本発明者らは、熟成型のチーズでは、熟� ��中に、酵素がチーズカードやチーズの成分( タンパク質、炭水化物、脂肪など)を分解す� �ことで、風味成分(フレーバー)が生成されて いることに改めて着目した。

 そして、従来のナチュラルチーズの製造� ��程において熟成中の酵素反応に関与する酵� ��を産生する乳酸菌やその菌体破砕処理物、� ��生物由来のたんぱく質分解酵素などの様々� ��添加条件により、熟成型のチーズを試作し� ��それらのチーズについて食感や風味、物性� ��どを評価・解析した。このとき、食感や風� ��の評価には官能検査を用い、物性の評価に� ��熟成の進行の指標として可溶性窒素含量を� ��いた。これら食感や風味と物性を同時に評� ��・解析することにより、食感や風味の良好� ��熟成型のチーズの効率的な製造方法を見出� ��た。

 つまり、実験的な検討により、従来のナ� ��ュラルチーズの製造工程において乳酸菌や� ��の菌体破砕処理物、微生物由来のたんぱく� ��分解酵素などの添加条件を工夫することで� ��熟成期間や風味を簡便な操作で効率的に制� ��や調整できるという知見を見出した。この� ��き、ナチュラルチーズの製造工程において� ��チーズカードやチーズへ乳酸菌を高濃度に� ��加してから熟成し、乳酸菌に由来する酵素� ��意図的に増やして活用することで、熟成を� ��進しつつ、風味を向上(特に旨味を強化)し� �、熟成型のチーズが得られるという知見を� �時に見出した。また、微生物由来のたんぱ� �質分解酵素を添加したチーズを熟成させ、� �成途中のたんぱく質の分解状況を把握する� �とで、酵素の種類と添加量の選択、熟成条� �の設定により苦味が無く、良好な熟成風味� �強化できる方法を見出した。

 本発明のナチュラルチーズの製造方法は、� ��エイを排出した後のチーズカード及び/又は チーズに対し、菌体濃度で10 ⁷  個/g以上、好ましくは10 ⁸  個/g以上になるように、乳酸菌を追加して� �ら熟成することを特徴とする。

 このとき、乳酸菌を10 ⁷  個/g未満でチーズカードやチーズへ添加す� �と、熟成期間の大幅な短縮や風味の向上(特� ��旨味の強調)という、本発明の効果が十分に 得られないこととなる。

 また、乳酸菌をチーズカードやチーズへ� ��加する際に、乳酸菌数には特に上限はない� ��、実際に利用したいと考える本発明の効果� ��程度、チーズの風味や製造工程の効率など� ��勘案しながら設定すれば良いこととなる。

 乳酸菌を高濃度でチーズカードやチーズ� ��添加することで、熟成期間を短縮しやすく� ��風味を向上(強調)しやすくなるが、乳酸菌� �過剰に添加すると、旨味の他に好ましくな� �風味を強調してしまう可能性もある。

 そのため、乳酸菌数の上限として例えば、1 0 ⁹  個/g、10 ¹⁰  個/g、10 ¹¹  個/gなどが考えられる。一方、チーズでは� �成の進行に伴い、乳酸菌の生菌数は減少し� �つ溶菌し、菌体内の酵素が菌体外に放出さ� �て、チーズの成分が風味物質(フレーバーな� ��)に変換される。

 チーズの熟成では一般的に、乳酸菌が世� ��交代しながら、酸生成などの代謝活動を活� ��に持続したりすることはないため、乳酸菌� ��過剰に添加しない限り、熟成を促進する効� ��の他には、特に欠陥は現れないと考えられ� ��。

 本発明において、前記のホエイを排出し� ��後のチーズカードは熟成前のチーズカード� ��あり、前記のチーズは熟成初期のチーズに� ��当する。熟成初期のチーズとは、例えば、� ��旦成形包装され、熟成工程に移行できる状� ��になっているチーズ、あるいは熟成工程中� ��あるがまだ所定の熟成度合(熟成期間)に達� �ていない(通常は1/3以下)チーズのことをいう 。

 なお、本発明のナチュラルチーズの製造� ��法では、乳酸菌が生菌であっても死菌であ� ��ても良いこととなる。つまり、乳酸菌が本� ��で持っている酸生成能(活性)などを意図的� �低くすることなどが必須ではなく、乳酸菌� �何らかの方法で特別に処理せずに、そのま� �生菌で使用しても良いこととなる。このと� �、チーズカードやチーズへ乳酸菌の生菌を� �に添加すると、時間の経過に伴い生菌数が� �少しつつ溶菌することで、菌体内酵素が菌� �外へ放出され、菌体外酵素と共にチーズカ� �ドやチーズへ作用し、熟成を促進したり、� �味を強調したりすることとなる。

 なお、チーズカードやチーズの乳酸菌数� ��多くする目的で、乳酸菌の生菌(スターター など)を前もって原料乳(チーズ用乳)へ多く添 加すると、チーズカードの調製の際に、チー ズ用乳の酸度が過剰に上昇したりするため、 pHの制御という技術的に特殊な工夫が別途必� ��となる。

