Gebiet der Erfindung

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von organischen Verbindungen umfassend die Verfahrensschritte

A) Bereitstellen eines Knallgasbakteriums mit einer verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerten Aktivität eines Enzyms E-i, welches die Umsetzung

2 Acetyl-CoA zu Acetoacetyl-CoA und CoA

zu katalysieren vermag, in einem wässrigen Medium

B) in Kontakt Bringen des wässrigen Mediums mit einem Gas enthaltend

H ₂ , C0 ₂ und 0 ₂

in einem Gewichtsverhältnis von 20 bis 70 zu 10 bis 45 zu 5 bis 35, und gegebenenfalls C) Aufreinigen der organischen Verbindung.

Stand der Technik Biobasierte Treibstoffe und Chemikalien werden heutzutage üblicherweise aus Kohlenhydraten, wie Glucose, Dextrose oder Glycerin hergestellt. Dies hat eine Vielzahl von Nachteilen:

i) Preise für Kohlenhydrate, wie Glucose, Dextrose oder Glycerin, werden sich

möglicherweise analog zu fossilen Rohstoffen entwickeln, da sie in Produkte mit hohem

Brennwert umgewandelt werden können.

ii) Kohlenhydrate, wie Glucose, Dextrose oder Glycerin, unterliegen starken

Preisschwankungen.

iii) Kohlenhydrate, wie Glucose, Dextrose oder Glycerin, sind als Rohstoffe nicht in allen Regionen in ausreichender Menge verfügbar.

iv) Die Verwendung von Kohlenhydraten, wie Glucose oder Dextrose, als

Fermentationsrohstoffe steht in Konkurrenz zum Einsatz als Nahrungsmittel.

Technologien für die hochselektive Herstellung von organischen Verbindungen mittels

Biokatalysatoren und mit H ₂ und C0 ₂ als Rohstoffen unter energetisch günstigen, aeroben Bedingungen sind heutzutage noch nicht verfügbar, würden es jedoch ermöglichen, rohstofftechnisch und regional hochflexibel, diese Chemikalien aus kostengünstigen Rohstoffen bzw. Abfallströmen (Erdgas, kommunale Abfälle, Biomasse, Konvertergas, etc.) herzustellen.

Beschreibung der Erfindung

Überraschenderweise wurde gefunden, dass das im Folgenden beschriebene Verfahren mindestens einen der Nachteile des Standes der Technik zu überwinden vermag.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher das in Anspruch 1 sowie den davon abhängigen Ansprüchen beschriebene Verfahren.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der im Rahmen der Erfindung offenbarten Knallgasbakterien zur Herstellung von organischen Verbindungen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung einer organischen Verbindung umfassend die Verfahrensschritte

A) Bereitstellen eines Knallgasbakteriums mit einer verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerten Aktivität eines Enzyms E-i, welches die Umsetzung

von 2 Acetyl-CoA zu Acetoacetyl-CoA und CoA

zu katalysieren vermag, in einem wässrigen Medium

B) in Kontakt Bringen des wässrigen Mediums mit einem Gas enthaltend

H ₂ , C0 ₂ und 0 ₂

in einem Gewichtsverhältnis von 20 bis 70 zu 10 bis 45 zu 5 bis 35, insbesondere von 30 bis 55 zu 15 bis 40 zu 10 bis 30, und gegebenenfalls

C) Aufreinigen der organischen Verbindung.

Unter dem Begriff„Knallgasbakterium" ist ein Bakterium zu verstehen, das in der Lage ist chemolithoautotroph zu wachsen und aus H ₂ und C0 ₂ in Gegenwart von Sauerstoff

Kohlenstoffgerüste mit mehr als einem C-Atom aufzubauen, wobei der Wasserstoff oxidiert und der Sauerstoff als terminaler Elektronenakzeptor benutzt wird. Es können erfindungsgemäß sowohl solche Bakterien eingesetzt werden, die von Natur aus Knallgasbakterien darstellen, oder aber auch Bakterien, welche durch gentechnische Modifikation zu Knallgasbakterien wurden, wie beispielsweise eine E. coli Zelle, die durch rekombinantes Einfügen der

notwendigen Enzyme in die Lage versetzt wurde, aus H ₂ und C0 ₂ in Gegenwart von Sauerstoff Kohlenstoffgerüste mit mehr als einem C-Atom aufzubauen, wobei der Wasserstoff oxidiert und der Sauerstoff als terminaler Elektronenakzeptor benutzt wird. Bevorzugt handelt es sich bei den im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Knallgasbakterien um solche, welche bereits als Wildtyp Knallgasbakterien darstellen.

Erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Knallgasbakterien sind ausgewählt aus den Gattungen Achromobacter, Acidithiobacillus, Acidovorax, Alcaligenes, Anabena, , Aquifex, Arthrobacter, Azospirillum, Bacillus, Bradyrhizobium, Cupriavidus, Derxia, Helicobacter, Herbaspirillum, Hydrogenobacter, Hydrogenobaculum, Hydrogenophaga,, Hydrogenophilus,

Hydrogenothermus, Hydrogenovibrio, Ideonella sp. 01, Kyrpidia, Metallosphaera,

Methanobrevibacter, Myobacterium, Nocardia, Oligotropha, Paracoccus, Pelomonas,

Polaromonas, Pseudomonas, Pseudonocardia, Rhizobium, Rhodococcus,

Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Streptomyces, Thiocapsa, Treponema, Variovorax, Xanthobacter, Wautersia, wobei Cupriavidus besonders bevorzugt ist,

besonders aus den Spezies Cupriavidus necator (alias Ralstonia eutropha, Wautersia eutropha, Alcaligenes eutrophus, Hydrogenomonas eutropha), Achromobacter ruhlandii, Acidithiobacillus ferrooxidans, Acidovorax facilis, Alcaligenes hydrogenophilus, Alcaligenes latus, Anabena cylindrica, Anabena oscillaroides, Anabena sp., Anabena spiroides, Aquifex aeolicus, Aquifex pyrophilus, Arthrobacter strain 11X, Bacillus schlegelii, Bradyrhizobium japonicum, Cupriavidus necator, Derxia gummosa, Escherichia coli, Heliobacter pylori, Herbaspirillum autotrophicum, Hydrogenobacter hydrogenophilus., Hydrogenobacter thermophilus, Hydrogenobaculum acidophilum, Hydrogenophaga flava, Hydrogenophaga palleronii, Hydrogenophaga

pseudoflava, Hydrogenophaga taeniospiralis, Hydrogeneophilus thermoluteolus,

Hydrogenothermus marinus, Hydrogenovibrio marinus, Ideonella sp. 0-1, Kyrpidia tusciae, Metallosphaera sedula, Methanobrevibactercuticularis, Mycobacterium gordonae, Nocardia autotrophica, Oligotropha carboxidivorans, Paracoccus denitrificans, Pelomonas saccharophila, Polaromonas hydrogenivorans, Pseudomonas hydrogenovora, Pseudomonas thermophila, Rhizobium japonicum, Rhodococcus opacus, Rhodopseudomonas palustris, Seliberia carboxydohydrogena, Streptomyces thermoautotrophicus, Thiocapsa roseopersicina,

Treponema primitia, Variovorax paradoxus, Xanthobacter autrophicus, Xanthobacter flavus, insbesondere aus den Stämmen Cupriavidus necator H 16, Cupriavidus necator H1 oder Cupriavidus necator Z-1 .

Das Knallgasbakterium des erfindungsgemäßen Verfahrens weist eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerten Aktivität eines Enzyms E-ι auf.

Mit„Wildtyp" einer Zelle wird hierin eine Zelle bezeichnet, deren Genom in einem Zustand vorliegt, wie er natürlicherweise durch die Evolution entstanden ist. Der Begriff wird sowohl für die gesamte Zelle als auch für einzelne Gene verwendet. Unter den Begriff„Wildtyp" fallen daher insbesondere nicht solche Zellen bzw. solche Gene, deren Gensequenzen zumindest teilweise durch den Menschen mittels rekombinanter Verfahren verändert worden sind.

Der Begriff„gesteigerte Aktivität eines Enzyms", wie er vorstehend und in den nachfolgenden Ausführungen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist vorzugsweise zu verstehen, dass der Wildtyp derart gentechnisch verändert wurde, dass die entsprechende Aktivitätssteigerung eintritt. Bevorzugt ist dieser Begriff als gesteigerte intrazelluläre Aktivität zu verstehen.

Die nun folgenden Ausführungen zur Erhöhung der Enzymaktivität in Zellen gelten sowohl für die Erhöhung der Aktivität des Enzyms E-ι als auch für alle nachfolgend genannten Enzyme, deren Aktivität gegebenenfalls erhöht werden kann.

Grundsätzlich lässt sich eine Steigerung der enzymatischen Aktivität dadurch erzielen, dass man die Kopienzahl der Gensequenz bzw. der Gensequenzen erhöht, welche für das Enzym kodieren, einen starken Promotor verwendet, die Kodonnutzung des Gens verändert, auf verschiedene Art und Weise die Halbwertszeit der mRNA oder des Enzyms erhöht, die

Regulation der Expression des Gens modifiziert oder ein Gen oder Allel nutzt, das für ein entsprechendes Enzym mit einer gesteigerten Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert. Erfindungsgemäß eingesetzte, gentechnisch veränderte

Mikroorganismen werden beispielsweise durch Transformation, Transduktion, Konjugation oder eine Kombination dieser Methoden mit einem Vektor erzeugt, der das gewünschte Gen, ein Allel dieses Gens oder Teile davon und einen die Expression des Gens ermöglichenden Promotor enthält. Die heterologe Expression wird insbesondere durch Integration des Gens oder der Allele in das Chromosom der Zelle oder einen extrachromosomal replizierenden Vektor erzielt.

Einen Überblick über die Möglichkeiten zur Erhöhung der Enzym-Aktivität in Zellen am Beispiel der Pyruvat-Carboxylase gibt DE-A-100 31 999, die hiermit als Referenz eingeführt wird und deren Offenbarungsgehalt hinsichtlich der Möglichkeiten zur Erhöhung der Enzym-Aktivität in Zellen einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung bildet.

Die Expression der vorstehend und aller nachfolgend genannten Enzyme bzw. Gene ist mit Hilfe von 1 - und 2-dimensionaler Proteingelauftrennung und anschließender optischer

Identifizierung der Proteinkonzentration mit entsprechender Auswertesoftware im Gel nachweisbar.

Wenn die Erhöhung einer Enzymaktivität ausschließlich auf einer Erhöhung der Expression des entsprechenden Gens basiert, so kann die Quantifizierung der Erhöhung der Enzymaktivität in einfacher Weise durch einen Vergleich der 1 - oder 2-dimensionalen Proteinauftrennungen zwischen Wildtyp und gentechnisch veränderter Zelle bestimmt werden. Eine gebräuchliche Methode zur Präparation der Proteingele bei Bakterien und zur Identifizierung der Proteine ist die von Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712-23 (2001 ) beschriebene Vorgehensweise. Die Proteinkonzentration kann ebenfalls durch Western-Blot-Hybridisierung mit einem für das nachzuweisende Protein spezifischen Antikörper (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989) und anschließende optische Auswertung mit entsprechender Software zur Konzentrationsbestimmung (Lohaus und Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39; Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 1 1 1 : 2630-2647) analysiert werden.

Diese Methode bietet sich auch immer dann an, wenn mögliche Produkte der durch die zu bestimmende Enzymaktivität katalysierten Reaktion im Mikroorganismus schnell

verstoffwechselt werden können oder aber die Aktivität im Wiltyp selber zu gering ist, um die zu bestimmende Enzymaktivität anhand der Produktbildung ausreichend bestimmen zu können.

Das Enzym E-i , dessen Aktivität in dem Knallgasbakterium verglichen zu seinem Wildtyp gesteigert ist, ist bevorzugt ausgewählt aus Acetyl-CoA:Acetyl-CoA C-Acetyltransferasen aus der Enzymklasse EC 2.3.1 .9.

Die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung angeführten Accession-Nummern entsprechen den ProteinBank Datenbank-Einträgen des NCBI mit Datum vom 26.06.2012; in der Regel wird vorliegend die Versionsnummer des Eintrages durch„Ziffer" wie beispielsweise „1 ", kenntlich gemacht.

