Login| Sign Up| Help| Contact|

Patent Searching and Data


Title:
METHOD FOR PRODUCING NANOCELLULOSES FROM A CELLULOSE SUBSTRATE
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2016/193617
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention concerns a method for producing nanocelluloses from a cellulose substrate comprising cellulose fibres, said method comprising the following sequence of steps: - a step of enzymatic treatment of said cellulose substrate, by bringing same into contact with at least one cleaving enzyme, then - a step of mechanical treatment of said cellulose substrate subjected to said step of enzymatic treatment, in order to delaminate said cellulose fibres and obtain said nanocelluloses, characterised in that said at least one cleaving enzyme is chosen from the enzymes belonging to the family of lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) capable of achieving cleavage in the presence of an electron donor. The invention also relates to the nanocelluloses obtained according to said method. No figure.

Inventors:
CATHALA BERNARD (FR)
VILLARES ANA (FR)
BERRIN JEAN-GUY (FR)
MOREAU CÉLINE (FR)
Application Number:
PCT/FR2016/051306
Publication Date:
December 08, 2016
Filing Date:
June 01, 2016
Export Citation:
Click for automatic bibliography generation   Help
Assignee:
INST NAT DE LA RECH AGRONOMIQUE - INRA (FR)
International Classes:
D21C5/00; B82Y40/00; C08L1/04; C12P19/04; D21B1/02; D21H11/18
Domestic Patent References:
WO2014029909A12014-02-27
WO2007091942A12007-08-16
WO2014085730A12014-06-05
WO2014077854A12014-05-22
WO2007091942A12007-08-16
Foreign References:
US20020040134A12002-04-04
US4483743A1984-11-20
US4483743A1984-11-20
US4486743A1984-12-04
Other References:
M. EIBINGER ET AL: "Cellulose Surface Degradation by a Lytic Polysaccharide Monooxygenase and Its Effect on Cellulase Hydrolytic Efficiency", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 289, no. 52, 26 December 2014 (2014-12-26), US, pages 35929 - 35938, XP055230517, ISSN: 0021-9258, DOI: 10.1074/jbc.M114.602227
J. W. AGGER ET AL: "Discovery of LPMO activity on hemicelluloses shows the importance of oxidative processes in plant cell wall degradation", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, vol. 111, no. 17, 14 April 2014 (2014-04-14), US, pages 6287 - 6292, XP055242278, ISSN: 0027-8424, DOI: 10.1073/pnas.1323629111
I. MORGENSTERN ET AL: "Fungal cellulose degradation by oxidative enzymes: from dysfunctional GH61 family to powerful lytic polysaccharide monooxygenase family", BRIEFINGS IN FUNCTIONAL GENOMICS, 12 September 2014 (2014-09-12), XP055145373, ISSN: 2041-2649, DOI: 10.1093/bfgp/elu032
SAITO ET AL.: "Cellulose Nanofibers Prepared by TEMPO-Mediated Oxidation of Native Cellulose", BIOMACROMOLECULES, vol. 8, no. 8, 13 July 2007 (2007-07-13), pages 2485 - 2491
LEVASSEUR ET AL.: "CAZy - Carbohydrate Active enZyme database", BIOTECHNOLOGY FOR BIOFUELS, vol. 6, 2013, pages 41, Retrieved from the Internet
MORGENSTERN I ET AL., BRIEFINGS IN FUNCTIONAL GENOMICS, vol. 3, no. 6P, pages 471 - 481
HEMSWORTH ET AL.: "Discovery and characterization of a new family of lytic polysaccharide monooxygenases", NATURE CHEMICAL BIOLOGY, 2014, pages 122 - 126
LO LEGGIO ET AL.: "Structure and boosting activity of a starch-degrading lytic polysaccharide monooxygenase", NAT COMMUN, vol. 6, no. 22, 2015, pages 5961, XP002739503, DOI: doi:10.1038/ncomms6961
LAVOINE N ET AL., CARBOHYDRATE POLYMERS, 2012, pages 735 - 764
SISQUEIRA ET AL., POLYMER, vol. 2, no. 4, 2010, pages 728 - 765
IWAMOTO S ET AL., APPLIED PHYSICS A, vol. 89, no. 2, 2007, pages 461 - 466
UNETANI K ET AL., BIOMACROMOLÉCULES, vol. 12, no. 2, 2011, pages 348 - 353
DUFRESNE ET AL., JOURNAL OF APPLIED POLYMER SCIENCE, vol. 64, no. 6, 1997, pages 1185 - 1194
WOOD TM, METHODS ENZYM, vol. 160, 1988, pages 19 - 25
Attorney, Agent or Firm:
ORSINI, Fabienne et al. (FR)
Download PDF:
Claims:
REVENDICATIONS

1 . Procédé pour la fabrication de nanocelluloses à partir d'un substrat cellulosique comprenant des fibres de cellulose,

lequel procédé comprend les étapes successives suivantes :

- au moins une étape de traitement enzymatique dudit substrat cellulosique, par la mise en contact avec au moins une enzyme de clivage, puis

- au moins une étape de traitement mécanique dudit substrat cellulosique soumis à ladite au moins une étape de traitement enzymatique, pour délaminer lesdites fibres de cellulose et pour obtenir lesdites nanocelluloses,

caractérisé en ce que ladite au moins une enzyme de clivage est choisie parmi les enzymes appartenant à la famille des mono-oxygénases lytiques de polysaccharides (LPMOs) aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose en présence d'un donneur d'électron.

2. Procédé pour la fabrication de nanocelluloses selon la revendication 1 , caractérisé en ce que les LPMOs sont choisies parmi les enzymes aptes à réaliser un clivage de la cellulose par oxydation de l'un au moins des atomes de carbone en positions Ci , C4 et C6 du cycle de glucose.

3. Procédé pour la fabrication de nanocelluloses selon la revendication 2, caractérisé en ce que les LPMOs sont choisies parmi les familles AA9 et AA1 0 de la classification CAZy.

4. Procédé pour la fabrication de nanocelluloses selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les LMPOs sont choisies parmi les LPMOs issues de Podospora anserina, de préférence parmi PaLPM09A (Genbank CAP68375), PaLPM09B (Genbank CAP73254), PaLPM09D (Genbank CAP66744) PaLPM09E (Genbank CAP67740), PaLPM09F (Genbank CAP71 839), PaLPM09G (Genbank CAP73072), PaLPM09H (Genbank CAP61476).

5. Procédé pour la fabrication de nanocelluloses selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le donneur d'électron est choisi parmi l'ascorbate, le gallate, le catéchol, le glutathion réduit, les fragments de lignine et les carbohydrates déshydrogénases fongiques.

6. Procédé pour la fabrication de nanocelluloses selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le substrat cellulosique est obtenu à partir de bois, d'un végétal fibreux riche en cellulose, de betterave, d'agrumes, de plantes annuelles à paille, d'animaux marins, d'algues, de champignons ou de bactéries.

7. Procédé pour la fabrication de nanocelluloses selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le substrat cellulosique est choisi parmi les pâtes papetières chimiques, de préférence les pâtes papetières de bois chimiques, de préférence encore l'une au moins des pâtes papetières suivantes :

- les pâtes blanchies,

- les pâtes semi-blanchies,

- les pâtes écrues,

- les pâtes au bisulfite,

- les pâtes au sulfate,

- les pâtes à la soude,

- les pâtes kraft.

8. Procédé pour la fabrication de nanocelluloses selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que ladite au moins une étape de traitement mécanique comprend l'un au moins des traitements mécaniques suivants :

- un traitement d'homogénéisation,

- un traitement de microfluidisation,

- un traitement d'abrasion,

- un traitement de cryobroyage.

9. Procédé pour la fabrication de nanocelluloses selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que, suite à ladite au moins une étape de traitement mécanique, ledit procédé comprend une étape de post-traitement, par exemple un traitement acide, un traitement enzymatique, une oxydation, une acétylation, une silylation, ou encore une dérivatisation de certains groupements chimiques portés par les nanocelluloses.

10. Procédé pour la fabrication de nanocelluloses selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que les nanocelluloses obtenues consistent en des nanofibrilles de cellulose et/ou en des nanocristaux de cellulose.

1 1 . Nanocelluloses issues d'un procédé de fabrication selon l'une quelconque des revendications 1 à 10.

12. Nanocelluloses selon la revendication 1 1 , caractérisées en ce que lesdits nanocelluloses comportent des cycles de glucose dont au moins un atome de carbone est oxydé en position(s) Ci et/ou C4, voire également C6.

Description:
Procédé pour la fabrication de nanocelluloses à partir d'un substrat cellulosique

DOMAINE TECHNIQUE AUQUEL SE RAPPORTE L'INVENTION La présente invention concerne de manière générale le domaine des nanocelluloses, et plus particulièrement les procédés pour la fabrication de ces nanocelluloses à partir d'un substrat cellulosique.

ARRI ERE-PLAN TECHNOLOGIQUE

La cellulose est un des polymères naturels les plus importants, une matière première quasi inépuisable, et une source importante de matériaux durables à l'échelle industrielle.

A ce jour, différentes formes de cellulose ont été identifiées avec une dimension de l'ordre du nanomètre, désignées sous le nom générique de « nanocelluloses ».

Les propriétés de ces nanocelluloses, notamment leurs propriétés mécaniques, leur capacité à former des films et leur viscosité, leur confèrent un intérêt majeur dans de nombreux domaines industriels.

Les nanocelluloses sont ainsi utilisées par exemple en tant qu'additif dispersant ou stabilisant dans les industries papetière, pharmaceutique, cosmétique ou agroalimentaire. Elles entrent également dans la composition de peintures et de vernis.

Les nanocelluloses sont également employées dans de nombreux dispositifs nécessitant un contrôle de la porosité nanométrique, en raison de leur surface spécifique élevée.

Enfin, de nombreux matériaux nanocomposites à base de nanocelluloses sont actuellement développés. En effet, les propriétés mécaniques remarquables des nanocelluloses, leur dispersion à l'échelle nanométrique ainsi que leur caractère hydrophile, leur confèrent des propriétés barrières au gaz excellentes. Ces caractéristiques suscitent notamment un intérêt important pour la fabrication d'emballages barrières.

