(MRB-CFI-1) E USO

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a um processo de obtenção de um complexo nanoestruturado inorgânico (CFI- ), complexo nanoestruturado associado a proteína (MRB-CFI-1) e uso.

[002] A principal aplicação da tecnologia é o tratamento do câncer de bexiga urinária, tanto em animais quanto em seres humanos. Sua atividade antitumoral é única e potencialmente substituto de outros fármacos antineoplásicos comerciais.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] Todos os órgãos do trato urogenital são sedes potenciais de tumores malignos. A incidência e o tipo variam de órgão para órgão. O câncer de bexiga urinária (CB) representa a segunda doença maligna mais comum do trato urinário (Siegel et al., 2012; American Câncer Society, 2016).

[004] A Sociedade Americana para o Câncer estimou para 2016 cerca de 76.960 novos casos de CB nos Estados Unidos, sendo 58.950 em homens e 18.010 em mulheres. A estimativa também previu 16.390 mortes por CB, sendo 11.820 homens e 4.570 mulheres (American Câncer Society, 2016). Segundo dados do Instituto Nacional do Câncer (INCA, 2016) a estimativa para o Brasil em 2016 foi de 9.670 novos casos de CB, sendo 7.200 homens e 2.470 mulheres. Em 2013 foram notificadas 3.642 mortes por CB, sendo 2.542 homens e 1.099 mulheres, o que demonstra o drástico aumento na prevalência desse tipo de tumor.

[005] Mais de 70% da incidência de CB é superficial (pTis, pTa e pT1), tumor não-invasivo (CBNMI), e a ocorrência de uma doença invasiva é ocasional (Askeland et al., 2012). Contudo, 50% dos tumores não-músculo invasivos recorrem em 4 anos após o tratamento e 11 % evoluem para o fenótipo invasivo (Askeland et al., 2012).

[006] O estadiamento histológico do CB é determinado pela profundidade de invasão tumoral da parede vesical e dependerá da ressecção transuretral (RTU) do tumor, por via endoscópica, para seu diagnóstico correto. Fragmentos de ressecção superficiais e profundos devem ser analisados separadamente (Epstein et al., 1998; Epstein, 2003). A classificação TNM 2009 (UICC - Union for Câncer Control) é utilizada para o estadiamento.

[007] Um número significativo de fatores de risco tem sido relacionado ao desenvolvimento de CB. Segundo dados do registro da base populacional do INCA o maior fator de risco para o desenvolvimento do CB é o tabagismo, sendo responsável por cerca de 66% de novos casos em homens e 30% em mulheres (INCA, 2016). Na meta-análise de estudos epidemiológicos de Zeegers et al. (2000) sobre o impacto das características do tabagismo ao risco de câncer do trato urinário, o cigarro foi apontado como um fator que aumenta substancialmente o risco para o desenvolvimento do câncer de bexiga. O cigarro possui dezenas de substâncias tóxicas, dentre elas aminas aromáticas e compostos N-nitrosos análogos do MNU (N-metil-N-nitrosouréia) um potente carcinógeno.

[008] Outro fator de risco potencial para o desenvolvimento do CB é a exposição ocupacional às aminas aromáticas por trabalhadores de indústrias de borracha, têxtil e de tinta e a infecção por Schistosoma haematobiun, sendo este endémico em países mediterrâneos como o Egito (Zeegers et al., 2000; Poon et al., 2015; Rosenquist & Grollman, 2016). A exposição a certas substâncias tais como o arsénio, que pode estar presente em águas de abastecimento, o ácido aristolóquico presente em muitas plantas de uso medicinal e a pioglitazona presente em fármacos para tratamento de diabetes estão associados como um fator de risco (Poon et al., 2015; Rosenquist & Grollman, 2016).

[009] De acordo com a Sociedade Americana para o Câncer a ingestão reduzida de líquidos pode ser um fator de risco, pois um indivíduo que ingere quantidades elevadas de líquidos, principalmente água, tende a eliminar substâncias químicas mais rapidamente levando em consideração que este tenderá a esvaziar sua bexiga com mais frequência (American Câncer Society, 2016).

[0010] Em geral, o CB é cerca de 3 a 4 vezes mais comum em homens do que em mulheres (Nezos et al., 2009). Por outro lado, a sobrevida das mulheres é pior com esse tipo de tumor. Especula-se que a alta agressividade do câncer de bexiga nas mulheres é decorrente do desbalanço hormonal, o qual surge a partir da quinta década de vida. Embora a bexiga urinária seja secundariamente regulada por hormônios sexuais esteroides, o urotélio normal e os tumores uroteliais são responsivos aos andrógenos e estrógenos (Garcia et al., 2015). Garcia et al. (2015) demonstraram pela primeira vez em ratas induzidas quimicamente ao CBNMI que os níveis proteicos aumentados da ubiquitina ligase SIAH-2 supraregularam os receptores androgênicos e diminuíram os níveis dos receptores estrogênicos, culminando com o escape das células uroteliais neoplásicas do sistema imune. Esses mesmos autores verificaram que os níveis dos receptores do sistema imune, toll-like receptors (TLRs), foram diminuídos no CBNMI e associaram esse efeito ao aumento dos níveis de SIAH- 2 e dos receptores androgênicos.

[0011] O tratamento primário do câncer de bexiga não-músculo invasivo (CBNMI) baseia-se no tratamento cirúrgico através da ressecção transuretral (RTU), seguido da imunoterapia intravesical com Bacillus Calmette-Guerin (BCG), para diminuição da recidiva e prevenção da progressão tumoral. No entanto, o uso de organismos vivos e atenuados pode causar efeitos colaterais e dificuldade em predizer a resposta imune e antitumoral. O uso do BCG é limitado no CBNMI devido à falha do tratamento, efeitos adversos e intolerância que ocorrem em mais de dois terços dos pacientes. Embora o uso da RTU com quimioterapia ou imunoterapia adjuvantes represente um importante avanço no tratamento do CBNMI, o manejo deste tumor, principalmente para tumores de alto grau, continua sendo um desafio, devido às altas taxas de recorrência e progressão para os fenótipos músculo invasivo e/ ou metastáticos. A opção cirúrgica para tais casos, cistectomia parcial ou total, está frequentemente associada às altas taxas de morbidade e mortalidade. Além disso, para alguns pacientes, a cistectomia não constitui uma opção disponível devido à presença de comorbidades concomitantes. Assim, é de fundamental importância o desenvolvimento de novas modalidades terapêuticas que previnam a progressão da doença, permitam a preservação do órgão e a qualidade de vida dos pacientes e, finalmente, que forneçam uma opção para aqueles que são inelegíveis à cistectomia. Compostos que são capazes de agir como agonistas dos receptores do sistema imune (toll-like receptors) podem representar candidatos promissores a serem desenvolvidos como medicamentos contra o câncer.

[0012] Nesse contexto, destaca-se o uso do Modificador de Resposta Biológica- Complexo Fosfato Inorgânico 1 associado à proteína (MRB-CFI-1 ), o qual tem sido proposto com resultados promissores no tratamento do CBNMI. Além disso, a invenção deste novo nanofármaco para o tratamento do CBNMI apresenta grande eficiência, baixa toxicidade, economicamente viável, com grande reprodutibilidade e rendimento. Após os experimentos com animais de laboratório e protocolo clínico-veterinário em cães com CBNMI, a invenção apresenta grande potencial para uso em seres humanos.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[0013] A presente invenção refere-se a processos de obtenção de um complexo nanoestruturado inorgânico (CFI- ), complexo nanoestruturado associado a proteína (MRB-CFI-1 ) e uso antitumoral.

[0014] O complexo nanoestruturado (CFI-1) compreende fosfato inorgânico, tamanho variando de 190,0 - 310,3 ± 36,4 nm, polidispersidade de 0,563 e potencial zeta de -22,6 ± 4,15 mV.

[0015] O complexo nanoestruturado associado a proteína (MRB-CFI-1 ) compreende fosfatos associado a proteína, tamanho variando de 318,0 - 477,1 ± 146 nm, polidispersidade de 0,9 e potencial zeta de -28,60 ± 6,74 mV.

[0016] São objetos adicionais o uso dos complexos obtidos (CFI-1 ) e (MRB-CFI- 1 ) para tratar câncer, preferencialmente próstata, bexiga, colorretal, mastocitoma e linfoma.

[0017] Os compostos NH ₄ MgPO ₄ x 6H2O, (NH ₄ )2MgH ₂ (PO ₄ )2 x 4H ₂ O, (NH ₄ )2Mg3(HPO ₄ ) ₄ x 8H2O e NH ₄ MgPO ₄ x H2O, embora descritos na literatura, associados ou não a proteínas hidrolíticas, são objetos nesta invenção para tratar câncer. A presente invenção revela, ainda, os mecanismos dos referidos complexos em ativar o sistema imunológico, tanto epitelial (local) quanto sistémico no combate dos tumores. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0018] Para obter uma total e completa visualização do objeto desta invenção, são apresentadas as figuras as quais se faz referências, conforme se segue.

[0019] Figura 1 : Padrão de difração de raios-X (XRD) do CFI-1.

[0020] Figura 2: Análise termogravimétrico (TGA) de CFI-1 (A) e MRB-CFI-1 (B).

[0021] Figura 3: Análise de calorimetria diferencia de varredura (DSC) de CFI-1 (A) e do MRB-CFI-1 (B). Velocidade de 10°C/min.

[0022] Figura 4: Espectro Raman do CFI-1 (A) e MRB-CFI-1 (B).

[0023] Figura 5: Tamanho e carga superficial de CFI-1 (A) pelo método de espalhamento dinâmico de luz (DLS) ou espectroscopia de correlação de fótons (PCS) por intensidade. Potencial zeta medido pela mobilidade eletroforética no Zeta Sizer (Malvem). (B) mostra o mesmo método aplicado para MRB-CFI-1.

[0024] Figura 6: Padrão de difração de raios-X do MRB-CFI-1 (A) e do CFI-1 (B). Em (C) superposição de padrões de CFI-1 e MRB-CFI-1.

[0025] Figura 7: Dicroismo circular (CD) do CFI-1 e do CFI-1 associado a proteína P14-16 (ou MRB-CFI-1 ).

[0026] Figura 8: Microscopias de varredura por campo de emissão (FESEM micrograph) para CFI-1 (A) e MRB-CFI-1 (B), concordam com o tamanho medido pelo método método de espalhamento dinâmico de luz (DLS) descrito na Figura 5.

[0027] Figura 9: Ultrassonografia dos animais dos Grupos Controle (a) e induzidos com MNU (b, c, d, e). (a) Morfologia da bexiga urinária com aspectos normais (a), (b) Massas tumorais infiltrando as paredes cranial e ventral da bexiga, medindo 0,32 cm X 0,21 cm (b), 0,32 cm X 0,24 cm (c) e 0,27 cm X 0,21 cm (d). Mapeamento doppler colorido evidenciando intenso fluxo sanguíneo no interior da massa tumoral (e).

[0028] Figura 10: Fotomicrografias da bexiga urinária, ureter e rim de ratos dos grupos Controle (a, b, c); MRB-CFI 1 20 (d, e, f); MRB-CFI 1 50 (g, h, i); e MRB- CFI 1 100 (m, n, o), (a) e (b) Urotélio normal composto por 2-3 camadas de células: uma camada de células basais (Bc), uma camada de células intermediárias (lc), e uma camada superficial composta por células em guarda- chuva (Uc). (c) e (f) Néfrons normais: glomérulo (Gl), podócitos (Pd), túbulo contorcido proximal (Pct), túbulo contorcido distai (Dct), mácula densa (Md), pólo urinário (Up), pólo vascular (Vp). (j) e (k) Hiperplasia urotelial plana e inflamação intensa (asteriscos e setas) tanto na bexiga urinária quanto no ureter; Vaso sanguíneo (Bv). (I) Intensa inflamação (asteriscos) nos néfrons. (d) e (e) Inflamação mínima (asteriscos e setas) tanto na bexiga urinária quanto no ureter, (g) e (h) Inflamação moderada (asteriscos e setas) e hiperplasia urotelial plana tanto na bexiga urinária quanto no ureter, (i) Inflamação moderada (asteriscos) nos néfrons. a - 1: Gl - glomérulo, Lp - lâmina própria, Ur - urotélio.