Erfindungsgemäß bevorzugte Acetyl-CoA:Acetyl-CoA C-Acetyltransferasen sind ausgewählt aus der Liste

AAC26023.1 , ABR35750.1 und ABR25255.1 sowie

Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des

Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang die Umsetzung von zwei Acetyl-CoA zu Acetoacetyl-CoA und CoA verstanden wird.

Eine Methode zur Bestimmung der Aktivität wird in Middleton et al. The Biochemical journal (1972), 126(1 ), 27 - 34 beschrieben.

Das Knallgasbakterium wird in Verfahrensschritt A) in einem wässrigen Medium bereitgestellt. Das eingesetzte wässrige Medium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C, USA, 1981 ) enthalten.

Das Medium kann Stickstoffquellen enthalten, als Stickstoffquelle können organische stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt,

Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie

Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und

Ammoniumnitrat, Ammoniak, Ammoniumhydroxid oder Ammoniakwasser verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Das Medium kann Phosphorquellen enthalten, als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogen-phosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden natriumhaltigen Salze verwendet werden.

Das Medium kann auch Kohlenstoffquellen enthalten, jedoch sollten diese insofern limitiert sein, als dass das Knallgasbakterium im Wesentlichen auf die Verwertung der in dem H ₂ , C0 ₂ und 0 ₂ enthaltenden Gas enthaltenen kohlenstoffhaltigen Gase angewiesen ist. Das Medium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Medium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten

Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.

Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid,

Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie

Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der

Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B. Antibiotika hinzugefügt werden.

In Verfahrensschritt B) wird das wässrige Medium mit einem Gas enthaltend H ₂ , C0 ₂ und 0 ₂ in Kontakt gebracht.

Hierdurch wird dem Knallgasbakterium das H ₂ , C0 ₂ und 0 ₂ enthaltende Gas als

Kohlenstoffquelle bereitgestellt. Das Knallgasbakterium synthetisiert mindestens teilweise aus dieser Kohlenstoffquelle Acetoacetyl-CoA, welches zu weiteren organischen Verbindungen verstoffwechselt wird. Anders als in einem acetogenen Verfahrensprozess, der unter streng anaeroben Bedingungen stattfindet, wird Verfahrensschritt B) des erfindungsgemäßen

Verfahrens unter aeroben Bedingungen durchgeführt.

Bevorzugt beträgt der Partialdruck des Wasserstoffes in dem H ₂ , C0 ₂ und 0 ₂ enthaltenden Gas 0,1 bis 100 bar, bevorzugt 0,2 bis 10 bar, besonders bevorzugt 0,5 bis 4 bar.

Der Partialdruck des Kohlendioxids in dem H ₂ , C0 ₂ und 0 ₂ enthaltenden Gas beträgt bevorzugt 0,03 bis 100 bar, besonders bevorzugt 0,05 bis 1 bar, insbesondere 0,05 bis 0,3 bar

Der Partialdruck des Sauerstoffs in dem H ₂ , C0 ₂ und 0 ₂ enthaltenden Gas beträgt bevorzugt 0,001 bis 100 bar, besonders bevorzugt 0,04 bis 1 bar, insbesondere 0,04 bis 0,5 bar.

Als Quelle für das H ₂ und C0 ₂ in Verfahrensschritt B) ist insbesondere Synthesegas geeignet, welches mit Sauerstoff versetzt eingesetzt wird; daher ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass das Gas in Verfahrensschritt B) Synthesegas enthält. Synthesegas kann z. B. aus dem Nebenprodukt der Kohlevergasung bereitgestellt werden. Das Knallgasbakterium wandelt folglich eine Substanz, die ein Abfallprodukt ist, in einen wertvollen Rohstoff um.

Alternativ kann Synthesegas durch die Vergasung von weit verfügbaren, preiswerten landwirtschaftlichen Rohstoffen für das erfindungsgemäße Verfahren bereitgestellt werden. Es gibt zahlreiche Beispiele an Rohstoffen, die in Synthesegas umgewandelt werden können, da fast alle Vegetationsformen zu diesem Zwecke genutzt werden können. Bevorzugte Rohstoffe sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend perennierende Gräser wie Chinaschilf,

Getreiderückstände, Verarbeitungsabfälle wie Sägemehl. Im Allgemeinen wird Synthesegas in einer Vergasungsapparatur aus getrockneter Biomasse gewonnen, hauptsächlich durch Pyrolyse, partielle Oxidation und Dampfreformierung, wobei die Primärprodukte CO, H ₂ und C0 ₂ sind.

Normalerweise wird ein Teil des Produktgases aufbereitet, um Produkterträge zu optimieren und Teerbildung zu vermeiden. Das Cracken des unerwünschten Teers in Synthesegas und CO kann unter Einsatz von Kalk und/oder Dolomit durchgeführt werden. Diese Prozesse werden im Detail in z. B. Reed, 1981 beschrieben (Reed, T.B., 1981 , Biomass gasification: principles and technology, Noves Data Corporation, Park Ridge, NJ.). Es können auch Mischungen verschiedener Quellen zur Generierung von Synthesegas eingesetzt werden.

Insbesondere ist es bevorzugt, dass der im Synthesegas enthaltene Kohlenstoff in

Verfahrensschritt B) mindestens 50 Gew.-%, bevorzugt mindestens 70 Gew.-%, besonders bevorzugt mindestens 90 Gew.-% des Kohlenstoffs aller Kohlenstoffquellen, die dem

Knallgasbakterium in Verfahrensschritt B) zur Verfügung stehen, ausmacht, wobei sich die Gewichtsprozente des Kohlestoffs auf die Kohlenstoffatome beziehen. Die restlichen

Kohlenstoffquellen können beispielsweise in Form von Kohlenhydraten im wässrigen Medium enthalten sein oder aber auch C0 ₂ aus einer anderen Quelle als Synthesegas darstellen. Weitere C0 ₂ -Quellen stellen Abgase wie beispielsweise Rauchgas, Erdölraffinerieabgase, durch Hefegärung oder clostridielle Gärung entstandene Gase, Abgase aus der Vergasung zellulosehaltige Materialien oder der Kohlevergasung dar.

Diese Abgase müssen nicht notwendigerweise als Nebenerscheinungen anderer Prozesse entstanden sein, sondern können extra für den Einsatz in dem erfindungsgemäßen Verfahren produziert werden. Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren herzustellende organische Substanz ist bevorzugt ausgewählt aus Substanzen umfassend drei oder vier Kohlenstoffatomen, insbesondere Butanol, Buten, Propen, Buttersäure, Aceton, 2-Hydroxyisobuttersäure und 2-Propanol und 2- Hydroxyisobuttersäure.

Erste Ausführungsform; Butanol Eine erste Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die organische Substanz Butanol ist, bevorzugt E-ι ausgewählt ist aus Acetyl-CoA:Acetyl- CoA C-Acetyltransferasen und bevorzugt das Knallgasbakterium eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E ₂ , welches die Umsetzung

von Acetoacetyl-CoA und NADH oder NADPH zu 3-Hydroxybutyryl-CoA und NAD+ oder NADP+

zu katalysieren vermag, aufweist.

Das Enzym E ₂ ist bevorzugt ausgewählt aus 3-Hydroxybutyryl-CoA Dehydrogenasen aus der Enzymklasse EC:1.1.1 .157.

Erfindungsgemäß bevorzugte 3-Hydroxybutyryl-CoA Dehydrogenasen sind ausgewählt aus der Liste

NP_349314.1 , YP_001307469.1 und CAQ53138.1

sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E ₂ generell insbesondere die Umsetzung von Acetoacetyl-CoA und NADH zu 3- Hydroxybutyryl-CoA und NAD+ verstanden wird.

Eine Methode zur Bestimmung der Aktivität wird in Senior et al. Biochemical Journal (1973), 134(1 ), 225-38 beschrieben.

Eine bevorzugte erste Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms E-i und gegebenenfalls E ₂ eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E ₃ , welches die Umsetzung

von 3-Hydroxybutyryl-CoA zu Crotonyl-CoA und Wasser

zu katalysieren vermag, aufweist.

Das Enzym E ₃ ist bevorzugt ausgewählt aus 3-Hydroxybutyryl-CoA Dehydratasen aus der Enzymklasse EC:4.2.1.55.

Erfindungsgemäß bevorzugte 3-Hydroxybutyryl-CoA Dehydratasen sind ausgewählt aus der Liste

NP_349318.1 , YP_001307465.1 und CAQ53134.1

sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der

Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der

Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E ₃ generell insbesondere die Umsetzung von 3-Hydroxybutyryl-CoA zu Crotonyl- CoA und Wasser verstanden wird.

Eine Methode zur Bestimmung der Aktivität wird in Boynton et al. Journal of bacteriology (1996), 178(1 1 ), 3015-24 beschrieben.

Eine weitere bevorzugte erste Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms E-i und gegebenenfalls E ₂ und /oder E ₃ eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E ₄ , welches die Umsetzung

von Crotonyl-CoA und NADH oder NADPH zu Butyryl-CoA und NAD+ oder NADP+

zu katalysieren vermag, aufweist.

Das Enzym E ₄ ist bevorzugt ausgewählt aus Butyryl-CoA Dehydrogenasen aus der

Enzymklasse EC:1.3.99.2

Erfindungsgemäß bevorzugte Butyryl-CoA Dehydrogenasen sind ausgewählt aus der Liste NP_349317.1 , YP_001307466.1 und CAQ53135.1

sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E ₄ generell insbesondere die Umsetzung von Crotonyl-CoA und NADH zu Butyryl- CoA und NAD+ verstanden wird.

Eine Methode zur Bestimmung der Aktivität wird in R. Graf Dissertation an der Universität Ulm 2002 und in Rhead et al, Proc. Nati. Acad. Sei. USA Vol. 77, No. 1 , pp. 580-583, January 1980 Medical Sciences beschrieben.

Eine weitere bevorzugte erste Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms E-i und gegebenenfalls E ₂ , E ₃ und /oder E ₄ eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E ₅ , welches die Umsetzung

von Butyryl-CoA und NADH oder NADPH zu Butyraldehyd, NAD+ oder NADP+ und HS-CoA oder

die Umsetzungen

von Butyryl-CoA und NADH oder NADPH zu Butyraldehyd, NAD+ oder NADP+ und HS-CoA und von Butyraldehyd und NADH oder NADPH zu n-Butanol und NAD+ oder NADPH+ zu katalysieren vermag, aufweist.

Bevorzugt ist das Enzym E ₅ ausgewählt aus bifunktionalen Aldehyd/Alkohol Dehydrogenasen aus der Enzymklasse EC:1 .2.1 .10 oder EC:1 .1.1.1 oder aus Butyraldehyd Dehydrogenasen aus der Enzymklasse EC:1 .2.1.10.

Erstgenannte Enzyme katalysieren beide der vorgenannten Reaktionen, während Butyraldehyd Dehydrogenasen lediglich Butyryl-CoA umsetzen.

Erfindungsgemäß bevorzugte bifunktionalen Aldehyd/Alkohol Dehydrogenasen sind ausgewählt aus der Liste

NPJ 49199.1 , NP_563447.1 und YP_002861217.1

sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der

Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der

Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E ₅ im Falle einer bifunktionalen Aldehyd/Alkohol Dehydrogenase insbesondere die Umsetzung von mindestens einer der beiden Reaktionen

von Butyryl-CoA und NADH oder NADPH zu Butyraldehyd, NAD+ oder NADP+ und HS-CoA und

von Butyraldehyd und NADH oder NADPH zu n-Butanol und NAD+ oder NADPH+

verstanden wird.

Eine Methode zur Bestimmung der beiden Aktivitäten wird in in Yan et al. Appl. Environ.

Microbiol. 1990 56 (9), 2591 -9 beschrieben.

Erfindungsgemäß bevorzugte Butyraldehyd Dehydrogenasen sind ausgewählt aus der Liste YP_001310903.1 und CAQ57983.1

sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E ₅ im Falle einer Butyraldehyd Dehydrogenase insbesondere die Umsetzung von Butyryl-CoA und NADH zu Butyraldehyd, NAD+ und HS-CoA verstanden wird.