Sur la base de leurs dimensions, fonctions et méthodes de préparation, qui elles-mêmes dépendent principalement de la source cellulosique et des conditions de traitement, les nanocelluloses peuvent être classées principalement dans deux familles : les fibrilles de cellulose et les nanocristaux de cellulose.

Les nanocristaux de cellulose (dits encore « nanocelluloses cristallines » ou NCCs pour « nanocrystalline cellulose ») sont en général obtenus par une hydrolyse avec un acide fort dans des conditions strictement contrôlées de température, de durée et d'agitation. Un tel traitement permet d'attaquer les régions amorphes des fibres tout en laissant les régions cristallines, plus résistantes, intactes. La suspension obtenue est ensuite lavée par des centrifugations et des dialyses successives dans l'eau distillée. Les NCCs les plus classiquement obtenus ont une longueur de quelques dizaines de nanomètres à environ 1 μηι (notamment de 40 nm à 1 μηι et de préférence de 40 nm à 500 nm), et un diamètre allant de 5 à 70 nm, de préférence inférieur à 15 nm (typiquement de 5 à 10 nm).

Les fibrilles de cellulose, couramment désignées microfibrilles de cellulose (dites encore « cellulose microfibrillée » ou MFC pour « microfibrillated cellulose ») ou nanofibrilles de cellulose (NFC pour « nanofibrillated cellulose ») sont typiquement isolées à partir de matériaux cellulosiques issus de la biomasse, par des procédés mécaniques permettant de délaminer les fibres de cellulose et de libérer les fibrilles de cellulose.

Par exemple, le document US 4 483 743 décrit un procédé de fabrication de cellulose microfibrillée, qui implique le passage d'une suspension liquide de cellulose au travers d'un homogénéiseur type Gaulin à haute pression. Des passages répétés de la suspension de cellulose permettent d'obtenir des microfibrilles ayant typiquement une largeur allant de 25 à 100 nm et une longueur bien plus importante.

De manière générale, les procédés mécaniques d'obtention de fibrilles de cellulose ont l'inconvénient de consommer d'importantes quantités d'énergie. A titre d'exemple, il a été évalué que l'utilisation d'un homogénéiseur entraîne une consommation d'énergie de l'ordre de 70000 kWh/t. Cette consommation énergétique importante, et en corollaire les coûts élevés de la production de nanocelluloses, restent donc un frein considérable à leur développement industriel.

Différentes stratégies de prétraitements des fibres de cellulose ont ainsi été développées afin de réduire la consommation d'énergie requise pour leur délamination mécanique.

Une première stratégie de prétraitement, décrite par exemple dans la demande WO 2007/091942, consiste à prétraiter les fibres de cellulose par des cellulases de manière à déstructurer la fibre avant l'application du traitement mécanique par homogénéisation.

Cependant, ce prétraitement enzymatique est extrêmement versatile en fonction de l'état de la fibre et notamment en fonction de l'histoire thermochimique préalable de la fibre.

De plus, la qualité des nanocelluloses obtenues (en particulier l'état de dispersion et notamment la taille latérale des nanofibrilles qui conditionne les propriétés d'usage et les rendements énergétiques sont très variables.

Une seconde stratégie de prétraitement s'appuie sur une étape chimique d'oxydation des fibres de cellulose (par exemple Saito et al., Biomacromolecules, Vol. 8, No. 8, 2007, pp. 2485-2491 ).

Typiquement, les fibres sont oxydées avec un oxydant tel que hypochlorite de sodium catalysé par le radical 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1 -oxyl (« TEMPO ») avant de subir le traitement mécanique précité.

Le traitement oxydatif convertit la fonction alcool primaire en position C 6 de l'unité de glucose de la cellulose en une fonction carboxylate, ce qui conduit à l'introduction de charges à la surface des fibres de cellulose. Ces charges créent des répulsions électrostatiques qui facilitent la délamination et qui augmentent son efficacité.

Toutefois, l'élimination des produits de réaction conduit à de grandes quantités d'effluents fortement pollués. En outre, des résidus de réactifs persistent au sein du produit final et continuent à réagir, altérant in fine les propriétés des nanocelluloses.

Ainsi, malgré les nouvelles stratégies de prétraitement développées, les coûts de production des nanocelluloses restent élevés, les rendements incertains, et la qualité et les propriétés sont variables.

II reste donc nécessaire de proposer de nouveaux procédés pour obtenir des nanocelluloses, avec une moindre consommation énergétique et de façon simple et reproductible, selon une voie peu ou pas toxique.

OBJET DE L'INVENTION

Afin de remédier aux inconvénients précités de l'état de la technique, la présente invention propose un procédé de fabrication de nanocelluloses s'appuyant sur une étape de prétraitement de fibres de cellulose avec au moins une enzyme appartenant à la famille des mono-oxygénases lytiques de polysaccharides, couramment désignés « LPMOs » pour « Lytic Polysaccharide MonoOxygenases ».

Plus particulièrement, on propose selon l'invention un procédé pour la fabrication de nanocelluloses à partir d'un substrat cellulosique comprenant des fibres de cellulose,

lequel procédé comprend les étapes successives suivantes :

- au moins une étape de traitement enzymatique dudit substrat cellulosique, par la mise en contact avec au moins une enzyme de clivage, puis

- au moins une étape de traitement mécanique dudit substrat cellulosique soumis à ladite au moins une étape de traitement enzymatique, pour délaminer les fibres de cellulose et pour obtenir lesdites nanocelluloses,

caractérisé en ce que ladite au moins une enzyme de clivage est choisie parmi les enzymes appartenant à la famille des LPMOs.

Typiquement, les LPMOs sont aptes à assurer un clivage oxydatif des fibres de cellulose, avantageusement des cycles de glucose des fibres de cellulose, en présence d'un donneur d'électron.

Sans être limité par une quelconque théorie, l'action des LPMOs facilite la fabrication de nanocellulose à travers deux actions :

- le clivage des chaînes cellulosiques provoque des fragilités au sein des fibres, facilitant la délamination mécanique,

- la formation de produits d'oxydation permet d'introduire des fonctions chimiques chargées sur la surface des fibres en induisant des répulsions électrostatiques.

Encore sans être limité par une quelconque théorie, ces modifications structurales combinées ont pour conséquence de favoriser la séparation des fibres jusqu'à dispersion nanométrique et de former des nanocelluloses (fibrilles ou nanocristaux) possédant des fonctionnalités nouvelles (taux de charges, fonctions chimiques actuellement non disponibles).

D'autres caractéristiques non limitatives et avantageuses du procédé de fabrication conforme à l'invention, prises individuellement ou selon toutes les combinaisons techniquement possibles, sont également décrites ci-après ainsi que dans la description détaillée de l'invention.

Le donneur d'électron peut être choisi parmi l'ascorbate, le gallate, le cathécol, le glutathion réduit, les fragments de lignine et les carbohydrates déshydrogénases fongiques (notamment les glucoses déshydrogénases, et les cellobiose déshydrogénases).

De préférence, les LPMOs sont choisies parmi les enzymes aptes à réaliser un clivage de la cellulose par oxydation de l'un au moins des atomes de carbone en position(s) Ci , C 4 et C 6 du cycle de glucose. De préférence encore, les LPMOs sont choisies parmi les enzymes aptes à réaliser un clivage de la cellulose par oxydation de l'un au moins des atomes de carbone en position(s) Ci et/ou C 4 , éventuellement en combinaison avec C 6 , du cycle de glucose.

Les LPMOs peuvent être choisies parmi les familles d'enzymes fongiques AA9 (anciennement dénommées GH61 ) et d'enzymes bactériennes AA10 (anciennement dénommées CBM33) de la classification CAZy (www.cazy.org). Notamment, les LPMOs peuvent être choisies parmi les LPMOs issues de Podospora anserina et de préférence parmi PaLPM09A (Genbank CAP68375), PaLPM09B (Genbank CAP73254), PaLPM09D (Genbank CAP66744) PaLPM09E (Genbank CAP67740), PaLPM09F (Genbank CAP71839), PaLPM09G (Genbank CAP73072), et PaLPM09H (Genbank CAP61476)

Suivant les modes de réalisation de l'invention, le substrat cellulosique est obtenu à partir de bois, d'un végétal fibreux riche en cellulose, de betterave, d'agrumes, de plantes annuelles à paille, d'animaux marins, d'algues, de champignons ou de bactéries.

De préférence, le substrat cellulosique est choisi parmi les pâtes papetières chimiques, de préférence les pâtes papetières de bois chimiques, de préférence encore l'une au moins des pâtes papetières suivantes :

- les pâtes blanchies,

- les pâtes semi-blanchies,

- les pâtes écrues,

- les pâtes au bisulfite,

- les pâtes au sulfate,

- les pâtes à la soude,

- les pâtes kraft.

Ladite au moins une étape de traitement mécanique comprend généralement l'un au moins des traitements mécaniques suivants :

- un traitement d'homogénéisation,

- un traitement de microfluidisation,

- un traitement d'abrasion,

- un traitement de cryobroyage.

Le procédé peut également comprendre une étape de post-traitement, par exemple un traitement acide, un traitement enzymatique, une oxydation, une acétylation, une silylation, ou encore une dérivatisation de certains groupements chimiques portés par les nanocelluloses.

L'invention se rapporte également aux nanocelluloses obtenues par la mise en œuvre du procédé de l'invention.

Typiquement, les nanocelluloses obtenues consistent en des nanofibrilles de cellulose et/ou en des nanocristaux de cellulose.

De préférence, les nanocelluloses comportent des cycles de glucose dont au moins un atome de carbone est oxydé en position(s) Ci et/ou C 4 , voire également en position C 6 . FIGURES

Figure 1 : Aspect des fibres kraft de cellulose traitées avec l'enzyme PaLPM09H selon différents ratios enzyme/substrat et soumises à un traitement mécanique faible avec un homogénéiseur-disperseur du type d'Ultra-Turrax et un traitement ultrasons. Images en microscopie optique des fibres non traitées (témoin) avec l'enzyme (A) ou traitées avec des ratios enzyme/substrat de 1 :50 (B); 1 :100 (C); et 1 : 500 (D).

