitglied der Gattung Bacillus, mindestens einem Mitglied der Gattung Lactobacillus, mindestens einem Mitglied der Gattung Pseudomonas, mindestens einem Mitglied der Gattung Streptococcus, mindestens einem Mitglied der Gattung Streptomyces, mindestens einem Mitglied der Gattung Hansenula, mindestens einem Mitglied der Gattung Pichia, mindestens einem Mitglied der Gattung Aspergillus, mindestens einem Mitglied der Gattung Escherichia und/oder mindestens einem Mitglied der Gattung Saccharomyces .

Vorteilhaft werden gram-positive oder gram-negative Bakterien, bevorzugt Bakterien der Familien Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae oder Nocardiaceae, besonders bevorzugt Bakterien der Gattungen Escherichia, Corynebacteria, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium oder Rhodococcus verwendet. Ganz besonders bevorzugt sind die Arten Escherichia coli oder Corynebacterium glutamicum. Weitere vorteilhafte Bakterien sind darüber hinaus in der Gruppe der Gram-positiven, alpha-Proteobacterien, beta- Proteobacterien oder gamma-Proteobacterien und weitere vorteilhafte Mikroorganismen in der Gattung Saccharomyces zu finden. Die Enzyme E und F können in dem erfindungsgemäßen Verfahren getrennt voneinander in mindestens zwei unterschiedlichen

Organismen expremiert werden. Bevorzugt ist die gleichzeitige Expression der Enzyme E und F in einem Organismus. Der Organismus kann bereits als Wildtyp das in erfindungsgemäßem Verfahren eingesetzte Enzym auf natürliche Art und Weise expremieren.

Es kann vorteilhaft sein, dass die Aktivität des eingesetzten Enzyms E und/oder F im Organismus erhöht wird. Dies kann z.B. durch Überexpression des Enzyms durch bekannte oder oben beschriebene rekombinante DNA-Techniken erreicht werden, aber beispielsweise auch durch Mutagenese und anschließende

Screening-Verfahren der Organismen auf erhöhte Aktivität. Es kann im erfindungsgemäßen Verfahren ein Organismus eingesetzt werden, welcher als Wildtyp kein einzusetzendes Enzym expremiert aber mit Hilfe von rekombinanten Techniken in die Lage versetzt wurde, ein geeignetes Enzym heterolog zu expremieren. In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das expremierte Enzym vorzugsweise homolog überexpremiert, besonders bevorzugt wird das expremierte Enzym heterolog überexpremiert. Dies kann mit Hilfe einer Expressionskassette erfolgen, in der ein geeigneter Promotor mit einer geeigneten kodierenden Nukleotidsequenz sowie einem Terminator- oder Polyadenylierungssignal fusioniert wurde. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und

Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1989) sowie in TJ. Silhavy, M. L. Berman und L.W. Enquist,

Experiments with Gene Fusions, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al . , Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind. Das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt wird zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen wirtsspezifischen Vektor insertiert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al . , Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen werden.

Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten, expremierten Enzyme können von dem produzierten Organismus sekretiert oder intrazellulär expremiert werden. In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Transaminierung der Ketogruppe und gegebenenfalls die vorherige Oxidation der Hydroxylgruppe während der Kultivierung des Organismus erfolgen oder im Anschluss an die Kultivierung. Der Organismus kann von dem Kulturmedium abgetrennt werden, oder in ihm verbleiben. Im Fall der intrazellulären Expression des eingesetzten Enzyms kann es vorteilhaft sein, die Organismus-Zellen mit den dem Fachmann bekannten Verfahren wie z.B. mit Detergentien, einer french Press oder einer Kugelmühle aufzuschließen.

Aufgrund verfahrenstechnischer Vorteile ist es bevorzugt, dass das Enzym E und/oder F ihre katalytische Funktion in der Zelle ausüben und das Verfahren kontinuierlich in dem Ganzzellkatalysator durchgeführt wird.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Enzym E und/oder F in aufgereinigter Form eingesetzt. Eine Aufreinigung kann mit bekannten, oben beschriebenen oder chromatographischen Verfahren erzielt werden. Das Enzym E und/oder F kann in dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahren immobilisiert, z.B. an Latexkugeln gekoppelt, oder frei in Lösung vorliegen.

Bevorzugtes Lösungsmittel in erfindungsgemäßem Verfahren ist Wasser . Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorteilhaft bei einer

Temperatur zwischen 0 ⁰ C bis 95 ⁰ C, bevorzugt zwischen 10 ⁰ C bis 85 ⁰ C, besonders bevorzugt zwischen 15 ⁰ C bis 75 ⁰ C durchgeführt . Der pH-Wert im erfindungsgemäßen Verfahren wird vorteilhaft zwischen pH 4 und 12, bevorzugt zwischen pH 5 und 10, besonders bevorzugt zwischen pH 6 und 9 gehalten.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann batchweise, semi-batchweise oder kontinuierlich betrieben werden. Es kann vorteilhaft sein, die Reaktionsbedingungen, bevorzugt den pH-Wert, während der enzymatischen Aminierung, dem

Verfahrensschritt B, zu variieren. Auf diese Weise kann das Verhältnis der gebildeten Enantiomere im Produkt beeinflusst bzw. eingestellt werden. Bevorzugt wird daher das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass durch die Variation der Reaktionsbedingungen, bevorzugt den pH-Wertes, das Verhältnis der gebildeten Enantiomere der mindestens eine Aminogruppe tragenden Ringsysteme beeinflusst wird.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann das Enzym F und E für die Oxidation der Hydroxylgruppe und die Transaminierung der Ketogruppe des multizyklischen Ringsystems verwendet werden und gleichzeitig ein Enzym G mit Aminosäuredehydrogenase-Aktivität zur gleichzeitigen Regeneration der Reduktionsäquivalente eingesetzt werden. Abbildung 1 verdeutlicht an beispielhaften Substanzen dieses Prinzip der Cofaktorregeneration . Daher werden in einer weiteren, bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens die durch die enzymatischen

Reaktionen der Enzyme E und F anfallenden Nebenprodukte, wie beispielsweise Reduktionsäquivalente oder Aminogruppendonoren, durch Verwendung mindestens eines Enzyms G mit Aminosäuredehydrogenase-Aktivität, wie beispielsweise Alanin- Dehydrogenase, Phenylalanin-Dehydrogenase, Aspartat- Dehydrogenase und die Serin-Dehydrogenase, insbesondere der Glutamat-Dehydrogenase regeneriert .

