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Patent Searching and Data


Title:
METHOD FOR PRODUCING OPTICALLY ACTIVE, CYCLIC DEPSIPEPTIDES COMPRISING LACTIC ACID AND PHENYL LACTIC ACID AND HAVING 24 RING ATOMS, USING FUNGUS STRAINS OF ROSELLINIA TYPE, AND FURTHER SPECIES OF XYLARIACEAE
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2010/072323
Kind Code:
A1
Abstract:
The present invention relates to a method for producing optically active cyclic depsipeptides comprising lactic acid and phenyl lactic acid and having 24 ring atoms, by means of both representatives of the Rosellinia and Coniolariella genii (xylariaceae) growing from fruiting bodies dead wood and living wood of deciduous and coniferous trees and fungus strains of the Rosellinia genus and further xylariaceae isolated directly from wood and roots of deciduous and coniferous trees, or enzymatic preparations isolated from said fungus strains. PF1022A having the general formula (I) is excellently suited for treating endoparasites, particularly in the fields of human and veterinary medicine.

Inventors:
HARDER ACHIM (DE)
PHAM THI LAM HUONG (DE)
JARLING RENE (DE)
ZASPEL IRMTRAUT (DE)
EWALD DIETRICH (DE)
Application Number:
PCT/EP2009/008740
Publication Date:
July 01, 2010
Filing Date:
December 08, 2009
Export Citation:
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Assignee:
BAYER ANIMAL HEALTH GMBH (DE)
HARDER ACHIM (DE)
PHAM THI LAM HUONG (DE)
JARLING RENE (DE)
ZASPEL IRMTRAUT (DE)
EWALD DIETRICH (DE)
International Classes:
C12P17/14
Foreign References:
EP0930304A11999-07-21
Other References:
SASAKI T ET AL: "A NEW ANTHELMINTIC CYCLODEPSIPEPTIDE PF1022A", JOURNAL OF ANTIBIOTICS (TOKYO), vol. 45, no. 5, 1992, pages 692 - 697, XP002934786, ISSN: 0021-8820
YANAI KOJI ET AL: "Para-position derivatives of fungal anthelmintic cyclodepsipeptides engineered with Streptomyces venezuelae antibiotic biosynthetic genes", NATURE BIOTECHNOLOGY, NATURE PUBLISHING GROUP, NEW YORK, NY, US, vol. 22, no. 7, 1 July 2004 (2004-07-01), pages 848 - 855, XP002332548, ISSN: 1087-0156
WEEKWERTH W ET AL: "BIOSYNTHESIS OF PF1022A AND RELATED CYCLOOCTADEPSIPEPTIDES", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY OF BIOLOCHEMICAL BIOLOGISTS, BIRMINGHAM, US, vol. 275, no. 23, 9 June 2000 (2000-06-09), pages 17909 - 17915, XP002943462, ISSN: 0021-9258
CHECA JULIA ET AL: "Coniolariella hispanica sp nov and other additions to Coniolariella", MYCOLOGICAL RESEARCH, vol. 112, no. Part 7, July 2008 (2008-07-01), pages 795 - 801, XP002564343, ISSN: 0953-7562
SCHERKENBECK JUERGEN ET AL: "PF1022A and related cyclodepsipeptides: A novel class of anthelmintics.", CURRENT TOPICS IN MEDICINAL CHEMISTRY, vol. 2, no. 7, July 2002 (2002-07-01), pages 759 - 777, XP002564556, ISSN: 1568-0266
Attorney, Agent or Firm:
BAYER ANIMAL HEALTH GMBH et al. (DE)
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Claims:
Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von PF1022A der Formel

einem cyclischen Octadepsipeptid mit 24 Ringatomen mit Hilfe von Pilzstämmen der Art Rosellinia und weiterer Gattungen der Familie Xylariaceae oder mittels der aus diesen Pilzstämmen isolierten enzymatischen Präparaten.

2. Verfahren zur Herstellung von PF1022A gemäß Anspruch 1 mit Hilfe der Pilzstämme Rosellinia spp. und weiterer Xylariaceaen, insbesondere Rosellinia aquila oder Rosellinia corticum.