[0029] Figuras 11 : Fotomicrografias da bexiga urinária e rim de camundongo dos grupos Controle (a, b), MRB-CFI 1 20 (c, d), MRB-CFI 1 50 (e, f) e MRB-CFI 1 100 (g, h). (a) Urotélio normal da bexiga urinária composto por 2-3 camadas de células: uma camada de células basais (Bc), uma camada de células intermediárias (lc), e uma camada superficial composta por células em guarda- chuva (Uc). (b) e (d) Néfrons normais: glomérulo (Gl), podócitos (Pd), túbulo contorcido proximal (Pct), túbulo contorcido distai (Dct), mácula densa (Md), pólo urinário (Up), pólo vascular (Vp). (c) Inflamação mínima (asteriscos e setas) na bexiga urinária, (e) e (g) Inflamação moderada (asteriscos e setas) e hiperplasia urotelial plana na bexiga urinária, (f) e (h) Inflamação moderada (asteriscos) nas nos néfrons. a - h: Gl - glomérulo, Lp - lâmina própria, Ur - urotélio.

[0030] Figura 12: Fotomicrografias da bexiga urinária e rim de coelhos dos grupos Controle (a, b), MRB-CFI 1 20 (c, d), MRB-CFI 1 50 (e, f) e MRB-CFI 1 00 (g, h). (a) e (c) Urotélio normal da bexiga urinária composto de 2-3 camadas células: uma camada de células basais (Bc), uma camada de células intermediárias (lc) e uma camada superficial composta por células em guarda- chuva (Uc). (b) e (d) Néfrons normais: glomérulo (Gl), podócitos (Pd), túbulo contorcido proximal (Pct), túbulo contorcido distai (Dct), mácula densa (Md), pólo urinário (Up), pólo vascular (Vp). (e) e (g) Inflamação moderada (asteriscos e setas) e hiperplasia urotelial plana na bexiga urinária, (f) e (h) Inflamação moderada (asteriscos) nos néfrons. a - h: Gl - glomérulo, Lp - lâmina própria, Ur - urotélio.

[0031] Figura 13: Fotografias da cavidade abdominal e avaliação macroscópica do peritônio dos ratos dos grupos Controle (a), CFI-1 (b) e MRB-CFI-1 (c, d), (a) Cavidade abdominal normal e peritônio sem sinais de inflamação, (b) Peritônio com sinais moderados de inflamação caracterizados por rubor, aumento da vascularização e pontos hemorrágicos (asteriscos), além de pequenos aglomerados de cristais de fosfatos (setas), (c), (d) Intensa inflamação peritoneal caracterizada pelo aumento do rubor, da vascularização e dos pontos hemorrágicos (asteriscos), além do aumento dos depósitos de cristais de fosfatos (setas) na cavidade abdominal.

[0032] Figura 14: Fotomicrografias das bexigas urinárias dos grupos Controle (a, b), MNU (c, d) e MNU + Complexo Fosfato Inogânico 1 (CFI-1) (e, f, g, h). (a), (b) Urotélio normal composto por 2-3 camadas: uma camada de células basais (cabeça de seta fechada), uma camada intermediária de células (seta), e uma camada superficial ou apical composta por células em guarda-chuva (cabeça de seta aberta), (c), (d), (f) Carcinoma urotelial invasivo (pT1): células neoplásicas dispostas em pequenos grupos (asteriscos) invadindo o conjuntivo da mucosa e diferenciação escamosa focal, (e) Carcinoma in situ plano (pTis), caracterizado por atipia celular: núcleos volumosos com citoplasma reduzido e nucléolos proeminentes (setas), (g), (h) Hiperplasia plana composta por diversas camadas celulares no urotélio, mas com ausência de atipias citológicas. a - h: Lp - conjuntivo da mucosa, M - camada muscular própria, Ur - urotélio.

[0033] Figura 15: Fotomicrografias das bexigas urinárias dos grupos MNU + P14- 16 (a, b, c, d) e MNU + MRB-CFI 1 (e, f, g, h). (a), (b), (g), (h) Hiperplasia plana composta por diversas camadas celulares no urotélio: camada de células basais, camada intermediária de células e camada superficial, mas com ausência de atipias citológicas. (c), (d) Carcinoma urotelial não-invasivo (pTa) caracterizado por lesões papilíferas e células uroteliais com arranjo desordenado e com perda da polaridade; figuras de mitose (setas), (e), (f) Urotélio normal composto por 2- 3 camadas: uma camada de células basais (cabeça de seta fechada), uma camada intermediária de células (seta), e uma camada superficial ou apical composta por células em guarda-chuva (cabeça de seta aberta), a - h: Lp - conjuntivo da mucosa, M - camada muscular própria, Ur - urotélio.

[0034] Figura 16: Ultrassonografias representativas da bexiga urinária dos Cães 1 e 2 nos seguintes tempos: antes da primeira instilação (a, b), após a primeira instilação (c, d) e após 3 (e, f), 6 (g, h), 18 (i, j) e 22 (k, I) instilações do MRB-CFI- 1. [0035] Figura 17: Ultrassonografias representativas da bexiga urinária dos Cães 3 e 4 nos seguintes tempos: antes da primeira instilação (a, b), após a primeira instilação (c, d) e após 3 (e, f), 6 (g, h), 18 (i, j) e 22 (k, I) instilações do MRB-CFI- 1.

[0036] Figura 18: Ultrassonografias representativas da bexiga urinária dos Cães 5 e 6 nos seguintes tempos: antes da primeira instilação (a, b), após a primeira instilação (c, d) e após 3 (e, f), 6 (g, h), 8 (i, j) e 22 (k, I) instilações do MRB-CFI- 1.

[0037] Figura 9: Citotoxicidade do MRB-CFI-1 e em células 5637 de carcinoma de bexiga urinária grau II. (A) As células 5637 foram plaqueadas em densidade celular de 2,0x10 ⁴ e tratadas com diluições seriadas dos compostos (12,5 mg, 6,25 mg, 3,13 mg, 1 ,56 mg e 0,39 mg) ao longo das 24 horas de incubao. Cada valor representa a média ± desvio padrão de três experimentos independentes (n = 3). A viabilidade celular foi normalizada para controle não-tratado. (B) Imagens representativas do composto MRB-CFI-1 pelo ensaio Calceína-AM/ PI. As células 5637 foram plaqueadas em densidade celular de 2,0x ⁰⁴ e tratadas com 12,5 mg, ao longo das 24 horas de incubação. As imagens foram obtidas em DAPI, GFP e lodeto de Propídio, ampliação de 100x e alongamento 2x2. Linha: I - grupo controle; II - 12,5 mg de MRB-CFI-1. Coluna: 1- Hoesch 33342 (DAPI); 2- Calceína (GFP); 3- lodeto de Propídio (PI), 4- Fusão de todos os canais. Escala de barra: 300 pm.

[0038] Figura 20: Difração de Raios-X (XRD): (A) CFI-1-PIBR-2017; obtido conforme definido no exemplo de concretização (I). (B) CFI-1 +Etanolamina; obtido conforme definido no exemplo de concretização (II). (C) Superposição das duas figuras de XRD.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0039] Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a processos de obtenção de um complexo nanoestruturado inorgânico (CFI-1), complexo nanoestruturado associado a proteína (MRB-CFI-1) e uso antitumoral.

[0040] A seguir estão descritos 02 (dois) exemplos de concretização referentes à obtenção do complexo nanoestruturado inorgânico (CFI- ) e do complexo nanoestruturado associado a proteína (MRB-CFI-1). 18 000031

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Exemplo de concretização (I):

[0041 ] O processo de obtenção de complexo nanoestruturado (CFI- ) por síntese química compreende as seguintes etapas:

(a) Preparar fosfato de amónio dibásico [(ΝΗ4)2ΗΡ0 ₄ ] in situ na presença de amónia e ácido ortofosfórico, em homogeneizador mecânico com potência mínima de 500 W (por exemplo, do tipo ultra turrax), em uma temperatura compreendida entre 25 e 55°C por 20-30 min até neutralização;

(b) Misturar dois sais: cloreto de magnésio hexahidratado, de 1-3% (em massa) e fosfato de amónio dibásico obtido na etapa (a) em uma concentração de 1-4% (em massa) entre 22 a 30°C e pH 5 a 7, em homogeneizador mecânico com potência mínima de 500 W (por exemplo, do tipo ultra turrax) em uma faixa de rotação variável entre 7000 e 5000 rpm por 30-40 min;

(c) Aplicar um patamar de pressão na mistura obtida na etapa (b) em homogeneizador de alta pressão (por ex.; NIRO) com a válvula de homogeneização com pressão variável entre 400 e 700 bar, preferencialmente 600 bar, no segundo estágio a válvula de homogeneização com pressão variável entre 50 e 70 bar, preferencialmente 60 bar, por até 1 a 3 ciclos, preferencialmente 2 ciclos;

(d) Resfriar a suspensão obtida na etapa (c) em banho de gelo a uma faixa de temperatura compreendia entre 0 e 20°C, preferencialmente 15°C;

(e) Precipitar; e

(f) Lavar os cristais com água destilada e estéril e secos a 30 a 40°C, preferencialmente a 37°C por 24 a 72 h, preferencialmente a 48 h.

[0042] Após a etapa (f) os cristais de CFI-1 foram secos e pesados, apresentando rendimento em massa de 45-50% de rendimento.

[0043] O complexo nanoestruturado (CFI-1), obtido conforme definido no exemplo de concretização (I), dito PRODUTO 1 , compreende fosfato inorgânico, tamanho variando de 190,0 - 310,3 ± 36,4 nm, polidispersidade de 0,563 e potencial zeta de -22,6 + 4, 5 mV.

[0044] O processo de obtenção de um complexo nanoestruturado associado a proteína (MRB-CFI-1 ) por síntese química compreende as seguintes etapas: (a) Preparar fosfato de amónio dibásico [(NH- 2HPO4] in situ na presença de amónia e ácido ortofosfórico, em homogeneizador mecânico com potência mínima de 500 W (por exemplo, do tipo ultra turrax), em uma temperatura compreendida entre 25 e 55°C por 20-30 min até neutralização;

(b) Misturar dois sais: cloreto de magnésio hexahidratado, de 1-3% (em massa) e fosfato de amónio dibásico obtido na etapa (a) em uma concentração de 1-4% (em massa) entre 22 a 30°C e pH 5 a 7, em homogeneizador mecânico em uma faixa de rotação variável entre 7000 e 15000 rpm por 30-40 min;

(c) Adicionar proteína em uma concentração 0,5-1 ,5% (massa/massa), preferencialmente 1 %, ao complexo obtido na etapa (b), em que a referida proteína compreende as proteínas hidrolíticas selecionadas do grupo compreendido por quitinase do Bacillus subtilis (14 kDa) e lisozima de clara de ovo (14 kDa), preferencialmente a lisozima, as quais possuem atividades imunomodulatórias.

(d) Aplicar um patamar de pressão na mistura obtida na etapa (c) em homogeneizador de alta pressão (NIRO) com a válvula de homogeneização com pressão variável entre 400 e 700 bar, preferencialmente 600 bar, no segundo estágio a válvula de homogeneização com pressão variável entre 50 e 70 bar, preferencialmente 60 bar, por até 1 a 3 ciclos, preferencialmente 2 ciclos;

(e) Resfriar a suspensão obtida na etapa (c) em banho de gelo a uma faixa de temperatura compreendia entre 0 e 20°C, preferencialmente 15°C;

(f) Precipitar; e

(g) Lavar os cristais com água destilada e estéril e secos a 30 a 40°C, preferencialmente a 37°C por 24 a 72 h, preferencialmente a 48 h.

[0045] A proteína adicionada na etapa (c) compreender, preferencialmente, uma concentração de 0,7%.

[0046] O complexo nanoestruturado associado a proteína (MRB-CFI-1 ), obtido conforme definido no exemplo de concretização (I), dito PRODUTO 2, compreende fosfato inorgânico associado a proteína, tamanho variando de 318,0 - 477,1 ± 146 nm, polidispersidade de 0,9 e potencial zeta de -28,60 ± 6,74 mV. Exemplo de concretização (II):

[0047] O processo de obtenção de complexo nanoestruturado (CFI-1 ) por síntese química compreende as seguintes etapas:

(a) Preparar uma solução de fosfato de amónio dibásico [(NH4)2HP0 ₄ ] (Massa Molar: 132,6 g/mol) ultrapuro (99,99%), com concentração compreendida na faixa de 1 e 4% (em massa), preferencialmente 1 %, diluído em 1.000 - 2.000 mL de água destilada, sob agitação magnética com velocidade controlada, rotação entre 200 e 400 rpm, preferencialmente 300 rpm, temperatura entre 22°C e 30°C, e pH 8,26 - 8,57 por 5 minutos;

(b) Adicionar de 0,5 a 2,0% de uma amina selecionada do grupo compreendido por monoetanolamina; dietanolamina; e trietanolamina, preferencialmente monoetanolamina (2-Aminoetanol; C2H7NO; Massa molar: 61 ,08 g/mol), na solução de fosfato de amónio dibásico [(ΝΗ ₄ )2ΗΡ04] obtido na etapa (a) sob agitação com rotação compreendida entre 200 e 400 rpm, em uma faixa de temperatura compreendida entre 22°C e 30°C, mantendo o pH entre 9,72 e 9,80 por 5 minutos até completar a homogeneização.