Figure 2 : Aspect des fibres kraft de cellulose traitées avec l'enzyme Pal_PM09H à un ratio enzyme/substrat 1 :50 et soumises à un traitement mécanique faible avec un homogénéiseur-disperseur du type d'Ultra-Turrax et un traitement ultrasons. Images en microscopie optique des fibres témoins (A) et des fibres traitées (B), et visualisation des nanofibrilles obtenues par microcopie électronique à transmission (C) et microscopie de force atomique (D).

Figure 3 : Aspect des fibres kraft de cellulose traitées avec les enzymes Pal_PM09H et Pal_PM09E selon un ratio enzyme/substrat de 1 :50 puis soumises à un traitement mécanique faible avec un homogénéiseur-disperseur du type d'Ultra-Turrax et un traitement ultrasons. Images en microscopie optique des fibres kraft traitées avec Pal_PM09H (A) et avec Pal_PM09E (B). Visualisation par microscopie de force atomique des nanofibrilles obtenues à partir des fibres kraft par traitement avec les enzymes LPMOs Pal_PM09H (C) et Pal_PM09E (D).

Figure 4 : Aspect des fibres kraft de cellulose soumises à deux traitements successifs avec l'enzyme Pal_PM09H à différents ratios enzyme/substrat puis soumises à un traitement mécanique faible avec un homogénéiseur-disperseur du type d'Ultra-Turrax et un traitement ultrasons. Images en microscopie optique des fibres traitées selon les ratios enzyme/substrat de 1 :50 (A); 1 :100 (B); 1 : 500 (C) et 1 :1000 (D).

Figure 5 : Analyse des photos AFM pour l'enzyme Pal_PM09H, pour caractériser le profil des hauteurs (Figure 5A) et la distribution en taille (Figure 5B) des nanocelluloses. Légende Figure 5A : exemple d'un profil de hauteur obtenu sur la surface largeur (x, μηι) versus hauteur (y, nm); légende Figure 5B : histogramme de distribution des hauteurs avec hauteur (x, nm) versus nombre (y).

DESCRIPTION DÉTAILLÉE

La description qui va suivre, en combinaison avec les Résultats Expérimentaux donnés à titre d'exemples non limitatifs, fera bien comprendre en quoi consiste l'invention et comment elle peut être réalisée.

Définitions générales

La présente invention concerne un procédé pour la fabrication de nanocelluloses, en particulier de fibrilles de cellulose et/ou de nanocristaux de cellulose, à partir d'un substrat cellulosique.

Par « cellulose », on entend un homopolysaccharide linéaire issu de la biomasse (englobant les matières organiques d'origine végétale, algues incluses, la cellulose d'origine animale ainsi que la cellulose d'origine bactérienne) et constitué d'unités (ou cycles) de glucose (D-Anhydroglucopyranose - AGU pour « Anhydro glucose unit ») reliées entre elles par des liaisons glycosidiques β-(1 -4). Le motif de répétition est un dimère de glucose également appelé dimère de cellobiose.

Les AGU possèdent 3 fonctions hydroxyles : 2 alcools secondaires (sur les carbones en positions 2 et 3 du cycle de glucose) et un alcool primaire (sur le carbone en position 6 du cycle de glucose).

Ces polymères s'associent par des liaisons intermoléculaires de type liaison hydrogène, conférant ainsi une structure fibreuse à la cellulose. En particulier, l'association des dimères de cellobiose forme une nanofibrille élémentaire de cellulose (dont le diamètre est d'environ 5 nm). L'association de nanofibrilles élémentaires forme une nanofibrille (dont le diamètre varie généralement de 50 à 500 nm). L'agencement de plusieurs de ces nanofibrilles forme ensuite ce qui est généralement appelé une fibre de cellulose.

Le terme « nanocelluloses » désigne les différentes formes de cellulose ayant une dimension de l'ordre du nanomètre. Ce terme englobe en particulier selon l'invention, deux familles de nanocelluloses : les nanocristaux de cellulose et les fibrilles de cellulose.

Les termes « fibrilles de cellulose », « nanofibrilles (de cellulose) », « nanofibres

(de cellulose) », « cellulose nanofibrillée », « microfibrilles (de cellulose) », « cellulose microfibrillée », « microfibrillated cellulose », « cellulose nanofibrils » sont synonymes.

Dans la suite de la présente demande, le terme « nanofibrilles de cellulose » (NFCs) sera utilisé de manière générique.

Chaque nanofibrille de cellulose contient des parties cristallines stabilisées par un solide réseau de liaisons hydrogènes inter- et intra-chaines. Ces régions cristallines sont séparées par des régions amorphes.

L'élimination des parties amorphes des nanofibrilles de cellulose, permet d'obtenir des nanocristaux de cellulose (NCCs).

Les NCCs comportent avantageusement au moins 50% de partie cristalline, de préférence encore au moins 55% de partie cristalline. Ils ont généralement un diamètre allant de 5 à 70 nm (de préférence inférieur à 15 nm) et une longueur allant de 40 nm à environ 1 μηι, de préférence allant de 40 nm à 500 nm.

Les termes « nanocristaux de cellulose », « cellulose nanocristalline », « cellulose whiskers », « microcristaux » ou « cellulose nanocrystal » sont synonymes.

Dans la suite de la présente demande, le terme « nanocristaux de cellulose » (NCCs) sera utilisé de manière générique.

Dans le cas de la cellulose bactérienne, les nanofibrilles, ou rubans, de cellulose bactérienne ont généralement une longueur de plusieurs micromètres et une largeur allant de 30 à 60 nm, notamment de 45 à 55 nm. Procédé selon l'invention

Le procédé pour la fabrication de nanocelluloses, selon l'invention, comprend les étapes successives suivantes :

- au moins une étape de traitement enzymatique d'un substrat cellulosique comprenant des fibres de cellulose, par sa mise en contact avec au moins une enzyme de clivage appartenant à la famille des mono-oxygénases lytiques de polysaccharides (LPMOs), puis

- au moins une étape de traitement mécanique dudit substrat cellulosique soumis à ladite au moins une étape de traitement enzymatique, pour délaminer lesdites fibres de cellulose et pour obtenir lesdites nanocelluloses.

Une ou plusieurs, et notamment au moins deux, étapes de traitement enzymatique peuvent être mises en œuvre selon le procédé de l'invention, préalablement à ladite au moins une étape de traitement mécanique. Par exemple, au moins deux étapes de traitement enzymatique peuvent être mises en œuvre successivement, préalablement à ladite au moins une étape de traitement mécanique.

Au moins une étape de traitement enzymatique peut également être mise en œuvre après ladite au moins une étape de traitement mécanique.

Lorsque plusieurs étapes de traitement enzymatique sont mises en œuvre, les conditions de traitement (durée, LPMO(s) choisie(s), ratio enzyme/cellulose, etc.) peuvent être identiques ou différentes entre elles.

Typiquement, ladite au moins une étape de traitement enzymatique, éventuellement suivie d'au moins une étape de traitement mécanique, peut être répétée, comme décrit ci-dessus, jusqu'à obtenir une délamination complète des fibres de cellulose.

Par exemple, le procédé de l'invention peut comprendre au moins deux cycles de traitement successifs, chaque cycle de traitement comprenant au moins une étape de traitement enzymatique du substrat cellulosique suivie d'au moins une étape de traitement mécanique dudit substrat.

Sans être limité par une quelconque théorie, la combinaison selon l'invention (i) d'un traitement enzymatique avec au moins une LPMO et (ii) d'un traitement mécanique de délamination, permet d'obtenir des nanocelluloses dont les caractéristiques structurelles et les propriétés mécaniques sont tout à fait différentes des nanocelluloses existantes dans l'état de la technique.

Encore sans être limité par une quelconque théorie, le procédé de l'invention permet d'obtenir des nanocelluloses de façon simple et reproductible. De préférence, la taille et les propriétés mécaniques de ces nanocelluloses sont homogènes. Substrat cellulosique

Le substrat cellulosique peut être obtenu selon l'invention à partir de toute matière de la biomasse (englobant les matières organiques d'origine végétale, algues incluses, animale ou fongique) comprenant des fibres cellulosiques (c.à.d. des fibres de cellulose).

Le substrat cellulosique est obtenu avantageusement à partir de bois (dont la cellulose est le composant principal), mais aussi de tout végétal fibreux riche en cellulose, comme par exemple, le coton, le lin, le chanvre, le bambou, le kapok, les fibre de noix de coco (coir), la ramie, la jute, le sisal, le raphia, le papyrus et certains roseaux, la bagasse de canne à sucre, la betterave (et notamment la pulpe de betterave), les agrumes, les tiges de maïs ou de sorgho, ou encore les plantes annuelles à paille.

Les substrats cellulosiques peuvent également être obtenus à partir d'animaux marins (comme le tunicier par exemple), d'algues (comme par exemple Valonia ou Cladophora) ou de bactéries pour la cellulose bactérienne (comme par exemple les souches bactériennes de types Gluconacetobacter).

On choisira, selon les applications, de la cellulose issue de parois primaires comme le parenchyme des fruits (par exemple les betteraves, les agrumes etc.) ou de parois secondaires, comme le bois.

Le substrat cellulosique consiste avantageusement en un matériau cellulosique préparé par des moyens chimiques ou mécaniques, à partir de toute source cellulosique telle que mentionnée ci-dessus (et notamment à partir du bois).

Le substrat cellulosique se présente avantageusement sous la forme d'une suspension de fibres de cellulose dans un milieu liquide (de préférence un milieu aqueux), ou d'une pâte de cellulose.

Les pâtes de cellulose peuvent être conditionnées à l'état « sec », soit typiquement dans un état de siccité supérieur ou égal à 80%, notamment supérieur ou égal à 90%. La pâte de cellulose peut ensuite être redispersée dans un milieu aqueux par un traitement mécanique.

De préférence, le substrat cellulosique contient au moins 90%, notamment au moins 95% et de préférence 100% de fibres de celluloses.

De préférence, le substrat cellulosique est adapté à la fabrication de papier ou d'un produit cellulosique. Le substrat cellulosique est ainsi de préférence choisi parmi les pâtes papetières (ou pâte à papier), et en particulier les pâtes papetières chimiques.