Wird in erfindungsgemäßem Verfahren eine Scyllo-Inositol- Transaminasen eingesetzt, so werden bevorzugt zusätzlich die Enzyme Glutamin-Synthetase und ω-Amidase eingesetzt, um Glutamin, den hier eingesetzten Aminogruppendonor zu regenerieren .

Produkte der Transaminierung Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind die mit dem erfindungemäßen Verfahren hergestellten Produkte, also die multizyklischen, mindestens eine Aminogruppe tragenden Ringsysteme .

Bevorzugt ist das mit dem erfindungemäßen Verfahren hergestellte Produkt ein Enantiomeren-Gemisch. Besonders bevorzugt ist das mit dem erfindungemäßen Verfahren hergestellte Produkt ein Enantiomeren-Gemisch enthaltend ein Verhältnis von Diaminoisoidid (III) zu Diaminoisosorbid (II) von 0,5 bis 4, bevorzugt 0,8 bis 3 und besonders bevorzugt von 1 bis 2.

In den nachfolgend aufgeführten Beispielen wird die vorliegende Erfindung beispielhaft beschrieben, ohne dass die Erfindung, deren Anwendungsbreite sich aus der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen ergibt, auf die in den Beispielen genannten Ausführungsformen beschränkt sein soll.

In den nachfolgenden Beispielen 1 bis 3 werden die Darstellung der Diamine (II) - (III) aus der Hexodiulose (VII), die Darstellung der gemischten Diamine/Diole (IX und X) aus dem Monoketon (VIII)

(IX)

und die Darstellung der Diamine (II ^' - (III) direkt aus (V) und (IV) beschrieben .

Beispiele :

Folgende Abbildungen erläutern den Gegenstand des Beispiels: Abbildung 2 zeigt das HPLC-Chromatogramm der Standards Diaminoisoidid (III) (0,5 g/l) und Diaminoisosorbid (II) (0,5 g/l) und Diaminoisomannit (I) . Abbildung 3 zeigt das HPLC-Chromatogramm der reduktiven Aminierung mit den Produkten Diaminoisosorbid, Diaminoisoidid und Spuren vom Diaminoisomannid bei pH 7,2.

Abbildung 4 zeigt das HPLC-Chromatogramm der Auftrennung des Reaktionsgemisches aus Aminotransferase BtrR und Diulose (VII) als Substrat bei pH 9. Abbildung 5 zeigt das HPLC-Chromatogramm der Auftrennung des

Reaktionsgemisches aus Aminotransferase BtrR und und Monoketon (VIII) als Substrat bei pH 9.

Abbildung 6 zeigt das HPLC Chromatogramm der Auftrennung des Reaktionsgemisches aus einer Aminotransferase aus Vibrio fluvialis und Diulose (VII) als Substrat.

Abbildung 7 zeigt das HPLC Chromatogramm der Auftrennung des Reaktionsgemisches aus einer Aminotransferase aus Bacillus megaterium und Diulose (VII) als Substrat. Abbildung 8 zeigt das HPLC Chromatogramm der Auftrennung des

Reaktionsgemisches aus einer Aminotransferase aus Alcaligenes denitrificans und Diulose (VII) als Substrat.

Abbildung 9 zeigt das HPLC Chromatogramm der Auftrennung des Reaktionsgemisches aus einer Aminotransferase aus

Chromobacterium violaceum und Diulose (VII) als Substrat.

Abbildung 10 zeigt das HPLC Chromatogramm der Auftrennung des

Reaktionsgemisches aus einer Aminotransferase aus Anthrobacter sp. und Diulose (VII) als Substrat. Abbildung 11 zeigt das HPLC Chromatogramm der Auftrennung des

Reaktionsgemisches aus einer Aminotransferase aus Vibrio fluvialis und Diulose (VII) als Substrat.

Abbildung 12 zeigt das HPLC Chromatogramm der Auftrennung des

Reaktionsgemisches aus einer Aminotransferase aus Pseudomonas putida und Diulose (VII) als Substrat.

Abbildung 13 zeigt das HPLC Chromatogramm der Auftrennung des

Reaktionsgemisches aus einer Aminotransferase aus Pseudomonas putida und Diulose (VII) als Substrat.

Abbildung 14 zeigt das HPLC Chromatogramm der Auftrennung des Reaktionsgemisches aus einer Aminotransferase aus Pseudomonas putida und Diulose (VII) als Substrat.

Abbildung 15 zeigt das HPLC Chromatogramm der Auftrennung des

Reaktionsgemisches aus einer Aminotransferase aus

Chromobacterium violaceum und Diulose (VII) als Substrat. Abbildung 16 zeigt das HPLC Chromatogramm der Auftrennung des

Reaktionsgemisches aus einer Aminotransferase aus Rhodobacter sphaeroides und Diulose (VII) als Substrat.