(c) Manter a solução de fosfato de amónio dibásico [(NH ₄ )2HP0 ₄ ] e monoetalonamina, obtida na etapa (b), sob agitação mecânica, rotação entre 200 - 400 rpm, temperatura entre 22°C a 30°C, e pH 9,72 - 9,80;

(d) Preparar uma solução de cloreto de magnésio hexahidratado (MgCte.

6H2O) (Massa molar: 203,3 g/mol) ultrapuro (99,99%), em uma concentração compreendida na faixa de 1-3% (em massa), preferencialmente 2%, sob agitação com rotação compreendida entre 200 e 400 rpm, preferencialmente 300 rpm, em uma faixa de temperatura compreendida entre 22 e 30°C, em uma faixa de pH compreendida entre 7,38 e 7,56, por 5 min até completar a homogeneização; sendo que posteriormente a referida solução é transferida em funil de separação de 200-600 mL ou a um aparelho Titrette® Bottletop Burette com volume adequado;

(e) Gotejamento lento e controlado do líquido mais denso obtido na etapa (d) na solução resultante obtida na etapa (b) sob agitação com rotação compreendida entre 200 e 400 rpm, temperatura compreendida entre 22°C a 30°C, e pH compreendido entre 9,72 e 9,80;

(f) Manter a solução resultante da etapa (e) sob agitação por 2 horas com rotação compreendida entre 200 e 400 rpm, temperatura compreendida entre 22°C a 30°C, e pH compreendido entre 8,10 e 8,20 até completar dissolução;

(g) Resfriar a suspensão obtida na etapa (f) em banho de gelo a uma faixa de temperatura compreendia entre 0 e 20°C, preferencialmente 15°C;

(h) Precipita-se;

(i) Lavar os cristais do CFI-1 com água destilada e estéril, e secos a 30°C a 40°C, preferencialmente a 37°C por 24 a 72h, preferencialmente a 48h.

[0048] O controle do gotejamento da etapa (e) é realizado na velocidade compreendida entre 26 e 33 gotas por minuto, em um intervalo de tempo compreendido entre 3 a 4 horas.

[0049] O controle do pH na etapa (e) é controlado de forma que 30 minutos após o início do gotejamento o pH esteja compreendido entre 9,12 e 9,32; 1 hora após o início do gotejamento o pH esteja compreendido 8,81 e 8,89; 2 horas após o início do gotejamento o pH esteja compreendido 8,25 e 8,43; 3 horas após o início do gotejamento o pH esteja compreendido entre 8, 10 - 8,20; é importante manter o pH constante durante a reação.

[0050] Após a etapa (i), os cristais de CFI-1 foram secos e pesados, apresentando rendimento em massa de 98 a 100%.

[0051] O complexo nanoestruturado (CFI-1 ) na presença de um composto com grupo amina que atua como estabilizante do pH, obtido conforme definido no exemplo de concretização (II), dito PRODUTO 3, compreende fosfato inorgânico, tamanho médio de 449,6 ± 1 16,6 nm, polidispersidade de 0,55 e potencial zeta de -20,0 ± 5,1 mV.

[0052] O processo de obtenção de um complexo nanoestruturado (CFI-1 ) associado a proteína (MRB-CFI-1 ) na presença de um composto com grupo amina que atua como estabilizante do pH compreende a adição do CFI-1 , obtido conforme definido no exemplo de concretização (II), à uma proteína em estado sólido, nas proporções em peso/peso (1 :1 , 1 :2, 1 :3; preferencialmente 1 :2), sendo que a referida proteína é selecionada do grupo compreendido por P14- 16, quitinase do Bacillus subtilis (14 kDa) ou lisozima de clara de ovo (14 kDa), as quais conhecidamente possuem atividades imunomodulatórias.

[0053] O complexo nanoestruturado associado a proteína P14-16 (MRB-CFI- ) compreende fosfato inorgânico misturado a proteína, por simples adição dos cristais da proteína no CFI- nas concentrações adequadas para o estudo de câncer de bexiga: tamanho médio de 509,6 ± 92.6 nm e potencial zeta: -26,3 ± 6,7 mV.

[0054] São objetos adicionais o uso dos complexos obtidos (CFI-1) e (MRB-CFI- 1) para tratar câncer, preferencialmente de próstata, bexiga, colorretal, mastocitoma e linfoma. Adicionalmente, os complexos (CFI-1) e (MRB-CFI-1) podem ser usados como adjuvante à quimioterápicos comerciais para os cânceres de próstata, bexiga, colorretal, mastocitoma e linfoma.

[0055] Os compostos NH MgP0 ₄ x 6H2O, (NH ₄ ) ₂ MgH ₂ (PO ₄ )2 x 4H ₂ 0, (NH ₄ ) ₂ Mg ₃ (HPO4)4 x 8H ₂ O e NH ₄ MgPO ₄ x H ₂ O embora descritos na literatura, associados ou não a proteínas hidrolíticas, são objetos nesta invenção para tratar câncer.

RESULTADOS - EXEMPLO DE CONCRETIZAÇÃO (I)

Caracterização do complexo de fosfato de magnésio e amónio (CFI-1) nanoestruturado:

[0056] Análise de XFD mostra a presença de amónio, magnésio e fosfato: A Tabela 1A (CFl-1) mostra uma relação de fosfato a magnésio de 3,2 e mostra só traços de metais como ferro e cálcio e um valor do resto da estrutura como NH ₄ + H2O (calculado por diferença por peso de massa total). Por esta análise a célula unitária aproximada seria (NH ₄ )6Mg3(P0 ₄ ) ₄ . Relação P/Mg = 3,2. A Tabela 1B (MRB-CFI-1) mostra uma relação de fosfato e magnésio de 2,86. Por esta análise a célula unitária é (NH4)6Mg3(P0 ₄ )4, sem considerar a parte orgânica.

estes va ores oi: (NH ₄ )6Mg3(P0 ₄ ) ₄ . Razão P0 ₄ /Mg= 3,2

Tabela 1 B: Analise de raios-x de fluorescência (XFD) MRB-CFI-1 :

Nota: Razão P0 ₄ /Mg= 2,86. A fórmula química mínima destes valores foi: (NH ₄ )6Mg3(P0 ₄ ) ₄ , sem considerar a parte orgânica.

[0057] A Tabela 2 mostra os componentes do complexo CFI-1 e do MRB-CFI-1 na superfície dos cristais como magnésio, nitrogénio, fósforo e oxigénio e total ausência de carbono por XPS. Logo, na superfície do cristal por esta técnica mostra nitrogénio (NH ₄ ), fosfato e magnésio como únicos componentes do composto CFI-1. No caso do MRB-CFI-1 aparecem os componentes da proteína. Logo, para CFI-1 seria NOeMg3(P0 )2 e para MRB-CFI-1 seria Ci4N0 ₈ g ₂ (P04)2. Tabela 2: Análise de CFI-1 e do MRB-CFI-1 por espectroscopia de fotoelétron excitados por raios-X (XPS) (%)

A fórmula química mínima da superfície do cristal foi a seguinte: Para CFI-1 : e para MRB-CFI-1 : Ci4 0 ₈ Mg ₂ (P04)2.

A superfície do cristal apresenta os seguintes valores: CFI-1 Razão: P/Mg = 0,86; MRB-CFI-1 Razão = P/Mg = 1 ,68.

Padrão de refração de raios-X:

[0058] Na Figura 1 as difrações do CFI-1 são similares a alguns dos sais de fosfatos de amónio e magnésio, entretanto diferem em intensidades. Logo devem ter distribuição diferente no complexo CFI-1. Há um aumento da expressão das faces (022) e diminuição da expressão nas faces [002], [1 1 ] e [21 1] relativos a outros sais de fosfato. A relação de fosfato/magnésio do CFI-1 é de 3,2 como demostrado na análise anterior. Logo a célula unitária do aglomerado do CFI-1 apresenta fórmula diferente dos outros sais de fosfato relatadas na literatura, além que o CFI-1 é nanoparticulado como se mostra no item a seguir. A nanocristalização evidentemente indica que o produto mineralizado foi orientado ao longo de uma direção especifica de fases.

Espectro de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR):

[0059] As bandas observadas para CFI-1 (espectro não demonstrado em figura) ao redor de 3600, 3500, 3260 e 3115 cm ^-1 , no espectro de FTIR, provavelmente pertencem a vibrações de alongamento do grupo OH e a vibração de alongamento antissimétricas dos grupos NH ₄ . A ligação água-PO4-H aparece ao redor de 2500 e 2200 cm ^-1 . A deformação da água aparece a 1680 cm ^"1 e as bandas a 1600 a 1400 cnr ¹ foram aquelas do modo de deformação do grupo H- NH do NH4. O grupo PO ₄ sozinho se observa a 1006 cm ^-1 (alongamento antissimétrico), 571 cm ^"1 (P-O flexão), 463 e 438 cm ^"1 (modo de PO ₄ ' ³ ). A 618 e 688 cm- ¹ (ligação Mg-O), e a 894 cm ^"1 a ligação de deformação do grupo com Mg). A ligação de hidrogénio da água-água é observada a 760 e 695 cnr ¹ , enquanto a ligação do hidrogénio da água e o grupo NH ₄ foi observado a 890 cm- ¹ . O espectro de FTIR do MRB-CFI-1 , apresenta as mesmas bandas com adição das bandas de 1640-1650 cm ^'1 Amida l e das 1574-1550 cm ^"1 Amida II.

Análise de termogravimetria de CFI-1 e MRB-CFI-1:

[0060] A Figura 2A (CFI-1) mostra perda de peso a 100°C de 8%, a 200°C de 47%, a 250°C de 50% e a 350°C perde 53%. Isto mostra perda de amónia e água quase simultaneamente. Figura 2 B mostrou perda de peso a 100°C, 150°C, 200°C, 250°C e 350°C de 25%, 48%, 52%, 53% e 54%, respectivamente. Logo, MRB-CFI-1 apresentou uma perda de peso mais rápida que CFI-1 , provavelmente devido a presença de proteína.

Análise de calorimetria diferencia de varredura (DSC) de CFI-1 e MRB-CFI-1:

[0061] A Figura 3A (CFI-1) mostra que a temperatura on set: 109,1°C, a entalpia (J/g), (AH°m) 1.262,00 J/g e ponto de fusão de 125,94°C para CFI-1. Figura 3B (MRB-CFI-1 ) mostra que a temperatura onset: 108, 1°C, Entalpia (J/g) (AH°m) 1.311 ,00 J/g. MP. 122,37°C. MRB-CFI-1 apresenta ponto de fusão menor que o CFI-1 devido a presença da proteína.

Espectro Raman:

[0062] A Figura 4A mostra as bandas Raman do CFI-1 observadas a 189 e 296 cm ^-1 são designadas respectivamente a vibração de estiramento de MgO e a vibração de deformação de O-Mg-O. A banda a 574 cm ^-1 pode ser atribuída ao v3 do grupo P0 ₄ . A banda a 944 cm ^-1 pode ser designada ao a banda de alongamento simétrico do grupo P-O. Na região larga de comprimento de onda entre 2670 e 3300 cm ^-1 são características de vibração de estiramento de H2O e NH ₄ ⁺ , e bandas pequenas entre 1400 e 1740 cm ^'1 correspondem a vibrações de deformação das mesmas. Figura 4B mostra MRB-CFI-1 e todas essas bandas apareceram correspondente a grupos fosfatos, magnésio e amónio, concomitantes com as bandas Raman convencionais de amidas entre 1300 - 1650 cm ^-1 correspondentes às amidas I, II e III, respectivamente.