 一方、乳酸菌の死菌をチーズカードやチ� ��ズへ直に添加しても、菌体内酵素が失活し� ��いなければ、何れは菌体外へ放出されて菌� ��外酵素と共にチーズカードやチーズへ作用� ��、熟成を促進したり、旨味を強調したりす� ��こととなる。

 なお、乳酸菌を物理的(機械的)や化学的� �菌体破砕処理して、細胞壁や細胞膜を破砕� �破壊すれば、菌体内酵素を強制的に菌体外� �放出できることとなり、チーズカードやチ� �ズへ菌体内酵素が作用を開始するまでの時� �を短縮できることとなる。

 そのため、本発明のナチュラルチーズの製� ��方法は、ホエイを排出した後のチーズカー� ��及び/又はチーズに対し、菌体濃度で10 ⁵  個/g以上、好ましくは10 ⁶  個/g以上に相当するように、乳酸菌の菌体� �砕処理物を追加してから熟成しても良いこ� �となる。

 このとき、菌体濃度で10 ⁵  個/g以上に相当するように、乳酸菌の菌体� �砕処理物を追加するとは、例えば、菌体濃� �が10 ⁷  個/g以上の乳酸菌の培養物を菌体破砕処理� �てから、この菌体破砕処理した培養液を、� �ーズカードへ1重量%以上で添加すると、菌体 濃度で10 ⁵  個/g以上に相当する乳酸菌の菌体破砕物が� �ーズカードへ含まれることとなり、このよ� �な状態を意味している。

 つまり、菌体濃度が10 ⁷  個/g以上の乳酸菌の培養物を菌体破砕処理� �ると、乳酸菌は細胞片(破片)などとなって菌 体の形状を維持できないため、乳酸菌数を正 確に計測できなくなるが、実質的には菌体濃 度で10 ⁷  個/g以上に相当する乳酸菌の破片などが培� �液には含まれていることになる。この菌体� �度で10 ⁷  個/g以上に相当する乳酸菌の破片などを含� �だ培養液を、チーズカードやチーズへ1重量% 以上で添加すると、菌体濃度で10 ⁵  個/g以上に相当する乳酸菌の菌体破砕物が� �ーズカードやチーズへ含まれることとなる� �そして、この乳酸菌の菌体破砕物がチーズ� �ードやチーズへ作用し、熟成を促進したり� �旨味を強調したりすることとなる。

 なお、本発明のナチュラルチーズの製造� ��法では、菌体破砕処理として乾式粉砕や湿� ��粉砕などが例示できる。具体的には、ボー� ��ミル、ビーズミル、ホモゲナイザー(均質機 )、超音波装置などを使用できる。より具体� �には、ビーズショッカー(ビーズ径: 0.1~0.5mm� ��好ましくは0.2~0.4mm、より好ましくは0.3mm)、� ��圧ホモゲナイザー(操作圧力: 100~200MPa、好� �しくは130~150MPa、より好ましくは140MPa)などを 使用できる。

 このとき、菌体破砕処理として効率を勘� ��すると、連続処理などへ対応しやすいこと� ��どから、高圧ホモゲナイザーを使用し、100M Pa以上の操作圧力での均質化処理とすること� ��特に好ましいと考えられる。

 なお、本発明では、乳酸菌由来の酵素を� ��用できれば良いことから、乳酸菌を菌体破� ��処理した後に、一部が生菌として残存して� ��ても良いこととなる。

 従来のナチュラルチーズの製造方法では� ��熟成期間を調整する目的で以下に例示する� ��うな種々の方策が採用されていた。チーズ� ��乳へ乳酸菌スターターを添加してから発酵� ��て乳酸菌数を増やす。カビ由来の酵素を利� ��する。乳酸菌の培養物(乳酸菌スターターな ど)を加熱処理、加圧処理、酵素(リゾチーム) 処理などして乳酸菌の酸生成能を消失させた 上で、その培養物を酵素調製物として利用し つつ、スターターと併用する。

 ただし、これらの製造方法には、例えば� ��以下に説明するような問題点があった。チ� ��ズ用乳で乳酸菌(生菌)を増やしても、酸度� �過剰に上昇して正常なチーズカードが調製� �れない。チーズ用乳に乳酸菌培養物を処理� �た酵素調整物を添加しても、その大部分が� �エイへ流出して損失(ロス)してしまう。カビ 由来の酵素では熟成中に苦味が出る。

 このように、従来、ナチュラルチーズの� ��造方法において熟成期間を調整する目的で� ��用されていた方法には、何らかの制約(汎用 性の低さ)や手間などがあり、大量生産や連� �生産などで特に実用性に欠けていた。

 本発明のナチュラルチーズの製造方法で� ��、ホエイを排出した後のチーズカードやチ� ��ズに対し、乳酸菌、乳酸菌の菌体破砕処理� ��、微生物由来のたんぱく質分解酵素の中の� ��ずれか、あるいはこれらを任意に組み合わ� ��たものを直に追加(添加)するため、従来の� �造方法の問題や課題などを解決しており、� �下のような特徴がある。