Abbildung 17 zeigt das HPLC Chromatogramm der Auftrennung des

Reaktionsgemisches aus einer Aminotransferase aus Paracoccus denitrificans und Diulose (VII) als Substrat. Abbildung 18 zeigt das HPLC Chromatogramm der Auftrennung des Reaktionsgemisches aus einer Aminotransferase aus Mesorhizobium loti und Diulose (VII) als Substrat.

Abbildung 19 zeigt das HPLC Chromatogramm der Auftrennung des Reaktionsgemisches aus einer Aminotransferase aus Rhodobacter sphaeroides und Diulose (VII) als Substrat.

Beispiel 1: Synthese von Diaminoisosorbid (II) und Diaminoisoidid (III) ausgehend von der Diulose (VII) mit der Aminotransferase BtrR aus Bacillus circulans Das Gen der Aminotransferase BtrR wurde bei Geneart synthetisiert, dabei wurde die Codonnutzung von Escherichia coli berücksichtigt, vgl. SEQ ID NO: 5. Zusätzlich enthielt die synthetisierte Sequenz eine EcoRI-Schnittstelle am 5' -Ende und eine Pstl-Schnittstelle am 3' -Ende (siehe Sequenz im Anhang) . Das Gen wurde integriert in den Vector pGA4 (ampR) geliefert. Für die Klonierung in den Vector pACYC-Duet-1 wurde btrR mit den Restriktionsenzymen EcoRI und PstI aus pGA4 herausgeschnitten. Der Ligationsansatz von btrR und pACYC-Duet-1 wurde zunächst in E. coli DH5α und nach Kontrollsequenzierung des Gens in den Zielorganismus E. coli BL21 (DE3) kloniert. Das rekombinante Plasmid trägt die Bezeichnung pACYC-Duetl : :btrR Durch die Klonierung von btrR in die MCSl von pACYC-Duetl wird eine (His)6~Tag Fusion am N-Terminus des Proteins eingeführt.

Für die Aufreinigung des Proteins BtrR-(His)δ wurde E. coli BL21 in LB-Medium kultiviert. Die Expression von btrR wurde in der exponentiellen Wachstumsphase OD 0,4-0,6 durch Zugabe von IPTG (Endkonzentration 1 mM) induziert. Nach einer Inkubationszeit von 6 h wurde die Kultur geerntet und das Zellpellet mit

BugBuster-Reagenz aufgeschlossen. Die Aminotransferase BtrR- (His)δ wurde über Ni-Chelat Affinitätschromatographie (His-bind columns, Novagen) nach Angaben des Säulenherstellers aufgereinigt . Das aufgereinigte Enzym wurde direkt in den

Enzymtest zur Umsetzung der Diulose eingesetzt. Die Produkte wurden anschließen über HPLC mit FMOC-Derivatisierung nachgewiesen .

Der Enzymtest setzte sich wie folgt zusammen:

Zusammensetzung des Enzymtests

Nach einer Inkubationszeit von 72 h wurde die Probe durch eine Filtrationseinheit mit einer Ausschlussgröße von 10 kDa filtriert, um das Protein zu entfernen. In der FMOC-HPLC wurde eine Diaminoisoidid-Konzentration von 8,46 mg/1 und eine Diaminosorbid-Konzentration von 6,3 mg/1 gemessen. Unter diesen Bedingungen lag das Verhältnis von Diaminoisoidid (III) zu Diaminoisosorbid (II) bei 1,34. Das Verhältnis (III) : (II) konnte durch Erniedrigung des pH-Wertes zur vermehrten Synthese von Diaminoisoidid verschoben werden. Bei einem pH-Wert von 7,2 wurde ein Verhältnis Diaminoisoidid : Diaminoisosorbid von 1,8 erhalten (2,28 g/l vs . 1,27 g/l) . Abbildung 2 zeigt das Chromatogramm der Standards Diaminoisosidid (0,5 g/l) und Diaminoisosorbid (0,5 g/l)

In Abbildung 3 ist die Auftrennung des Reaktionsgemisches aus Aminotransferase BtrR und Diulose (VII) als Substrat bei pH 9, in Abbildung 4 die Auftrennung des Reaktionsgemisches aus Aminotransferase BtrR und Diulose (VII) als Substrat bei pH 7,2 gezeigt .

Bei der Aminierung der Diulose (VII) entstehen zum Grossteil die Diamine (II) und (III) und nur in sehr geringer Menge das Diamin

(D •

Durch Variation des pH-Wertes während der enzymatischen Aminierung konnte somit das Verhältnis zwischen Stereoisomer (II) und Stereoisomer (III) verändert werden.

Beispiel 2: Aminierung des Monoketons (VIII) mit

Aminotransferase BtrR aus B. circulans .

Der Enzymtest setzt sich zusammen wie in Beispiel 1 beschrieben.

Anstelle der Diulose wird Monoketon (VIII) mit einer

Endkonzentration von 50 mM eingesetzt.

Zusammensetzung des Enzymtests

Abbildung 5 zeigt das HPLC-Diagramm der Auftrennung des Reaktionsgemisches aus Aminotransferase BtrR und Monoketon (VIII) als Substrat bei pH 9. Bei der Aminierung des Monoketons (VIII), wird entsprechend des Beispiel 1 mehr (X) als (IX) erhalten.