Eine weitere bevorzugte erste Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms E-i und gegebenenfalls E ₂ , E ₃ , E ₄ und /oder E ₅ eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E ₆ , welches die Umsetzung

von Butyraldehyd und NAD(P)H zu n-Butanol und NAD(P)+

zu katalysieren vermag, aufweist.

Bevorzugt ist das Enzym E ₆ ausgewählt aus Butanol Dehydrogenasen aus der Enzymklasse EC:1.1 .1 .-.

Erfindungsgemäß bevorzugte Butanol Dehydrogenasen sind ausgewählt aus der Liste

YP_001310904.1 , YP_001310904 und CAQ53139.1 sowie Proteine mit einer

Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden,

vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm

Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E ₆ generell insbesondere die Umsetzung von Butyraldehyd und NAD(P)H zu n-Butanol und NAD(P)+ verstanden wird.

Eine Methode zur Bestimmung der Aktivität wird in Duerre et al, Applied Microbiology and Biotechnology (1987), 26(3), 268-72 beschrieben.

Es ist insbesondere bevorzugt, dass das Knallgasbakterium eine gesteigerte Aktivität E ₆ aufweist, wenn es über eine gesteigerte Aktivität eines Enzyms E ₅ verfügt, welches nur die Umsetzung von Butyryl-CoA und NADH oder NADPH zu Butyraldehyd, NAD+ oder NADP+ und HS-CoA zu katalysieren vermag und somit bevorzugt eine Butyraldehyd Dehydrogenase ist. Eine weitere bevorzugte erste Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms E-i und gegebenenfalls E ₂ , E ₃ , E ₄ , E ₅ und /oder E ₆ eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E ₇ ausgewählt aus Elektrontransfer-Flavoproteinen aus der

Enzymklasse EC:2.8.3.9 aufweist.

Insbesondere geeignet ist hier ein Enzym E ₇ , welches ein heterodimeres Enzym ist, aufgebaut aus zwei Untereinheiten, bei dem die

alpha-Untereinheit ausgewählt ist aus NP_349315.1 , YP_001307468.1 und CAQ53137.1 und die

beta-Untereinheit ausgewählt ist aus NP_349316.1 , YP_001307467.1 und CAQ53136.1 sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der

Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen.

Hier ist es insbesondere bevorzugt, wenn alpha- und beta- Untereinheiten aus dem gleichen Organismus kombiniert werden.

Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass das eingesetzte Knallgasbakterium eine gesteigerte Aktivität E ₇ aufweist, wenn bereits eine gesteigerte Aktivität von E ₄ vorliegt.

In besonders bevorzugten ersten Ausführungsformen des erfindungemäßen Verfahrens weist das Knallgasbakterium gesteigerte Aktivitäten in den Kombinationen

E1 E2, E1E ₃ , E-|E ₄ , E1E ₅ , E1E ₅ , Ε-ιΕβ, E-|E ₇ ,

E1 E2E ₃ , Ei EsE ₄ , E1 E ₅ E ₆ , E-| E2E ₄ , E1 E2E ₅ , E1E2E ₆ , Ei EsE ₄ , E1 E ₃ E ₅ , E1 E ₃ E ₆ , E-|E ₄ E ₅ , E-|E ₄ E ₆ , Ei E ₆ E ₇ , E ₁ E ₃ E4E5E ₆ E _7! E ₁ E ₂ E4E5E ₆ E _7! E1 E2E3E5E6E7, E ₁ E ₂ E3E4E ₆ E _7! E ₁ E ₂ E3E4E ₅ E ₆ und E ₁ E ₂ E3E4E ₅ E ₆ E7 auf, wobei E ₁ E ₂ E ₃ E4E ₅ E ₆ E7, E ₁ E ₃ E4E5E ₆ E ₇ , E ₁ E ₃ E4E ₅ E7, E ₁ E ₂ E3E ₄ E ₅ E7

besonders bevorzugt ist.

Zweite Ausführungsform; Buten

Eine zweite Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die organische Substanz Buten ist, bevorzugt E-ι ausgewählt ist aus Acetyl-CoA:Acetyl- CoA C-Acetyltransferasen und bevorzugt das Knallgasbakterium eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E ₂ , welches die Umsetzung

von Acetoacetyl-CoA und NADH oder NADPH zu 3-Hydroxybutyryl-CoA und NAD+ oder NADP+

zu katalysieren vermag, aufweist.

Das Enzym E ₂ ist bevorzugt ausgewählt aus 3-Hydroxybutyryl-CoA Dehydrogenasen aus der Enzymklasse EC:1.1.1 .157.

Erfindungsgemäß bevorzugte 3-Hydroxybutyryl-CoA Dehydrogenasen sind ausgewählt aus der Liste

NP_349314.1 , YP_001307469.1 und CAQ53138.1

sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der

Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E ₂ generell insbesondere die Umsetzung von Acetoacetyl-CoA und NADH zu 3- Hydroxybutyryl-CoA und NAD+ verstanden wird.

Eine bevorzugte zweite Ausführungsform des erfindungemaßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms E-i und gegebenenfalls E ₂ eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E ₃ , welches die Umsetzung

von 3-Hydroxybutyryl-CoA zu Crotonyl-CoA und Wasser

zu katalysieren vermag, aufweist.

Das Enzym E ₃ ist bevorzugt ausgewählt aus 3-Hydroxybutyryl-CoA Dehydratasen aus der Enzymklasse EC:4.2.1.55.

Erfindungsgemäß bevorzugte 3-Hydroxybutyryl-CoA Dehydratasen sind ausgewählt aus der Liste

NP_349318.1 , YP_001307465.1 und CAQ53134.1

sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der

Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten

Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E ₃ generell insbesondere die Umsetzung von 3-Hydroxybutyryl-CoA zu Crotonyl- CoA und Wasser verstanden wird.

Eine weitere bevorzugte zweite Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms E-i und gegebenenfalls E ₂ und /oder E ₃ eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E ₄ , welches die Umsetzung

von Crotonyl-CoA und NADH oder NADPH zu Butyryl-CoA und NAD+ oder NADP+

zu katalysieren vermag, aufweist. Das Enzym E ₄ ist bevorzugt ausgewählt aus Butyryl-CoA Dehydrogenasen aus der Enzymklasse EC:1.3.99.2

Erfindungsgemäß bevorzugte Butyryl-CoA Dehydrogenasen sind ausgewählt aus der Liste NP_349317.1 , YP_001307466.1 und CAQ53135.1

sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der

Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E ₄ generell insbesondere die Umsetzung von Crotonyl-CoA und NADH zu Butyryl- CoA und NAD+ verstanden wird.

Eine weitere bevorzugte zweite Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms E-i und gegebenenfalls E ₂ , E ₃ und /oder E ₄ eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerteAktivität eines Enzyms E ₅ , welches die Umsetzung

von Butyryl-CoA und NADH oder NADPH zu Butyraldehyd, NAD+ oder NADP+ und HS-CoA oder

die Umsetzungen

von Butyryl-CoA und NADH oder NADPH zu Butyraldehyd, NAD+ oder NADP+ und HS-CoA und

von Butyraldehyd und NADH oder NADPH zu n-Butanol und NAD+ oder NADPH+

zu katalysieren vermag, aufweist.

Bevorzugt ist das Enzym E ₅ ausgewählt aus bifunktionalen Aldehyd/Alkohol Dehydrogenasen aus der Enzymklasse EC:1 .2.1 .10 oder EC:1 .1.1 .1 oder aus Butyraldehyd Dehydrogenasen aus der Enzymklasse EC:1 .2.1.10.

Erstgenannte Enzyme katalysieren beide der vorgenannten Reaktionen, während Butyraldehyd Dehydrogenasen lediglich Butyryl-CoA umsetzen. Erfindungsgemäß bevorzugte bifunktionalen Aldehyd/Alkohol Dehydrogenasen sind ausgewählt aus der Liste

NPJ 49199.1 , NP_563447.1 und YP_002861217.1

sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der

Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten

Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E ₅ im Falle einer bifunktionalen Aldehyd/Alkohol Dehydrogenase insbesondere die Umsetzung von mindestens einer der beiden Reaktionen

von Butyryl-CoA und NADH oder NADPH zu Butyraldehyd, NAD+ oder NADP+ und HS-CoA und

von Butyraldehyd und NADH oder NADPH zu n-Butanol und NAD+ oder NADPH+

verstanden wird.

Erfindungsgemäß bevorzugte Butyraldehyd Dehydrogenasen sind ausgewählt aus der Liste YP_001310903.1 und CAQ57983.1

sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der

Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E ₅ im Falle einer Butyraldehyd Dehydrogenase insbesondere die Umsetzung von Butyryl-CoA und NADH zu Butyraldehyd, NAD+ und HS-CoA verstanden wird.

Eine weitere bevorzugte zweite Ausführungsform des erfindungemaßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms E-i und gegebenenfalls E ₂ , E ₃ , E ₄ und /oder E ₅ eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E ₆ , welches die Umsetzung

von Butyraldehyd und NAD(P)H zu n-Butanol und NAD(P)+

zu katalysieren vermag, aufweist.

Bevorzugt ist das Enzym E ₆ ausgewählt aus Butanol Dehydrogenasen aus der Enzymklasse EC:1.1 .1 .-.

Erfindungsgemäß bevorzugte Butanol Dehydrogenasen sind ausgewählt aus der Liste

YP_001310904.1 , YP_001310904 und CAQ53139.1 sowie Proteine mit einer

Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm

Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E ₆ generell insbesondere die Umsetzung von Butyraldehyd und NAD(P)H zu n-Butanol und NAD(P)+ verstanden wird.

Es ist insbesondere bevorzugt, dass das Knallgasbakterium eine gesteigerte Aktivität E ₆ aufweist, wenn es über eine gesteigerte Aktivität eines Enzyms E ₅ verfügt, welches nur die Umsetzung von Butyryl-CoA und NADH oder NADPH zu Butyraldehyd, NAD+ oder NADP+ und HS-CoA zu katalysieren vermag und somit bevorzugt eine Butyraldehyd Dehydrogenase ist. Eine weitere bevorzugte zweite Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms E-i und gegebenenfalls E ₂ , E ₃ , E ₄ , E ₅ und /oder E ₆ eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E ₇ ausgewählt aus Elektrontransfer-Flavoproteinen aus der Enzymklasse EC:2.8.3.9 aufweist.

Insbesondere geeignet ist hier ein Enzym E ₇ , welches ein heterodimeres Enzym ist, aufgebaut aus zwei Untereinheiten, bei dem die

alpha-Untereinheit ausgewählt ist aus NP_349315.1 , YP_001307468.1 und CAQ53137.1 und die

beta-Untereinheit ausgewählt ist aus NP_349316.1 , YP_001307467.1 und CAQ53136.1 sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der

Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen.

Hier ist es insbesondere bevorzugt, wenn alpha- und beta- Untereinheiten aus dem gleichen Organismus kombiniert werden.

Eine weitere bevorzugte zweite Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms E-i und gegebenenfalls E ₂ , E ₃ , E ₄ , E ₅ , E ₆ und /oder E ₇ eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E ₈ , welches die Umsetzung

von n-Butanol zu 1 -Buten und Wasser

zu katalysieren vermag, aufweist.

Bevorzugt ist das Enzym E ₈ ausgewählt aus Oleat Hydratasen aus der Enzymklasse

EC:4.2.1 .53, Kieviton Hydratasen aus der Enzymklasse EC:4.2.1.95 und Phaseollidin

Hydratasen aus der Enzymklasse EC:4.2.1.97.

Erfindungsgemäß bevorzugte Oleat Hydratasen sind ausgewählt aus der Liste

ACT54545, OLHYD_STRPZ und OLHYD_FLAME, bevorzugte Kieviton Hydratase ist

AAA87627.1 , sowie für beide Enzymklassen Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E ₈ generell insbesondere die Umsetzung von n-Butanol zu 1 -Buten und Wasser verstanden wird.

Eine Methode zur Bestimmung der Aktivität wird in Cleveland et al. Physio. Plant. Pathol. 22 (1983) 129-142 beschrieben; es muss lediglich Kieviton durch Butanol als Substrat ersetzt werden.