Tamanho (nm) e carga superficial (potencial zeta, mV) do CFI-1:

[0063] A Figura 5A (CFI-1 ) mostra um valor de tamanho de partículas na região nano de 190,0 - 310,3 + 36,4 nm. O Potencial zeta medido foi de -22,6 ± 4, 15 mV. Figura 5B mostra do MRB-CFI-1. Tamanho variando de 318,0 - 477,1 ± 146 nm, polidispersidade de 0,9 e potencial zeta de -28,60 ± 6,74 mV. Solubilidade em diferentes pHs:

[0064] A Tabela 3 mostra a solubilidade do sistema de CFI-1-água que foi determinada a 25 e 35°C por meio de equilíbrio de cristais e solução em um recipiente. Uma solução experimental de 100 ml de volume contendo 0,45 g de CFI-1 foi tratada a vários pH. A variação do pH da solução foi feita pela adição de solução de HCI e NaOH. As misturas foram continuamente agitadas durante 24 h para assegurar a saturação da solução. O sólido não dissolvido deixou-se sedimentar sem agitação e após mais 2 horas foi filtrada através de um filtro de membrana de 0,22 pm. O resíduo foi seco durante a noite no forno a 35°C. As amostras secas foram pesadas utilizando uma balança analítica. A diferença entre o resíduo e a massa inicial de CFI-1 deu a solubilidade. A Tabela 3 mostra que o valor de solubilidade a pH 7 foi de 80 mg/L Este valor pode mudar por pH e força iônica.

Tabela 3: Solubilidade do CFI-1 a diferentes pHs [0,45 g/100 ml_ CFI-1] .

pH Solubilidade por diferença de peso (mg/L)

25°C 35°C

7,0 180 250

5,0 270 285

3,0 300 325

Caracterização do complexo de MRB-CFI-1 :

Padrão de difração de raios-X (XRD).

[0065] A Figura 6 mostra claramente a associação do CFI-1 com a proteína- lisozima (P14-16). As superposições das duas difrações diferem em alguns dos valores de 2Θ. Da Figura 5 o produto obtido na presença da proteína P 14-16 teve uma maior expressão de difração nas faces (002) e (120) indicando que o produto de mineralização foi orientado preferentemente em uma única direção. Isto mostra uma forte interação da proteína P14-16 sobre CFI-1.

Dicroísmo circular do MRB-CFI-1.

[0066] A Figura 7, mostra na região de UV 200-250 nm, a magnitude da elipticidade a 208 nm e 222 nm, onde para o complexo MRB-CFI-1 a pH 7.4 (PBS) teve uma variação. O aumento indicou um aumento no conteúdo de alfa- hélice da proteína P14-16 nativa (lisozima). Este aumento do conteúdo de alfa- hélice indica uma estrutura mais ordenada já que alguns dos resíduos devem estar envolvidos na interação na região não helicoidal da estrutura terciária. Este tipo de efeito ocorre em proteínas quando são submetidos a ação de surfactantes negativos. Neste caso o CFI-1 que é negativo faz o mesmo efeito.

Tamanho (nm) e carga superficial (potencial zeta, mV) do CFI-1 (A) versus (B) MRB-CFI-1.

[0067] A Figura 8 mostrou uma comparação da distribuição diferente quando associado o CFI-1 com a proteína P14-16 (MRB-CFI-1 ). O MRB-CFI-1 (Figura 8B) mostra menor homogeneidade que o CFI-1 sozinho (Figura 8A). O MRB- CFI-1 mostra um pequeno aumento no tamanho da partícula e carga superficial (Figura 5). Seus analises pelo FESEM mostram claramente as características esféricas e nanométricas tanto do CFI-1 (Figura 8C) como MRB-CFI-1 (Figura 8D).

Análises Toxicológicas e Bioquímicas In Vivo do MRB-CFI-1:

[0068] Para as análises toxicológicas e bioquímicas do nanofármaco MRB-CFI- 1 foram utilizados 20 ratos fêmeas da linhagem Fischer 344, 20 camundongos fêmeas da linhagem C57BL/6 e 20 coelhos fêmeas da linhagem Nova Zelândia.

[0069] Os animais foram divididos em 4 grupos para cada espécie, a saber: Grupo Controle (n= 5 animais para cada espécie): recebeu uma dose intravesical de solução fisiológica 0,9%, por 6 semanas consecutivas; Grupo MRB-CFI-1 20 (n= 5 animais para cada espécie): recebeu uma dose intravesical de 20 mg/Kg de MRB-CFI-1 , por 6 semanas consecutivas; Grupo MRB-CFI-1 50 (n= 5 animais para cada espécie): recebeu uma dose intravesical de 50 mg/Kg de MRB-CFI-1 , por 6 semanas consecutivas; Grupo MRB-CFI-1 100 (n= 5 animais para cada espécie): recebeu uma dose intravesical de 100 mg/Kg de MRB-CFI-1 , por 6 semanas consecutivas.

[0070] O protocolo para o uso dos animais na pesquisa foi aprovado pela Comissão de ética no Uso de Animais (CEUA) - UNICAMP (protocolos números: 4536-1/2017; 4579-1/2017; 4435-1). [0071 ] Após o período experimental de 6 semanas, todos os animais de cada grupo foram eutanasiados. Para as análises de toxicidade local e sistémica do nanofármaco MRB-CFI-1 , os órgãos do sistema urinário (bexiga urinária, ureteres e rins), além de outros órgãos-alvos como fígado, baço, estômago e pâncreas foram coletados e submetidos às análises histopatológicas. A histopatologia desses órgãos foi avaliada e a toxicidade correlacionada com os graus de inflamação. O grau de inflamação foi avaliado por uma escala semi- quantitativa: 0, inflamação ausente, 1 , inflamação mínima (inferior a cinco linfócitos numa área de 0,25 mm2), 2, inflamação moderada (células inflamatórias mononucleares espalhadas por todo o tecido, mas com estroma ainda visível), 3, inflamação intensa (células inflamatórias mononucleares infiltrando densamente os tecidos.

[0072] Também, foram realizadas análises bioquímicas para verificar a toxicidade sistémica desse composto, a saber: alanina aminotransferase (ALT), um marcador específico para lesão parenquimatosa hepática; aspartato aminotransferase (AST), marcador inespecífico para lesão hepática e/ ou cardíaca; fosfatase alacalina; bem como os níveis circulantes de creatinina e uréia para verificar a função renal. As determinações espectrofotométricas foram realizadas em um espectrofotômetro Pharmacia Biotech com câmara de cuvete com temperatura controlada (UV/visível Ultrospec 5.000 com software de aplicações Swift II para controle de computador, 97-4213, Cambridge, Inglaterra, Reino Unido). Todos os reagentes químicos foram provenientes da empresa LaborLab (Guarulhos, São Paulo, Brasil).

Avaliação In Vivo da Resposta Inflamatória Peritoneal após a Administração do CFI-1, proteína P14-16 e do composto MRB-CFI-1:

[0073] Para verificar se o composto MRB-CFI-1 e seus constituintes (CFI-1 e proteína P 4-16) eram capazes de deflagrar a resposta inflamatória (ativação do sistema imune) peritoneal quando administrados diretamente na cavidade abdominal, foram utilizadas 8 ratas da variedade Fischer 344, na faixa etária de 7 semanas, pesando em média 150 gramas, obtidas no Centro de Bioterismo da Universidade Estadual de Campinas (CEMIB/UNICAMP).

[0074] Os animais foram divididos em 4 grupos (n=2 animais por grupo): Grupo Controle: recebeu uma dose intraperitoneal de 0,3 mL de solução fisiológica 0,9% a cada 72 horas, totalizando 3 doses; Grupo CFI-1 : recebeu uma dose intraperitoneal de 20 mg/Kg de CFI-1 suspenso em solução fisiológica 0,9% a cada 72 horas, totalizando 3 doses; Grupo P14-16: recebeu uma dose intraperitoneal de 20 mg/Kg da proteína P14-16 suspensa em solução fisiológica 0,9% a cada 72 horas, totalizando 3 doses; Grupo MRB-CFI-1 : recebeu uma dose intraperitoneal de 20 mg/Kg do composto MRB-CFI-1 suspenso em solução fisiológica 0,9% a cada 72 horas, totalizando 3 doses. Após 24 horas da última aplicação de cada composto, os animais foram eutanasiados e os peritônios foram avaliados macroscopicamente e coletados para posterior avaliação histológica.

[0075] O protocolo para o uso dos animais na pesquisa foi aprovado pela Comissão de ética no Uso de Animais (CEUA) - UNICAMP (protocolo número: 4536-1/2017).

Ensaio Pré-clínico: Indução e Tratamento do Câncer de Bexiga Urinária Não- Músculo Invasivo (CBNMI) em Ratos Fischer 344:

[0076] Na presente invenção foram utilizadas 100 ratas da variedade Fischer 344, na faixa etária de 7 semanas, pesando em média 150 gramas, obtidos no Centro de Bioterismo da Universidade Estadual de Campinas (CEMIB/UNICAMP). Para a indução do CBNMI, 80 animais foram anestesiados com Cloridrato de Xilazina 2% (5mg/kg i.m.; Kõnig, São Paulo, Brasil) e Cloridrato de Ketamina 10% (60mg/kg, i.m.; Fort Dodge, lowa, EUA), mantidos nesse estado por 45 minutos para evitar micção espontânea e instilada uma dose de 1 ,5 mg/kg de N-metil-N-nitrosouréia (MNU - Sigma, St. Louis, MO, EUA) dissolvida em 0,3 ml_ de citrato de sódio ( M pH 6,0) a cada 15 dias (semana 0, 2, 4, 6), totalizando 4 doses (Fávaro et al., 2014; Garcia et al., 2016). Os outros 20 animais que não receberam MNU foram considerados como Grupo Controle.

[0077] Duas semanas após a última dose de MNU, os animais foram submetidos ao exame de ultrassonografia para avaliar a ocorrência de tumor. Os ultrassons foram avaliados utilizando um sistema portátil de ultrassonografia controlado por software com um transdutor linear de 10-5 MHz de 38 mm.

[0078] A ultrassonografia da bexiga urinária dos animais induzidos com MNU mostrou massas tumorais infiltrando as paredes cranial e ventral do órgão, medindo 0,32 cm X 0,21 cm; 0,32 cm X 0,24 cm; e 0,27 cm X 0,21 cm (Figuras 9b, 9c, 9d). Mapeamento doppler colorido evidenciou intenso fluxo sanguíneo no interior das massas tumorais, reforçando o diagnóstico de neoplasia urotelial (Figura 9e).

[0079] Após a indução do CBNMI com MNU, os animais foram divididos em 5 grupos (20 animais por grupo): Grupo Controle (Grupo 1): recebeu uma dose intravesical de 0,3 ml_ de solução fisiológica 0,9% por 6 semanas consecutivas; Grupo MNU (Câncer, Grupo 2): recebeu o mesmo tratamento que o Grupo 1 ; Grupo MNU + CFI-1 (Grupo 3): recebeu uma dose intravesical de 20 mg/Kg de CFI-1 suspenso em solução fisiológica 0,9% por 6 semanas consecutivas; Grupo MNU + P14-16 (Grupo 4): recebeu uma dose intravesical de 20 mg/Kg da proteína P14-16 suspensa em solução fisiológica 0,9% por 6 semanas consecutivas; Grupo MNU + MRB-CFI-1 (Grupo 5): recebeu uma dose intravesical de 20 mg/Kg do composto MRB-CFI-1 suspenso em solução fisiológica 0,9% por 6 semanas consecutivas.

[0080] As doses intravesicais nos diferentes grupos experimentais foram instiladas via cateter flexível 20 gauge (Abocath, São Paulo, Brasil). Os animais de todos os grupos experimentais receberão água e a mesma dieta sólida ad libitum (Nuvilab, Colombo, PR, Brasil). Após 16 semanas de tratamento, os animais foram eutanasiados e as bexigas urinárias coletadas e submetidas às análises histopatoiógicas e imunohistoquímicas. O protocolo para o uso dos animais na pesquisa foi aprovado pela Comissão de ética no Uso de Animais (CEUA) - UNICAMP (protocolo número: 4536-1/2017).

Análises Histopatoiógicas:

[0081] Para as análises histopatoiógicas, amostras da bexiga urinária de todos os animais de cada grupo experimental (n=20 animais por grupo) foram coletadas e fixadas em Bouin por doze horas. Após a fixação, os tecidos foram lavados em álcool etílico a 70%, com posterior desidratação em uma série crescente de álcoois. Posteriormente, os fragmentos foram díafanizados com xilol por 2 horas e inclusos em polímeros plásticos (Paraplast Plus, ST. Louis, MO, EUA). Em seguida, os materiais foram seccionados no micrótomo Slee CUT5062 R 2165 (Slee Mainz, Mainz, Alemanha) com espessura de 5 micrômetros, corados com Hematoxilina-Eosina e fotografados no fotomicroscópio DM2500 (Leica, Munique, Alemanha). [0082] O diagnóstico das lesões uroteliais foram classificadas conforme o estadiamento proposto pelo consenso da Organização Mundial da Saúde/Sociedade Internacional de Patologia Urológica (Epstein et al., 1998).