 (C-1) カードの調製時の工程や操作に影響せ ず、従来の工程や操作を変えなくても良い、
 (C-2) カードの調整時の乳酸菌(スターター� �ど)の選択の自由度が大きい、
 (C-3) 原料乳(チーズ用乳)へ酵素調製物を添� ��する場合と異なり、酵素がホエイへ流出し� ��損失しないため、その効果の全部を有効に� ��用できる、
 (C-4) 乳酸菌を死菌だけでなく、生菌でも活 用でき、乳酸菌を酵素調製物などへ加工する ことが必須でない、
 (C-5) 乳酸菌を生菌だけでなく、死菌でも菌 体破砕処理物でも活用でき、チーズカードや チーズへ添加する前に、乳酸菌の生菌数が減 少していても良いため、乳酸菌の培養物など を冷蔵状態でも冷凍状態でも保存できる(乳� �菌の保存方法に制約が少なく自由度が高い)� ��
 (C-6) 熟成前のチーズカードだけでなく、熟 成中のチーズに熟成の途中からでも適用でき る。

 前記(C-6)では、例えば、当初には従来通� �でチーズの熟成を開始し、その熟成の途中� �チーズへ乳酸菌、乳酸菌の菌体破砕処理物� �微生物由来のたんぱく質分解酵素の中のい� �れか、あるいはこれらを任意に組み合わせ� �ものを追加で添加しても良い。具体的には� �その熟成中のチーズをミートチョッパーな� �で粉砕し、そこへ乳酸菌、乳酸菌の菌体破� �処理物、微生物由来のたんぱく質分解酵素� �中のいずれか、あるいはこれらを任意に組� �合わせたものを添加・混合してから、その� �ーズを改めて真空包装して熟成を継続する� �となどが考えられる。

 本発明の製造方法において、ホエイを排� ��した後のチーズカード及び/又はチーズに対 して追加(添加)する、乳酸菌、乳酸菌の菌体� ��砕処理物、微生物由来のたんぱく質分解酵� ��の中のいずれか、あるいはこれらを任意に� ��み合わせたものにおける乳酸菌には、Lactoco ccus 属、Lactobacillus 属、Streptococcus 属、Leucon ostoc 属、Propionibacterium 属、Bifidobacterium 属� �どを例示できる。具体的には、Lactococcus lact is subsp. lactis、L. lactis subsp. lactis biovar dia cetilactis、L. lactis subsp.cremoris、Lactobacillus hel veticus、L. helveticus subsp. jugurti、L. delbrueckii� �subsp. bulgaricus、L. delbrueckii subsp. lactis、L.  acidophilus、L. crispatus、L. amylovorus、L. gallinaru m、L. gasseri、L. johnsonii、L. casei、L. casei sub sp. rhamnosus、Streptococcus salivarius subsp. thermoph ilus、Leuconostoc cremoris、Leu. lactis、Leu. mesenter oides subsp. mesenteroides、Leu. mesenteroides subsp.  dextranicum、Leu. parames enteroides、Propionibacterium� �shermani、Bifidobacterium bifidum、B. longum、B. brev e. B. infantis、B. adolescentisなどを例示できる� ��このとき、これらの乳酸菌を単独で用いて� ��、2種類以上を混合して組み合わせて用いて も良い。

 本発明のナチュラルチーズの製造方法に� ��いて、乳酸菌は、膜分離法、遠心分離法、� ��空蒸発法の何れか1以上の方法により濃縮さ れたものを用いることができる。また、凍結 乾燥法、減圧噴霧乾燥法、噴霧乾燥法の何れ かの方法により乾燥された乳酸菌を用いても 良い。更に、中和培養した乳酸菌を用いても 良い。

 膜分離法、遠心分離法、真空蒸発法、凍� ��乾燥法、減圧噴霧乾燥法、噴霧乾燥法、中� ��培養法などにより、単位容量当たりの乳酸� ��数を増やして、乳酸菌の培養物などで乳酸� ��を高濃度に調整できる。

 このとき、乳酸菌の培養物を膜分離法、遠� ��分離法、真空蒸発法、中和培養法などで調� ��すると、乳酸菌は10 ¹⁰  ~10 ¹²  個/g程度となり、凍結乾燥法、減圧噴霧乾� �法、噴霧乾燥法などで調製すると、乳酸菌� �10 ¹¹  ~10 ¹³  個/g程度となる。