De manière générale, la pâte de cellulose et notamment la pâte papetière peut contenir, en association avec les fibres de cellulose, de l'hémicellulose et de la lignine. De préférence, la pâte de cellulose contient moins de 10% et notamment moins de 5% de lignine et/ou d'hémicellulose. De préférence, les pâtes papetières chimiques contiennent quasiment exclusivement, voire exclusivement des fibres de cellulose.

La pâte papetière peut être choisie parmi l'une au moins des pâtes papetières suivantes : les pâtes blanchies, les pâtes semi-blanchies, les pâtes écrues, les pâtes au bisulfite (écrues ou blanchies), les pâtes au sulfate (écrues ou blanchies), les pâtes à la soude (écrues ou blanchies) et les pâtes kraft.

Il est également possible d'utiliser des pâtes à dissoudre ayant une faible proportion d'hémicellulose, de préférence inférieure à 10% et notamment inférieure ou égale à 5%.

De préférence, les pâtes papetières utilisées dans un procédé de l'invention sont des pâtes de bois, notamment des pâtes papetières chimiques de bois.

Mono-oxygénases lytigues de polysaccharides - LPMO

Le substrat cellulosique est ainsi soumis à au moins une étape de prétraitement avec au moins une enzyme de clivage appartenant à la famille des mono-oxygénases lytiques de polysaccharides (« Lytic Polysaccharide Ponooxygenases » ou LPMO).

Les LPMOs sont des enzymes mononucléaires de type II à cuivre. Elles présentent des caractéristiques structurelles communes, notamment :

- une surface plane avec un site actif situé proche de son centre et

- un site de liaison fortement conservé pour un ion cuivre de type II exposé à la surface de la protéine.

L'interaction entre l'enzyme LPMO et la surface de la cellulose intervient par l'intermédiaire de la face plane de l'enzyme LPMO et met en jeu des interactions avec des résidus aromatiques polaires. Les LPMOs utilisables selon l'invention sont définies par leur capacité à catalyser un clivage oxydatif des fibres de cellulose du substrat cellulosique, par oxydation de l'un au moins des atomes de carbone en positions Ci , C 4 et

C 6 d'un cycle glucose desdites fibres de cellulose.

Le principe du clivage oxydatif réalisé par les LPMOs implique l'activation d'un groupement C-H suivie par un clivage dépendant du dioxygène (0 2 ), produisant ainsi des oligomères oxydés sur l'un au moins des carbones en positions Ci , C 4 , et C 6 .

La ou les LPMO(s) mises en œuvre sont aptes à catalyser un clivage des fibres de cellulose par oxydation de l'un au moins des carbones choisis parmi les carbones en positions Ci et/ou C 4 et/ou C 6 d'un cycle glucose de la cellulose. Le clivage oxydatif conduit à la formation de groupements carboxyles à la surface des fibres de cellulose :

- le clivage oxydatif en position Ci d'un cycle glucose d'une unité de cellobiose entraîne la formation d'une lactone, spontanément hydrolysée en acide aldonique, et

- le clivage oxydatif en position C 4 d'un cycle glucose d'une unité de cellobiose conduit à la formation d'un kétoaldose.

L'oxydation du groupement alcool en position C 6 d'un cycle glucose d'une unité de cellobiose conduit à la formation d'un groupe carbonyle.

Dans certains modes de réalisation, la ou les LPMO(s) utilisées catalysent un clivage des fibres de cellulose par oxydation de l'un au moins des carbones choisis parmi les carbones en position(s) Ci et/ou C 4 d'un cycle glucose de la cellulose, éventuellement en combinaison avec le carbone en position C 6 .

Les LPMOs catalysent le clivage oxydatif d'une unité de cellobiose en présence d'un donneur externe d'électron.

Ce donneur d'électron, généralement une molécule de faible poids moléculaire, est choisi parmi l'ascorbate, le glutathion réduit, le gallate, le cathécol, des fragments de lignine, ou encore une enzyme de la famille des carbohydrates déshydrogénases.

De préférence, les carbohydrates déshydrogénases sont choisies parmi les enzymes fongiques, notamment les cellobiose déshydrogénase (CDHs).

Les CDHs (ou Cellobiose oxidoréductases - EC 1 .1 .99.1 8) catalysent la réaction [Cellobiose + accepteur d'électron <=> cellobiono-1 ,5-lactone + accepteur réduit]. Ce sont des hémoflavoenzymes fongiques appartenant à la superfamille des glucose- méthanol-choline (GMC) oxydoréductases. Les CDHs sont des enzymes monomériques portant deux groupes prosthétiques, un groupe hème b et une flavine adénine dinucléotide. Le domaine flavoprotéine des CDHs catalyse l'oxydation à deux électrons de la cellobiose en lactone en utilisant un accepteur d'électrons. Cet accepteur d'électron peut être par exemple choisi parmi le dioxygène, les quinones et les radicaux phénoxy ou les LPMOs.

L'activité d'une enzyme CDH peut être déterminée en suivant la réduction du réactif 2,6-dichlorophénol indophénol (DCPIP) dans un tampon sodium acétate contenant du cellobiose (Bey et al., 201 1 , Microb. Cell Fact. 1 0:1 13).

Des exemples de CDHs utilisables en combinaison avec au moins une enzyme LPMO et agissant également en tant que donneur d'électron peuvent être choisis parmi les CDHs provenant de Pycnoporus cinnabarinus, Humicola insolens, Podospora anserina, ou Myceliophthora thermophila.

De préférence encore, on utilise une enzyme LPMO pour laquelle une activité cellulolytique (c'est-à-dire catalysant le clivage oxydatif de la cellulose) a été identifiée. L'activité de clivage oxydatif des LPMOs sur un substrat cellulosique peut être testée dans des tests de clivage tels que décrit dans la partie Exemple de la présente demande.

Plus précisément, les LPMOs mises en œuvre dans l'invention sont avantageusement choisies parmi les enzymes dites « à activité auxiliaire » (ou « Auxiliary Activity » - AA) selon la classification établie dans la base de données CAZy, relatives aux enzymes actives sur les hydrates de carbone (CAZy - Carbohydrate Active enZyme database - http://www.cazy.org/ - Voir aussi Levasseur et al., Biotechnology for Biofuels 2013, 6 :41 ).

De préférence encore, l'étape de traitement enzymatique est réalisée avec au moins une enzyme choisie parmi les enzymes LPMOs des familles dites AA9, AA10, AA1 1 et AA13, selon la classification établie dans la base de données CAZy.

L'enzyme LPMO selon l'invention peut contenir un module protéique de fixation au carbohydrate (« carbohydrate binding module ») spécifique de la cellulose de type CBM1 selon la classification CAZy.

Les enzymes listées dans la présente demande sont identifiées par les références Genbank (identifiant une séquence génétique) et Uniprot lorsque cette dernière est disponible (identifiant une séquence protéique - voir tableau 1 ). Par défaut, la référence indiquée entre parenthèses pour chaque enzyme correspond à la référence « Genbank ».

De préférence, on utilise (avantageusement exclusivement) au moins une enzyme de la famille AA9 et/ou au moins une enzyme de la famille AA10 de la classification CAZy.

Les enzymes de la famille AA9, listées dans le tableau 1 ci-après, sont des enzymes fongiques largement distribuées dans le génome de la plupart des ascomycètes et chez certains basidiomycètes (champignons).

De manière générale, les enzymes de la famille AA9 étaient initialement classées dans la famille des glycosides hydrolases 61 (GH61 ) de la classification CAZy. Des analyses spécifiques ont montré depuis, que l'activité endoglucanase des enzymes AA9 était faible, voire inexistante (Morgenstern I et al., Briefings in Functional Genomics vol.3(6P) : 471 -481 ).

De préférence, on utilise des LPMOs dont l'activité endoglucanase est non significative ou inexistante.

L'ion cuivre des LPMOs de la famille AA9 est lié à la protéine selon un modèle d'hexacoordination impliquant au moins 2 résidus conservés d'histidine et des molécules d'eau.

Les enzymes de la famille AA9 catalysent un clivage oxydatif de l'unité cellobiose sur le carbone en position Ci et/ou C 4, de préférence sur le carbone en position Ci ou C 4 . Certaines enzymes (T. aurantiacus TaGH6 ~ \ A (G3XAP7) et Podospora anserina PaGH61 B (B2AVF1 )) pourraient catalyser un clivage oxydatif de la cellobiose sur un carbone en position C 6 .

Les LPMOs de la famille AA9 exprimée chez les champignons présentent généralement une modification post-traductionnelle consistant en une méthylation du résidu histidine N-terminal.

De préférence, on utilise des LPMOs de la famille AA9 comprenant au moins un domaine CBM1 ou CBM18 (CBM pour « carbohydrate binding module ») en position N- terminale. Ces enzymes comprennent alors une surface plane formée de plusieurs résidus aromatiques polaires formant un domaine de type CBM1 ou CBM1 8.

De préférence encore, ladite au moins une LPMO de la famille AA9 est issue de Podospora anserina et/ou de Neurospora crassa.

Les enzymes de la famille AA9 issues de Podospora anserina sont typiquement choisies dans le groupe constitué de PaLPM09A (CAP68375), PaLPM09B (CAP73254), PaLPM09D (CAP66744), PaLPM09E (CAP67740), PaLPM09F (CAP71 839), PaLPM09G (CAP73072), PaLPM09H (CAP61476).

De préférence, on utilise les enzymes PaLPM09E (CAP67740) et/ou PaLPM09H (CAP61476).

Les enzymes de la famille AA9 issues de Neurospora crassa sont typiquement choisies dans le groupe constitué de A/cLPM09C (EAA36362), A/cLPM09D (EAA32426 /CAD21 296), A/cLPM09E (EAA26873), A/cLPM09F (EAA26656/CAD70347), A/cLPM09M (EAA331 78), A/cU00836 (EAA34466), A/cU02240 (EAA30263), A/cU07760 (EAA2901 8).

Les enzymes de la famille AA10 (classification CAZy) étaient anciennement classées dans la famille CBM33 (ou « carbohydrate binding module family 33 ») de la classification CAZy.