Description:
Verfahren zur Herstellung Milchsäure- und Phenylmilchsäurehaltiger optisch aktiver, cvclischer Depsipeptide mit 24 Ringatomen mit Hilfe von Pilzstämmen der Art Rosellinia sowie weiteren Gattungen der Xylariaceen.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung optisch aktiver, milchsäure- und phenylmilchsäure-haltiger, cyclischer Depsipeptide mit 24 Ringatomen (z.B. PF1022A) mittels der Pilzstämme der Gattung Rosellinia und weiterer Gattungen der Familie Xylariaceae oder mittels der aus diesen Pilzstämmen isolierten enzymatischen Präparaten. PF1022A mit der allgemeinen Formel (I) eignet sich hervorragend zur Bekämpfung von Endoparasiten, besonders auf dem Gebiet der Human- und Veterinärmedizin.

Formel Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von bekannten milchsäure- und phenylmilchsäure-haltigen Cyclodepsipeptiden mit 24 Ringatomen. Derartige cyclische Depsipeptide mit 24 Ringatomen (Octadepsipeptide) und ihre Verwendung als Endoparasitizide sind bereits Gegenstand einer vorgängigen Patentanmeldung (US005571793A). Es gibt eine Reihe von chemischen und mikrobiellen Verfahren zur Herstellung von cyclischen, D-2-hydroxy-isovaleriansäure-haltigen Depsipeptiden mit 24-Ringatomen (z.B. durch Synthese, vgl.: Ohyama M. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 58 (1994) S. 1193-1194; Scherkenbeck J. et al. Tetrahedron 51 (1995) S. 8459-8470; Kobayashi M. et al. Annu. Rep. Sankyo Res. Lab. 46 (1994) S. 67- 75; Lee B. ef al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 12 (2002) S. 353-356; Dutton FE et al. J. Antibiot. 47 (1994) S. 1322-1327).

Die Fermentation des D-milchsäure- und D-phenylmilchsäure-haltigen Cyclooctadepsipeptids PF1022A mit Hilfe eines Pilzstammes, welcher „Strain PF1022A" genannt wurde, wird in einem japanischen Patent beschrieben (Sasaki T. ef al. J. Antibiot.

45 (1992) S. 692-697; Yanai K ef al. Nature Biotechnology 22 (2004) S. 848-855). Dieser

Stamm PF1022A wurde aus Pflanzenblättern von Camellia japonica, welche in der Ibaraki

Prefektur in Japan gesammelt wurden, isoliert. Der Stamm wurde hinterlegt im „National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and

Technology" (Japan) mit der Accession-Nummer FERM BP-2671 und in „Institute for

Fermentation, Osaka" mit der Nr. IFO33096. Der von Meiji Saika Kaisha Ltd. beschriebene PF1022A produzierende Pilzstamm gehört zur Familie Xylariaceae, seine nächsten Verwandten sind Rosellinia necatrix IFO 32537 (Miyadoh S. ef al. Nippon Kingakukai Kaiho 41 (2000), S. 183-188) und Xylaria polymorpha IFO 9780 (Sasaki T. ef al. J. Antibiot. 45 (1992), S. 692-697). Diese beiden Stämme produzieren keine PF1022A-

Verbindung.

Die vorliegende Erfindung betrifft das Auffinden neuer Pilzstämme, welche aus Fruchtkörpern von auf Totholz von Laub- und Nadelbäumen wachsenden Arten der Gattungen Rosellinia und Coniolariella sowie weiteren Xylariaceen isoliert werden, zur Herstellung von PF1022A. Beschreibung der Isolierung von Pizstämmen aus Fruchtkörpern der auf Totholz von Laub- und Nadelbäumen wachsenden Rosellinia SDD. und der weiteren Xylariaceen als potentielle Wirkstoffbildner des PF1022A :

Die ubiquitär vorkommende Gattung Rosellinia wird in die Familie Xylariaceae eingeordnet, die der umfangreichen Ordnung Xylariales (Phylum Ascomycota) angehört. Vertreter dieser Ordnung besitzen charakteristische kugelförmige Fruchtkörper (Perithecien) mit definierten Ostiolen, in denen die Asci mit Sporen ausgebildet werden.