Imunomarcação dos Antípenos: TLR4, TRIF, IRF3, INF-v, TLR2, IKK-a, MyD88, IL-6 e TNF-a:

[0083] Amostras da bexiga urinária de todos os animais de cada grupo experimental (n=20 animais por grupo), as mesmas utilizadas para as análises histopatológicas, foram utilizadas para as imunomarcações. A seguir foram obtidos cortes com 5 μιτι de espessura no micrótomo rotativo Slee CUT5062 RM 2165 (Slee Mainz, Mainz, Alemanha), coletados em lâminas silanizadas. A recuperação antigênica foi realizada por incubação dos cortes em tampão citrato (pH 6.0) a 100°C em microondas ou tratamento com proteinase K, dependendo das características de cada anticorpo. O bloqueio das peroxidases endógenas foi obtido com H2O2 (0,3% em metanol) com posterior incubação em solução bloqueadora com albumina soro bovino (BSA) 3%, em tampão TBS-T por 1 hora em temperatura ambiente. Posteriormente, os antígenos TLR4, TRIF, IRF3, INF- Y, TLR2, IKK-a, MyD88, IL-6 e TNF-a foram localizados através dos anticorpos primários específicos (Tabela 4), diluídos em BSA 1 % e armazenados overnight a 4 °C. O kit AdvanceTM HRP (Dako Cytomation Inc., EUA) foi usado para detecção dos antígenos de acordo com as instruções do fabricante. Após lavagem com tampão TBS-T, os cortes foram incubados com anticorpo secundário HRP conjugado proveniente do kit AdvanceTM HRP por 40 minutos e, posteriormente revelados com diaminobenzidina (DAB), contra-corados com Hematoxilina de Harris e avaliados no fotomicroscópio DM2500 (Leica, Munique, Alemanha).

[0084] Para avaliar a intensidade das imunorreatividades dos antígenos, a porcentagem de células uroteliais positivas foi examinada em dez campos para cada anticorpo com aumento de 400x. A intensidade da marcação foi graduada em uma escala de 0-3, e expressa como 0 (ausência de imunorreatividade), 0% de células uroteliais positivas; 1 (fraca imunorreatividade), 1-35% de células uroteliais positivas; 2 (moderada imunorreatividade), 36-70% de células uroteliais positivas; 3 (intensa imunorreatividade), >70% de células uroteliais positivas (Garcia et al., 2016). Tabela 4: Características dos Anticorpos Primários para Imunomarcação.

Análise Estatísticas:

[0085] As análises histopatológicas e imunohistoquímicas foram avaliadas através do teste de proporção. Para essas análises, erro tipo-l de 5% foi considerado estatisticamente significante.

Ensaio Pré-clínico: Indução e Tratamento do Câncer de Bexiga Urinária Não- Músculo Invasivo (CBNMI) em Camundongos C57BU6:

[0086] Na presente invenção foram utilizados 100 camundongos fêmeas da linhagem C57BL/6J, todos na faixa etária de 7 semanas, pesando em média 40 gramas, obtidos no Centro de Bioterismo da Universidade Estadual de Campinas (C EM I B/U NI CAM P). Os animais de todos os grupos experimentais receberam água e a mesma dieta sólida ad libitum (Nuvilab, Colombo, PR, Brasil). Para a indução do CBNMI, 80 animais foram anestesiados com Cloridrato de Xilazina 2% (5 mg/kg i.m.; Kõnig, São Paulo, Brasil) e Cloridrato de Ketamina 10% (60 mg/kg, i.m.; Fort Dodge, lowa, EUA), mantidos nesse estado por 45 minutos para evitar micção espontânea e instilada uma dose de 1 ,5 mg/Kg de N-metil-N- nitrosouréia (MNU - Sigma, St. Louis, MO, EUA) dissolvida em citrato de sódio (1 M pH 6,0) a cada 15 dias (semana 0, 2, 4), totalizando 3 doses (modificado de Fávaro et al., 2012). Os outros 20 animais que não receberam MNU foram considerados como Grupo Controle.

[0087] Uma semana após a última dose de MNU, os animais foram submetidos ao exame ultrassonográfico para avaliar a ocorrência de tumor e, posteriormente divididos em 5 grupos (n= 20 animais por grupo) para os respectivos tratamentos: a) Grupo Controle (Grupo 1): recebeu uma dose intravesical de 0,1 ml_ de solução fisiológica 0,9% por 6 semanas consecutivas; b) Grupo MNU (Câncer): receberá o mesmo tratamento que o Grupo 1 ; c) Grupo MNU + CFI-1 (Grupo 3): recebeu uma dose intravesical de 20 mg/Kg de Fosfato Inorgânico (CFI 1) por 6 semanas consecutivas; d) Grupo MNU + P14-16 (Grupo 4): recebeu uma dose intravesical de 20 mg/Kg da proteína P 14-16 por 6 semanas consecutivas; e) Grupo MNU + MRB-CFI-1 (Grupo 5): recebeu uma dose intravesical de 20 mg/Kg do composto MRB-CFI-1 por 6 semanas consecutivas.

[0088] As doses intravesicais nos diferentes grupos experimentais foram instiladas via cateter flexível 22 gauge (Abocath, São Paulo, Brasil). A urina foi coletada semanalmente e após o tratamento os animais foram eutanasiados e as bexigas urinárias foram coletadas. O protocolo para o uso dos animais na pesquisa foi aprovado pela Comissão de ética no Uso de Animais (CEUA) - UNICAMP (protocolo número: 4579-1/2017).

Análises Histopatológicas:

[0089] Para as análises histopatológicas, amostras da bexiga urinária de todos os animais de cada grupo experimental (n=20 animais por grupo) foram coletadas e fixadas em Bouin por doze horas. Após a fixação, os tecidos foram lavados em álcool etílico a 70%, com posterior desidratação em uma série crescente de álcoois. Posteriormente, os fragmentos foram diafanizados com xilol por 2 horas e inclusos em polímeros plásticos (Paraplast Plus, ST. Louis, MO, EUA). Em seguida, os materiais foram seccionados no micrótomo Slee CUT5062 RM 2165 (Slee Mainz, Mainz, Alemanha) com espessura de 5 micrômetros, corados com Hematoxilina-Eosina e fotografados no fotomicroscópio DM2500 (Leica, Munique, Alemanha). O diagnóstico das lesões uroteliais foram classificadas conforme o estadiamento proposto pelo consenso da Organização Mundial da Saúde/Sociedade Internacional de Patologia Urológica (Epstein et al., 1998).

Análises de Viabilidade celular

[0090] A viabilidade celular do nanofármaco MRB-CFI-1 e seus constituintes foi avaliada em células de carcinoma de bexiga urinária grau II (linhagem celular 5637), com 24 horas de incubação. Para isso, foram utilizadas duas abordagens (MTT e Calceína/ lodeto de Propídio), com diferentes princípios químicos para aumentar a robustez dos resultados e evitar artefatos. As células 5637 foram plaqueadas em densidade celular de 2,0x10 ⁴ e tratadas com diluições seriadas dos compostos (12,5 mg; 6,25 mg; 3,13 mg; 1 ,56 mg e 0,39 mg) ao longo das 24 horas de incubação.

Análises Estatísticas:

[0091] As análises histopatológicas foram avaliadas através do teste de proporção. Para essas análises, erro tipo-l de 5% foi considerado estatisticamente significante.

Resultados:

Análises Toxicológicas e Bioquímicas In Vivo do MRB-CFI-1:

[0092] Os níveis séricos de ALT, AST, fosfatase alcalina, uréia e creatinina nos ratos, camundongos e coelhos tratados intravesicalmente com MRB-CFI-1 nas doses de 20 mg/Kg, 50 mg/Kg e 100 mg/Kg não diferiram estatisticamente de seus respectivos controles (Tabelas 5, 6 e 7), indicando que esse composto não apresentou efeitos tóxicos sistémicos.

[0093] A bexiga urinária, ureter e rins dos ratos, camundongos e coelhos do grupo Controle não apresentaram inflamação e alterações histopatológicas (Figuras 10a, 10b, 10c, 11a, 11 b, 12a, 12b; Tabela 5). Os ratos do grupo MRB- CFI-1 20 apresentaram inflamação mínima na bexiga urinária (100,0%), ureteres (80,0%) e rins (60,0%) (Figuras 10d, 10e, 10f, Tabela 5). Inflamação moderada foi verificada na bexiga urinária (80,0%), ureteres (80,0%) e rins (60,0%) dos ratos do grupo MRB-CFI-1 50 (Figuras 10g, 10h, 10i, Tabela 5). Os ratos do grupo MRB-CFI-1 100 apresentaram inflamação intensa na bexiga urinária (80,0%), ureteres (80,0%) e rins (60,0%) (Figuras 10j, 10k, 101, Tabela 5). Os ratos dos grupos MRB-CFI-1 50 e MRB-CFI-1 100 apresentaram hiperplasia plana no urotélio da bexiga urinária e ureteres (Figuras 10g, 10h, 10j, 10k).

[0094] Os camundongos do grupo MRB-CFI-1 20 apresentaram inflamação mínima na bexiga urinária (100,0%) e ureteres (100,0%), e ausência de inflamação nos rins (Figuras 11c, 11d; Tabela 6). Inflamação moderada foi verificada na bexiga urinária (100,0%), ureteres ( 00,0%) e rins (100,0%) dos camundongos dos grupos MRB-CFI-1 50 e MRB-CFI-1 100 (Figuras 11e, 11f, 11g, 11h; Tabela 6). A hiperplasia plana foi verificada no urotélio da bexiga urinária e ureteres dos camundongos dos grupos MRB-CFI- 50 e MRB-CFI-1 100 (Figuras 11 e, 11g). Os coelhos dos grupos MRB-CFI-1 50 e MRB-CFI-1 100 apresentaram inflamação moderada na bexiga urinária (100,0%) e rins ( 00,0%), enquanto que os animais do grupo MRB-CFI-1 20 não apresentaram inflamação e alterações histopatológicas nos órgãos do sistema urinário (Figuras 12c, 12d, 12e, 12f, 12g, 12h; Tabela 7). A hiperplasia plana foi verificada no urotélio da bexiga urinária e ureteres dos coelhos dos grupos MRB-CFI-1 50 e MRB-CFI-1 100 (Figuras 12e, 12g).

[0095] Ausência de inflamação e alterações histopatológicas foram verificadas no fígado, baço, estômago e pâncreas de todos os animais de cada espécie (Tabelas 8, 9, 10).

Tabela 5: Parâmetros Toxicológicos e Bioquímicos para Ratos.

ALT Uréia

Fosfatase

(U/L) AST (mg/dL) Creatinina

Grupos Alcalina

(U/L) (mg/dL)

(U/L)

Controle 22,9±3,2 a 85,4±5,3 a 176,7±15,2 a 38,5±2,2 a 0,55±0,03 a MRB-CFI-1 20 22,8±4, 1 a 75,6±9, 1 a 183, 1±13,4 a 40,2±4,0 a 0,43±0,04 a MRB-CFI-1 50 26,5±5,4 a 73,3±9, 1 a 178,6+31 ,1 a 40,0±1 ,6 a 0,49+0,09 a MRB-CFI-1 100 28, 1±10,4a 73,8±10,6 a 194,2±14,1 a 40,8±3,8 a 0,51 ±0,03 a

Dados expressos como média ± desvio padrão (n=5 animais por grupo).

Duas médias seguidas pela mesma letra minúscula não diferem estatisticamente pelo teste de Turkey (P<0,05).

Tabela 6: Parâmetros Toxicológicos e Bioquímicos para Camundongos.

ALT Fosfatase Uréia

AST Creatinina

Grupos Alcalina

(U/L) (mg/dL)

(U/L) (mg/dL)

(U/L)

Controle 11 ,7+3,1 a 92,4±5,5 a 154,1±9,3 a 36,0±7,1 a 0,27±0,04 a

MRB-CFI-1 20 13,4±2,7 a 94,8±5,5 a 179,7±7,8 a 32,3±4,9 a 0,23±0,05 a

MRB-CFI-1 50 14, 1±2,7 a 93,7±5,5 a 185,3±10,7 a 25,9±3,7 a 0,34±0, 14 a

MRB-CFI-1 100 13,7±2,0 a 94,4±5,4 a 187,5±8,8 a 26,6±3,5 a 0,31+0,08 a

Dados expressos como média ± desvio padrão (n=5 animais por grupo)

Duas médias seguidas pela mesma letra minúscula não diferem estatisticamente pelo teste de Turkey (P<0,05). Tabela 7: Parâmetros Toxicológicos e Bioquímicos para Coelhos.