La famille AA10 des LPMOs comprend à ce jour plus d'un millier d'enzymes, identifiées particulièrement chez les bactéries, mais aussi chez certains eucaryotes ainsi que dans quelques virus.

Les LPMOs de la famille AA10 possèdent une structure similaire à celle des enzymes de la famille AA9 et notamment au moins un résidu tyrosine conservé en position N-terminal qui est impliqué dans la liaison avec l'ion cuivre. Cependant, dans la plupart des LPMOs de la famille AA1 0, l'un des autres résidus tyrosine impliqués dans la liaison axiale de l'ion cuivre est remplacé par un résidu phénylalanine. Pour ces enzymes, une activité oxydative a été démontrée sur la chitine et sur la cellulose.

De préférence, les enzymes de la famille AA10 sont multimodulaires et comprennent un domaine CBM en position N-terminal. Ces domaines sont typiquement des domaines CBM2, CBM5, CBM1 0, CBM12 ainsi que des modules fibronectine type I I I.

La famille AA1 1 est caractérisée par des enzymes qui réalisent un clivage oxydatif en Ci sur la chitine. On choisira de préférence l'enzyme d'Aspergillus oryzae (voir également Hemsworth et al., Nature Chemical Biology 2014(1 0):1 22-1 26 - Discovery and characterization of a new family of lytic polysaccharide monooxygenases).

La famille AA1 3 est caractérisée par des enzymes qui réalisent un clivage oxydatif en Ci sur l'amidon. On choisira de préférence l'enzyme d'Aspergillus nidulans (Lo Leggio et al., Nat Commun. 2015(22) 6: 5961 -Structure and boosting activity of a starch- degrading lytic polysaccharide monooxygenase).

De manière générale, l'étape de traitement enzymatique est mise en œuvre au moyen d'au moins une enzyme LPMO listée dans le tableau 2 ci-après.

Dans certains modes de réalisation du procédé de l'invention, ladite au moins une enzyme de la famille des LPMOs (avantageusement de la famille AA9 et/ou de la famille AA10) est utilisée en combinaison avec au moins une cellulase.

La cellulase est avantageusement choisie parmi au moins une endoglucanase (par exemple une endoglucanase) et/ou au moins une carbohydrate déshydrogénase (avantageusement une cellobiose déshydrogénase (CDHs)). Les carbohydrates déshydrogénases peuvent jouer le rôle de donneur d'électron pour les LPMOs.

En pratique, ladite au moins une enzyme LPMO mise en œuvre est avantageusement purifiée à partir d'un surnageant de culture d'un champignon et/ou produite en système hétérologue, notamment dans une bactérie, un champignon ou une levure, par exemple chez la levure Pichia pastoris.

Ladite au moins une enzyme LPMO est mélangée avec le substrat cellulosique, de manière à permettre la mise en contact entre ladite au moins une enzyme et les fibres de cellulose.

L'étape de traitement enzymatique est de préférence réalisée sous agitation douce, de façon à assurer une bonne dispersion des enzymes au sein des fibres. Cette étape de traitement enzymatique est par exemple mise en œuvre pendant une durée allant de 24h à 72h (de préférence 48h).

De préférence, l'étape de traitement enzymatique est mise en œuvre à une température allant de 30 à 45 ° C.

Selon l'invention ladite au moins une enzyme LPMO peut être ajoutée au substrat cellulosique selon un rapport (ou ratio) enzyme/cellulose allant de 1 :1000 à 1 :50, notamment de 1 :500 à 1 :50 ou de 1 :1 00 à 1 :50 ou encore de 1 :1 000 à 1 :500, de 1 : 500 à 1 : 1 00.

De préférence, ladite au moins une enzyme LPMO est utilisée à une concentration allant de 0,001 à 1 0 g/L, notamment de 0, 1 à 5 g/L, et de préférence encore de 0,5 à 5 g/L.

Selon un mode de réalisation particulier, le substrat cellulosique est soumis à au moins deux (voire seulement à deux) étapes de traitement enzymatique successives (en série, avantageusement séparées par une étape de rinçage).

La ou les LPMOs mises en œuvre au cours de chacune de ces étapes de traitement enzymatique sont identiques ou différentes ; les conditions (notamment le ratio enzyme/substrat) sont identiques ou différentes entre ces étapes successives.

Dans ce cas, les Exemples démontrent que les fibres sont entièrement déstructurées, y compris à des rapports enzyme/cellulose faibles. Etaoe(s) de traitement(s) mécaniaue(s)

Le substrat cellulosique prétraité est ensuite soumis à au moins une étape de traitement mécanique qui est destinée à délaminer les fibres de cellulose pour l'obtention des nanocelluloses.

La délamination (dite encore « fibrillation » ou « défibrillation ») consiste à séparer, par un phénomène mécanique, les fibres de cellulose en nanocelluloses.

Comme démontré au travers des Exemples ci-après, le clivage oxydatif des fibres de cellulose, catalysé par ladite au moins une LPMO, facilite la délamination de ces fibres de cellulose lors de l'étape de traitement mécanique.

Cette étape de délamination mécanique des fibres de cellulose peut alors être réalisée dans des conditions moins drastiques et donc moins coûteuses en énergie. Par ailleurs, l'utilisation de LPMOs selon l'invention permet d'introduire dans les fibres de cellulose des groupements chargés induisant des répulsions électrostatiques, sans contamination avec des réactifs de traitement, comme lors de l'utilisation de réactifs TEMPO.

Les traitements mécaniques visant à délaminer les fibres de cellulose sont connus de l'homme du métier et peuvent être mis en œuvre dans le procédé de l'invention.

De manière générale, on peut citer les traitements mécaniques faibles avec un homogénéiseur-disperseur (par exemple du type d'Ultra-Turrax) et/ou les traitements ultrasons.

On peut encore par exemple se référer au document de Lavoine N et al (Carbohydrate Polymers, 2012, (92) :735-64) qui décrit notamment (pages 740 à 744) des traitements mécaniques pour la préparation de cellulose microfibrillée (par exemple des nanofibrilles de cellulose).

Typiquement, un traitement mécanique peut être choisi parmi des traitements mécaniques d'homogénéisation, de microfluidisation, d'abrasion, ou de cryobroyage.

Le traitement d'homogénéisation implique le passage du substrat cellulosique prétraité, typiquement une pâte de cellulose ou une suspension liquide de cellulose, au travers d'un espace étroit sous pression élevée (tel que décrit par exemple dans le brevet US 4,486,743).

Ce traitement d'homogénéisation est de préférence effectué au moyen d'un homogénéiseur de type Gaulin. Dans un tel dispositif, le substrat cellulosique prétraité, typiquement sous forme d'une suspension de cellulose, est pompé à haute pression et distribué au travers d'une valve automatique de faible orifice. Une succession rapide d'ouvertures et de fermetures de la valve soumet les fibres à une importante chute de pression (généralement d'au moins 20 MPa) et à une action de cisaillement à vitesse élevée suivie d'un impact de décélération à vitesse élevée. Le passage du substrat dans l'orifice est répété (généralement de 8 à 10 fois) jusqu'à ce que la suspension de cellulose devienne stable. Afin de maintenir une température du produit dans une gamme allant de 70 à 80 °C durant le traitement d'homogénéisation, ce l'eau de refroidissement est généralement utilisée.

Ce traitement d'homogénéisation peut également être mis en œuvre à l'aide d'un dispositif de type microfluidiseur (voir par exemple Sisqueira et al. Polymer 2010 2(4) :728-65). Dans un tel dispositif, la suspension de cellulose passe au travers d'une fine chambre typiquement en forme de « z » (dont les dimensions du canal sont généralement comprises entre 200 et 400 μηι) sous pression élevée (environ 2070 bars). Le taux de cisaillement élevé qui est appliqué (généralement supérieur à 10 7 .s "1 ) permet d'obtenir des nanofibrilles très fines. Un nombre variable de passages (par exemple de 2 à 30, notamment de 10 à 30 ou de 5 à 25, et en particulier de 5 à 20) avec des chambres de tailles différentes peut être utilisé, pour augmenter le degré de fibrillation.

Le traitement d'abrasion ou de meulage (voir par exemple Iwamoto Set al., 2007 Applied Physics A89(2) :461 -66) est basé sur l'utilisation d'un dispositif de meulage apte à exercer des forces de cisaillement fournies par des pierres de meulage.

Le substrat cellulosique prétraité, généralement sous forme d'une pâte de cellulose, est passé entre une pierre de meulage statique et une pierre de meulage en rotation, typiquement à une vitesse de l'ordre de 1500 rotations par minute (rpm). Plusieurs passages (généralement entre 2 et 5) peuvent être nécessaires pour obtenir des fibrilles de taille nanométrique.

Un dispositif de type mixeur (par exemple tel que décrit dans Unetani K et al., Biomacromolécules 201 1 , 12(2), pp.348-53) peut également être utilisé pour produire des microfibrilles à partir du substrat cellulosique prétraité, par exemple à partir d'une suspension de fibres de bois.

Le traitement de cryobroyage (ou cryoconcassage) (Dufresne et al., 1997, Journal of Applied Polymer Science, 64(6) :1 185-94) consiste à broyer une suspension de substrat cellulosique prétraité préalablement congelée avec de l'azote liquide. Les cristaux de glace formés à l'intérieur des cellules font exploser les membranes cellulaires et libèrent des fragments de parois. Ces procédés sont généralement utilisés pour la production de microfibrilles de cellulose à partir de produits, ou de résidus, de l'agriculture. Etaoe(s) de post-traitement du substrat cellulosique

Dans certains modes de réalisation, le procédé de fabrication comprend au moins une étape de post-traitement du substrat cellulosique, mise en œuvre après que ledit substrat ait été soumis au traitement mécanique.

Généralement, ladite au moins une étape de post-traitement vise à augmenter le degré de fibrillation des nanocelluloses obtenues et/ou à conférer auxdites nanocelluloses de nouvelles propriétés mécaniques, en fonction des applications envisagées.