 本発明のナチュラルチーズの製造方法では� ��乳酸菌を高濃度でチーズカードやチーズへ� ��加することで、熟成期間を短縮しやすく、� ��味を強化しやすくなるが、乳酸菌の培養物� ��過剰に添加すると、その培養物の組成や風� ��の影響が大きくなり、好ましくない物性や� ��味となる可能性もある。そのため、乳酸菌� ��培養物の添加を少量にして、乳酸菌を高濃� ��でチーズカードやチーズへ添加することが� ��ましい。つまり、前記した濃縮法、乾燥法� ��中和培養法などにより、乳酸菌の培養物な� ��で乳酸菌を高濃度に調整してから、チーズ� ��ードやチーズへ添加することが好ましい。� ��方、乳酸菌の培養物の添加を少量にしすぎ� ��と、チーズカードやチーズで乳酸菌が均一� ��混合されず、分散状態が偏る可能性もある� ��そのため、乳酸菌の培養物の添加量を、チ� ��ズやチーズカードに対して0.1~5重量%、好ま� ��くは0.5~4重量%、より好ましくは1~3重量%に設 定することが適当であり、この添加量で、チ ーズカードやチーズに対して追加で、乳酸菌 を10 ⁷  個/g以上となるように設定することが好ま� �い。

 本発明のナチュラルチーズの製造方法で� ��、乳酸菌を濃縮や乾燥する際に、乳酸菌を� ��残させずに死滅させても良いが、乳酸菌の� ��つ酵素を損失や失活させないことが重要と� ��る。具体的には、乳酸菌を50℃以下や40℃以 下などの低温や中温で扱う必要がある。その ため、乳酸菌の濃縮法では、膜分離法、遠心 分離法が真空蒸発法よりも好ましく、乳酸菌 の乾燥法では、凍結乾燥法、減圧噴霧乾燥法 が噴霧乾燥法よりも好ましい。

 ところで、乳酸菌の持つ酵素には、菌体� ��に生成(放出)される菌体外酵素と、菌体内� �生成(保持)される菌体内酵素がある。そして 、この菌体外酵素では、タンパク質を分子量 の大きいペプチドに分解するプロテアーゼが 主体であり、菌体内酵素では、菌体内に取り 込んだペプチドを分子量の小さいペプチドや アミノ酸に分解するペプチダーゼやアミノペ プチダーゼが主体である。このとき、凝乳酵 素のレンネット由来の酵素がプロテアーゼと して主体で効果を発揮し、乳酸菌由来の菌体 外酵素は特に必要ではない。一方、分子量の 大きいペプチドは苦味の素となることがあり 、分子量の小さいペプチドやアミノ酸は旨味 の素となる。このとき、ペプチダーゼやアミ ノペプチダーゼは主に乳酸菌の菌体内酵素に 由来するため、菌体内酵素は特に必要である 。ここで、乳酸菌の濃縮法のうち、真空蒸発 法では、培養液の成分と共に乳酸菌を高濃度 化するのに対して、膜分離法、遠心分離法で は、培養液の成分を除去しながら乳酸菌の菌 体のみを高濃度化できる。つまり、膜分離法 、遠心分離法では、チーズの旨味を増やす菌 体内酵素の比率を高めながら、乳酸菌を高濃 度化でき、真空蒸発法に比べて効率的である 。なお、本発明のナチュラルチーズの製造方 法では、食品用のプロテアーゼ(タンパク質� �解酵素)を適宜併用すると、より効率的であ� ��。

 本発明のナチュラルチーズの製造方法で� ��、中和培養法として以下を例示できる。す� ��わち、乳酸菌の培養液でpHを5~6程度に制御� �ながら、乳酸菌の増殖の至適温度付近であ� �25~40℃、10~36時間で保持して培養する方法で� ��る。乳酸菌の培養液には、乳酸菌が良好に� ��殖(生育)できる公知の液体培地を適用すれ� �良く、脱脂乳、還元脱脂乳、ホエイ、還元� �エイなどに、炭素源としてブドウ糖、乳糖� �ショ糖など、窒素源として酵母エキス、肉� �キス、ペプトンなど、塩類としてリン酸一� �リウム、リン酸二カリウム、酢酸ナトリウ� �などを添加して調製すれば良い。乳酸菌の� �養中でのpHの制御には、アルカリ剤として水 酸化ナトリウム、アンモニア、炭酸ナトリウ ムの水溶液などを適宜使用すれば良い。乳酸 菌の培養液へアルカリ剤を添加し、乳酸菌の 生育を阻害や抑制する乳酸を中和して、乳酸 菌の増殖を促進する。中和培養しない場合に 比べて、中和培養した場合には、単位容量当 たりの乳酸菌数を10倍程度に増やせることと� ��る。

 本発明のナチュラルチーズの製造方法は� ��ホエイを排出した後のチーズカード及び/又 はチーズに対し、微生物由来のたんぱく質分 解酵素を添加してから熟成することを特徴と する。

 このとき、前記の微生物由来のたんぱく� ��分解酵素を添加した後、熟成したチーズの� ��ンタングステン酸可溶性窒素量(Phospho Tangst en Acid Soluble Nitrogen(PTASN))が全窒素量(Total Ni trogen(TN))に対して6.0~8.5%(PTASN/TN×100)に達した� �点で、水溶性窒素量(Water Soluble Nitrogen (WSN) )とPTASNの比(WSN/PTASN)が4.5以下であることを特� ��とするものである。