In besonders bevorzugten zweiten Ausführungsformen des erfindungemäßen Verfahrens weist das Knallgasbakterium gesteigerte Aktivitäten in den Kombinationen E-|E ₂ E ₈ , E-iEsEs, E-^Es, Ei E ₅ Es, E-I EÖES, E1 E3E4E5E6E7E8, E1 E2E4E5E6E7E8, E1 E2E3E5E6E7E8, E1 E2E3E4E6E7E8,

E ₁ E ₂ E3E4E ₅ E ₆ E8 und E ₁ E ₂ E3E4E5E ₆ E ₇ E8 auf,

wobei E ₁ E ₂ E3E4E5E ₆ E ₇ E8, E ₁ E ₃ E4E5E ₆ E ₇ E8, E ₁ E ₃ E4E5E ₇ E8, E ₁ E ₂ E3E4E5E ₇ E8 besonders bevorzugt ist.

Dritte Ausführungsform; Propen und Buttersäure Eine dritte Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist, dadurch gekennzeichnet, dass die organische Substanz Propen oder Buttersäure ist, bevorzugt E-ι ausgewählt ist aus Acetyl-CoA:Acetyl-CoA C-Acetyltransferasen und bevorzugt das Knallgasbakterium eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E ₂ , welches die Umsetzung von Acetoacetyl-CoA und NADH oder NADPH zu 3-Hydroxybutyryl-CoA und NAD+ oder NADP+

zu katalysieren vermag, aufweist.

Das Enzym E ₂ ist bevorzugt ausgewählt aus 3-Hydroxybutyryl-CoA Dehydrogenasen aus der Enzymklasse EC:1.1.1 .157.

Erfindungsgemäß bevorzugte 3-Hydroxybutyryl-CoA Dehydrogenasen sind ausgewählt aus der Liste

NP_349314.1 , YP_001307469.1 und CAQ53138.1

sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E ₂ generell insbesondere die Umsetzung von Acetoacetyl-CoA und NADH zu 3- Hydroxybutyryl-CoA und NAD+ verstanden wird.

Eine bevorzugte dritte Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms E-i und gegebenenfalls E ₂ eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E ₃ , welches die Umsetzung

von 3-Hydroxybutyryl-CoA zu Crotonyl-CoA und Wasser

zu katalysieren vermag, aufweist.

Das Enzym E ₃ ist bevorzugt ausgewählt aus 3-Hydroxybutyryl-CoA Dehydratasen aus der Enzymklasse EC:4.2.1.55.

Erfindungsgemäß bevorzugte 3-Hydroxybutyryl-CoA Dehydratasen sind ausgewählt aus der Liste

NP_349318.1 , YP_001307465.1 und CAQ53134.1

sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der

Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E ₃ generell insbesondere die Umsetzung von 3-Hydroxybutyryl-CoA zu Crotonyl- CoA und Wasser verstanden wird.

Eine weitere bevorzugte dritte Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms E-i und gegebenenfalls E ₂ und /oder E ₃ eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E ₄ , welches die Umsetzung

von Crotonyl-CoA und NADH oder NADPH zu Butyryl-CoA und NAD+ oder NADP+

zu katalysieren vermag, aufweist.

Das Enzym E ₄ ist bevorzugt ausgewählt aus Butyryl-CoA Dehydrogenasen aus der

Enzymklasse EC: 1 .3.99.2

Erfindungsgemäß bevorzugte Butyryl-CoA Dehydrogenasen sind ausgewählt aus der Liste NP_349317.1 , YP_001307466.1 und CAQ53135.1

sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E ₄ generell insbesondere die Umsetzung von Crotonyl-CoA und NADH zu Butyryl- CoA und NAD+ verstanden wird.

Eine weitere bevorzugte dritte Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms E-i und gegebenenfalls E ₂ , E ₃ und /oder E ₄ eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E ₉ , welches die Umsetzung

von n-Butyryl-CoA und Pi zu Butyryl-Phosphat und HS-CoA

zu katalysieren vermag, aufweist.

P, steht in diesem Zusammenhang für ein anorganisches Phosphat. Bevorzugt ist das Enzym E ₉ ausgewählt aus Phosphat Butyryltransferasen aus der Enzymklasse EC:2.3.1.19.

Erfindungsgemäß bevorzugte Phosphat Butyryltransferasen sind ausgewählt aus der Liste ABR32393.1 und ZP_05394269.1

sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E ₉ generell insbesondere die Umsetzung von n Butyryl-CoA und P, zu Butyryl- Phosphat und HS-CoA verstanden wird.

Eine Methode zur Bestimmung der Aktivität wird in Wiesenborn et al. Applied and

Environmental Microbiology (1989), 55(2), 317-22 beschrieben.

Eine weitere bevorzugte dritte Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms E-i und gegebenenfalls E ₂ , E ₃ , E ₄ und /oder E ₉ eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte

Aktivität eines Enzyms E ₁₀ , welches die Umsetzung

von Butyryl-Phosphat und ADP zu Butyrat und ATP

zu katalysieren vermag, aufweist.

Bevorzugt ist das Enzym E ₁₀ ausgewählt aus Butyratkinasen aus der Enzymklasse EC:2.7.2.7.

Erfindungsgemäß bevorzugte Butyratkinasen sind ausgewählt aus der Liste

ABR32394.1 und ZP_05392467.1

sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der

Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E ₁₀ generell insbesondere die Umsetzung von Butyryl-Phosphat und ADP zu Butyrat und ATP verstanden wird.

Eine Methode zur Bestimmung der Aktivität wird in Hartmanis J Biol Chem. 1987 Jan 15; 262(2):617-21 beschrieben.

Eine weitere bevorzugte dritte Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms E-i und gegebenenfalls E ₂ , E ₃ , E ₄ , E ₉ und /oder E ₁₀ eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms En, welches die Umsetzung

von Butyrat und H ₂ 0 ₂ zu Propen und H ₂ 0

zu katalysieren vermag, aufweist.

Bevorzugt ist das Enzym En ausgewählt aus Cytochrom P450 der CYP152-Familie.

Erfindungsgemäß bevorzugte Cytochrom P450 der CYP152-Familie sind ausgewählt aus der Liste

HQ709266.1 , NP_388092,1 und NP_739069.1

sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der

Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms En generell insbesondere die Umsetzung von Butyrat und H ₂ 0 ₂ zu Propen und H ₂ 0 verstanden wird. Eine Methode zur Bestimmung der Aktivität wird in Mathew Applied and Environmental Microbiology, Mar. 201 1 , p. 1718-1727 beschrieben.

In besonders bevorzugten dritten Ausführungsformen des erfindungemäßen Verfahrens weist das Knallgasbakterium gesteigerte Aktivitäten in den Kombinationen E ₁ E2E ₃ E ₄ E ₉ , E ₁ E ₂ E ₃ E ₄ E ₁₀ , Ei E2EsE ₄ Eii , E"|E ₃ E ₄ E ₉ EioE"ii , Ei E2E ₄ EgEioEn , E1 E2E ₃ E ₉ E1 ₀ E11 , E"| E2E ₃ E ₄ EioE"ii , Ε-| Ε2Ε ₃ Ε ₄ Ε ₉ Ειι E ₁ E2E ₃ E ₄ E ₉ E ₁ o und E ₁ E2E ₃ E ₄ E ₉ E ₁ oE ₁₁ auf,

wobei E ₁ E2E ₃ E ₄ E ₉ E ₁ oE ₁₁ , E ₁ E ₃ E ₄ E ₉ E ₁₀ E ₁₁ besonders bevorzugt ist.

In der dritten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Kombination der Enzyme E ₉ E ₁₀ , auch in Kombination mit den oben genannten anderen Enzymen wie vorstehend beschrieben, welche in Summe die Reaktion von n-Butyryl-CoA zu Butyrat katalysiert, durch mindestens ein Enzym ersetzt werden, bei der das n-Butyryl-CoA durch eine Thioesterase oder Acyl-CoA-Synthetase oder Acyl-CoA Acylat:CoA-Transferase zu Butyrat umgewandelt wird.

Vierte Ausführungsform; Aceton

Eine vierte Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die organische Substanz Aceton ist, bevorzugt E-ι ausgewählt ist aus Acetyl-CoA:Acetyl- CoA C-Acetyltransferasen, und das Knallgasbakterium eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E ₁₂ , welches die Umsetzung

von Acetoacetyl-CoA zu Acetoacetat und CoA

zu katalysieren vermag, aufweist.

Bevorzugt ist das Enzym E ₁₂ ausgewählt aus Acetoacetyl-CoA:Acetat/Acyl:CoA Transferasen aus der Enzymklasse EC:3.1.2.1 1 , aus Butyrat-Acetoacetat-CoA-Transferasen aus der

Enzymklasse EC 2.8.3.9 oder aus Acyl-CoA-Hydrolasen aus der Enzymklasse EC 3.1 .2.20. Erfindungsgemäß bevorzugte Acetoacetyl-CoA:Acetat/Acyl:CoA Transferasen sind ausgewählt aus der Liste

aus zwei Untereinheiten aufgebaute Transferasen, bei denen

die alpha-Untereinheit ausgewählt ist aus NP_149326.1 , YP_001310904.1 und CAQ57984.1 und die

beta-Untereinheit ausgewählt ist aus NP_149327.1 , YP_001310905.1 und CAQ57985.1 sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E ₁₂ generell insbesondere die Umsetzung von Acetoacetyl-CoA zu Acetoacetat und CoA verstanden wird.

Erfindungsgemäß bevorzugte Butyrat-Acetoacetat-CoA-Transferasen sind ausgewählt aus ctfA und ctfB aus Clostridium acetobutylicum und atoD und atoA aus Escherichia coli sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der

Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E ₁₂ generell insbesondere die Umsetzung von Acetoacetyl-CoA zu Acetoacetat und CoA verstanden wird.

Erfindungsgemäß bevorzugte Acyl-CoA Hydrolasen sind ausgewählt aus

teil aus B. subtilis bzw. ybgC aus Heamophilus influenzae

sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E ₁₂ generell insbesondere die Umsetzung von Acetoacetyl-CoA zu Acetoacetat und CoA verstanden wird.

Eine Methode zur Bestimmung der Transferaseaktivität des Enzyms E ₁₂ wird in Jeffrey et al, Applied and Environmental Microbiology, die der Hydrolaseaktivität des Enzyms E ₁₂ in Aragon et al. Journal of Biological Chemistry (1983), 258(8), 4725-33. beschrieben.

Eine bevorzugte vierte Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms E-i und gegebenenfalls E ₁₂ eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerten Aktivität eines Enzyms E ₁₃ , welches die Umsetzung

von Acetoacetat zu Aceton und C0 ₂

zu katalysieren vermag, aufweist.

Das Enzym E ₁₃ ist bevorzugt ausgewählt aus Acetoacetat Decarboxylasen aus der

Enzymklasse EC:4.1.1.4 oder aus Aceton:C02 Ligasen aus der Enzymklasse EC 6.4.1 .6. Erfindungsgemäß bevorzugte Acetoacetat Decarboxylasen sind ausgewählt aus der Liste NPJ 49328.1 , YP_001310906.1 und CAQ57986.1

sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der

Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten

Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E ₁₃ generell insbesondere die Umsetzung von Acetoacetat zu Aceton und C0 ₂ verstanden wird.

Eine Methode zur Bestimmung der Aktivität wird in Daniel et al. Appl. Environ. Microbiol. 1990, p. 3491 -3498 Vol. 56, No. 1 1 beschrieben.

Erfindungsgemäß bevorzugte Aceton:C02 Ligasen sind ausgewählt aus der Liste der oligomeren Proteine mit Sequenzen.

Eine Methode zur Bestimmung der Aktivität von Aceton:C02 Ligasen wird Miriam K. Sluis et al in Proc Natl Acad Sei U S A. 1997 August 5; 94(16): 8456-8461 beschrieben, wobei hier als Substrate Acetoacetat, AMP und Orthophosphat verwendet werden.