Ladite au moins une étape de post-traitement peut notamment être choisie parmi un traitement acide, un traitement enzymatique, une oxydation, une acétylation, une silylation, ou encore une dérivatisation de certains groupements chimiques portés par les microfibrilles. On peut également se référer par exemple au document de Lavoine N et al (Carbohydrate Polymers, 2012, (92) :735-64) qui décrit notamment (point 2.3, pages 747 à 748) des post-traitements qui peuvent être combinés à différents prétraitements et traitements mécaniques des fibres de celluloses.

Nanocelluloses selon l'invention

Le procédé selon l'invention permet ainsi l'obtention de nanocelluloses, en particulier de nanocristaux de cellulose et/ou de nanofibrilles de cellulose.

Contrairement aux NFCs obtenues après oxydation par des réactifs chimiques de type TEMPO, les nanocelluloses obtenues par le procédé de l'invention sont dépourvues de résidus de réactifs d'oxydation (à savoir par exemple le bromure de sodium, l'hypochlorite de sodium, le chlorite de sodium, le radical (2,2,6,6- tétraméthylpipéridin-1 -yl)oxyl (TEMPO), les dérivés ou analogues).

De préférence, à l'issue du procédé selon l'invention, les nanocelluloses comportent au moins un cycle de glucose (typiquement plusieurs cycles de glucose) dont l'un au moins des atomes de carbone en positions Ci et/ou C 4 , voire aussi C 6 , est oxydé par un phénomène de clivage oxydatif.

Les nanocelluloses selon l'invention comportent ainsi des cycles de glucose qui sont :

- mono-oxydés sur l'atome de carbone en position Ci , et/ou

- mono-oxydés sur l'atome de carbone en position C 4 , et/ou

- doublement oxydés, sur les atomes en positions Ci et C 4 .

Ces cycles de glucose, oxydés sur les atomes en positions Ci et/ou C 4 , peuvent encore comporter un atome de carbone oxydé en position C 6 .

Par « atome de carbone oxydé », on entend en particulier un atome de carbone qui comporte une fonction carbonyle, et avantageusement encore une fonction carboxyle.

Les nanocelluloses selon l'invention sont ainsi avantageusement chargées négativement, du fait de la présence de différents fonctions en surface dont des fonctions carboxylates sur les carbones en positions Ci et/ou C 4 (contrairement au procédé TEMPO qui conduit à une oxydation spécifique du carbone en position C 6 ).

RESULTATS EXPERIMENTAUX

1 . Des tests de clivage de la cellulose par une enzyme LPMO peuvent être menés selon le protocole suivant :

Le test de clivage est réalisé dans un volume de 300 μΙ de liquide contenant 4,4 μΜ d'enzyme LPMO et 1 mM d'ascorbate et 0,1 % (poids/volume) de poudre de cellulose gonflée à l'acide phosphorique (PASC phosphoric acid-swoller cellulose - préparée comme décrit dans Wood TM, Methods Enzym 1988, 160 :19-25) dans 50 mM d'un tampon acétate de sodium à pH 4,8 ou 5 μΜ de cello-oligosaccharides (Megazyme, Wicklow, Ireland) dans 10 mM de tampon acétate de sodium à pH 4,8.

La réaction enzymatique est mise en œuvre dans un tube de 2 ml incubé dans un thermomixer (Eppendorf, Montesson, France) à 50 °C et 580 rpm (rotation par minute).

Après 16 h d'incubation, l'échantillon est porté à 100°C pendant 10 minutes afin de stopper la réaction enzymatique, puis centrifugé à 16 000 tours par minutes (rpm) pendant 15 minutes à 4°C afin de séparer la fraction solution de la fraction insoluble restante.

Les produits clivés obtenus peuvent être analysés par chromatographie à échange d'ions et/ou par spectrométrie de masse (MALDI-TOF).

2. Des essais préliminaires ont été menés pour démontrer l'efficacité du procédé de fabrication de nanocellulose selon l'invention.

Ces essais ont été réalisés sur une fibre papetière (fibres kraft de cellulose) au moyen d'enzyme LMPO de la famille AA9 issues de Podospora anserina (PaLPM09E (Genbank CAP67740) et/ou PaLPM09H (Genbank CAP61476)) et produites en système hétérologue chez la levure (Pichia pastoris).

Les fibres sont mises en contact des enzymes (à une concentration d'1 g/L et selon des rapports enzyme/cellulose de 1 :50, 1 :100, 1 :500 et 1 :1000) et d'ascorbate (2 mM) puis soumises à une agitation douce pendant 48 heures à 40 °C.

Les fibres traitées sont ensuite soumises à une action mécanique avec un homogénéiseur-disperseur (Ultra-Turrax puissance 500 W, vitesse maximum pendant 3 minutes), suivie d'un traitement aux ultrasons pendant 3 minutes.

Comparativement aux substrats non traités à l'enzyme, on observe que la défibrillation est facilitée pour l'ensemble des rapports enzyme/cellulose utilisés (Figure 1 B-D - les photos montrent, de façon qualitative, la défibrillation).

En l'absence d'enzyme, les fibres restent intactes et aucune défibrillation n'est constatée (voir les fibres témoins non traitées, Figure 1 A).

Les dispersions ont été ensuite analysées par TEM (Microscopie Electronique en Transmission) et AFM (Microscopie de Force Atomique).

En l'absence d'enzymes LPMOs (figure 2A), on constate que très peu de structures sont visibles à l'échelle nanométrique.

En revanche, pour les fibres traitées par l'enzyme LPMO, des structures de dimensions nanométriques sont facilement repérées aussi bien dans le surnageant que dans les culots d'expérience. Les fibres sont entièrement déstructurées, laissant apparaître les zones cristallines de la fibre (Figure 2C-D).

Le traitement des fibres avec l'enzyme PaLPM09E combiné au traitement mécanique ultérieur (Figures 3B et D) produit une défibrillation de la cellulose similaire à celle obtenue avec un procédé identique impliquant l'enzyme PaLPM09H (voir Figure 3A et C).

De manière générale, les figures 2C, 2D, 3C et 3D démontrent de façon indiscutable que des nanocelluloses sont obtenues.

Si les fibres ayant subies un premier traitement avec l'enzyme LPMO sont à nouveau soumises à un second traitement successif avec une enzyme LPMO aux conditions décrites ci-dessus, suivi du traitement mécanique, les fibres sont entièrement déstructurées y compris aux rapports enzyme/cellulose faibles (c'est-à-dire les ratios 1/500 et 1/1000) (Figure 4).

Les photos AFM pour l'enzyme PaLPM09H ont été analysées par le logiciel WSxM pour caractériser le profil des hauteurs (Figure 5A) et la distribution en taille (Figure 5B) des nanocelluloses.

Cette analyse montre, qu'au ratio enzyme/cellulose 1 :50, les nanocelluloses ont un diamètre inférieur à 100 nm.

Ce résultat confirme que les produits obtenus par le procédé selon l'invention sont des nanocelluloses. Tableau 1 :

Enzymes fongiques répertoriées de la famille AA9 (classification CAZy)

Nom Organisme Réf. GenBank Réf.

Uniprot cellobiohydrolase family protein 61 , Chaetomium AGY80103.1

partial (Cbh61 -2) (fragment) thermophilum CT2

cellobiohydrolase family protein 61 , Chaetomium AGY80104.1

partial (Cbh61 -3) (fragment) thermophilum CT2

cellobiohydrolase family protein 61 , Chaetomium AGY80105.1

partial (Cbh61 -4) (fragment) thermophilum CT2

ORF (possible fragment) Colletotrichum CAQ16278.1 B5WYD8 graminicola M2

ORF Colletotrichum CAQ16206.1 B5WY66 graminicola M2

ORF Colletotrichum CAQ16208.1 B5WY68 graminicola M2

ORF Colletotrichum CAQ16217.1 B5WY77 graminicola M2

unnamed protein product Coprinopsis cinerea CAG27578.1

CGB_A6300C Cryptococcus ADV19810.1

bacillisporus WM276

CNAG_00601 Cryptococcus AFR92731 .1

neoformans var. AFR92731 .2

grubii H99

(Cryne_H99_ 1 )

CeM Cryptococcus AAC39449.1 059899 neoformans var.

neoformans

CNA05840 (CeM ) Cryptococcus AAW41 121 .1 F5HH24 neoformans var.

neoformans JEC21

(Cryne_JEC21_ 1)

ORF (fragment) Flammulina velutipes ADX07320.1

KACC 42777

FFUJJ 2340 Fusarium fujikuroi IMI CCT72465.1

58289 (Fusful)

FFUJJ 3305 Fusarium fujikuroi IMI CCT671 19.1

58289 (Fusful)

FFUJ_07829 Fusarium fujikuroi IMI CCT69268.1

58289 (Fusful)

FFUJJ 2621 Fusarium fujikuroi IMI CCT72729.1

58289 (Fusful)

FFUJJ 2840 Fusarium fujikuroi IMI CCT72942.1

58289 (Fusful)

FFUJ_09373 Fusarium fujikuroi IMI CCT73805.1

58289 (Fusful)

FFUJJ 0599 Fusarium fujikuroi IMI CCT74544.1

58289 (Fusful) Nom Organisme Réf. GenBank Réf.

Uniprot

FFUJJ 0643 Fusarium fujikuroi IMI CCT74587.1

58289 (Fusful)

FFUJJ 4514 Fusarium fujikuroi IMI CCT67584.1

58289 (Fusful)

FFUJ_1 1399 Fusarium fujikuroi IMI CCT75380.1

58289 (Fusful)

FFUJJ 4514 Fusarium fujikuroi IMI CCT67584.1

58289

FFUJ_1 1399 Fusarium fujikuroi IMI CCT75380.1

58289

FFUJ_04652 Fusarium fujikuroi IMI CCT64153.1

58289 (Fusful)

FFUJ_03777 Fusarium fujikuroi IMI CCT64954.1

58289 (Fusful)

FFUJ_04940 Fusarium fujikuroi IMI CCT63889.1

58289 (Fusful)

Séquence 122805 from patent US Fusarium ABT35335.1

7214786 graminearum

FG03695.1 (Cel61 E) Fusarium XP_383871 .1

graminearum PH- 1

unnamed protein product Fusarium CEF78545.1

graminearum PH- 1

unnamed protein product Fusarium CEF74901 .1

graminearum PH- 1

unnamed protein product Fusarium CEF78472.1

graminearum PH- 1

unnamed protein product Fusarium CEF86346.1

graminearum PH- 1

unnamed protein product Fusarium CEF87450.1

graminearum PH- 1

unnamed protein product Fusarium CEF85876.1

graminearum PH- 1

unnamed protein product Fusarium CEF86254.1

graminearum PH- 1

unnamed protein product Fusarium CEF87657.1

graminearum PH- 1

unnamed protein product Fusarium CEF76256.1

graminearum PH- 1

unnamed protein product Fusarium CEF78876.1

graminearum PH- 1

unnamed protein product Fusarium CEF79735.1

graminearum PH- 1 om Organisme Réf. GenBank Réf.