Beispiel 3: Umsetzung zum Diamin ausgehend vom Isosorbid mit einer gekoppelten Reaktion

Um eine Umsetzung vom Isosorbid zum Diamin zu erreichen, wird eine Reaktion mit Zellextrakt aus Pichia guillermondii und aufgereinigtem BtrR-His Protein angesetzt. Neben der direkten Synthese vom Isosorbid über die Diulose zum Diamin erfolgt die Synthese auch über die Zwischenstufen Monoketon-Monoalkohol, Monoamin-Monoalkohol, Monoamin-Monoketon zum Diamin. Der Zellextrakt von P. guillermondii wird wie folgt hergestellt:

0,43 g Zellfeuchtmasse wurden in einem Reaktionsgefäß (Füllmenge 1,5 ml) mit ImI 0,lmol/l Tris / HCl Puffer pH 7,2 resuspendiert. Zu dieser Zellsuspension wurden 1 g Glasperlen (0,25 - 0,3 mm Durchmesser) gegeben und dann 2x 5 min bei einer Frequenz l/30s in der Kugelmühle (Retsch) aufgeschlossen. Vor dem zweiten 5 min-Lauf wurde das Reaktionsgefäß kurz auf Eis gestellt um Reibungswärme abzuführen. Danach wurde 10min bei 13200xg zentrifugiert und der Überstand vorsichtig abgenommen. Nach einer Inkubationszeit von 72 h werden die Proben über Filtrationseinheiten mit einer Ausschlussgröße von 30 kDa in einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Um eine Rückreaktion der „Isosorbid"-Dehydrogenase zu vermeiden und NAD ⁺ zu regenerieren, wird Pyruvat und L-Lactatdehydrogenase eingesetzt. Der Enzymtest setzt sich wie folgt zusammen:

Puffer und Lösungen Endkonzentration im Ansatz

Über HPLC-Analyse können die Monoamin-Zwischenprodukte (IX) und (X) und die Diamine (II) und (III) identifiziert werden. Es konnte die Oxidation von Isosorbid (V) und Isomannid (IV) bis hin zur Diulose (VII) erreicht werden. Mit der rekombinant expremierten Transaminase wurde das Produkt der Oxidation (die Diulose (VII)) zu den Diamin (II) und (III) bzw. die Zwischenprodukte der Oxidation (z.B. das Monoketon (VIII) zu den Monoaminen (IX) und (X) aminiert.

Somit wurde sowohl die enzymatische Oxidation sowohl der exoständigen als auch der endoständigen sekundären Hydroxylgruppen von Dianhydrohexitolen erreicht als auch die enzymatische Aminierung der Produkte dieser Reaktionen. Dabei konnten Aminogruppen sowohl in exo- als auch in endo-Stellung erhalten werden.

Beispiel 4: Herstellung einer Äminotransferase aus Vibrio fluvialis und Aminierung der Diulose (VII) mit dieser. Das Gen der Aminotransferase aus Vibrio fluvialis (SEQ ID NO: 6) wurde bei Geneart synthetisiert; dabei wurde die Codonnutzung von Escherichia coli berücksichtigt. Zusätzlich enthielt die synthetisierte Sequenz eine Wdel-Schnittstelle am 5' -Ende und eine Xhol-Schnittstelle am 3' -Ende. Das Gen wurde integriert in den Vector pET21a geliefert.

Der Vektor mit dem Zielgen wurde anschließend in den Zielorganismus E. coli BL21 (DE3) kloniert. Die Expression des Aminotransferasegens wurde in der exponentiellen Wachstumsphase bei ODεoo 0,7 durch Zugabe von IPTG (Endkonzentration 1 mM) induziert. Nach einer Inkubationszeit von 3 h wurde die Kultur geerntet und das Zellpellet lyophilisiert. Lyophilisat aus 20 mg Zellen wurde nach Rehydrierung in 100 mM Natriumphosphatpuffer (pH7) direkt in den Enzymtest zur Umsetzung der Diulose eingesetzt. Die Produkte wurden anschließen über HPLC mit FMOC-Derivatisierung nachgewiesen . Der Enzymtest setzte sich wie folgt zusammen:

Zusammensetzung des Enzymtests

Nach einer Inkubationszeit von 24 h wurde die Probe durch eine Filtrationseinheit mit einer Au s s ch Iu s s gr öß e von 10 kDa filtriert, um das Protein und das Zelllysat zu entfernen. Anschließend wird der Ansatz nach FMOC Derivatisierung mittels HPLC vermessen. Abbildung 6 zeigt das HPLC Chromatogramm der Auftrennung des Reaktionsgemisches aus einer Aminotransferase aus Vibrio fluvialis und Diulose (VII) als Substrat.

Beispiel 5: Herstellung einer Aminotransferase aus Bacillus megaterium und Aminierung der Diulose (VII) mit dieser. Das Gen der (SEQ ID NO: 8) Aminotransferase aus Bacillus megaterium wurde bei Geneart synthetisiert; dabei wurde die Codonnutzung von Escherichia coli berücksichtigt. Zusätzlich enthielt die synthetisierte Sequenz eine Wdel-Schnittstelle am 5' -Ende und eine Xhol-Schnittstelle am 3' -Ende. Das Gen wurde integriert in den Vector pET21a geliefert. Der Vektor mit dem Zielgen wurde anschließend in den Zielorganismus E. coli BL21 (DE3) kloniert. Die Expression des Aminotransferasegens wurde in der exponentiellen Wachstumsphase bei OD ₆ oo 0,7 durch Zugabe von IPTG (Endkonzentration 1 mM) induziert. Nach einer Inkubationszeit von 3 h wurde die Kultur geerntet und das Zellpellet lyophilisiert. Lyophilisat aus 20 mg Zellen wurde nach Rehydrierung in 100 mM Natriumphosphatpuffer (pH7) direkt in den Enzymtest zur Umsetzung der Diulose eingesetzt. Die Produkte wurden anschließen über HPLC mit FMOC-Derivatisierung nachgewiesen . Der Enzymtest setzte sich wie folgt zusammen:

Zusammensetzung des Enzymtests

Nach einer Inkubationszeit von 24 h wurde die Probe durch eine Filtrationseinheit mit einer Ausschlussgröße von 10 kDa filtriert, um das Protein und das Zelllysat zu entfernen. Anschließend wird der Ansatz nach FMOC Derivatisierung mittels HPLC vermessen. Abbildung 7 zeigt das HPLC Chromatogramm der Auftrennung des Reaktionsgemisches aus einer Aminotransferase aus Bacillus megaterium und Diulose (VII) als Substrat.