In besonders bevorzugten vierten Ausführungsformen des erfindungemäßen Verfahrens weist das Knallgasbakterium gesteigerte Aktivitäten in den Kombinationen E"|E ₁₂ , E-|E ₁₃ und EiEi ₂ Ei ₃ auf,

wobei E- _\ E ₁₂ E ₁₃ besonders bevorzugt ist.

Fünfte Ausführungsform; Propan-2-ol; gegebenenfalls gefolgt von Dehydratisierung zu Propen Eine fünfte Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die organische Substanz Propan-2-ol ist, bevorzugt E-ι ausgewählt ist aus Acetyl- CoA:Acetyl-CoA C-Acetyltransferasen, und das Knallgasbakterium eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E ₁₂ , welches die Umsetzung

von Acetoacetyl-CoA zu Acetoacetat und CoA

zu katalysieren vermag, aufweist.

Bevorzugt ist das Enzym E ₁₂ ausgewählt aus Acetoacetyl-CoA:Acetat/Acyl:CoA Transferasen aus der Enzymklasse EC:3.1.2.1 1 , aus Butyrat-Acetoacetat-CoA-Transferasen aus der Enzymklasse EC 2.8.3.9 oder aus Acyl-CoA-Hydrolasen aus der Enzymklasse EC 3.1 .2.20. Erfindungsgemäß bevorzugte Acetoacetyl-CoA:Acetat/Acyl:CoA Transferasen sind ausgewählt aus der Liste

aus zwei Untereinheiten aufgebaute Transferasen, bei denen

die alpha-Untereinheit ausgewählt ist aus NP_149326.1 , YP_001310904.1 und CAQ57984.1 und die

beta-Untereinheit ausgewählt ist aus NP_149327.1 , YP_001310905.1 und CAQ57985.1 sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E ₁₂ generell insbesondere die Umsetzung von Acetoacetyl-CoA zu Acetoacetat und CoA verstanden wird.

Erfindungsgemäß bevorzugte Butyrat-Acetoacetat-CoA-Transferasen sind ausgewählt aus ctfA und ctfB aus Clostridium acetobutylicum und atoD und atoA aus Escherichia coli sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E ₁₂ generell insbesondere die Umsetzung von Acetoacetyl-CoA zu Acetoacetat und CoA verstanden wird.

Erfindungsgemäß bevorzugte Acyl-CoA Hydrolasen sind ausgewählt aus

teil aus B. subtilis bzw. ybgC aus Heamophilus influenzae sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E ₁₂ generell insbesondere die Umsetzung von Acetoacetyl-CoA zu Acetoacetat und CoA verstanden wird.

Eine bevorzugte fünfte Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms E-i und gegebenenfalls E ₁₂ eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerteAktivität eines Enzyms

E ₁₃ , welches die Umsetzung

von Acetoacetat zu Aceton und C0 ₂

zu katalysieren vermag, aufweist.

Das Enzym E ₁₃ ist bevorzugt ausgewählt aus Acetoacetat Decarboxylasen aus der

Enzymklasse EC:4.1.1 .4 oder aus Aceton:C02 Ligasen aus der Enzymklasse EC 6.4.1 .6.

Erfindungsgemäß bevorzugte Acetoacetat Decarboxylasen sind ausgewählt aus der Liste

NPJ 49328.1 , YP_001310906.1 und CAQ57986.1

sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der

Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten

Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E ₁₃ generell insbesondere die Umsetzung von Acetoacetat zu Aceton und C0 ₂ verstanden wird.

Eine Methode zur Bestimmung der Aktivität wird in Daniel et al. Appl. Environ. Microbiol. 1990, p. 3491 -3498 Vol. 56, No. 1 1 beschrieben.

Eine Methode zur Bestimmung der Aktivität von Aceton:C02 Ligasen wird Miriam K. Sluis et al in Proc Natl Acad Sei U S A. 1997 August 5; 94(16): 8456-8461 beschrieben, wobei hier als Substrate Acetoacetat, AMP und Orthophosphat verwendet werden. Eine weitere bevorzugte fünfte Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms E-i und gegebenenfalls E ₁₂ , und /oder E ₁₃ eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E ₁₄ , welches die Umsetzung

von Aceton, NADPH und H ⁺ zu Propan-2-ol + NADP ⁺

zu katalysieren vermag, aufweist.

Bevorzugt ist das Enzym E ₁₄ ausgewählt aus Propan-2-ol:NADP ⁺ Oxidoreduktase aus der Enzymklasse EC:1 .1.1.80.

Eine Methode zur Bestimmung der Aktivität von Propan-2-ol:NADP ⁺ Oxidoreduktase wird in Antonio D. Uttaro et al in Molecular and Biochemical Parasitology 85 (1997) 213 219 beschrieben.

In besonders bevorzugten fünften Ausführungsformen des erfindungemäßen Verfahrens weist das Knallgasbakterium gesteigerte Aktivitäten in den Kombinationen E-|E ₁₄ , E"|E ₁₂ E ₁₄ , EiEi ₂ Ei ₃ E ₁₄ und EiE ₁₂ E ₁₃ E ₁₄ auf,

wobei EiE ₁₂ E ₁₃ E ₁₄ besonders bevorzugt ist.

In einer besonders bevorzugten fünften Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens wird in Verfahrensschritt C) das Propan-2-ol aus der wässrigen Lösung destillativ als Azeotrop isoliert. Methoden zur Isolierung von Propan-2-ol sind unter anderem in Lei Zhigang, Zhang Jinchang, Chen Biaohua Separation of aqueous isopropanol by reactive extractive distillation in Journal of Chemical Technology and Biotechnology Volume 77, Issue 1 1 pages 1251-1254, November 2002, Lloyd Berg et al Separation of the propyl alcohols from water by azeotropic or extractive destillation US5085739 und Berg, Lloyd Separation of ethanol, isopropanol and water mixtures by azeotropic distillation US5762765 beschrieben. Eine besonders bevorzugte fünfte Ausführungsform des erfindungemaßen Verfahrens umfasst einen Verfahrensschritt D).

Dehydratisierung von dem in Verfahrensschritt C) isolierten Propan-2-ol zu Propen.

Bevorzugt wird das isolierte Propan-2-ol in Verfahrensschritt D) durch chemische

Dehydratisierung an einem sauren Katalysator zu Propen umgesetzt. Entsprechende Verfahren sind in Maria L. Martinez et al Synthesis, characterization and catalytic activity of AISBA-3 mesoporous catalyst having variable silicon-to-aluminum ratios Microporous and Mesoporous Materials 144 (201 1 ) 183-190 und A.S. Araujo et al Kinetic study of isopropanol dehydration over silicoaluminophosphate catalyst Reaction Kinetics and Catalysis Letters January 1999, Volume 66,lssue 1 , pp 141 -146 beschrieben.

Sechste Ausführungsform; 2-Hydroxyisobuttersäure Eine sechste Ausführungsform des erfindungemaßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die organische Substanz 2-Hydroxyisobuttersäure oder ein Salz der 2- Hydroxyisobuttersäure ist, bevorzugt E-ι ausgewählt ist aus Acetyl-CoA:Acetyl-CoA C- Acetyltransferasen, das Knallgasbakterium gegebenenfalls eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E ₂ , welches die Umsetzung

von Acetoacetyl-CoA und NADH oder NADPH zu 3-Hydroxybutyryl-CoA und NAD+ oder NADP+

zu katalysieren vermag, aufweist

und das Knallgasbakterium eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerten Aktivität eines Enzyms E ₁₅ , welches die Umsetzung

von 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A zu 2-Hydroxyisobutyryl-Coenzym A zu katalysieren vermag, aufweist.

In diesem Zusammenhang bevorzugte Enzyme E ₂ sind jene, die in der ersten Ausführungsform als bevorzugte angegeben sind.

Bei dem Enzym E ₁₅ handelt es sich vorzugsweise um eine Hydroxyl-lsobutyryl-CoA Mutase, um eine Isobutyryl-CoA Mutase (EC 5.4.99.13) oder um eine Methylmalonyl-CoA Mutase (EC 5.4.99.2), jeweils bevorzugt um eine Coenzym B12-abhängige Mutase.

Bei dem Enzym E ₁₅ handelt es sich bevorzugt um solche Enzyme, die sich aus den

Mikroorganismen Aquincola tertiaricarbonis L108, DSM18028, DSM18512, Methylibium petroleiphilum PM1 , Methylibium sp. R8, Xanthobacter autotrophicus Py2, Rhodobacter sphaeroides (ATCC 17029), Nocardioides sp. JS614, Marinobacter algicola DG893,

Sinorhizobium medicae WSM419, Roseovarius sp. 217, Pyrococcus furiosus DSM 3638 isolieren lassen.

In einer bevorzugten Ausgestaltung der sechsten Ausführungsform stellt das Enzym E ₁₅ ein heterodimeres Enzyme dar, welches Sequenzen umfasst, ausgewählt aus Seq-ID-Nr. 78 und 80

sowie

Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber der jeweiligen vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion,

Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten

Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E ₁₅ generell insbesondere die Umsetzung von 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A zu 2-Hydroxyisobutyryl-Coenzym A verstanden wird.

In besonders bevorzugten sechsten Ausführungsformen des erfindungemäßen Verfahrens weist das Knallgasbakterium gesteigerte Aktivitäten in den Kombinationen auf.

In der sechsten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es bevorzugt, dass neben dem Enzym E ₁₅ zusätzlich das Knallgasbakterium eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerten Menge eines MeaB Proteins, insbesondere eines mit Seq-ID-Nr. 82, aufweist. Bei dem MeaB Protein handelt es sich bevorzugt um solche ausgewählt aus Sequenz ID Nr. 82, YP_001023545.1 {Methylibium petroleiphilum PM1 ), YP_001409454.1 {Xanthobacter autotrophicus Py2), YP_001045518.1 {Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029),

YP_002520048.1 {Rhodobacter sphaeroides), AAL86727.1 {Methylobacterium extorquens AMI), CAX21841 .1 {Methylobacterium extorquens DM4), YP_001637793.1 {Methylobacterium extorquens PA1 ), AAT28130.1 {Aeromicrobium erythreum), CAJ91091 {Polyangium

cellulosum), AAM77046.1 {Saccharopolyspora erythraea) und NP_417393.1 {Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655)

sowie

Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber der jeweiligen vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion,

Substitution oder eine Kombination davon verändert sind.

Insbesondere können Enzyme E ₁₅ und das MeaB Protein als Fusionsproteine expremiert werden, wie sie beispielsweise in der PCT/EP2010/065151 offenbart sind und welche besonders bevorzugt eingesetzt werden.