 また、前記の微生物由来のたんぱく質分� ��酵素はプロテアーゼ活性が2000unit/g以上であ り、なおかつペプチダーゼ活性が160unit/g以上 であることを特徴とするものである。

 前記において、リンタングステン酸可溶� ��窒素量(PTASN)はケルダール法で測定すること ができ、その前処理などの操作手順の一例を 説明すると次の通りである。チーズカードや チーズ(試料)を25gで採取し、温湯の150mLに溶� �する。これにホルマリン(40%)を数滴で加えて 、振とうしながら、50℃、2時間で保持する。 その後、脂肪層を除去した残りの液体を、300 0rpm、5分間で遠心分離する。上清液を目の細� ��い綿布で濾過し、その濾液(透過液)をメス� �ラスコ(250ml)へ入れる。遠沈管や綿布に残っ� ��沈殿を温湯で洗いながら、遠心分離と濾過� ��る操作を2回程度で繰り返し、そこで得た液 体を最初の濾液と混合する。前記の混合液へ 水を加えて、250mLの液体にする。前記の液体5 0mLを採取して、そこへ水を10mL、硫酸(25w/v%)を 30mL、PTA水溶液(19w/v%)を10mLで加えて、室温、24 時間で保持する。これを濾紙(TOYO No.5 B)で濾 過し、その濾液(透過液)20mLを採取して、ケル ダール法で窒素を定量する。

 また、全窒素量(TN)はケルダール法により 測定できる。例えば、次のようにして行うこ とができる。

 試料(チーズ)5gに約50℃に加温した0.05Mク� �ン酸ナトリウム・二水和物溶液を60ml加え、� ��転式ホモゲナイザーを用いて8000rpmで約3分� �、ホモジナイズする。ホモゲナイザーを蒸� �水で洗いこみながら100gの試料液とする。こ� ��試料液2mlを取り、ケルダール法により窒素� ��定量する。得られた値がチーズ1gあたりの� �窒素量である。

 前記における水溶性窒素量(WSN)はケルダ� �ル法により測定できる。例えば、次のよう� �して行うことができる。

 試料(チーズ)5gに約50℃に加温した0.05Mク� �ン酸ナトリウム・二水和物溶液を60ml加え、� ��転式ホモゲナイザーを用いて8000rpmで約3分� �、ホモジナイズする。ホモゲナイザーを蒸� �水で洗いこみながら100gとする。これをスタ� ��ラーで攪拌しながら、6規定塩酸溶液でpH4.40 ±0.05に調整する。東洋ろ紙No.5Aでろ過し、ろ� ��2mlを取り、ケルダール法により窒素を定量� ��る。得られた値がチーズ1gあたりの水溶性� �素量である。

 前記においてプロテアーゼ活性の測定は� ��ゼインーフォリン法(日本食品添加物協会)� �準じて、例えば、次のようにして行うこと� �できる。

 プロテアーゼ活性測定の基質は、酸カゼ� ��ン(ALACID720, Fonterra社)1.2gを50mMリン酸水素二� ��トリウム溶液に溶解させ、1N塩酸でpH7.0に調 整した後、蒸留水で200mlにフィルアップした� ��のを使用した。

 20mlのガラスチューブに基質液5mlを入れ37� ��で保温した。ここに適宜希釈した酵素液1ml� ��注入し、反応を開始した。30分後に反応停� �液(0.44Mトリクロロ酢酸)を注入後、30分間放� �し、酵素反応を停止させた。反応液を東洋� �紙No.2Aでろ過し、ろ液2mlに5mlの0.55M炭酸ナト� ��ウム溶液、1mlの0.67Nフェノール試薬(和光純� ��)を加え、37℃で30分間反応させた。発色し� �液の660nmの吸光度を測定した。60分間に反応� ��液1ml中にチロシン10μgに相当するアミノ酸� �生成させる酵素量を1unitと定義して、次式に より酵素重量当たりの活性を算出した。単位 は、unit/gとした。

 unit/g=(OD ₆₆₀ -OD ₀ )×117.6×(1/2)×(1/10)×N
   OD ₆₆₀ :反応ろ液の吸光度
   OD ₀ :酵素ブランクの吸光度
   117.6:チロジン検量線より求めた、吸光度 差が1のときのチロジン量
   (1/2):反応ろ液量
   (1/10):単位換算係数
   N:試料1g又は1ml当たりの希釈倍率