Uniprot unnamed protein product Fusarium CEF74460.1

graminearum PH- 1

unnamed protein product Fusarium CEF84640.1

graminearum PH- 1

endo-3-1 ,4-glucanase (Cel61 G) Gloeophyllum AEJ35168.1

trabeum

GH61 D Heterobasidion AF072234.1

parviporum

GH61 B Heterobasidion AF072233.1

parviporum

GH61 A Heterobasidion AF072232.1

parviporum

GH61 F Heterobasidion AF072235.1

parviporum

GH61 G Heterobasidion AF072236.1

parviporum

GH61 H Heterobasidion AF072237.1

parviporum

GH61 I Heterobasidion AF072238.1

parviporum

GH61 J Heterobasidion AF072239.1

parviporum

unnamed protein product Humicola insolens CAG27577.1

endoglucanase IV (EgiV) Hypocrea orientalis AFD50197.1

EU7-22

GH61 A (GH61 A) Lasiodiplodia CAJ81215.1

theobromae CBS

247.96

GH61 B (GH61 B) Lasiodiplodia CAJ81216.1

theobromae CBS

247.96

GH61 C (GH61 C) Lasiodiplodia CAJ81217.1

theobromae CBS

247.96

GH61 D (GH61 D) Lasiodiplodia CAJ81218.1

theobromae CBS

247.96

ORF Leptosphaeria CBX91313.1 E4ZJM8 maculans v23. 1.3

ORF Leptosphaeria CBX93546.1 E4ZQ1 1 maculans v23. 1.3

ORF Leptosphaeria CBX94224.1 E4ZS44 maculans v23. 1.3 Nom Organisme Réf. GenBank Réf.

Uniprot

MGG_12733 (probable fragment) Magnaporthe grisea XP_003716689.1

70- 15 (Maggrl)

copper-dependent polysaccharide Malbranchea CCP37674.1

monooxygenases (Gh61 ) (fragment) cinnamomea CBS

115.68

copper-dependent polysaccharide Melanocarpus CCP37668.1

monooxygenases (Gh61 ) (fragment) albomyces CBS

638.94

copper-dependent polysaccharide Myceliophthora CCP37667.1

monooxygenases (Gh61 ) (fragment) fergusii CBS 406.69

MYCTH_21 12799 Myceliophthora AE061257.1

thermophila ATCC

42464

MYCTH_79765 Myceliophthora AEO56016.1

thermophila ATCC

42464

MYCTHJ 10651 Myceliophthora AEO54509.1

thermophila ATCC

42464

MYCTH_2298502 Myceliophthora AEO55082.1

thermophila ATCC

42464

MYCTH_2299721 Myceliophthora AE055652.1

thermophila ATCC

42464

MYCTH_2054500 Myceliophthora AE055776.1

thermophila ATCC

42464

MYCTHJ 1 1088 Myceliophthora AE056416.1

thermophila ATCC

42464

β-glycan-cleaving enzyme Myceliophthora AE056542.1

(StCel61 a ; MYCTH_46583) thermophila ATCC

(Cel61 A) 42464

MYCTH_2301632 Myceliophthora AE056547.1

thermophila ATCC

42464

MYCTHJ 00518 Myceliophthora AE056642.1

thermophila ATCC

42464

lytic polysaccharide monooxygenases Myceliophthora AE056665.1

(active on cellulose) (MYCTH_92668) thermophila ATCC

42464

Nom Organisme Réf. GenBank Réf.

Uniprot

Pc13g131 10 Pénicillium CAP92380.1 B6H3A3 chrysogenum

Wisconsin 54- 1255

(PenchWisc1_ 1)

Pc20g1 1 100 Pénicillium CAP86439.1 B6HG02 chrysogenum

Wisconsin 54- 1255

(PenchWisc1_ 1)

Cel61 (Cel61 A) Phanerochaete AAM22493.1 Q8NJI9 chrysosporium BKM- F- 1767

Lytic polysaccharide mono- Phanerochaete BAL43430.1

oxygenase active on cellulose chrysosporium K-3

(Gh61 D;PcGH61 D)

PIIN_01487 Piriformospora indica CCA67659.1

(Pirinl)

PIIN_021 10 Piriformospora indica CCA68244.1

(Pirinl)

PIIN_03975 Piriformospora indica CCA70035.1

(Pirinl)

PIIN_04357 Piriformospora indica CCA70418.1

(Pirinl)

PIIN_04637 Piriformospora indica CCA70703.1

(Pirinl)

PIIN_061 17 Piriformospora indica CCA72182.1

(Pirinl)

PIIN_061 18 Piriformospora indica CCA72183.1

(Pirinl)

PIIN_06127 Piriformospora indica CCA72192.1

(Pirinl)

PIIN_06155 Piriformospora indica CCA72220.1

(Pirinl)

PIIN_07098 Piriformospora indica CCA73144.1

(Pirinl)

PIIN_07105 Piriformospora indica CCA73151 .1

(Pirinl)

PIIN_08199 Piriformospora indica CCA74246.1

(Pirinl)

PIIN_08783 Piriformospora indica CCA74814.1

(Pirinl)

PIIN_09022 Piriformospora indica CCA75037.1

(Pirinl)

PIIN_00566 (fragment) Piriformospora indica CCA66803.1

(Pirinl) om Organisme Réf. GenBank Réf.

Uniprot

PIIN_01484 Piriformospora indica CCA67656.1

(Pirinl)

PIIN_01485 (fragment) Piriformospora indica CCA67657.1

(Pirinl)

PIIN_01486 (fragment) Piriformospora indica CCA67658.1

(Pirinl)

PIIN_04356 Piriformospora indica CCA70417.1

(Pirinl)

PIIN_05699 (fragment) Piriformospora indica CCA71764.1

(Pirinl)

PIIN_06156 Piriformospora indica CCA72221 .1

(Pirinl)

PIIN_08402 Piriformospora indica CCA74449.1

(Pirinl)

PIINJ 0315 (fragment) Piriformospora indica CCA76320.1

(Pirinl)

PIINJ 0660 (fragment) Piriformospora indica CCA76671 .1

(Pirinl)

PIIN_00523 (fragment) Piriformospora indica CCA77877.1

(Pirinl)

Putative Glycoside Hydrolase Family Podospora anserina CDP30131 .1 B2AL941 S mat+ (Podan2) CAP64732.1

Putative Glycoside Hydrolase Family Podospora anserina CDP30928.1 B2B3461 S mat+ (Podan2) CAP71532.1

Pa_1_500 Podospora anserina CAP59702.1 B2A9F5

S mat+ (Podan2) CDP22345.1

Pa_4_350 Podospora anserina CAP61395.1 B2AD80

S mat+ (Podan2) CDP27750.1

Pa_4_1020 Podospora anserina CAP61476.1 B2ADG1

S mat+ (Podan2) CDP27830.1

Pa_0_270 Podospora anserina CAP61650.1 B2ADY5

S mat+ (Podan2) CDP28001 .1

Pa_5_8940 Podospora anserina CAP64619.1 B2AKU6

S mat+ (Podan2) CDP30017.1

Pa_5_4100 (fragment) Podospora anserina CAP64865.1 B2ALM7

S mat+ (Podan2) CDP29378.1

Pa_5_6950 Podospora anserina CAP651 1 1 .1 B2AMI8

S mat+ (Podan2) CDP29800.1

Pa_5_10660 Podospora anserina CAP65855.1 B2APD8

S mat+ (Podan2) CDP30283.1

Pa_5_10760 Podospora anserina CAP65866.1 B2APE9

S mat+ (Podan2) CDP30272.1 Nom Organisme Réf. GenBank Réf.

Uniprot

Pa_5_1 1630 (fragment) Podospora anserina CAP65971 .1 B2API9

S mat+ (Podan2) CDP30166.1

Pa_4_7570 Podospora anserina CAP66744.1 B2ARG6

S mat+ (Podan2) CDP28479.1

Pa_1_21900 (fragment) Podospora anserina CAP67176.1 B2AS05

S mat+ (Podan2) CDP24589.1

Pa_1_22040 Podospora anserina CAP67190.1 B2AS19

S mat+ (Podan2) CDP24603.1

Pa_1_22150 (fragment) Podospora anserina CAP67201 .1 B2AS30

S mat+ (Podan2) CDP24614.1

Pa_6_1 1220 Podospora anserina CAP67466.1 B2ASU3

S mat+ (Podan2) CDP30332.1

Pa_6_1 1370 Podospora anserina CAP67481 .1 B2ASV8

S mat+ (Podan2) CDP30347.1

Pa_6_1 1470 Podospora anserina CAP67493.1 B2ASX0

S mat+ (Podan2) CDP30359.1

Pa_1_16300 Podospora anserina CAP67740.1 B2ATL7

S mat+ (Podan2) CDP23998.1

Pa_7_5030 Podospora anserina CAP68173.1 B2AUV0

S mat+ (Podan2) CDP31642.1

Pa_7_3770 Podospora anserina CAP68309.1 B2AV86

S mat+ (Podan2) CDP31780.1

Pa_7_3390 Podospora anserina CAP68352.1 B2AVC8

S mat+ (Podan2) CDP31823.1

lytic polysaccharide mono-oxygenase Podospora anserina CAP68375.1 B2AVF1 active on cellulose S mat+ (Podan2) CDP31846.1

(Gh61 B;Pa_7_3160)(Gh61 B)

Pa_6_7780 Podospora anserina CAP71839.1 B2B403

S mat+ (Podan2) CDP31230.1

Pa_2_1700 Podospora anserina CAP72740.1 B2B4L5

S mat+ (Podan2) CDP25137.1

Pa_2_4860 Podospora anserina CAP73072.1 B2B5J7

S mat+ (Podan2) CDP25472.1

lytic polysaccharide mono-oxygenase Podospora anserina CAP73254.1 B2B629 active on cellulose S mat+ (Podan2) CDP25655.1

(Gh61 A;Pa_2_6530)(Gh61 A)

Pa_2_7040 Podospora anserina CAP7331 1 .1 B2B686

S mat+ (Podan2) CDP25714.1

Pa_2_7120 Podospora anserina CAP73320.1 B2B695

S mat+ (Podan2) CDP25723.1

Pa_3_190 Podospora anserina CAP61048.1 B2AC83

S mat+ (Podan2) CDP26500.1 Nom Organisme Réf. GenBank Réf.