Beispiel 6: Herstellung einer Aminotransferase aus Alcaligenes denitrificans und Aminierung der Diulose (VII) mit dieser. Das Gen (SEQ ID NO: 10) der Aminotransferase aus Alcaligenes denitrificans wurde bei Geneart synthetisiert; dabei wurde die Codonnutzung von Escherichia coli berücksichtigt. Zusätzlich enthielt die synthetisierte Sequenz eine Wdel-Schnittstelle am 5' -Ende und eine Xhol-Schnittstelle am 3' -Ende. Das Gen wurde integriert in den Vector pET21a geliefert. Der Vektor mit dem Zielgen wurde anschließend in den Zielorganismus E. coli BL21 (DE3) kloniert. Die Expression des Aminotransferasegens wurde in der exponentiellen Wachstumsphase bei OD600 0,7 durch Zugabe von IPTG (Endkonzentration 1 mM) induziert. Nach einer Inkubationszeit von 3 h wurde die Kultur geerntet und das Zellpellet lyophilisiert. Lyophilisat aus 20 mg Zellen wurde nach Rehydrierung in 100 mM Natriumphosphatpuffer (pH7) direkt in den Enzymtest zur Umsetzung der Diulose eingesetzt. Die Produkte wurden anschließen über HPLC mit FMOC-Derivatisierung nachgewiesen . Der Enzymtest setzte sich wie folgt zusammen:

Zusammensetzung des Enzymtests

Nach einer Inkubationszeit von 24 h wurde die Probe durch eine Filtrationseinheit mit einer Ausschlussgröße von 10 kDa filtriert, um das Protein und das Zelllysat zu entfernen. Anschließend wird der Ansatz nach FMOC Derivatisierung mittels HPLC vermessen. Abbildung 8 zeigt das HPLC Chromatogramm der Auftrennung des Reaktionsgemisches aus einer Aminotransferase aus Älcaligenes denitrificans und Diulose (VII) als Substrat.

Beispiel 7: Herstellung einer Aminotransferase aus Chromobacter violaceum und Aminierung der Diulose (VII) mit dieser. Das Gen (SEQ ID NO: 12) der Aminotransferase aus Chromobacter violaceum wurde bei Geneart synthetisiert; dabei wurde die Codonnutzung von Escherichia coli berücksichtigt. Zusätzlich enthielt die synthetisierte Sequenz eine Wdel-Schnittstelle am 5' -Ende und eine Xhol-Schnittstelle am 3' -Ende. Das Gen wurde integriert in den Vector pET21a geliefert. Der Vektor mit dem Zielgen wurde anschließend in den Zielorganismus E. coli BL21 (DE3) kloniert. Die Expression des Aminotransferasegens wurde in der exponentiellen Wachstumsphase bei OD ₆ oo 0,7 durch Zugabe von IPTG (Endkonzentration 1 mM) induziert. Nach einer Inkubationszeit von 3 h wurde die Kultur geerntet und das Zellpellet lyophilisiert. Lyophilisat aus 20 mg Zellen wurde nach Rehydrierung in 100 mM Natriumphosphatpuffer (pH7) direkt in den Enzymtest zur Umsetzung der Diulose eingesetzt. Die Produkte wurden anschließen über HPLC mit FMOC-Derivatisierung nachgewiesen . Der Enzymtest setzte sich wie folgt zusammen:

Zusammensetzung des Enzymtests

Nach einer Inkubationszeit von 24 h wurde die Probe durch eine Filtrationseinheit mit einer Ausschlussgröße von 10 kDa filtriert, um das Protein und das Zelllysat zu entfernen. Anschließend wird der Ansatz nach FMOC Derivatisierung mittels HPLC vermessen. Abbildung 9 zeigt das HPLC Chromatogramm der Auftrennung des Reaktionsgemisches aus einer Aminotransferase aus Chromobacterium violaceum und Diulose (VII) als Substrat.

Beispiel 8: Herstellung einer Aminotransferase aus Arthrobacter sp . und Aminierung der Diulose (VII) mit dieser. Das Gen (SEQ ID NO: 14) der Aminotransferase aus Arthrobacter sp. wurde bei Geneart synthetisiert; dabei wurde die Codonnutzung von Escherichia coli berücksichtigt. Zusätzlich enthielt die synthetisierte Sequenz eine Wdel-Schnittstelle am 5' -Ende und eine Xhol-Schnittstelle am 3' -Ende. Das Gen wurde integriert in den Vector pET21a geliefert. Der Vektor mit dem Zielgen wurde anschließend in den Zielorganismus E. coli BL21 (DE3) kloniert.