 また、前記において、ペプチダーゼ活性� ��測定は、例えば、次のようにして行うこと� ��できる。

 ペプチダーゼ活性測定の基質には、アミ� ��酸のp-ニトロアニリド(以下、p-NAと略す)誘� �体であるLys-p-NAを用いた。

 5mlのガラスチューブに、100μlの20mMアミノ 酸p-NA溶液、1.8mlの100mMリン酸カリウムバッフ� ��ー(pH7.0、37℃)を入れ37℃に保温した。ここ� �適宜希釈した酵素液100μlを注入し、反応を� �始した。30分後に反応停止液(30%(w/v)酢酸)1.0ml を注入し酵素反応を停止させた。反応停止後 10000rpmで5分遠心分離し、上清の410nmの吸光度� ��測定した。ペプチダーゼ活性によって遊離� ��たp-NAは410nmに極大吸収を持つ。1分間に1μmol のp-NAを遊離する酵素活性を1unitと定義して、 次式により酵素重量当たりの活性を算出した 。単位は、unit/gとした。

  unit/g=(OD ₄₁₀ -OD ₀ )×1.13×(1/30)×(1/0.1)×N
   OD ₄₁₀ :酵素反応液の吸光度
   OD ₀ :酵素ブランクの吸光度
   1.13:検量線より求めた、吸光度差が1のと きのp-NA量
   (1/30):反応時間
   (1/0.1):反応液量
   N:試料1g又は1ml当たりの希釈倍率

 本発明において、PTASN/TN×100が6~8.5%に達し た時点というのはチーズ風味の傾向が分析に よって確認できる熟成程度に相当し、その時 期においてWSN/PTASNが4.5以下であることが苦味 が出ないために必要である。

  PTASN/TN×100が6%未満の場合、熟成の傾向(� ��んぱく質の分解の特徴)を把握するには不十 分で、実際の熟成風味を反映しない場合もあ りうる。

 PTASN/TN×100が6~8.5%に達するのは、通常のチ ーズでは7~10℃の熟成温度では6~10ヶ月である� ��、保管温度15℃では1.5~3ヶ月である。熟成促 進のために本発明のように微生物由来のたん ぱく質分解酵素を添加したチーズでは、15℃� ��管では1~2ヶ月、18~20℃保管では2週間から1ヶ 月で判定が可能である。

 添加する微生物由来のたんぱく質分解酵� ��の特徴として、プロテアーゼ活性が2000unit/g 以上であり、なおかつペプチダーゼ活性が160 unit/g以上であることが必要である。プロテア ーゼ活性が2000unit/g未満の場合はタンパク分� �が遅くなりペプチドの生成量が少なくなる� �ペプチダーゼ活性が160unit/g未満だとペプチ� �の分解が遅くなり、苦味ペプチドが残存し� �熟成課程で苦味の強いチーズになる。

 前述した微生物由来のたんぱく質分解酵� ��としては、例えば、天野エンザイム株式会� ��製の「プロテアーゼA『アマノ』G」(商品名) 、「プロテアーゼM『アマノ』G」(商品名)、� �ウマミザイムG」(商品名)、「ペプチダーゼR� ��(商品名)、「グルタミナーゼダイワ」(商品� ��)、Kerry Food ingredients社製の「BioFV」(商品名 )などを使用することができる。チーズの風� �の改善という観点からは、「プロテアーゼA� ��アマノ』G」(商品名)、「プロテアーゼM『ア マノ』G」(商品名)、「ウマミザイムG」(商品� ��)、「BioFV」(商品名)がより好ましかった。

 本発明のナチュラルチーズの製造方法で� ��、チーズカード及び/又はチーズを殺菌しな くても良い。何れにしても、乳酸菌、乳酸菌 の菌体破砕処理物、微生物由来のたんぱく質 分解酵素などをチーズカードやチーズへ直に 添加するため、その有効成分である乳酸菌由 来の酵素や微生物由来のたんぱく質分解酵素 などがホエイと共に排出されない。つまり、 実際に添加した乳酸菌、乳酸菌の菌体破砕処 理物、微生物由来のたんぱく質分解酵素など の全部か大部分がチーズカードに保持されて 活用されることとなり、その有効成分である 酵素の損失(ロス)がないか僅かで少ないこと� ��なる。

 本発明のナチュラルチーズの製造方法で� ��、原料乳(チーズ用乳)へpH調整剤を添加して 、チーズカードを形成させても良く、このpH� ��整剤には、あたかも乳酸菌を添加した場合� ��ようなpHの履歴(経時変化)で、チーズ用乳の pHを低下させる物質(食品添加物など)が好ま� �く、具体的には、グルコノデルタラクトン(G DL)を例示できる。

 つまり、チーズカードを形成させる際に� ��乳酸菌スターターの代わりに、pH調整剤を� �用しても良いし、乳酸菌スターターとpH調整 剤を併用しても良いこととなる。

 このとき、グルコノデルタラクトンの添� ��量は、原料乳(チーズ用乳)に対して、0.1~1重 量%、好ましくは0.2~0.8重量%、より好ましくは 0.3~0.6重量%である。グルコノデルタラクトン� ��添加量が1重量%を超えると、チーズ用乳へ� �ルコノデルタラクトンを添加した際に、pHが 緩やかに低下しないため、チーズカードの水 分が十分に排出できないこともあり、チーズ (最終製品)の水分が高めになってしまう。