Eine Methode zur Bestimmung der Aktivität wird in Murthy VV et al in Biochim Biophys Acta. 1977 Aug 1 1 ; 483(2): 487-91 beschrieben

Folgende Abbildungen sind Bestandteil der Beispiele:

Abbildung 1 : Exemplarische Aceton- und Isopropanol-Produktion C. necator H 16 pBBR- EcatoDAB|Caadc

Abbildung 2: Exemplarische Butanol-Produktion mit C. necator H 16 pBBR-RephaABJ-CaadhE2

Beispiele: Ausführungsbeispiel 1: Konstruktion von Plasmiden für die Herstellung von Aceton mit

Cupriavidus necator

Für die Konstruktion von Plasmiden für die Herstellung von Aceton mit C. necator wurden fünf synthetische Expressionskassetten synthetisiert, die aus folgenden Komponenten bestehen:

1 . dem E. coli atoDAB-Operon, kodierend für die ß-Untereinheit der Acetyl-CoA:Acetoacetyl- CoA-Transferase AtoD (Seq-ID-Nr. 13), die α-Untereinheit der Acetyl-CoA:Acetoacetyl-CoA- Transferase AtoA (Seq-ID-Nr. 14) und die Thiolase AtoB (Seq-ID-Nr. NR. 15), incl. der atoD- , atoA- und aioß-Ribosomenbindestellen und dem aioß-Terminator, wobei die für AtoD, AtoA und AtoB kodierenden Bereiche für die Translation in C. necator codonoptimiert wurden (nRBS-EcatoD-nRBS-EcatoA-nRBS-EcatoB-T-EcatoB; Seq-ID-Nr. 16) dem C. necator phaA-Gen, kodierend für die Thiolase PhaA (Seq-ID-Nr. 17), incl. der phaA- Ribosomenbindestelle, und dem C. acetobutylicum ctfAB-Operon, kodierend für die a- und ß-Untereinheit der Acetyl-/Butyryl-CoA-Acetoacetat:CoA-Transferase CtfA (Seq-ID-Nr. 18) und CtfB (Seq-ID-Nr. 19), incl. der ctfA- bzw. cffß-Ribosomenbindestellen und dem ctfAB- Terminator, wobei die für CtfA und CtfB kodierenden Bereiche für die Translation in C.

necator codonoptimiert wurden (nRBS-RephaA-nRBS-CactfA-nRBS-CactfB-T-CactfAB; Seq-ID-Nr. 20) der Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Gens (Seq-ID-Nr. 1 ), dem C.

acetobutylicum thIA-Gen, kodierend für die Thiolase ThIA (Seq-ID-Nr. 21 ) sowie dem C. acetobutylicum ctfAB-Operon, kodierend für die a- und ß-Untereinheit der Acetyl-/Butyryl- CoA-Acetoacetat:CoA-Transferase CtfA (Seq-ID-Nr. 18) und CtfB (Seq-ID-Nr. 19), incl. der nativen ctfA- bzw. cifß-Ribosomenbindestellen und dem nativen cfÄAß-Terminator, wobei die für ThIA, CtfA und CtfB kodierenden Bereiche für die Translation in C. necator codonoptimiert wurden (RBS-RegroEL-CathlA-nRBS-CactfA-nRBS-CactfB-T-CactfAB; Seq- ID-Nr. 22) der Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Gens (Seq-ID-Nr. 1 ), gefolgt vom C.

acetobutylicum thIA-Gen, kodierend für die Thiolase ThIA (Seq-ID-Nr. 21 ), der

Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Gens (Seq-ID-Nr. 1 ), gefolgt vom H. influenzae yögC-Gen, kodierend für die Thioesterase YbgC (Seq-ID-Nr. 23) und schließlich der Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Gens (Seq-ID-Nr. 1 ), gefolgt vom C.

acetobutylicum adc-Gen, kodierend für die Acetoacetat-Decarboxylase Ade (Seq-ID-Nr. 24), incl. dem ac/c-Terminator, wobei die für ThIA, YbgC und Ade kodierenden Bereiche für die Translation in C. necator codonoptimiert wurden (RBS-RegroEL-CathlA-RBS-RegroEL- HiybgC-RBS-RegroEL-Caadc-T-Caadc; Seq-ID-Nr. 25) dem E. coli /acZ-Promotor (Seq-ID-Nr. 26), der Ribosomenbindestelle des C. necator groEL- Gens (Seq-ID-Nr. 1 ) sowie dem C. acetobutylicum adc-Gen, kodierend für die Acetoacetat- Decarboxylase Ade (Seq-ID-Nr. 24), incl. dem ac/c-Terminator, wobei der für Ade kodierende Bereich für die Translation in C. necator codonoptimiert wurde (Plac-RBS- RegroEL-Caadc-T-Caadc; Seq-ID-Nr. 27) Die Expressionskassetten nRBS-EcatoD-nRBS-EcatoA-nRBS-EcatoB-T-EcatoB, nRBS- RephaA-nRBS-CactfA-nRBS-CactfB-T-CactfAB, RBS-RegroEL-CathlA-nRBS-CactfA-nRBS- CactfB-T-CactfAB und RBS-RegroEL-CathlA-RBS-RegroEL-HiybgC-RBS-RegroEL-Caadc-T- Caadc wurden dann über Kpn\/Hind\\\ in den Broad Host Range Expressionsvektor

pBBR1 MCS-2 (Seq-ID-Nr. 10) kloniert, so dass die Expression der Gene unter Kontrolle des £ coli /acZ-Promotors steht. Die resultierenden Expressionsplasmide wurden als pBBR-

EcatoDAB, pBBR-RephaA-CactfAB, pBBR-CathlA-ctfAB und pBBR-CathlA-HiybgC-Caadc bezeichnet und entsprechen den Seq-ID-Nrs. 28, 29, 30 und 31 .

Die Expressionskassette Plac-RBS-RegroEL-Caadc-T-Caadc wurde dann über /-// ^' ndlll/ßamHI in die Vektoren pBBR-EcatoDAB, pBBR-RephaA-CactfAB und pBBR-CathlA-ctfAB (Seq-ID-Nr. 28, 29 und 30) kloniert. Die resultierenden Expressionsplasmide wurden als pBBR-

EcatoDAB|Caadc, pBBR-RephaA-CactfAB|adc und pBBR-CathlA-ctfAB|adc bezeichnet und entsprechen den Seq-ID-Nrs. 32, 33 und 34.

Ausführungsbeispiel 2: Konstruktion von Plasmiden für die Herstellung von Aceton mit

Cupriavidus necator

Für die Konstruktion von Plasmiden für die Herstellung von Aceton mit C. necator wurden fünf synthetische Expressionskassetten synthetisiert, die aus folgenden Komponenten bestehen: 1 . dem £. coli atoDAB-Operon, kodierend für die ß-Untereinheit der Acetyl-

CoA:Acetoacetyl-CoA-Transferase AtoD (Seq-ID-Nr. 13), die α-Untereinheit der Acetyl- CoA:Acetoacetyl-CoA-Transferase AtoA (Seq-ID-Nr. 14) und die Thiolase AtoB (Seq-ID- Nr. 15), incl. der atoD-, atoA- und aioß-Ribosomenbindestellen und dem atoB- Terminator, wobei die für AtoD, AtoA und AtoB kodierenden Bereiche für die Translation in C. necator codonoptimiert wurden (nRBS-EcatoD-nRBS-EcatoA-nRBS-EcatoB-T-

EcatoB; Seq-ID-Nr. 16) dem C. necator phaA-Gen, kodierend für die Thiolase PhaA (Seq-ID-Nr. 17), incl. der p/?a4-Ribosomenbindestelle, und dem C. acetobutylicum ctfAB-Operon, kodierend für die a- und ß-Untereinheit der Acetyl-/Butyryl-CoA-Acetoacetat:CoA-Transferase CtfA (Seq-ID-Nr. 18) und CtfB (Seq-ID-Nr. 19), incl. der ctfA- bzw. ctfB- Ribosomenbindestellen und dem cfÄ4ß-Terminator, wobei die für CtfA und CtfB kodierenden Bereiche für die Translation in C. necator codonoptimiert wurden (nRBS- RephaA-nRBS-CactfA-nRBS-CactfB-T-CactfAB; Seq-ID-Nr. 20) der Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Gens (Seq-ID-Nr. 1 ), dem C.

acetobutylicum thIA-Gen, kodierend für die Thiolase ThIA (Seq-ID-Nr. 21 ) sowie dem C. acetobutylicum ctfAB-Operon, kodierend für die a- und ß-Untereinheit der Acetyl- /Butyryl-CoA-Acetoacetat:CoA-Transferase CtfA (Seq-ID-Nr. 18) und CtfB (Seq-ID-Nr. 19), incl. der nativen ctfA- bzw. cffß-Ribosomenbindestellen und dem nativen ctfAB- Terminator, wobei die für ThIA, CtfA und CtfB kodierenden Bereiche für die Translation in C. necator codonoptimiert wurden (RBS-RegroEL-CathlA-nRBS-CactfA-nRBS-CactfB- T-CactfAB; Seq-ID-Nr. 22) der Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Gens (Seq-ID-Nr. 1 ), gefolgt vom C. acetobutylicum thIA-Gen, kodierend für die Thiolase ThIA (Seq-ID-Nr. 21 ), der

Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Gens (Seq-ID-Nr. 1 ), gefolgt vom H.

influenzae ybgC-Gen, kodierend für die Thioesterase YbgC (Seq-ID-Nr. 23) und schließlich der Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Gens (Seq-ID-Nr. 1 ), gefolgt vom Cupriavidus necator JMP134 acöß-Gen, kodierend für die Aceton carboxylase beta Untereinheit AcbB (Seq-ID-Nr. 9), der Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Gens (Seq-ID-Nr. 1 ), gefolgt vom Cupriavidus necator JMP134 acbA-Gen, kodierend für die Aceton carboxylase alpha Untereinheit AcbA (Seq-ID-Nr. 8) und der

Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Gens (Seq-ID-Nr. 1 ), gefolgt vom

Cupriavidus necator JMP134 acbC-Gen, kodierend für die Aceton carboxylase gamma Untereinheit AcbC (Seq-ID-Nr. 86) incl. dem ac/c-Terminator, wobei die für ThIA und YbgC kodierenden Bereiche für die Translation in C. necator codonoptimiert wurden (RBS-RegroEL-CathlA-RBS-RegroEL-HiybgC-RBS-RegroEL-AcbB- RBS-RegroEL- AcbA- RBS-RegroEL-AcBC-T-Caadc; Seq-ID-Nr. 7) 5. dem £. coli /acZ-Promotor (Seq-ID-Nr. 26), der Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Gens (Seq-ID-Nr. 1 ) gefolgt vom Cupriavidus necator JMP134 acbB-Gen, kodierend für die Aceton carboxylase beta Untereinheit AcbB (Seq-ID-Nr. 9), der Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Gens (Seq-ID-Nr. 1 ), gefolgt vom

Cupriavidus necator JMP134 acbA-Gen, kodierend für die Aceton carboxylase alpha

Untereinheit AcbA (Seq-ID-Nr. 8) und der Ribosomenbindestelle des C. necator groEL- Gens (Seq-ID-Nr. 1 ), gefolgt vom Cupriavidus necator JMP134 acbC-Gen, kodierend für die Aceton carboxylase gamma Untereinheit AcbC (Seq-ID-Nr. 86) incl. dem adc- Terminator. (Plac-RBS- RegroEL-AcbB- RBS-RegroEL-AcbA- RBS-RegroEL-AcBC-T- Caadc; Seq-ID-Nr. 6)

Die Expressionskassetten nRBS-EcatoD-nRBS-EcatoA-nRBS-EcatoB-T-EcatoB, nRBS- RephaA-nRBS-CactfA-nRBS-CactfB-T-CactfAB, RBS-RegroEL-CathlA-nRBS-CactfA-nRBS- CactfB-T-CactfAB und RBS-RegroEL-CathlA-RBS-RegroEL-HiybgC-RBS-RegroEL- AcbB- RBS-RegroEL-AcbA- RBS-RegroEL-AcBC -T-Caadc wurden dann über Kpn\IHind\\\ in den Broad Host Range Expressionsvektor pBBR1 MCS-2 (Seq-ID-Nr. 10) kloniert, so dass die Expression der Gene unter Kontrolle des E. coli /acZ-Promotors steht. Die resultierenden Expressionsplasmide wurden als pBBR-EcatoDAB, pBBR-RephaA-CactfAB, pBBR-CathlA- ctfAB und pBBR-CathlA-HiybgC-ReacbBAC bezeichnet und entsprechen den Seq-ID-Nr.s 28, 29, 30 und 5.

Die Expressionskassette Plac- RBS-RegroEL- AcbB- RBS-RegroEL-AcbA- RBS-RegroEL- AcBC -T-Caadc wurde dann über /-// ^' ndlll/ßamHI in die Vektoren pBBR-EcatoDAB, pBBR- RephaA-CactfAB und p B B R-Cath I A-ctf AB (Seq-ID-Nr.s 28, 29 und 30) kloniert. Die

resultierenden Expressionsplasmide wurden als pBBR-EcatoDAB|ReacbBAC, pBBR-RephaA- CactfAB| ReacbBAC und pBB R-Cath IA-ctfAB| ReacbBAC bezeichnet und entsprechen den Seq-ID-Nrs. 4, 3 und 2.