ALT Fosfatase Uréia

AST Creatinina

Grupos Alcalina

(U/L) (mg/dL)

(U/L) (mg/dL)

(U/L)

Controle 20,9±2,6 a 42,0±1 ,4 a 129,0±12,7 a 39,7±4,7 a 0,90±0,06 a

MRB-CFI-1 30,5±2, 1 a 43,0±4,2 a

47,0±1 ,4 a 126,0±9,9 a 0,85±0, 15 a 20

MRB-CFI-1 33,4±0,6 a 40,2±5,4 a

41 ,0±1 ,3 a 137,5±10,6 a 0,94±0,06 a 50

MRB-CFI-1 35,7±1 ,8 a 44,0±4,2 a

47,5±2, 1 a 126,0±19,8 a 0,95±0,08 a 100

Dados expressos como média ± desvio padrão (n=5 animais por grupo)

Duas médias seguidas pela mesma letra minúscula não diferem estatisticamente pelo teste de Turkey (P<0,05).

Tabela 8: Avaliação semi-quantitativa da inflamação na bexiga urinária, ureteres, rins, fígado, baço, pâncreas e estômago para os 5 ratos de cada grupo experimental.

Grupos

Controle

Órgãos MRB-CFI-1 50

(n= 05) MRB-CFI-1 20 (n= 05) MRB-CFI-1 100

(n= 05) (n= 05)

0, inflamação ausente, 1 , inflamação mínima (inferior a cinco linfócitos numa área de 0,25 mm ² ), 2, inflamação moderada (células inflamatórias mononucleares espalhadas por todo o tecido, mas com estroma ainda visível), 3, inflamação intensa (células inflamatórias mononucleares infiltrando densamente os tecidos. Tabela 9: Avaliação semi-quantitativa da inflamação na bexiga urinária, ureteres, rins, fígado, baço, pâncreas e estômago para os 5 camundongos de cada grupo experimental.

Grupos

0, inflamação ausente, 1 , inflamação mínima (inferior a cinco linfócitos numa área de 0,25 mm ² ), 2, inflamação moderada (células inflamatórias mononucleares espalhadas por todo o tecido, mas com estroma ainda visível), 3, inflamação intensa (células inflamatórias mononucleares infiltrando densamente os tecidos.

Tabela 10: Avaliação semi-quantitativa da inflamação na bexiga urinária, ureteres, rins, fígado, baço, pâncreas e estômago para os 5 coelhos de cada grupo experimental.

Grupos

0, inflamação ausente, 1 , inflamação mínima (inferior a cinco linfócitos numa área de 0,25 mm ² ), 2, inflamação moderada (células inflamatórias mononucleares espalhadas por todo o tecido, mas com estroma ainda visível), 3, inflamação intensa (células inflamatórias mononucleares infiltrando densamente os tecidos. Avaliação da Resposta Inflamatória Peritoneal após a Administração do CF 1-1, proteína P14-16 e do composto MRB-CFI-1:

[0096] As análises macroscópicas dos peritônios revelaram que os animais dos Grupos Controle (Figura 13a) e P14-16 não demonstraram sinais inflamatórios, bem como aumento da vascularização. Todos os animais do Grupo CFI-1 (Figura 13b) apresentaram sinais moderados de inflamação peritoneal, os quais foram caracterizados por rubor, aumento da vascularização e pontos hemorrágicos, além de pequenos aglomerados de cristais de fosfatos na cavidade abdominal. Em relação ao Grupo MRB-CFI-1 , todos os animais apresentaram intensa inflamação peritoneal caracterizada pelo aumento do rubor, da vascularização e dos pontos hemorrágicos (Figuras 13c, 13d). Além disso, verificou-se aumento dos depósitos de cristais de fosfatos na cavidade abdominal. Assim, os presentes resultados macroscópicos revelaram que o composto MRB-CFI-1 foi capaz de induzir a resposta inflamatória, o que justifica sua avaliação como imunomodulador nos experimentos em animais com câncer de bexiga não-músculo invasivo (CBNMI) induzido quimicamente, associado aos seus mínimos ou ausentes efeitos tóxicos.

Análises Histopatológicas: Tratamento do Câncer de Bexiga Urinária Não- Músculo Invasivo (CBNMI) em Ratos Fischer 344:

[0097] O trato urinário do grupo Controle não apresentou alterações microscópicas (Figuras 14a, 14b; Tabela 11). O urotélio normal foi composto por 2 - 3 camadas, sendo: uma camada de células basais, uma camada celular intermediária, e uma camada superficial ou apical composta por células em guarda-chuva (Figuras 14a, 14b).

[0098] Em contraste, o trato urinário do grupo MNU (Câncer) apresentou drásticas alterações histopatológicas, tais como: carcinoma urotelial invasivo (pT1 ) (Figuras 14c, 14d) e carcinoma urotelial não-invasivo (pTa) em 60% e 40% dos animais, respectivamente (Tabela 11). O carcinoma pT1 (Figuras 14c, 14d, 14f) foi caracterizado por células neoplásicas agrupadas em pequenos grupos ou cordões invadindo o conjuntivo da mucosa, numerosas figuras de mitose e células pleomórficas com núcleos aumentados e diferenciação escamosa focal. [0099] As lesões neoplásicas mais frequentes no Grupo MNU+Complexo Fosfato Inorgânico foram o carcinoma in situ plano (pTis) (Figuras 14e) e o carcinoma pT1 (Figura 14f), os quais ocorreram em 40% e 20% dos animais, respectivamente (Tabela 11). Os outros animais não apresentaram lesões malignas, sendo que 20% deles apresentaram hiperplasia plana (Figuras 14g, 14h; Tabela 11) e 20% morfologia vesical normal, indicando que esse tratamento promoveu 40% de regressão tumoral (Tabela 11). O carcinoma pTis (Figuras 14e) foi caracterizado por uma desordenada proliferação das células uroteliais em um urotélio plano, com acentuadas atipias celulares caracterizadas por núcleos volumosos, redução do citoplasma e nucléolos múltiplos e proeminentes.

[00100] As análises histopatológicas dos animais do Grupo MNU+P14-16 apresentaram 40% de regressão tumoral, sendo que 20% desses apresentaram hiperplasia plana (Figuras 15a, 15b; Tabela 11) e 20% morfologia vesical normal (Tabela 11). As lesões neoplásicas mais frequentes nesse grupo foram o carcinoma pTa de alto grau (Figuras 15c, 15d) e o carcinoma pT1 , ambos em 20% dos animais (Tabela 11). O carcinoma não-invasivo pTa foi caracterizado por lesões papilíferas ou não papilíferas, células uroteliais com arranjo desordenado e com perda da polaridade, núcleos hipercromáticos, pleomórficos e nucléolos proeminentes (Figuras 15c, 15d).

[00101] Os aspectos microscópicos da bexiga urinária do grupo MRB-CFI-1 foram similares aos encontrados no grupo Controle. Urotélio normal foi encontrado em 40% dos animais (Figuras 15e, 15f; Tabela 11). A alteração histopatológica mais frequente nesse grupo foi a hiperplasia plana (Figuras 15g, 15h) que ocorreu em 40% dos animais (Tabela 11), indicando que esse composto promoveu a regressão tumoral em 80% dos animais. A hiperplasia plana foi caracterizada por espessamento do urotélio e ausência de atipias citológicas (Figuras 14h, 15a, 15b, 15g, 15h). O carcinoma pTis ocorreu em 20% dos animais desse grupo (Tabela 11). Tabela 11 : Porcentagem de alterações histopatológicas na bexiga urinária de ratos dos diferentes grupos experimentais.

Grupos

Histopatologia Controle MNU MNU+CFI-1 WINU+ MNU+MRB

(n=20) (n=20) (n=20) P14-16 -CFI-1

(n=20) (n=20)

Normal 20(100%) - 4(20%) 4(20%) 8(40%)

*

Hiperplasia Plana - - 4(20%) 4(20%) 8(40%)*

Neoplasia

Intraurotelial de alto - - 8(40%)* - 4(20%) grau - Carcinoma in

situ (pTis)

Carcinoma Urotelial - 8(40%)* - 8(40%) - Não-lnvasivo (pTa)

Carcinoma Urotelial

Invasivo (pT1 ) 12(60%) 4(20%) 4(20%)

'Significância estatística (teste de proporção, P<0,0001 ). Lesões Benignas: Hiperplasia Plana; Lesões Malignas: pTis, pTa e pT1 .

Imunomarcaçâo dos Antíaenos: TLR4, TRIF, IRF3. INF-v, TLR2, IKK-a, MvD88, IL-6 e TNF-a: Tratamento do Câncer de Bexiga Urinária Não-Músculo Invasivo (CBNMI) em Ratos Fischer 344:

[00102] As imunomarcações para MyD88 e IKK-a foram significativamente moderadas nos grupos Controle, MNU + CFI-1 , MNU + P14-16 e MRB-CFI-1 em relação ao grupo MNU, o qual apresentou fraca imunorreatividade para esses antígenos (Tabela 12). Ainda, as imunomarcações para IL-6 e TNF-a foram significativamente moderadas no grupo MNU em relação aos demais grupos experimentais, indicando que o nanofármaco MRB-CFI-1 e seus constituintes não induziram a via para produção de citocinas inflamatórias mediadas por TLRs 2 e 4.

[00103] Em contraste, as imunomarcações para TLR2, TLR4, TRIF, IRF3 e INF- γ foram significativamente intensas no urotélio dos grupos MRB-CFI-1 e Controle em relação aos demais grupos experimentais (Tabela 12), indicando que o nanofármaco MRB-CFI-1 foi capaz de estimular a via de interferon mediada pelos TLRs 2 e 4. Ainda, as imunomarcações para esses antígenos foram moderadas nos grupos MNU + CFI- e MNU + P14-16 em relação ao grupo MNU (Tabela 12).

Tabela 12: Média da Intensidade da imunomarcação para os diferentes antígenos na bexiga urinária dos grupos Controle, MNU, MNU + CFI-1 , MNU + P14-16 e MNU + MRB-CFI- .

Grupos

Antígenos Controle MNU MNU + CFI-1 MNU + P14-16 MNU + MRB-CFI-1

(n= 20) (n= 20) (n= 20) (n= 20) (n= 20)

TLR4 3 1 (10,4%) 2 (53, 1 %) 2 (52,0%) 3 (88,7%)*

(91 ,8%)*

TRIF 3 1 (8,6%) 2 (50,2%) 2 (57,2%) 3 (90,4%)*

(80,5%)*

IRF-3 3 1 (8,9%) 2 (59,7%) 2 (61 ,8%) 3 (91 ,0%)*

(87,5%)*

IFN-Y 3 1 (9,5%) 2 (60,2%) 2 (64,9%) 3 (91 ,0%)*

(88,2%)*

TLR2 3 1 (15,0%) 2 (51 ,0%) 2 (56,3%) 3 (89,7%)*

(92,4%)*

IKK-a 2 1 (20,3%) 2 (50, 1 %)* 2 (54,7%)* 2 (50,4%)*

(47,6%)*

MyD88 2 1 (17,4%) 2 (47,3%)* 2 (49, 1 %)* 2 (48,8%)*

(50, 1 %)*

IL-6 1 2 1 (20,8%) 1 (24,0%) 1 (22,5%)

(16,0%)* (47,2%)*

TNF-a 1 2 1 (15,3%) 1 (17, 1 %) 1 (24,6%)

(18,5%)* (49,0%)*

0, ausência de reatividade; 1 , fraca imunorreatividade (1 % - 35% células uroteliais positivas); 2, moderada imunoreatividade (36% - 70% células uroteliais positivas); 3, intensa imunoreatividade (> 70% células uroteliais positivas). 'Significância estatística (teste de proporção, P<0.0001 ).

Análises Histopatológicas - Tratamento do Câncer de Bexiga Urinária Não- Músculo Invasivo (CBNMI) em Camundongos C57BL/6:

[00104] O trato urinário do grupo Controle não apresentou alterações microscópicas (Tabela 13). Em contraste, o trato urinário do grupo MNU (Câncer) apresentou drásticas alterações histopatológicas, tais como: carcinoma pT1 , carcinoma pTa e carcinoma pTis em 20%, 20% e 60% dos animais, respectivamente (Tabela 13). [00105] As lesões neoplásicas mais frequentes no Grupo MNU+CFI-1 foram o carcinoma pTis e o carcinoma pTa, os quais ocorreram em 20% e 40% dos animais, respectivamente (Tabela 13). Os outros animais não apresentaram lesões malignas, sendo que 20% deles apresentaram hiperplasia plana e 20% uma lesão pré-maligna denominada de neoplasia intraurotelial de baixo grau (Tabela 13), indicando que esse tratamento promoveu a regressão e inibiu a progressão tumoral em 40% dos animais.