 チーズカードを形成させる際に、pH調整� �を使用する利点は以下の通りである。

 (D-1) 乳酸菌スターターの培養用の設備投資 、培養中の運転条件の管理、培養終了後の乳 酸菌の活力や菌数の管理などが不要になり、 それらの負担が軽減される、
 (D-2) 乳酸菌スターターを使用してチーズカ ードを形成させる場合には、pHの履歴を常に� ��識しながら、乳酸菌スターターを選択しな� ��ればならないが、pH調整剤(GDLなど)では、そ の危惧がなくなる、
 (D-3) 乳酸菌スターターを使用してチーズカ ードを形成させる場合には、ファージによる 汚染でチーズ用乳のpHの低下が遅延し、チー� ��カードが正常に形成されないことがあるが� ��pH調整剤(GDLなど)では、その可能性がなくな る。つまり、チーズカードやチーズへ乳酸菌 を後添加(追加)する場合には、pHの低下など� �は無関係なので、ファージによる汚染があ� �ても問題とならない。ここでの乳酸菌では� �体内酵素の利用が目的であり、ファージに� �る汚染で溶菌が進行する可能性があり、む� �ろファージによる汚染は良い方向に働く可� �性もある、
 (D-4) 乳酸菌スターターを使用してチーズカ ードを形成させる場合には、チーズの風味や 物性への影響を意識しながら、乳酸菌スター ターを選択しなければならないが、pH調整剤( GDLなど)では、その危惧がなくなる。そのた� �、チーズカードやチーズへ後添加(追加)する 乳酸菌の選択に注力でき、この後添加する乳 酸菌として風味の生成へ大きく影響するもの を使用しやすくなる。その結果として、熟成 型のナチュラルチーズで、風味(香味)や物性� ��任意で様々に調整でき、従来にない新たな� ��チュラルチーズを開発できる、
 (D-5) チーズの細菌的な保存性を確保する目 的で、チーズカードを形成させる段階で、そ の菌叢を乳酸菌で優勢に保つ必要がある場合 には、pH調整剤(GDLなど)と乳酸菌を併用する� �とも可能である。

 ホエイを排出した後のチーズカード(すな わち、熟成前のチーズカード)及び/又はチー� ��(すなわち、熟成初期のチーズ)に対して、� �酸菌、乳酸菌の菌体破砕処理物、微生物由� �のたんぱく質分解酵素の中のいずれか、あ� �いはこれらを任意に組み合わせたものを添� �する場合には、ホエイを排出した後のチー� �カード及び/又はチーズを細かく切断や粉砕� ��た状態で行うことが効率的である。すなわ� ��、ホエイを排出した後のチーズカード及び/ 又はチーズを細かく切断や粉砕した状態で、 乳酸菌の培養液や濃縮液を噴霧したり、乳酸 菌の乾燥粉体を添加・混合したり、微生物由 来のたんぱく質分解酵素を添加・混合する。 このようにすると、乳酸菌由来の酵素や微生 物由来のたんぱく質分解酵素がチーズカード (熟成前のチーズカード)及び/又はチーズ(熟� �初期のチーズ)の全体へ十分に混合されて効� ��的である。

 例えば、ドライソルトチーズなどの製造� ��程では、ホエイの大部分が排出された後に� ��チーズカードが細断されている工程で食塩( 粉末)を添加・混合することとなるが、この� �塩などと共に乳酸菌の乾燥粉体を添加すれ� �、新たな工程が特に必要ないこととなる。

 一方、熟成中のチーズに熟成の途中から� ��酸菌を添加する場合には、チーズカードの� ��合と同様に、チーズを細かく切断や粉砕し� ��状態で処理すると、乳酸菌がチーズの全体� ��十分に混合されて効率的であるが、チーズ� ��塊へ乳酸菌の液体や粉体をニードルやチュ� ��ブで注入などしても良い。

 本発明のナチュラルチーズの製造方法で� ��、特に熟成型のチーズを対象としており、� ��ェダー、ゴーダ、エダム、エメンタール、� ��ルメザン、カマンベール、ブルーなどを本� ��明の製造方法によって製造するナチュラル� ��ーズとして例示できる。

 本発明のナチュラルチーズは、前記の製� ��方法で製造される、熟成型のチーズであり� ��その風味の特徴として、旨味が強化され、� ��味が抑制されている。

 そして、本発明のナチュラルチーズでは� ��例えば、ホエイ排出後のチーズカードに対� ��て追加で、乳酸菌、乳酸菌の菌体破砕処理� ��、微生物由来のたんぱく質分解酵素の中の� ��ずれか、あるいはこれらを任意に組み合わ� ��たものを添加してから熟成を開始して90日� �のチーズの可溶性窒素含量が熟成開始時に� �較して4%以上、好ましくは5%以上、より好ま� ��くは6%以上で増加する。

 本発明において前述したチーズの可溶性� ��素含量は、チーズの全窒素中のリンタング� ��テン酸(PTA)可溶性窒素のことであり、分子� �が約600以下の低分子のペプチドやアミノ酸� �含まれる窒素のことである。これらの低分� �のペプチドやアミノ酸は、チーズカードや� �ーズのタンパク質が酵素により分解されて� �成してくるものであり、チーズの熟成の進� �に伴い増加する。