Die Expression des Aminotransferasegens wurde in der exponentiellen Wachstumsphase bei OD ₆ oo 0,7 durch Zugabe von IPTG (Endkonzentration 1 mM) induziert. Nach einer Inkubationszeit von 3 h wurde die Kultur geerntet und das Zellpellet lyophilisiert. Lyophilisat aus 20 mg Zellen wurde nach

Rehydrierung in 100 mM Natriumphosphatpuffer (pH7) direkt in den Enzymtest zur Umsetzung der Diulose eingesetzt. Die Produkte wurden anschließen über HPLC mit FMOC-Derivatisierung nachgewiesen . Der Enzymtest setzte sich wie folgt zusammen:

Zusammensetzung des Enzymtests

Nach einer Inkubationszeit von 24 h wurde die Probe durch eine Filtrationseinheit mit einer Ausschlussgröße von 10 kDa filtriert, um das Protein und das Zelllysat zu entfernen. Anschließend wird der Ansatz nach FMOC Derivatisierung mittels HPLC vermessen. Abbildung 10 zeigt das HPLC Chromatogramm der Auftrennung des Reaktionsgemisches aus einer Aminotransferase aus Arthrobacter sp . und Diulose (VII) als Substrat.

Beispiel 9: Herstellung einer Aminotransferase aus Vibrio fluvialis und Aminierung der Diulose (VII) mit dieser. Das Gen (SEQ ID NO: 16) der Aminotransferase aus Vibrio fluvialis wurde bei Geneart synthetisiert. Zusätzlich enthielt die synthetisierte Sequenz eine Wdel-Schnittstelle am 5' -Ende und eine Hindlll-Schnittstelle am 3' -Ende. Das Gen wurde in den Vector pOM17c integriert.

Der Vektor mit dem Zielgen wurde anschließend in den Zielorganismus E. coli BL21 (DE3) kloniert. Die Expression des Aminotransferasegens wurde in der exponentiellen Wachstumsphase bei OD ₆ oo 0,5 durch Zugabe von IPTG (Endkonzentration 1 mM) induziert. Nach einer Inkubationszeit von 5 h wurde die Kultur geerntet und abzentrifugiert . Nachdemm das Zellpellet in 100 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) aufgenommen wurde, wurden die Zellen mittels Kugelmühle aufgeschlossen und der Rohextrakt durch anschließende Zentrifugation gewonnen. Der Rohextrakt wurde anschließend direkt in den Enzymtest zur Umsetzung der Diulose eingesetzt, Die Produkte wurden anschließen über HPLC mit FMOC- Derivatisierung nachgewiesen. Der Enzymtest setzte sich wie folgt zusammen:

Zusammensetzung des Enzymtests

Nach einer Inkubationszeit von 24 h wurde die Reaktion gestoppt und der Ansatz nach FMOC Derivatisierung mittels HPLC vermessen. Abbildung 11 zeigt das HPLC Chromatogramm der Auftrennung des Reaktionsgemisches aus einer Aminotransferase aus Vibrio fluvialis und Diulose (VII) als Substrat.

Beispiel 10: Herstellung einer Aminotransferase aus Pseudomonas putida und Aminierung der Diulose (VII) mit dieser. Das Gen (SEQ ID NO: 18) der Aminotransferase wurde aus genomischer DNA von Pseudomonas putida amplifiziert und nachfolgend in einen pASK-IBA5+ Vektor mit N-terminalem Strep- tag II unter Entfernung des Start-ATGs des Aminotransferasegens kloniert. Dabei wurden die Schnittstellen Ehel und Hindi I I verwendet . Der Vektor mit dem Zielgen wurde anschließend zur Transformation des Zielorganismus E. coli BL21 eingesetzt.

Die Expression der Aminotransferase wurde in der exponentiellen Wachstumsphase bei OD ₅₅₀ 0,5 durch Zugabe von 0,2 μg/ml AHT induziert. Nach einer Induktionszeit von 3 h wurde die Kultur geerntet, in 25 mM Hepes/NaOH, pH 8,3 aufgenommen, und die Zellen wurden mittels French-Press aufgeschlossen. Anschließend wurde die mit einen Strep-tag II-fusionierten Aminotransferase mittels Streptavidin-Sepharose gereinigt und über Nacht gegen 25 mM Hepes/NaOH, pH 8,3 dialysiert. Dann wurde das gereinigte Enzyem direkt in dem Enzymtest zur Transaminierung der Diulose eingesetzt . Der Enzymtest setzte sich wie folgt zusammen:

Zusammensetzung des Enzymtests

Anschließend wurde der Ansatz nach FMOC Derivatisierung mittels HPLC vermessen. Abbildung 12 zeigt das HPLC Chromatogramm der Auftrennung des Reaktionsgemisches der enzymatischen Umsetzung der Diulose (VII) durch eine Aminotransferase aus Pseudomonas putida .

Beispiel 11: Herstellung einer Aminotransferase aus Pseudomonas putida und Aminierung der Diulose (VII) mit dieser. Das Gen (SEQ ID NO: 20) der Aminotransferase aus Pseudomoas putida wurde aus genomischer DNA kloniert. Zusätzlich enthielt die klonierte Sequenz eine Λ/del-Schnittstelle am 5' -Ende und eine Xhol-Schnittstelle am 3' -Ende. Das Gen wurde in den Vector pET21a(+) integriert.

Der Vektor mit dem Zielgen wurde anschließend in den Zielorganismus E. coli BL21 (DE3) kloniert. Die Expression des Aminotransferasegens wurde in der exponentiellen Wachstumsphase bei ODεoo 0,5 durch Zugabe von IPTG (Endkonzentration 1 mM) induziert. Nach einer Inkubationszeit von 5 h wurde die Kultur geerntet und abzentrifugiert . Nachdemm das Zellpellet in 100 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) aufgenommen wurde, wurden die Zellen mittels Kugelmühle aufgeschlossen und der Rohextrakt durch anschließende Zentrifugation gewonnen. Der Rohextrakt wurde anschließend direkt in den Enzymtest zur Umsetzung der Diulose eingesetzt. Die Produkte wurden anschließen über HPLC mit FMOC- Derivatisierung nachgewiesen. Der Enzymtest setzte sich wie folgt zusammen:

Zusammensetzung des Enzymtests

Nach einer Inkubationszeit von 24 h wurde die Reaktion gestoppt und der Ansatz nach FMOC Derivatisierung mittels HPLC vermessen. Abbildung 13 zeigt das HPLC Chromatogramm der Auftrennung des Reaktionsgemisches aus einer Aminotransferase aus Pseudomoas putida und Diulose (VII) als Substrat.