Neben der Gattung Rosellinia werden die weiteren Gattungen Coniolariella, Daldinia, Hypoxylon, Poronia, Ustulina und Xylaria in diese Familie eingeordnet. Jede dieser Gattungen verfügt über eine Reihe unterschiedlicher Arten, innerhalb derer potentiell Produzenten von cyclischen Depsipeptiden auftreten können.

Die Gattungen der Familie Xylariaceae besitzen sehr harte spröde Perithecien, in denen sich die Asci mit jeweils 8 dunkelbraunen bis schwarzen Sporen befinden. Die Gattung Rosellinia umfasst eine Reihe von Arten, die saprophytisch oder endophytisch leben, aber auch als Pathogene in Erscheinung treten. Pathogene Arten parasitieren lebendes Holz und Wurzelsysteme von Laub- und Nadelbäumen. Saprophytische Vertreter dieser Gattung leben vor allem auf totem Holz, welches sich bereits im Zersetzungsprozess befindet. Die Gattung Coniolariella wurde erst kürzlich aus der Gattung Rosellinia abgetrennt als eigenständige Gattung (Checa, J.; Arenal, F.; Blanco, N.; Rogers, L.D.: „Coniolariella hispanica sp. nov. and other additions to Coniolariella" Mycological Research 2008, 112, 7, 795-801 ). Die einzelnen Arten haben in der Natur relativ hohe Ansprüche an das Temperatur-, Feuchte- und Lichtregime. Ihr Auftreten ist zusätzlich an den jahreszeitlichen Rhythmus (insbesondere später Winter, zeitiges Frühjahr) gebunden sowie an einen hohen Grad an Naturnähe der bevorzugten Biotope. Rosellinia-Aύen können in Wäldern, die wenig oder nicht bewirtschaftet werden, nachgewiesen werden.

Die hier interessierenden Pilzstämme aus der Gattung Rosellinia wurden alle von Totlaubholzproben (z.B. Berg-Ahorn, Robinie) isoliert. Allerdings ist eine genaue Zuordnung der Baumart zu der jeweiligen Totholzprobe nicht immer möglich auf Grund des unterschiedlichen Zersetzungsgrades.

Die Gewinnung von Reinkulturen erfolgte aus reifen, unversehrten und möglichst allein stehenden Perithecien, die vom Totholz entnommen wurden. Diese wurden oberflächlich mit 0,05%iger AgNO 3 -Lösung desinfiziert und mehrmals mit sterilem Wasser gespült. Die Perithecien wurden vorsichtig auf einem Objektträger zerdrückt und die freiwerdenden Asci und Sporen in Röhrchen mit sterilem Wasser überführt.

Durch die mikroskopische Kontrolle konnte eingeschätzt werden, in welcher Dichte und mit welchem Reifezustand die Sporen auftraten. Bei hoher Sporendichte wurde die Sporensuspension dekadisch weiter verdünnt und von der jeweiligen Verdünnungsstufe 100 μl auf Malzextrakt-Agar (MEA) plattiert. Die Platten wurden bei 18 bis 20 0 C aufbewahrt, täglich unter dem Mikroskop bonitiert und auskeimende Sporen auf frischen Potato-Dextrose-Agar (PDA) übertragen. Das gebildete Myzel auf diesem Nährboden wächst weißlich flach und zart aus ohne Luftmycelbildung.

Nachdem die Kulturen ausreichend gewachsen waren, wurde das Myzel standardmäßig mit Methanol extrahiert. Die Identifizierung der Inhaltsstoffe der Myzelextrakte und die Quantifizierung der PF1022A-Gehalte erfolgen mittels LC-PDA-ESI-Q-TOF-MS und - MS/MS. Es wurden verschiedene Linien von Rosellinia bzw. aus der neuen Gattung Coniolariella gefunden, die sich als positiv hinsichtlich der Bildung von PF1022A erwiesen.