Ausführungsbeispiel 3: Konstruktion von Plasmiden für die Herstellung von 1-Butanol mit Cupriavidus necator -

Es wurden sieben synthetische Expressionskassetten synthetisiert, die aus folgenden

Komponenten bestehen: dem C. necator phaA-Gen, kodierend für die Thiolase PhaA (Seq-ID-Nr. 17), incl. der phaA- Ribosomenbindestelle, dem C. necator phaBl -Gen, kodierend für die (R)-3-Hydroxybutyryl- CoA-Dehydrogenase PhaB1 (Seq-ID-Nr. 35), incl. der pftaßi-Ribosomenbindestelle, dem Aeromonascaviae phaJ-Gen, kodierend für die (R)-3-Hydroxybutyryl-CoA-Deydratase PhaJ (Seq-ID-Nr. 36), incl. der phaJ-Ribosomenbindestelle, der Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Gens (Seq-ID-Nr. 1 ), dem C. acetobutylicum adhE2-Gen, kodierend für die bifunktionale Butyryl-CoA-/Butyraldehyd-Dehydrogenase AdhE2 (Seq-ID-Nr. 37), sowie dem A. caviae phaJ-Terminator (Seq-ID-Nr. 38), wobei die für PhaJ und AdhE2 kodierenden Bereiche für die Translation in C. necator codonoptimiert wurden (nRBS-RephaA-nRBS- RephaB1-nRBS-AcphaJ-RBS-RegroEL-CaadhE2-T-AcphaJ; Seq-ID-Nr. 39) dem C. necator phaA-Gen, kodierend für die Thiolase PhaA (Seq-ID-Nr. 17), incl. der phaA- Ribosomenbindestelle, dem C. necator phaBl '-Gen, kodierend für die (R)-3-Hydroxybutyryl- CoA-Dehydrogenase PhaBl (Seq-ID-Nr. 35), incl. der phaB 7-Ribosomenbindestelle und dem Aeromonascaviae phaJ-Gen, kodierend für die (R)-3-Hydroxybutyryl-CoA-Deydratase PhaJ (Seq-ID-Nr. 36), incl. der phaJ-Ribosomenbindestelle sowie dem Aeromonascaviae pftaJ-Terminator (Seq-ID-Nr. 38), wobei der für PhaJ kodierende Bereich für die Translation in C. necator codonoptimiert wurde (nRBS-RephaA-nRBS-RephaB1-nRBS-AcphaJ-T- AcphaJ; Seq-ID-Nr. 40) der Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Gens (Seq-ID-Nr. 1 ), gefolgt vom C.

acetobutylicum thIA-Gen, kodierend für die Thiolase ThIA (Seq-ID-Nr. 21 ), der

Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Gens (Seq-ID-Nr. 1 ), gefolgt vom C.

acetobutylicum hbd-Gen, kodierend für die (S)-3-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydrogenase Hbd (Seq-ID-Nr. 41 ), der Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Gens (Seq-ID-Nr. 1 ), gefolgt vom C. acetobutylicum adhE2-Gen, kodierend für die bifunktionale Butyryl-CoA- /Butyraldehyd-Dehydrogenase AdhE2 (Seq-ID-Nr. 37) und dem C. acetobutylicum ctfAB- Terminator (Seq-ID-Nr. 42), wobei die für ThIA, Hbd und AdhE2 kodierenden Bereiche für die Translation in C. necator codonoptimiert wurden (RBS-RegroEL-CathlA-RBS-RegroEL- Cahbd-RegroEL-CaadhE2-T-CactfAB; Seq-ID-Nr. 43)

ERICHTIGTES B ATT REGEL 91 ISA EP 4. der Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Ger s (Seq-ID-Nr. 1 ), gefolgt vom C.

acetobutylicum thIA-Gen, kodierend für die Thiolase ThIA (Seq-ID-Nr. 21 ), der

Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Gens (Seq-ID-Nr. 1 ), gefolgt vom C.

acetobutylicum hbd-Gen, kodierend für die (S)-3-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydrogenase Hbd (Seq-ID-Nr. 41 ) und dem C. acetobutylicum cfÄAß-Terminator (Seq-ID-Nr. 42), wobei die für ThIA und Hbd kodierenden Bereiche für die Translation in C. necator codonoptimiert wurden (RBS-RegroEL-CathlA-RBS-RegroEL-Cahbd-T-CactfAB; Seq-ID-Nr. 44)

5. dem E. coli /acZ-Promotor (Seq-ID-Nr. 26), dem C. necator etfBA-bcd-Operon, kodierend für die ß-Untereinheit des Elektron-Transferproteins EtfB (Seq-ID-Nr. 45), die a-Untereinheit des Elektron-Transferproteins EtfA (Seq-ID-Nr. 46) und die Butyryl-CoA-Dehydrogenase Bcd (Seq-ID-Nr. 46), incl. der eifß-, etfA- und bcd-Ribosomenbindestellen und dem C.

necator etfBA-bcd-T ermmator (Seq-ID-Nr. 48) (Plac-nRBS-ReetfB-nRBS-ReetfA-nRBS- Rebcd-nT; Seq-ID-Nr. 49)

6. dem E. coli /acZ-Promotor (Seq-ID-Nr. 26), dem C. acetobutylicum c/f-Gen, kodierend für die Crotonase Crt (Seq-ID-Nr. 50), incl. der c/f-Ribosomenbindestelle, dem C.

acetobutylicum etfBA-bcd-Operon, kodierend für die ß-Untereinheit des Elektron- Transferproteins EtfB (Seq-ID-Nr. 51 ), die α-Untereinheit des Elektron-Transferproteins EtfA (Seq-ID-Nr. 52) und die Butyryl-CoA-Dehydrogenase Bcd (Seq-ID-Nr. 53), incl. der etfB-, etfA- und bcd-Ribosomenbindestellen und dem C. necator etfBA-bcd-T ermmator (Seq-ID- Nr. 48) (Plac-nRBS-Cacrt-nRBS-CaetfB-nRBS-CaetfA-nRB-Cabcd-T-Rebcd; Seq-ID-Nr. 54)

7. dem £. coli /acZ-Promotor (Seq-ID-Nr. 26), dem C. acetobutylicum etfBA-bcd-Operor\,

kodierend für die ß-Untereinheit des Elektron-Transferproteins EtfB (Seq-ID-Nr. 51 ), die a- Untereinheit des Elektron-Transferproteins EtfA (Seq-ID-Nr. 52) und die Butyryl-CoA- Dehydrogenase Bcd (Seq-ID-Nr. 53), incl. der eifß-, etfA- und bcd-Ribosomenbindestellen und dem C. necator etfBA-bcd-T ermmator (Seq-ID-Nr. 48) (Plac-nRBS-CaetfB-nRBS- CaetfA-nRB-Cabcd-T-Rebcd; Seq-ID-Nr. 55)

Die Expressionskassetten nRBS-RephaA-nRBS-RephaB1 -nRBS-AcphaJ-RBS-RegroEL- CaadhE2-T-AcphaJ, nRBS-RephaA-nRBS-RephaB1 -nRBS-AcphaJ-T-AcphaJ, RBS-RegroEL- CathlA-RBS-RegroEL-Cahbd-RegroEL-CaadhE2-T-CactfAB und RBS-RegroEL-CathlA-RBS- RegroEL-Cahbd-T-CactfAB wurden dann über Kpn\/Hind\\\ in den Broad Host Range

Expressionsvektor pBBR1 MCS-2 (Seq-ID-Nr. 10) kloniert, so dass die Expression der Gene unter Kontrolle des E. coli /acZ-Promotors steht. Die resultierenden Expressionsplasmide wurden als pBBR-RephaABJ-CaadhE2, pBBR-RephaABJ, pBBR-CathlA-hbd-adhE2-ctfAB und pBBR-CathlA-hbd-ctfAB bezeichnet und entsprechen den Seq-ID-Nrs. 56, 57, 58 und 59.

Die Expressionskassette Plac-nRBS-ReetfB-nRBS-ReetfA-nRBS-Rebcd-nT wurde dann über Hind\\\/Bam \ in die Vektoren pBBR-RephaABJ-CaadhE2 und pBBR-RephaABJ (Seq-ID-Nr.s 56 und 57) kloniert. Die resultierenden Expressionsplasmide wurden als pBBR-RephaABJ- CaadhE2|ReetfBA-bcd und pBBR-RephaABJ|ReetfBA-bcd bezeichnet und entsprechen den Seq-ID-Nrs. 60 und 61 .

Die Expressionskassette Plac-nRBS-Cacrt-nRBS-CaetfB-nRBS-CaetfA-nRB-Cabcd-T-Rebcd wurde dann über Hind\\\/Bam \ in die Vektoren pBBR-RephaABJ-CaadhE2, pBBR-RephaABJ, pBBR-CathlA-hbd-adhE2-ctfAB und pBBR-CathlA-hbd-ctfAB (Seq-ID-Nrs. 56, 57, 58 und 59) kloniert. Die resultierenden Expressionsplasmide wurden als pBBR-RephaABJ-CaadhE2|Cacrt- etfBA-Cabcd, pBBR-RephaABJ|Cacrt-etfBA-Cabcd, pBBR-CathlA-hbd-adhE2-ctfAB|crt-etfBA- bcd und pBBR-CathlA-hbd-ctfAB|crt-etfBA-bcd bezeichnet und entsprechen den Seq-ID-Nrs. 62, 63, 64 und 65.

Die Expressionskassette Plac-nRBS-CaetfB-nRBS-CaetfA-nRB-Cabcd-T-Rebcd wurde dann über Hind\\\/Bam \ in die Vektoren pBBR-RephaABJ-CaadhE2 und pBBR-RephaABJ (Seq-ID- Nrs. 56 und 57) kloniert. Die resultierenden Expressionsplasmide wurden als pBBR-RephaABJ- CaadhE2|etfBA-bcd und pBBR-RephaABJ|CaetfBA-bcd bezeichnet und entsprechen den Seq- ID-Nrs. 66 und 67.

Ausführungsbeispiel 4: Konstruktion von Plasmiden für die Herstellung von Butyrat und 1- Propen mit Cupriavidus necator

Für die Konstruktion von Plasmiden für die Herstellung von Butyrat und 1 -Propen mit C. necator wurde eine synthetische Expressionskassetten synthetisiert, die aus folgenden Komponenten besteht: 1 . dem C. necator groEL- Promotor (Seq-ID-Nr. 68), der Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Gens (Seq-ID-Nr. 1 ), gefolgt vom Jeotgalicoccus sp. ATCC 8456 o/eT-Gen, kodierend für die terminale Olefine bildende Fettsäure-Decarboxylase OleT (Seq-ID-Nr. 69), der Ribosomenbindestelle des C. necator gro£Z--Gens (Seq-ID-Nr. 1 ) und schließlich dem C. acetobutylicum ptb-buk-Operon, kodierend für die Phosphotransbutyrylase Ptb (Seq-ID- Nr. 70) und die Butyratkinase Buk (Seq-ID-Nr. 71 ), incl. der öü/ -Ribosomenbindestelle und dem piö-öü/ -Terminator (Seq-ID-Nr. 72), wobei die für OleT, Ptb und Buk kodierenden Bereiche für die Translation in C. necator codonoptimiert wurden (PRegroESL-RBS- RegroEL-JeoleT-RBS-RegroEL-Captb-nRBS-Cabuk-T-Captb-buk; Seq-ID-Nr. 73)

Die Expressionskassette PRegroESL-RBS-RegroEL-JeoleT-RBS-RegroEL-Captb-nRBS-

Cabuk-T-Captb-buk wurde dann über BamH\/Sac\ in die Vektoren pBBR-RephaABJ|ReetfBA- bcd, pBBR-RephaABJ|CaetfBA-bcd und pBBR-CathlA-hbd-ctfAB|crt-etfBA-bcd (Seq-ID-Nrs. 58, 60 und 62) kloniert. Die resultierenden Expressionsplasmide wurden als pBBR- RephaABJ|etfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk, pBBR-RephaABJ|CaetfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk und pBBR-CathlA-hbd-ctfAB|crt-etfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk bezeichnet und entsprechen den Seq- ID-Nrs. 74, 75 und 76.