Uniprot

Pa_3_2580 Podospora anserina CAP70156.1 B2AZV6

S mat+ (Podan2) CDP26748.1

Pa_3_3310 Podospora anserina CAP70248.1 B2AZD4

S mat+ (Podan2) CDP26841 .1

endo-3-1 ,4-glucanase (EgM ; Pyrenochaeta AEV53599.1

PIEGL1 ) lycopersici ISPaVe

ER 1211

copper-dependent polysaccharide Rasamsonia CCP37669.1

monooxygenases (Gh61 ) (fragment) byssochlamydoides

CBS 151.75

copper-dependent polysaccharide Remersonia CCP37675.1

monooxygenases (Gh61 ) (fragment) thermophila CBS

540.69

RHTO0S_28e01816g Rhodosporidium CDR49619.1

toruloides CECT1137

copper-dependent polysaccharide Scytalidium CCP37676.1

monooxygenases (Gh61 ) (fragment) indonesiacum CBS

259.81

SMU2916 (fragment) Sordaria macrospora CAQ58424.1 C1 KU36 k-hell

lytic polysaccharide mono-oxygenase Thermoascus ABW56451 .1

active on cellulose aurantiacus ACS05720.1

copper-dependent polysaccharide Thermoascus CCP37673.1

monooxygenases (Gh61 ) (fragment) aurantiacus CBS

891.70

ORF Thermoascus AG068294.1

aurantiacus var.

levisporus

copper-dependent polysaccharide Thermomyces CCP37672.1

monooxygenases (Gh61 ) (fragment) dupontii CBS 236.58

copper-dependent polysaccharide Thermomyces CCP37678.1

monooxygenases (Gh61 ) (fragment) lanuginosus CBS

632.91

unnamed protein product Thielavia terrestris CAG27576.1

THITE_2106556 Thielavia terrestris AE062422.1

NRRL 8126

THITE_21 16536 Thielavia terrestris AE067662.1

NRRL 8126

THITE_2040127 Thielavia terrestris AEO64605.1

NRRL 8126

THITE_21 19040 Thielavia terrestris AEO69044.1

NRRL 8126

THITEJ 15795 Thielavia terrestris AE064177.1

NRRL 8126 Nom Organisme Réf. GenBank Réf.

Uniprot

THITE_21 10890 Thielavia terrestris AE064593.1

NRRL 8126

THITE_21 12626 Thielavia terrestris AE065532.1

NRRL 8126

THITE_2076863 Thielavia terrestris AEO65580.1

NRRL 8126

THITE 170174 Thielavia terrestris AE066274.1

NRRL 8126

THITE_2044372 Thielavia terrestris AE067396.1

NRRL 8126

THITE_2170662 Thielavia terrestris AEO68023.1

NRRL 8126

THITE 128130 Thielavia terrestris AE068157.1

NRRL 8126

THITE_2145386 Thielavia terrestris AE068577.1

NRRL 8126

THITE_2054543 Thielavia terrestris AE068763.1

NRRL 8126

THITE_2059487 Thielavia terrestris AE071031 .1

NRRL 8126

THITE_2142696 Thielavia terrestris AE067395.1

NRRL 8126

THITE_43665 Thielavia terrestris AEO69043.1

NRRL 8126

THITE_2085430 (fragment) Thielavia terrestris AE063926.1

NRRL 8126

THITE_2122979 Thielavia terrestris XP_003657366.1

NRRL 8126

cellulase-enhancing factor (GH61 B) Thielavia terrestris ACE10231 .1

NRRL 8126

Séquence 4 from patent US Thielavia terrestris ACE10232.1

7361495 (GH61 C) NRRL 8126

Séquence 4 from patent US Thielavia terrestris ACE10232.1

7361495 (GH61 C) NRRL 8126

Séquence 6 from patent US Thielavia terrestris ACE10233.1

7361495 (GH61 D) NRRL 8126

Séquence 6 from patent US Thielavia terrestris ACE10233.1

7361495 (GH61 D) NRRL 8126

lytic polysaccharide mono-oxygenase Thielavia terrestris AE071030.1

active on cellulose NRRL 8126 ACE10234.1

(131562;TtGH61 E)(GH61 E)

Séquence 10 from patent US Thielavia terrestris ACE10235.1

7361495 (GH61 G) NRRL 8126

Tableau 2 :

LPMOs (familles AA9, AA10 et AA11 de la classification CAZy).

Par « spécificité de substrat », on entend le type de substrat clivé (clivage oxydatif) par l'enzyme LPMO correspondante.

Par « sélectivité connue », on entend le carbone du cycle de glucose oxydé par l'enzyme LPMO correspondante

Par « Modularité », on entend la classe CAZy (AA9, 10 ou 1 1 ) de l'enzyme et la présence connue d'un domaine conservé (CBM ou X278).

Spécificité

Réf. Réf. Sélectivité

Organisme Autres noms de Modularité

Uniprot GenBank connue

substrat

champignons

A. oryzae Q2UA85 BAE61530 AolkkA 1 chitine C1 AA1 1 -X278

A. nidulan EAA AA13- s C8VGF8 62623.1 AnAA13 amidon C1 CBM20

M. MYCTH 1 120

thermophila G2QI82 AEO60271 89 cellulose C1 AA9

M. MYCTH 9266

thermophila G2QAB5 AE056665 8 cellulose C1 AA9

Q7RWN

N. crassa 7 EAA26873 A/CLPM09E cellulose C1 AA9-CBM1

Q1 K8B6

Q8WZQ EAA32426

N. crassa 2 CAD21296 A/CLPM09D cellulose C4 AA9

N. crassa Q7SA19 EAA33178 A/CLPM09M cellulose C1 , C4 AA9

cellulose

hemicellu-

N. crassa Q7SHI8 EAA36362 A/CLPM09C lose C4 AA9-CBM1

EAA26656

N. crassa Q1 K4Q1 CAD70347 A/CLPM09F cellulose C1 AA9

N. crassa Q7SCJ5 EAA34466 NcU00836 cellulose C1 AA9-CBM1

EAA AA13-

N. crassa Q7SCE9 34371 .2 NcAA13 amidon C1 CBM20

N. crassa Q7S439 EAA30263 NcU02240 cellulose C4 AA9-CBM1

N. crassa Q7S1 1 1 EAA29018 NcU07760 cellulose C1 , C4 AA9-CBM1

P.

chrysosporium H1 AE14 BAL43430 PcLPM09D cellulose C1 AA9

PaGH61 A

P. anserina B2B629 CAP73254 PaLMPOB cellulose C1 a , C4 a AA9-CBM1

PaGH61 B

P. anserina B2AVF1 CAP68375 PaLMP09A cellulose C1 , C4 AA9-CBM1

AA9

P. anserina B2ARG6 CAP66744 PaLPM09D cellulose C1 CBM1 Spécificité

Réf. Réf. Sélectivité

Organisme Autres noms de Modularité

Uniprot GenBank connue

substrat

AA9 CBM1

P. anserina B2ATL7 CAP67740 PaLPM09E cellulose C1

AA9 CBM1

P. anserina B2B403 CAP71839 PaLPM09F cellulose n.d

AA9 CBM1

P. anserina B2B5J7 CAP73072 PaLPM09G cellulose n.d

AA9 CBM1

P. anserina B2ADG1 CAP64476 PaLPM09H cellulose C1 , C4

T. ABW5645

aurantiacus G3XAP7 1 7aGH61 A cellulose C1 AA9

T. terrestris G2RGE5 AEO71030 cellulose n.d. AA9

T. reesei Q7Z9M7 AAP57753 cellulose n.d. AA9

T. reesei 014405 CAA71999 Cel61 A cellulose n.d. AA9

Bacteria

Bacillus

amyloliquefa- ciens E1 UUV3 CBI42985 n.d. n.d. AA10

Burkholderia BURPS1710b

pseudomallei 01 14

1710b Q3JY22 ABA49030 (BpAAI OA) n.d. n.d. AA10

Bacillus

licheniformes Q62YN7 AAU22121 chitine C1 AA10 β-1 ,4-

Caldibacillus mannanase

cellulovorans Q9RFX5 AAF22274 (ManA) n.d. n.d. AA10

Enterococcus

faecalis Q838S1 AAO80225 E LPMO10A chitine C1 AA10

LPMO

(HcAAI O-

Hahella 2;HCH 00807

chejuensis Q2SNS3 ABC27701 ) cellulose nd AA10

Serratia

marcescens 083009 AAU88202 SmLPMOI OA chitine C1 AA10

Streptomyces cellulose

coelicolor Q9RJC1 CAB61 160 ScLPMOl OB chitine C1 , C4 AA10

Streptomyces AA10- coelicolor Q9RJY2 CAB61600 ScLPMOI OC cellulose C1 CBM2 Spécificité

Réf. Réf. Sélectivité

Organisme Autres noms de Modularité

Uniprot GenBank connue

substrat

Thermobifida cellulose

fusca Q47QG3 AAZ55306 77LPMO10A chitine 01 , 04 AA10

Thermobifida AA10- fusca Q47PB9 AAZ55700 77LPMO10B cellulose 01 CBM2

V.

cholerae O ' l Q9KLD5 AAF96709 I/CLPMO10B n.d. n.d. AA10




 
Previous Patent: MULTILAYER MEMBRANE

Next Patent: ARTIFICIAL SATELLITE