Acht PF1022A-Produzenten werden nach morphologischen Merkmalen sowie molekularen Daten nach Sequenzierung des ITS1/4-Abschnitts der 5.8S rDNA sowie partiell der 18S- und 28S-Bereiche den folgenden Arten zugeordnet:

XR-9: Rosellinia corticum bzw. Rosetlinia sp. (nicht näher determinierte Rosellinia-Art) von Laubholz

XR-15: Coniolariella hispanica Checa, Arenal & J. D. Rogers, sp. nov. von Berg-Ahorn

XR-16: Coniolariella hispanica Checa, Arenal & J. D. Rogers, sp. nov. von Laubholz

XR-19: Rosellinia sp. bzw. R. corticum, entweder von Robinie oder von Berg-Ahorn

XR-21 : Rosellinia sp. bzw. R. corticum von Laubholz

XR-26: Rosellinia sp. bzw. R. corticum von Laubholz

XR-55: Rosellinia sp. bzw. R. corticum von Laubholz

XR-56: Rosellinia sp. bzw. R. corticum von Laubholz Es wurden Versuche zur Kultivierung durchgeführt. Im Vergleich zu Mycelia sterilia T38- 18 „Wildtyp" und den Stämmen Rosellinia abscondita CBS 448.89 und CBS 450.89 wurde auf den Medien MEA, mPDA, CMA sowie Seed-Agar bei den neuen isolierten Pilzstämmen ein wesentlich schnelleres Wachstum festgestellt.

Die Kulturen Rosellinia corticum bzw. Rosellinia sp. XR-9, Coniolariella hispanica XR-15 und C. hispanica XR-16 wuchsen innerhalb von 10 bis 12 Tagen bei 21 bis 22 0 C bis an den Rand der Kulturschale (9 cm), wogegen die Vergleichskulturen Mycelia sterilia T38- 18 „Wildtyp", Rosellinia abscondita CBS 448.89 und R abscondita CBS 450.89 deutlich geringere Durchmesser aufwiesen. Das bedeutet, dass die neuen Rosellinia- bzw. Co/7/o7a/7e//a-Stämme ein viel rascheres Wachstum aufweisen. Ebenso schnell wuchsen auch die Stämme Rosellinia sp. bzw. R corticum XR-19, XR-21 , XR-26, XR-55, XR-56.

Auf MEA und mPDA bildete sich ein zartes Myzel aus, während auf den nährstoffreichen Medien CMA und Seed-Agar ein dichtes, teilweise filziges Myzel gebildet wurde. Auf dem Medium M1 bildeten die Isolate XR-19 und XR-26 ein teilweise fedriges Myzelbild.

Zusammensetzung der verwendeten Medien :

CMA : Maismehl 50 g/l, Agar-Agar 15 g/l

M1 : Malzextrakt 10 g/l, Hefeextrakt 4g/l, Glukose 4 g/l, Agar-Agar 15 g/l

Seed-Agar: Pharmamedia 20 g/l, Sojapepton 2 g/l, Maltose 40 g/l, MgSO 4 JH 2 O 2 g/l, NaCI 2 g/l, CaCO 3 3 g/l, Agar-Agar 15 g/l

MEA: Malzextrakt 17 g/l, Agar-Agar 15 g/l

mPDA: Glukose 5 g/l, Kartoffelstärke 20 g/l, Hefeextrakt 1 ,5 g/l, Agar-Agar 15 g/l

Da es sich bei den vorliegenden Kulturen um Isolate handelt, die direkt aus dem natürlichen Ökosystem in künstliche Bedingungen überführt wurden, können Kulturformen auftreten, die unterschiedliche Myzelformen sowie eine Variation in der Stärke der Wirkstoffbildung ausbilden. Beschreibung der Identifizierung der Inhaltsstoffe, insbesondere PF1022A. in den Myzelextrakten der neuisolierten Stämmen im Vergleich zu Mycelia sterilia T38-18 (WT) mittels LC-PDA-ESI-Q-TOF-MS und -MS/MS:

Zur Identifizierung der Inhaltsstoffe, insbesondere der PF1022-Verbindungen wurden die Myzel-Methanolextrakte von Mycelia sterilia T38-18 (WT: Wildtyp) und von den neuen Isolaten XR-9, XFM 5, XR-16, XR-19, XR-21 , XR-26, XR-55 und XR-56 mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit zwei Detektoren Photodiodenarray (PDA) und Massenspektrometer (MS) untersucht.