Beispiel 12: Herstellung einer Aminotransferase aus Pseudomonas putida und Aminierung der Diulose (VII) mit dieser. Das Gen (SEQ ID NO: 22) der Aminotransferase aus Pseudomoas putida wurde aus genomischer DNA kloniert. Zusätzlich enthielt die klonierte Sequenz eine Λ/del-Schnittstelle am 5' -Ende und eine Xhol-Schnittstelle am 3' -Ende. Das Gen wurde in den Vector pET21a(+) integriert. Der Vektor mit dem Zielgen wurde anschließend in den Zielorganismus E. coli BL21 (DE3) kloniert. Die Expression des Aminotransferasegens wurde in der exponentiellen Wachstumsphase bei OD600 0,5 durch Zugabe von IPTG (Endkonzentration 1 mM) induziert. Nach einer Inkubationszeit von 5 h wurde die Kultur geerntet und abzentrifugiert . Nachdemm das Zellpellet in 100 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) aufgenommen wurde, wurden die Zellen mittels Kugelmühle aufgeschlossen und der Rohextrakt durch anschließende Zentrifugation gewonnen. Der Rohextrakt wurde anschließend direkt in den Enzymtest zur Umsetzung der Diulose eingesetzt. Die Produkte wurden anschließen über HPLC mit FMOC- Derivatisierung nachgewiesen. Der Enzymtest setzte sich wie folgt zusammen:

Zusammensetzung des Enzymtests

Nach einer Inkubationszeit von 24 h wurde die Reaktion gestoppt und der Ansatz nach FMOC Derivatisierung mittels HPLC vermessen. Abbildung 14 zeigt das HPLC Chromatogramm der Auftrennung des Reaktionsgemisches aus einer Aminotransferase aus Pseudomoas putida und Diulose (VII) als Substrat.

Beispiel 13: Herstellung einer Aminotransferase aus Chromobacterium violaceum und Aminierung der Diulose (VII) mit dieser.

Das Gen (SEQ ID NO: 24) der Aminotransferase aus Chromobacterium violaceum wurde aus genomischer DNA kloniert. Zusätzlich enthielt die klonierte Sequenz eine Wdel-Schnittstelle am 5'- Ende und eine Xhol-Schnittstelle am 3' -Ende. Das Gen wurde in den Vector pET29a integriert.

Der Vektor mit dem Zielgen wurde anschließend in den Zielorganismus E. coli BL21 (DE3) kloniert. Die Expression des Aminotransferasegens wurde in der exponentiellen Wachstumsphase bei OD ₆ oo 0,5 durch Zugabe von IPTG (Endkonzentration 1 mM) induziert. Nach einer Inkubationszeit von 5 h wurde die Kultur geerntet und abzentrifugiert . Nachdemm das Zellpellet in 100 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) aufgenommen wurde, wurden die Zellen mittels Kugelmühle aufgeschlossen und der Rohextrakt durch anschließende Zentrifugation gewonnen. Der Rohextrakt wurde anschließend direkt in den Enzymtest zur Umsetzung der Diulose eingesetzt, Die Produkte wurden anschließen über HPLC mit FMOC- Derivatisierung nachgewiesen. Der Enzymtest setzte sich wie folgt zusammen:

Zusammensetzung des Enzymtests

Nach einer Inkubationszeit von 24 h wurde die Reaktion gestoppt und der Ansatz nach FMOC Derivatisierung mittels HPLC vermessen. Abbildung 15 zeigt das HPLC Chromatogramm der Auftrennung des Reaktionsgemisches aus einer Aminotransferase aus Chromobacterium violaceum und Diulose (VII) als Substrat.

Beispiel 14: Herstellung einer Aminotransferase aus Rhodobacter sphaeroides und Aminierung der Diulose (VII) mit dieser. Das Gen (SEQ ID NO: 26) der Aminotransferase wurde aus genomischer DNA von Rhodobacter sphaeroides amplifiziert und nachfolgend in einen pASK-IBA5+ Vektor mit N-terminalem Strep- tag II unter Entfernung des Start-ATGs des Aminotransferasegens kloniert. Dabei wurden die Schnittstellen Ehel und Hindi I I verwendet . Der Vektor mit dem Zielgen wurde anschließend zur Transformation des Zielorganismus E. coli BL21 eingesetzt.

Die Expression der Aminotransferase wurde in der exponentiellen Wachstumsphase bei OD ₅₅₀ 0,5 durch Zugabe von 0,2 μg/ml AHT induziert. Nach einer Induktionszeit von 3 h wurde die Kultur geerntet, in 25 mM Hepes/NaOH, pH 8,3 aufgenommen, und die Zellen wurden mittels French-Press aufgeschlossen. Anschließend wurde die mit einen Strep-tag II-fusionierten Aminotransferase mittels Streptavidin-Sepharose gereinigt und über Nacht gegen 25 mM Hepes/NaOH, pH 8,3 dialysiert. Dann wurde das gereinigte Enzyem direkt in dem Enzymtest zur Transaminierung der Diulose eingesetzt . Der Enzymtest setzte sich wie folgt zusammen:

Zusammensetzung des Enzymtests

Anschließend wurde der Ansatz nach FMOC Derivatisierung mittels HPLC vermessen. Abbildung 16 zeigt das HPLC Chromatogramm der Auftrennung des Reaktionsgemisches der enzymatischen Umsetzung der Diulose (VII) durch eine Aminotransferase aus Rhodobacter sphaeroides .