 この可溶性窒素含量は、熟成の進行を表す� ��標であり、次のように定義される
  可溶性窒素含量 [%] = チーズのPTA可溶性� ��素 / チーズの全窒素 × 100
 ここで、チーズのPTA可溶性窒素や全窒素は� ��ルダール法で測定することができ、その際� ��前処理工程などの一例としては前述したも� ��を採用できる。

 なお、可溶性窒素含量の評価では、乳酸� ��の培養液の成分などに由来する可溶性窒素� ��量を減じて、チーズカードやチーズの熟成� ��伴う実際の可溶性窒素含量と定義した。

 図1は、従来のゴーダチーズについて可溶 性窒素含量を前述した方法で測定した結果を 表わすグラフである。従来のゴーダチーズで は熟成開始から90日後のチーズの可溶性窒素� ��量は熟成開始時に比較して2~3%で増加してい た。

 本発明の製造方法によって製造した本発� ��のナチュラルチーズにおいても、チーズの� ��溶性窒素含量は従来と同様な傾向で増加す� ��ことが想定される。これは、後述する実施� ��1~8においても確認することができた。熟成� ��始後のチーズの可溶性窒素含量は、風味の� ��善という観点から、熟成開始後90日の時点� �可溶性窒素含量が熟成開始時に比較して4%以 上、好ましくは5%以上、より好ましくは6%以� �で増加することが好ましい。

 本発明者等の実験によれば、ホエイを排出� ��た後のチーズカード及び/又はチーズに対し 、菌体濃度で10 ⁷  個/g以上になるように乳酸菌を追加してか� �、あるいは、菌体濃度で10 ⁵  個/g以上に相当するように乳酸菌の菌体破� �処理物を追加してから熟成する場合、熟成� �始後3カ月経過時の可溶性窒素含量 [%]が、� �成開始時に比較して4.0~8.5%増加していること が風味の改善という観点から望ましかった。

 また、ホエイを排出した後のチーズカー� ��及び/又はチーズに対し、微生物由来のたん ぱく質分解酵素を添加してから熟成する場合 、熟成開始後3カ月経過時の可溶性窒素含量  [%]が、熟成開始時に比較して6.0~8.5%増加して� ��ることが風味の改善という観点から望まし� ��った。

 チーズの熟成期間や風味などを調整する� ��法では従来、熟成(保管)温度を制御(管理)す ることが実用的であり、代表的であった。つ まり、チーズの熟成を促進して、熟成期間を 短くしたい場合や風味を強くしたい場合など には、熟成温度を高くすれば良く、チーズの 熟成を抑制して、熟成期間を長くしたい場合 や風味を弱くしたい場合などには、熟成温度 を低くすれば良い。このとき、チーズの熟成 を停止したい場合には、熟成(保管)温度を氷� ��や冷凍などの状態にすれば良い。ただし、� ��ーズの熟成を大幅に促進しようとしても、� ��菌増殖、酸化反応、品質劣化などの影響か� ��熟成温度には上限(約15℃)が存在し、熟成温 度で熟成を促進する効果には限界があった。

 これに対して、熟成温度を制御しつつ、� ��らに本発明を適用すれば、チーズの熟成を� ��進することも抑制することも自由自在に調� ��できる。そして、このようにしてチーズの� ��成を調整する方法は前記した通り、熟成前� ��チーズカードだけでなく、熟成中のチーズ� ��熟成の途中からでも適用できる。このこと� ��、各種のチーズ(製品)の需要を予測して在� �を管理したり、生産物量を調整したりしな� �ら、発注の時期(タイミング)を計るという、 チーズ製造者や販売者にとって不安定でスト レスの大きい業務を軽減できる。特に長期熟 成型のチーズを短期間で容易に入手できるよ うになることは画期的である。

 本発明のナチュラルチーズの製造方法で� ��、例えば、通常や従来の必要な熟成期間と� ��べて、30~60%、好ましくは30~70%、より好まし� ��は30~80%、さらに好ましくは20~70%、最も好ま� ��くは20~80%まで実質的に短縮できる。

 以下、本発明に関して実施例を挙げて説� ��するが、本発明は、これにより限定される� ��のではない。

(チェダーチーズ用チーズカードの調製)
 乳量にして100kgの規模でチェダーチーズを� �造するにあたり、まず、チーズカードを調� �した。原料乳(チーズ用乳)では、タンパク質 /脂肪の比率を0.8に調整し、63℃、30分間で加� ��殺菌した。この殺菌後のチーズ用乳へ塩化� ��リウムを0.03重量%で添加した後に、乳酸菌� �スターターを1.2重量%、レンネットを0.01重量 %で添加した。凝固を確認した後カッティン� �、クッキングを行い、ホエイを排出したチ� �ズカードを製造した。この乳酸菌のスター� �ーには、Lactococcus lactis subsp. lactis、L. lacti s subsp. cremoris の混合菌が含まれていた。ホ エイを排出したチーズカードを加圧成形した 後に、約2cm四方の寸法に切り分けてから重量 で3等分し、チーズカード1、2、3とした。