Diese Untersuchung erlaubt den Vergleich der Inhaltsstoffe in den Methanolextrakten der Myzel (auf Seed Agar-Medium) von Mycelia sterilia T38-18 (WT) mit denen von dem neuen Isolat XR-21 anhand der HPLC-Chromatogramme bei Detektion mit PDA- und MS- Detektoren. Hier kann ein eindeutiger Unterschied der vorgenannten Stämme in der Produktion der Inhaltsstoffe wie folgt erkannt werden:

Mycelia sterilia (WT) produziert eine Reihe von PF1022-Verbindungen: PF1022-A (C 52 H 76 N 4 O 12 ), PF1022-B (C 64 H 84 N 4 O 12 ), PF1022-C (C 58 H 80 N 4 O 12 ), PF1022-D (C 46 H 72 N 4 O 12 ), PF1022-E (C 52 H 76 N 4 O 13 ) und PF1022-F (C 40 H 68 N 4 O 12 ). Davon sind PF1022-A (Retentionszeit R t : 25,1 bis 25,6 min in den Chromatogrammen bei Detektion mit PDA- und MS-Detektoren) und PF1022-D (R,: 19,5 bis 20 min) die Hauptinhaltsstoffe, während die neuen Isolate,

z.B. der Stamm XR-21 neben PF1022-A (Charakterisierung mittels LC-PDA-MS anhand UV/Vis- und MS-Daten sowie R t , gleiche Molekülmasse bei der gleichen Retentionszeit in den HPLC-Chromatogrammen im Vergleich zu PF1022A aus Mycelia sterilia) und andere Verbindungen (R,: 12 bis 24 min), welche nicht zu den PF1022-Verbindungen gehören, als Hauptinhaltsstoffe auch PF1022-B und -C als Nebenverbindungen, jedoch fast keine PF1022-D produziert. Ebenfalls wurden die Verbindungen PF1022-E und -F hier nicht gefunden.

Ähnliche Ergebnisse können auch beim Vergleich zwischen dem TIC-MS- Chromatogramm von Mycelia sterilia (WT) mit denen von den neuen Isolaten XR-15 und XR-19 festgestellt werden. Weitere Untersuchungen zur Identifizierung der PF1022A- Verbindung erfolgten mittels LC-ESI-Q-TOF-MS/MS.

Es erfolgte auch ein Vergleich der selektierten Peaks der PF1022A-Verbindung in den LC-MS/MS-Chromatogrammen der Myzelextrakte von Mycelia sterilia (WT) und von den neuen Isolaten XR-15 und XR-19. Diese Peaks haben die gleiche Retentionszeit. Die in den MS/MS-Spektren detektierten MS/MS-Fragmente der Masse 949,6 des Protonadduktes der PF1022A-Verbindung aus den Myzelextrakten von Mycelia sterilia (WT) sowie von den neuen Isolaten XR-15 und XR-19 sind einander identisch.

Die o. g. Ergebnisse der LC-PDA-ESI-Q-TOF-MS- und -MS/MS-Untersuchungen bestätigen, dass die neuen Isolate wie XR-9, XR-15, XR-16, XR-19, XR-21 , XR-26, XR- 55 und XR-56 kein Mycelia sterilia (WT) sind, jedoch auch die PF1022A-Verbindung produzieren.

Da die neuen Roselllinia- und Xy/aria-Stämme die Nebenprodukte PF1022-D, -E und -F nicht produzieren, ist das Verfahren der Extraktion und Isolierung von PF1022A gegenüber Mycelia sterilia (WT) sehr stark vereinfacht.