Tabela 13: Porcentagem de alterações histopatológicas na bexiga urinária de camundongos dos diferentes grupos experimentais.

Grupos

Histopatologia Controle MNU MNU+CFI-1 MNU+ MNU+MRB- (n=20) (n=20) (n=20) P14-16 CFI-1

(n=20) (n=20)

Normal 20(100%)* - - - 8(40%)

Hiperplasia Plana - - 4(20%) ^* 4(20%) ^* 4(20%) ^*

Neoplasia

Intraurotelial de - - 4(20%)* - 4(20%) ^* baixo grau

Neoplasia 12(60%)* 4(20%) 4(20%) 4(20%) Intraurotelial de alto

grau - Carcinoma in

situ (pTis)

Carcinoma Urotelial

Não-lnvasivo (pTa) - 4(20%) 8(40%) ^* 8(40%)* -

Carcinoma Urotelial

Invasivo (pT1 ) - 4(20%) ^* - 4(20%) ^* -

^" Significância estatística (teste de proporção, P<0,0001 ). Lesões Benignas: Hiperplasia Plana; Lesões Pré-malignas: Neoplasia Intraurotelial de baixo grau; Lesões Malignas: pTis, pTa e pT1.

[00106] As análises histopatológicas dos animais do Grupo MNU+P14-16 apresentaram 20% de regressão tumoral, sendo que 20% desses apresentaram hiperplasia plana (Tabela 13). As lesões neoplásicas mais frequentes nesse grupo foram os carcinomas pTis, pTa e pT1 , ambos em 20%, 40% e 60% dos animais, respectivamente (Tabela 13).

[00107] Os aspectos microscópicos da bexiga urinária do grupo MRB-CFI-1 foram similares aos encontrados no grupo Controle. Urotélio normal foi encontrado em 40% dos animais (Tabela 13). Lesões benignas como a hiperplasia plana, e lesões pré-malignas como a neoplasia intraurotelial de baixo grau foram encontradas em 20% e 20% dos animais, respectivamente (Tabela 13), indicando que esse tratamento promoveu a regressão e inibiu a progressão tumoral em 80% dos animais. A lesão neoplásica mais frequente nesse grupo foi o carcinoma pTis em 20% dos animais (Tabela 13).

Ensaio Clínico-Veterinário: Tratamento do Câncer de Bexiga Urinária Espontâneo em Cães:

[00108] Vários modelos animais induzidos experimentalmente para câncer de bexiga foram estabelecidos, incluindo tumores quimicamente induzidos. Embora tais modelos animais estejam em uso na pesquisa do câncer de bexiga, modelos animais em que a doença ocorre naturalmente, mimetizam o mais próximo possível os seres humanos e podem ser úteis para avaliar novas terapias (Wu et al. _r 2006; Arantes-Rodrigues et al., 2013), incluindo a terapia com MRB-CFI- 1.

[00109] O câncer de bexiga de ocorrência natural em cães pode fornecer um excelente modelo, pois se aproxima do câncer de bexiga invasivo humano, especificamente o carcinoma urotelial invasivo de alto grau em características celulares e moleculares; comportamento biológico, incluindo sítios e frequência de metástases; e resposta à terapia (Knapp et al., 2014).

[00110] Para este fim, os efeitos da imunoterapia intravesical com MRB-CFI-1 na progressão do câncer de bexiga estão sendo avaliados em 20 cães, atendidos na Clínica Veterinária "Dr. Ronaldo Tizziani "(Campinas, São Paulo, Brasil). Após o diagnóstico de carcinoma urotelial e o consentimento dos donos dos cães, o tratamento com MRB-CFI-1 foi iniciado. O protocolo para o uso de cães na pesquisa foi aprovado pela Comissão de ética no Uso de Animais (CEUA) - UNICAMP (protocolo número: 4481-1/2017).

[0011 1] Os cães receberam 25 mg de MRB-CFI-1 dissolvido em 2,0 mL de solução salina fisiológica a 0,9% pelas vias intravesical (sondagem) ou cistocentese, dependendo das condições de acesso à bexiga urinária de cada cão. Estes animais receberam uma dose semanal de MRB-CFI-1 durante seis semanas consecutivas. Para terapia de manutenção, os animais receberam uma dose de MRB-CFI-1 a cada 15 dias durante 6 meses e uma dose mensal por mais 6 meses.

[001 12] Os efeitos terapêuticos do MRB-CFI-1 foram avaliados por ultrassonografia durante o ciclo de tratamento. As avaliações de ultrassom foram realizadas nos seguintes tempos: antes da primeira instilação, após a primeira instilação e após 3, 6, 18 e 24 instilações de MRB-CFI-1.

[00113] Seis cães finalizaram o esquema terapêutico completo com MRB-CFI-1 , enquanto 12 estão na fase de manutenção e 2 na fase de indução. A seguir serão apresentados os resultados dos 6 cães, os quais finalizaram o esquema terapêutico completo: Cão 1 : raça Dachshund, género: fêmea, idade: 9 anos; Cão 2: raça Sem Raça Definida (SRD), género: fêmea; idade: 16 anos; Cão 3: raça Dachshund, género: fêmea, idade: 9 anos; Cão 4: raça Teckel, género: fêmea, idade: 1 anos; Cão 5: raça Lhasa Apso, género: fêmea, idade: 13 anos; Cão 5: raça Dachshund, género: fêmea, idade: 12 anos; Cão 6: raça Poodle, género: fêmea, idade: 16 anos.

Resultados:

Análises Bioquímicas de Cães com Câncer de Bexiga Urinária Submetidos ao Tratamento com MRB-CFl- :

[001 14] As análises séricas de Hemoglobina, Leucócitos, Plaquetas, Função Hepática (ALT) e Função Renal (uréia e creatinina) indicaram quê o tratamento completo com MRB-CFI-1 (24 aplicações) não foi tóxico para os 6 cães, sendo que muitos parâmetros como Hemoglobina, Leucócitos e ALT atingiram os valores de normalidade com o tratamento proposto (Tabela 14).

[001 15] Portanto, tais exames indicaram que o tratamento com MRB-CFI-1 não apresentou sinais de toxicidade sistémica na dose terapêutica proposta.

Análises Ultrassonográficas de Cães com Câncer de Bexiga Urinária Submetidos ao Tratamento com MRB-CFI-1:

[001 16] a) Cão 1 : antes da primeira instilação do MRB-CFI-1 , observou-se a presença de massa tumoral com contornos irregulares, ecogenicidade mista, ecotextura hiperecóica, medindo 3,08 cm x 1 ,89 cm, e volume de 5,75 cm ³ (Figura 16a, Tabela 15). Após 6 instilações do MRB-CFI-1 , a massa tumoral reduziu 56,52% do seu volume em relação ao ultrassom inicial (Figuras 16c, 16e, 16g, Tabela 15). No final de 24 instilações, a massa tumoral reduziu 79,30% do seu volume (Figuras 16i, 16k, Tabela 15). No início do tratamento o Cão 1 apresentou hematúria, a qual desapareceu após a terceira aplicação do MRB- CFI-1 e não retornou mesmo após a última aplicação (Tabela 15).

[00117] b) Cão 2: antes da primeira instilação do MRB-CFI-1 , observou-se a presença de massa tumoral com contornos irregulares, ecogenicidade mista, ecotextura hiperecóica, medindo 3,42 cm x 2,75 cm, e volume de 13,53 cm ³ (Figura 16b, Tabela 15). Após 6 instilações do MRB-CFI-1 , a massa tumoral reduziu 88,17% do seu volume em relação ao ultrassom inicial (Figuras 16d, 16f, 16h, Tabela 15). No final de 24 instilações, a massa tumoral reduziu 93,93% do seu volume (Figuras 16j, 161, Tabela 15). No início do tratamento o Cão 2 apresentou hematúria, a qual desapareceu após a terceira aplicação do MRB- CFI-1 e não retornou mesmo após a última aplicação (Tabela 15).

[00118] c) Cão 3: antes da primeira instilação do MRB-CFI-1 , observou-se a presença de massa tumoral com contornos irregulares, ecogenicidade mista, ecotextura hiperecóica, medindo 4,22 cm x 2,60 cm, e volume de 14,93 cm ³ (Figura 17a, Tabela 15). Após 6 instilações do MRB-CFI-1 , a massa tumoral reduziu 61 ,35% do seu volume em relação ao ultrassom inicial (Figuras 17c, 17e, 17g, Tabela 15). No final de 24 instilações, a massa tumoral reduziu 81 ,0% do seu volume (Figuras 17i, 17k, Tabela 15). No início do tratamento o Cão 3 apresentou hematúria, a qual desapareceu após a décima oitava aplicação do MRB-CFI-1 (Tabela 15), não retornando após o término do tratamento.

[00119] d) Cão 4: antes da primeira instilação do MRB-CFI-1 , observou-se a presença de massa tumoral com contornos irregulares, ecogenicidade mista, ecotextura hiperecóica, medindo 3,91 cm x 1 ,84 cm, e volume de 6,92 cm ³ (Figura 17b, Tabela 15). Após 6 instilações do MRB-CFI-1 , a massa tumoral reduziu 48,84% do seu volume em relação ao ultrassom inicial (Figuras 17d, 17f, 17h, Tabela 15). No final de 24 instilações, a massa tumoral reduziu 82,22% do seu volume (Figuras 17j, 171, Tabela 15). No início do tratamento o Cão 4 apresentou hematúria, a qual desapareceu após a décima oitava aplicação do MRB-CFI-1 (Tabela 15), não retornando após o término do tratamento.

[00120] e) Cão 5: antes da primeira instilação do MRB-CFI-1 , observou-se a presença de massa tumoral com contornos irregulares, ecogenicidade mista, ecotextura hiperecóica, medindo 2,25 cm x 1 ,86 cm, e volume de 4,07 cm ³ (Figura 18a, Tabela 15). Após 6 instilações do MRB-CFI- , a massa tumoral reduziu 44,71 % do seu volume em relação ao ultrassom inicial (Figuras 18c, 18e, 18g, Tabela 15). No final de 24 instilações, a massa tumoral reduziu 84,5% do seu volume (Figuras 18i, 18k, Tabela 15). No início do tratamento o Cão 5 apresentou hematúria, a qual desapareceu somente após a última aplicação (Tabela 15).

[00121] f) Cão 6: antes da primeira instilação do MRB-CFI-1 , observou-se a presença de massa tumoral com contornos irregulares, ecogenicidade mista, ecotextura hiperecóica, medindo 2,84 cm x 2,73 cm, e volume de 11 ,08 cm ³ (Figura 18b, Tabela 15). Após 6 instilações do MRB-CFI-1 , a massa tumoral reduziu 74,45% do seu volume em relação ao ultrassom inicial (Figuras 18d, 18f, 18h, Tabela 15). No final de 24 instilações, a massa tumoral reduziu 86,28% do seu volume (Figuras 18j, 181, Tabela 15). O Cão 6 não apresentou hematúria desde o início do tratamento até o final (Tabela 15).

[00122] Assim, esses resultados indicaram que a imunoterapia intravesical com MRB-CFI-1 foi eficaz na redução e prevenção da progressão das lesões neoplásicas uroteliais no câncer espontâneo de bexiga urinária canina.

Análises de Viabilidade Celular

[00123] A viabilidade celular do MRB-CFI-1 e seus componentes, CFI-1 e proteína P14-16, foi de 76,01 % ± 12,39, 68,63% ± 9,47 e 75,71 % ± 1 1 ,52, respectivamente, utilizando a concentração máxima de 12,5 mg, conforme demosntrado no ensaio de redução de MTT (Figura 19A).

[00124] A Figura 19B demonstra o impacto do tratamento com MRB-CFI-1 na integridade da membrana celular. Ainda, foi observado células negativas à calceína, indicando perda de viabilidade celular, e células positivas para iodeto de propídio (PI), indicando morte celular. Os resultados com 12,5 mg do composto MRB-CFI-1 mostraram 75,25% ± 6,19 de calceína positiva e 25,50% ± 2,52 de PI positivo para morte celular. Portanto, todas as técnicas relataram relação dose-resposta comparável, sendo que o nanocomposto MRB-CFI-1 mostrou baixa toxicidade, como esperado de fármacos com propriedades imunomodulatórias. Tabela 14: Avaliação Clínica dos Cães Antes e Após os Tratamentos Intravesicais com MRB-CFI- 1.