Beispiel 15: Herstellung einer Aminotransferase aus Paracoccus denitrificans und Aminierung der Diulose (VII) mit dieser. Das Gen (SEQ ID NO: 28) der Aminotransferase aus Paracoccus denitrificans wurde aus genomischer DNA kloniert. Zusätzlich enthielt die klonierte Sequenz eine Λ/del-Schnittstelle am 5'- Ende und eine Xhol-Schnittstelle am 3' -Ende. Das Gen wurde in den Vector pET21a(+) integriert.

Der Vektor mit dem Zielgen wurde anschließend in den Zielorganismus E. coli BL21 (DE3) kloniert. Die Expression des Aminotransferasegens wurde in der exponentiellen Wachstumsphase bei ODεoo 0,5 durch Zugabe von IPTG (Endkonzentration 1 mM) induziert. Nach einer Inkubationszeit von 5 h wurde die Kultur geerntet und abzentrifugiert . Nachdemm das Zellpellet in 100 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) aufgenommen wurde, wurden die Zellen mittels Kugelmühle aufgeschlossen und der Rohextrakt durch anschließende Zentrifugation gewonnen. Der Rohextrakt wurde anschließend direkt in den Enzymtest zur Umsetzung der Diulose eingesetzt. Die Produkte wurden anschließen über HPLC mit FMOC- Derivatisierung nachgewiesen. Der Enzymtest setzte sich wie folgt zusammen:

Zusammensetzung des Enzymtests

Nach einer Inkubationszeit von 24 h wurde die Reaktion gestoppt und der Ansatz nach FMOC Derivatisierung mittels HPLC vermessen. Abbildung 17 zeigt das HPLC Chromatogramm der Auftrennung des Reaktionsgemisches aus einer Aminotransferase aus Paracoccus denitrificans und Diulose (VII) als Substrat.

Beispiel 16: Herstellung einer Aminotransferase aus Mesorhizobium loti und Aminierung der Diulose (VII) mit dieser. Das Gen (SEQ ID NO: 30) der Aminotransferase wurde aus genomischer DNA von Mesorhizobium loti DSM 2626 amplifiziert und nachfolgend in einen pASK-IBA35+-Vektor mit N-terminalem His ₆ ~tag unter Entfernung des N-terminalen ATG des Aminotransferasegens inseriert. Dabei wurden die Schnittstellen Ehel und Kpnl verwendet .

Der Vektor mit dem Zielgen wurde anschließend zur Transfomation des Zielorganismus E. coli BL21 verwendet. Die Expression der Aminotransferase wurde in der exponientiellen Wachstumsphase bei OD ₅₅ O 0,5 durch Zugabe von 0,2 μg/ml AHT induziert. Nach einer Induktionszeit von 3 h wurde die Kultur geerntet und die Zellen in 40 mM Hepes/NaOH, pH 7.5 aufgenommen und mittels French Press aufgeschlossen. Anschließend wurde die mit einem His6~tag-fusionierte Aminotransferase mittels Zn ²⁺ - aktivierter Iminodiacetic-Sepharose gereinigt und mittels Gelfiltration an Superdex200 in 25 mM Hepes/NaOH, pH 8, 3 umgepuffert. Dann wurde das gereinigte Enzym direkt in den Enzymtest zur Transaminierung der Diulose eingesetzt. Der Enzymtest setzte sich wie folgt zusammen:

Anschließend wurde der Ansatz nach FMOC Derivatisierung mittels HPLC vermessen. Abbildung 18 zeigt das HPLC Chromatogramm der Auftrennung des Reaktionsgemisches der enzymatischen Umsetzung der Diulose (VII) durch eine Aminotransferase aus Mesorhizobium loti.

Beispiel 17: Herstellung einer Aminotransferase aus Rhodobacter sphaeroides und Aminierung der Diulose (VII) mit dieser. Das Gen (SEQ ID NO: 32) der Ami no t r an s f e r a s e wurde aus genomischer DNA von Rhodobacter sphaeroides DSM 158 amplifiziert und nachfolgend in einen pASK-IBA35+-Vektor mit N-terminalem His ₆ ~tag unter Entfernung des N-terminalen ATG des Aminotransferasegens inseriert. Dabei wurden die Schnittstellen Ehel und Hindi I I verwendet.

Der Vektor mit dem Zielgen wurde anschließend zur Transfomation des Zielorganismus E. coli BL21 verwendet.

Die Expression der Aminotransferase wurde in der exponientiellen Wachstumsphase bei OD ₅₅₀ 0,5 durch Zugabe von 0,2 μg/ml AHT induziert. Nach einer Induktionszeit von 3 h wurde die Kultur geerntet und die Zellen in 40 mM Hepes/NaOH, pH 7.5 aufgenommen und mittels French Press aufgeschlossen. Anschließend wurde die mit einem His6-tag-fusionierte Aminotransferase mittels Zn ²⁺ - aktivierter Iminodiacetic-Sepharose gereinigt und mittels Gelfiltration an Superdex200 in 25 mM Hepes/NaOH, pH 8,3 umgepuffert. Dann wurde das gereinigte Enzym direkt in den Enzymtest zur Transaminierung der Diulose eingesetzt. Der Enzymtest setzte sich wie folgt zusammen:

Anschließend wurde der Ansatz nach FMOC Derivatisierung mittels HPLC vermessen. Abbildung 19 zeigt das HPLC Chromatogramm der Auftrennung des Reaktionsgemisches der enzymatischen Umsetzung der Diulose (VII) durch eine Aminotransferase aus Rhodobacter sphaeroides .