Parâmetros Bioquímicos

Esquema Hemoglobina Leucócitos Plaquetas ALT Uréia Creatinina Terapêutico (g/dL) (mm ³ ) (mm ³ ) (U/L) (mg/dL) (mg/dL)

Antes da 1 ^a 10,6 29.900 355.000 95,0 36,0 1 ,20

Instilação

Cão 1 Após a 6 ^a Instilação 11 ,8 16.300 400.000 88,0 51 ,0 0,85

Após a 24 ^a 12,1 13.000 375.000 81 ,0 42,0 0,98 Instilação

Antes da 1 ^a 12,6 28.000 455.000 188,0 25,0 1 ,10

Instilação

Cão 2 Após a 6 ^a Instilação 12,0 16.300 350.000 129,0 35,0 0,80

Após a 24 ^a 13,1 11.000 400.000 68,0 22,0 1 ,00 Instilação

Antes da 1 ^a 12,0 7.900 1.100.000 46,0 39,0 1 ,16

Instilação

Cão 3 Após a 6 ^a Instilação 13,9 8.600 759.000 58,0 45,0 0,94

Após a 24 ^a 14,7 12.900 300.000 41 ,0 50,0 0,90 Instilação

Antes da 1 ^a 11 ,4 15.800 430.000 64,0 54,0 1 , 15

Instilação

Cão 4 Após a 6 ^a Instilação 12,3 18.800 390.000 80,0 53,0 0,78

Após a 24 ^a 12,0 17.000 410.000 84,0 56,0 0,66 Instilação

Antes da 1 ^a 12,7 10.500 260.000 33,0 31 ,0 0,62

Instilação

Cão 5 Após a 6 ^a Instilação 12,1 9.600 334.000 50,0 40,0 1 ,15

Após a 24 ^a 12,5 11.200 420.000 45,0 52,0 0J7 Instilação

Antes da 1 ^a 14,2 9.100 260.000 52,0 34,0 0,85

Instilação

Cão 6 Após a 6 ^a Instilação 13,9 8.300 360.000 40,0 31 ,0 0,88

Após a 24 ^a 14,7 7.900 330.000 48,0 33,0 0,92 Instilação

Valores de Referência: Hemoglobina: Após 1 Ano (12 - 18 g/dL); Leucócitos: Após 1 Ano (6.000 - 18.000/mm ³ ); Palquetas: 150.000 - 500.000/mm ³ ; ALT: 10 - 88 U/L; Uréia: 15 - 65 mg/dL; Creatinina: 0,5 - 1 ,5 mg/dL.

Tabela 15: Avaliações Ultrassonográficas do Tamanho, Volume e Redução Tumoral Comparadas com a Presença de Hemácias na Urina de Cães, Antes e Após os Tratamentos Intravesicais com MRB-CFI-1.

Parâmetros Ultrassonográficos do Tumor Parâmetro

Urina I

Esquema Terapêutico Comprimento Largura Volume Redução do Tumor Hemácias

(cm) (cm) (cm ³ ) (%) (p/mL)

Antes da 1 ^a Instilação 3,08 1 ,89 5,75 - 50.000

Após a 1 ^a Instilação 2,19 2,09 5,00 13,04 30.000

Cão 1 Após a 3 ^a Instilação 2,06 1 ,82 3,57 37,91 6.000

Após a 6 ^a Instilação 1 ,60 1 ,87 2,50 56,52 4.000

Após a 18 ^a Instilação 1 ,66 1 ,44 1 ,80 68,69 1.000

Após a 24 ^a Instilação 1 ,61 1 ,19 1 ,19 79,30 200

Antes da 1 ^a Instilação 3,42 2,75 13,53 - 70.000

Após a 1 ^a Instilação 3,08 1 ,99 6,38 52,84 10.000

Cão 2 Após a 3 ^a Instilação 2,66 1 ,81 4,56 66,29 3.000

Após a 6 ^a Instilação 1 ,54 1 ,41 1 ,60 88,17 500

Após a 18 ^a Instilação 1 ,79 1 ,12 1 ,17 91 ,35 200

Após a 24 ^a Instilação 1 ,94 0,90 0,82 93,93 300

Antes da 1 ^a Instilação 4,22 2,60 14,93 - 120.000

Após a 1 ^a Instilação 3,68 2,11 8,57 42,59 90.000

Cão 3 Após a 3 ^a Instilação 3,22 2,33 9,15 38,71 75.000

Após a 6 ^a Instilação 3,19 1 ,86 5,77 61 ,35 15.000

Após a 18 ^a Instilação 2,63 1 ,66 3,79 74,61 3.000

Após a 24 ^a Instilação 2,58 1 ,45 2,83 81 ,00 900

Antes da 1 ^a Instilação 3,91 1 ,84 6,92 - 960.000

Após a 1 ^a Instilação 3,48 1 ,92 6,71 3,03 150.000

Cão 4 Após a 3 ^a Instilação 4,14 1 ,74 6,56 5,20 78.000

Após a 6 ^a Instilação 2,76 1 ,53 3,38 48,84 24.000

Após a 18 ^a Instilação 1 ,96 1 ,31 1 ,76 74,56 6.000

Após a 24 ^a Instilação 2,35 1 ,00 1 ,23 82,22 2.000

Antes da 1 ^a Instilação 2,25 1 ,86 4,07 - 464.000

Após a 1 ^a Instilação 2,19 1 ,81 3,75 7,86 200.000

Cão 5 Após a 3 ^a Instilação 1 ,96 1 ,85 3,51 13,75 98.000

Após a 6 ^a Instilação 1 ,94 1 ,49 2,25 44,71 50.000

Após a 18 ^a Instilação 1 ,61 1 ,55 2,02 50,36 12.000

Após a 24 ^a Instilação 1 ,27 0,98 0,63 84,50 3.000

Antes da 1 ^a Instilação 2,84 2,73 1 1 ,08 - 1.500

Após a 1 ^a Instilação 2,57 2,64 9,12 17,68 1.000

Cão 6 Após a 3 ^a Instilação 3,03 2,06 6,70 39,53 2.500

Após a 6 ^a Instilação 2,34 1 ,52 2,83 74,45 1.500

Após a 18 ^a Instilação 2,49 1 ,20 2,02 81 ,76 1.000

Após a 24 ^a Instilação 2,69 1 ,04 1 ,52 86,28 1.200

Valor de Referência Hemácias (Urina I): até 6.000 p/mL

Análises de Adjuvância Terapêutica da Imunoterapia Intravesical com MRB-CFI- 1 e Quimioterapia Sistémica com Cisplatina no Câncer de Bexiga Não-Músculo Invasivo (CBN Ml)

[00125] Os efeitos histopatológicos da imunoterapia intravesical com MRB-CFI- 1 combinada à quimioterapia sistémica com cisplatina sistémica foram verificados em ratos Fischer 344 fêmeas, quimicamente induzidos ao câncer de bexiga não-músculo invasivo (CBNMI), conforme método já descrito acima. Após a indução do CBNMI com N-metil-N-nitrosourea (MNU), os animais foram distribuídos em quatro grupos experimentais (n= 7 animais por grupo): grupo 1 (Câncer): recebeu uma dose intravesical de 0,2 mL de solução fisiológica 0,9% por 6 semanas consecutivas; grupo 2 (Câncer + MRB-CFI-1): recebeu uma dose intravesical de 20 mg/Kg do composto MRB-CFI-1 por 6 semanas consecutivas; grupo 3 (Câncer + Cisplatina): recebeu uma dose intraperitoneal de 0,25 mg/Kg de Cisplatina uma vez por semana durante 4 semanas consecutivas; grupo 4 (Câncer + MRB-CFI-1 + Cisplatina): recebeu tratamento simultâneo com MRB- CFI-1 e Cisplatina nas mesmas concentrações e vias de administrações que os grupos 2 e 3. O protocolo para o uso dos animais na pesquisa foi aprovado pela Comissão de ética no Uso de Animais (CEUA) - UNICAMP (protocolo número: 4324-1 ).

[00126] Os resultados demonstraram carcinoma urotelial com invasão da lâmina própria (pT1) e carcinoma papilífero (pTa) em 100% dos animais do grupo Câncer.

[00127] Os animais tratados sistemicamente com cisplatina apresentaram diminuição da progressão das lesões neoplásicas uroteliais em 14,28%) dos animais, os quais apresentaram lesão benigna caracterizada por hiperplasia papilífera (Tabela 16). As lesões neoplásicas mais frequentes nesse grupo foram carcinoma in situ (pTis), carcinoma pTa e carcinoma pT1 em 14,28%, 57, 14% e 14,28% dos animais, respectivamente (Tabela 16).

[00128] Os animais tratados com MRB-CFI-1 intravesical, apresentaram diminuição da progressão das lesões neoplásicas uroteliais em 42,85%>, os quais apresentaram urotélio normal (Tabela 16). As lesões neoplásicas mais frequentes nesse grupo foram carcinoma pTis e carcinoma pTa em 28,57% e 28,57% dos animais, respectivamente (Tabela 16).

[00129] O tratamento combinado com imunoterapia intravesical com MRB-CFI-1 e quimioterapia sistémica com cisplatina evidenciou melhor recuperação histopatológica do estado de câncer e diminuição da progressão das lesões neoplásicas uroteliais em 71 ,42% dos animais, sendo que 42,85% apresentaram urotélio normal e 28,57% apresentaram lesão benigna caracterizada por hiperplasia plana (Tabela 16). A lesão neoplásica mais frequente nesse grupo foi o carcinoma pTis em 28,57% dos animais (Tabela 16).

[00130] Assim, pode-se concluir que a combinação de imunoterapia intravesical com MRB-CFI-1 e cisplatina sistémica pode ser considerada uma opção valiosa para o tratamento de pacientes que não respondem ao tratamento padrão com BCG e/ ou que não satisfazem os critérios para cistectomia precoce.

Tabela 16: Porcentagem de alterações histopaíológicas na bexiga urinária de ratos dos diferentes grupos experimentais.

Câncer+Cisplatina+MRB-CFI-1.

^' Significância estatística (teste de proporção, P<0,0001). RESULTADOS - EXEMPLOS DE CONCRETIZAÇÕES (I) e (II)

[00131] A caracterização do CFI-1 com controle do pH na ausência (PIBR 10 2017 012768 0) (CFI-1-PIBR-2017) e presença da monoetanolamina são as seguintes:

Analise elementar:

[00132] (A) CFI-1 (obtido conforme definido no exemplo de concretização (I)): C (0,05%), H(7,02%), N(5,35%). (B) CFI-1 (obtido conforme definido no exemplo de concretização (II)): C(0,08%), H(6,92%), N(5,33%).

Analise de Espectroscopia de Fotoelétrons Excitados por Raios-X ou XPS:

[00133] (A) CFI-1 (obtido conforme definido no exemplo de concretização (I)): P (16,4%), Mg (19,1 %), N (4,2%), O (60,3%), Razão P/Mg= 0,9. (B) CFI-1 (obtido conforme definido no exemplo de concretização (II)): P (16,9%), Mg (16,7%), N (5,0%) e 0(61 ,3%), Razão P/Mg= 1 ,0.

Tamanho (nm) e carpa superficial (potencial zeta, mV):

[00134] (A) CFI-1 (obtido conforme definido no exemplo de concretização (I)): mostra um valor de tamanho de partículas na região nano de 310,3, ± 56,9 nm; e potencial zeta de -21 ,8 ± 5,8 mV. (B) CFI-1 (obtido conforme definido no exemplo de concretização (II)): mostra um valor de tamanho de partículas na região nano de 449,6 ± 1 16,6 nm; e potencial zeta de -20,0 ± 5,1 mV.

Analise de Espectroscpia de Fluorescência de Raios-X (XRF):

[00135] (A) CFI-1 (obtido conforme definido no exemplo de concretização (I)): PO ₄ (55,06%), Mg (16,88%), NH (27,68), Razão PO ₄ /Mg= 3,36. (B) CFI-1 (obtido conforme definido no exemplo de concretização (II)): PO ₄ (56,43%), Mg (17,61 %), NH ₄ (25,13), Razão PO ₄ /Mg= 3,02.

Padrão de difração de raios-X (XRD)

[00136] A Figura 20 mostra claramente que o CFI-1-PIBR-2017 (A), obtido conforme definido no exemplo de concretização (I), apresenta as mesmas características de difração cristalina que o CFI-1 +Etanolamina (B), obtido conforme definido no exemplo de concretização (II). A Figura 20C mostra a superposição das duas figuras de XRD.