Ausführungsbeispiel 5: Konstruktion von Plasmiden für die Herstellung von 2-Propanol mit Cupriavidus necator

Für die Konstruktion von Plasmiden für die Herstellung von 2-Propanol mit C. necator wurde eine synthetische Expressionskassette synthetisiert, die aus folgenden Komponenten besteht:

1 . dem C. necator groEL- Promotor (Seq-ID-Nr. 68), der Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Gens (Seq-ID-Nr. 1 ), gefolgt vom Clostridium beijerinckii NRRL B593 adh-Gen, kodierend für eine primäre und sekundäre Alkohole oxidierende Alkoholdehydrogenase (Seq-ID-Nr. 1 1 ), wobei der für die primäre und sekundäre Alkohole oxidierende

Alkoholdehydrogenase kodierende Bereich für die Translation in C. necator codonoptimiert wurden (PRegroESL-RBS-Cbadh-T-Rebcd; Seq-ID-Nr. 12)

Die Expressionskassette PRegroESL-RBS-Cbadh-T-Rebcd wurde dann über Sac\/Spe\ in die Vektoren pBBR-EcatoDAB|Caadc, pBBR-RephaA-CactfAB|adc und pBBR-CathlA-ctfAB|adc (Seq-ID-Nrs. 32, 33 und 34) kloniert. Die resultierenden Expressionsplasmide wurden als pBBR-EcatoDAB|Caadc|Cbadh, pBBR-RephaA-CactfAB|adc|Cbadh und pBBR-CathlA- ctfAB|adc|Cbadh bezeichnet und entsprechen den Seq-ID-Nrs. 83, 84 und 85.

A usführungsbeispiel 6: Generierung des Vektors pBBR 1 MCS-2::HCM-phaA und pBBR 1 MCS- 2::meaBhcmA-hcmB-phaA

Der Vektor pBBR1 MCS-2::HCM-phaA wurde ausgehend vom Plasmid pBBR1 MCS-2::HCM (Generierung und Eigenschaften in Patentanmeldung EP12173010 beschrieben) erzeugt. Für die Konstruktion wurde eine synthetische Expressionskassette synthetisiert, die aus folgenden Komponenten besteht:

1 . dem C. necator phaA-Gen, kodierend für die Thiolase PhaA (Seq-ID-Nr. 17), incl. der p/?a4-Ribosomenbindestelle; up- und downstream der Sequenz werden Xbal

Schnittstellen angefügt (nRBS-RephaA; Seq-ID-Nr. 87).

Das Plasmid pBBR1 MCS-2::HCM wurde mit der Restricktionsendonuklease Xbal linearisiert und anschließend mit der ebenfalls mittels Xbal restringierten und so vorbereiteten

Expressionskassette nRBS-RephaA ligiert. Alle molekularbiologischen Arbeiten erfolgen in dem Fachmann bekannter Art und Weise.

Die Expression der Gene erfolgt nach erfolgreicher Klonierung unter Kontrolle des E. coli lacZ- Promotors. Das resultierenden Expressionsplasmid wird als pBBR1 MCS-2::HCM-phaA bezeichnet und entspricht der Seq-ID-Nr. 88.

Der Vektor pBBR1 MCS-2::meaBhcmA-hcmB-phaA wurde ausgehend vom Plasmid pBBR1 MCS-2::meaBhcmA-hcmB (Generierung und Eigenschaften in Patentanmeldung WO201 1/057871 beschrieben) erzeugt. Für die Konstruktion wurde eine synthetische

Expressionskassette synthetisiert, die aus folgenden Komponenten besteht: 1 . dem C. necator phaA-Gen, kodierend für die Thiolase PhaA (Seq-ID-Nr. 17), incl. der p/?a4-Ribosomenbindestelle; up- und downstream der Sequenz werden Xbal

Schnittstellen angefügt (nRBS-RephaA; Seq-ID-Nr. 87).

Das Plasmid pBBR1 MCS-2::meaBhcmA-hcmB wurde mit der Restricktionsendonuklease Sacl linearisiert und anschließend mit der ebenfalls mittels Sacl restringierten und so vorbereiteten Expressionskassette nRBS-RephaA ligiert. Alle molekularbiologischen Arbeiten erfolgen in dem Fachmann bekannter Art und Weise.

Die Expression der Gene erfolgt nach erfolgreicher Klonierung unter Kontrolle des £ coli lacZ- Promotors. Das resultierenden Expressionsplasmid wird als pBBR1 MCS-2::meaBhcmA-hcmB- phaA bezeichnet und entspricht der Seq-ID-Nr. 89.

Ausführungsbeispiel 7: Einbringen von Plasmiden für die Herstellung von, Aceton, 2-Propanol, 1-Butanol, Butyrat, 2-Hydroxyisobuttersäure und 1 -Propen in Cupriavidus necator Die Plasmide werden in kompetente £ coli S 17-1 -Zellen transferiert, einen Stamm, mit dem die konjugative Übertragung von Plasmiden u.a. in Cupriavidus necaior-Stämme möglich ist. Dazu wird eine Spotmating-Konjugation (wie bei FRIEDRICH et al.,1981 , Naturally occurring genetic transfer of hydrogen-oxidizing ability between strains of Alcaligenes eutrophus. J Bacteriol 147:198-205 beschrieben) mit den die jeweiligen Plasmide tragenden £. coli S 17-1 -Stämmen als Donoren und R. eutopha H16 (reklassifiziert als Cupriavidus necator, DSMZ 428) sowie R. eutropha PHB-4 (reklassifiziert als Cupriavidus necator, DSMZ 541 ) als Rezipienten durchgeführt.

Es werden in allen Fällen Transkonjuganten erhalten, die die jeweiligen Plasmide tragen und die entsprechenden Stämme wie folgt bezeichnet:

• C. necator H16 pBBR-EcatoDAB|Caadc

• C. necator H16 pBBR-RephaA-CactfAB|adc

• C. necator H16 pBBR-CathlA-ctfAB|adc

• C. necator H16 pBBR-RephaABJ-CaadhE2

· C. necator H16 pBBR-RephaABJ

• C. necator H16 pBBR-CathlA-hbd-adhE2-ctfAB

• C. necator H16 pBBR-CathlA-hbd-ctfAB

• C. necator H16 pBBR-RephaABJ-CaadhE2|ReetfBA-bcd • C. necator H16 pBBR-RephaABJ|ReetfBA-bcd

• C. necator H16 pBBR-RephaABJ-CaadhE2|crt-etfBA-bcd

• C. necator H16 pBBR-RephaABJ|crt-etfBA-bcd

• C. necator H16 pBBR-RephaABJ-CaadhE2|etfBA-bcd

· C. necator H16 pBBR-RephaABJ|CaetfBA-bcd

• C. necator H16 pBBR-CathlA-hbd-adhE2-ctfAB|crt-etfBA-bcd

• C. necator H16 pBBR-CathlA-hbd-ctfAB|crt-etfBA-bcd

• C. necator H16 pBBR-RephaABJ|etfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk

• C. necator H16 pBBR-RephaABJ|CaetfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk · C. necafor H16 pBBR-CathlA-hbd-ctfAB|crt-etfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk

• C. necator H 16 pBBR-EcatoDAB|Caadc|Cbadh

• C. necator H16 pBBR-RephaA-CactfAB|adc| Cbadh

• C. necator H16 pBBR-CathlA-ctfAB|adc| Cbadh

• C. necator H16 pBBR-EcatoDAB|ReacbBAC

· C. necator H16 pBBR-RephaA-CactfAB| ReacbBAC

• C. necator H16 pBBR-CathlA-ctfAB| ReacbBAC

• C. necator H16 pBBR1 MCS-2::HCM-phaA

• C. necator PHB-4 pBBR-EcatoDAB|Caadc

· C. necator PHB-4 pBBR-RephaA-CactfAB|adc

• C. necator PHB-4 pBBR-CathlA-ctfAB|adc

• C. necator PHB-4 pBBR-RephaABJ-CaadhE2

• C. necator PHB-4 pBBR-RephaABJ

• C. necafor PHB-4 pBBR-CathlA-hbd-adhE2-ctfAB

· C. necafor PHB-4 pBBR-CathlA-hbd-ctfAB

• C. necator PHB-4 pBBR-RephaABJ-CaadhE2|ReetfBA-bcd

• C. necator PHB-4 pBBR-RephaABJ|ReetfBA-bcd

• C. necator PHB-4 pBBR-RephaABJ-CaadhE2|crt-etfBA-bcd

• C. necator PHB-4 pBBR-RephaABJ|crt-etfBA-bcd

· C. necafor PHB-4 pBBR-RephaABJ-CaadhE2|etfBA-bcd

• C. necator PHB-4 pBBR-RephaABJ|CaetfBA-bcd

• C. necafor PHB-4 pBBR-CathlA-hbd-adhE2-ctfAB|crt-etfBA-bcd c. necator PHB- ^■ 4 pBBR-CathlA-hbd-ctfAB|crt-etfBA-bcd

c. necator PHB- ^■ 4 pBBR-RephaABJ|etfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk

c. necator PHB- ^■ 4 pBBR-RephaABJ|CaetfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk

c. necator PHB- ^■ 4 pBBR-CathlA-hbd-ctfAB|crt-etfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk c. necator PHB- ^■ 4 pBBR-EcatoDAB|Caadc|Cbadh

c. necator PHB- ^■ 4 pBBR-RephaA-CactfAB|adc| Cbadh

c. necator PHB- ^■ 4 pBBR-CathlA-ctfAB|adc| Cbadh

c. necator PHB- -4 pBBR-EcatoDAB|ReacbBAC

c. necator PHB- -4 pBBR-RephaA-CactfAB| ReacbBAC

c. necator PHB- -4 pBBR-CathlA-ctfAB| ReacbBAC

c. necator PHB- -4 pBBR1 MCS-2::HCM-phaA

c. necator PHB- -4 pBBR1 MCS-2::meaBhcmA-hcmB-phaA

Ausführungsbeispiel 8: Quantifizierung von Aceton, 2-Propanol, 1 -Butanol,

2-Hydroxyisobuttersäure, Butyrat und 1 -Propen

Butyrat und Butanol

Die Quantifizierung von Butanol und Butyrat aus einer Fermentationsbrühe erfolgt mittels HPLC/RID und DAD.

Jeweils 2 mL Fermentationsprobe werden in einem 2 mL Eppendorff-Reaktionsgefaß für 5 bei 13000 rpm abzentrifugiert. Anschließend wird der Überstand über einen 0,2 μηη Spritzenvorsatzfilter steril in ein HPLC-Vial filtriert. Gegebenenfalls müssen die Proben entsprechend dem Messbereich verdünnt werden.

Die Messung erfolgt unter den folgenden Bedingungen:

HPLC Agilent 1200, Agilent Technologies, Waldbronn

Mobile Phase: Mobile Phase A1 : H ₂ 0 (Millipore) + 5 mM wässerige H ₂ S0 ₄

Gradient: Isokratisch

Säule: Supelcogel C-610H (9 μηη Partikelgröße,

L x l.D. 30 cm x 7,8 mm) Best.Nr.: 59320-U (Fa. Aldrich)

Vorsäule : Supelcogel H Guard Column (9 μηι Partikelgröße,

L x I.D. 5 cm x 4,6 mm) Best.Nr.: 59319 (Fa. Aldrich)

Säulentemperatu 80 °C

Fluss: 1 ,0 mL/min

Detektor: RID

DAD (210 nm)

Injektionsvolumen: 20 μΙ_,„Flush Sovent" Injektor Nadel: Isopropanol/Wasser (1 Laufzeit: 27 min

Messbereich: Für alle Analyten ca. 0,100 g/L - 12,0 g/L

Kalibrierung und Auswertung: Standardsubstanzen von Butanol und Butyrat (~ 20 mg je Analyt) werden zusammen in einen 10 mL Messkolben eingewogen. Der Messkolben wird mit LM (Millipore Wasser) bis zum Eichstrich aufgefüllt (Lösung S1 : Stammlösung). Aus der Stammlösung wird durch Verdünnen mit Millipore Wasser eine 5-Punkt Kalibrierung angesetzt. 1 mL S1 wird in einen 10 mL Messkolben pipettiert und mit LM bis zum Eichstrich aufgefüllt. In jeder Messreihe werden vor und nach den Proben jeweils die Kalibrierstandards in HPLC-Vials vermessen. Für die

Auswertung werden beide Kalibrierreihen gemittelt. Die Auswertung von Butyrat erfolgt über das DAD Signal bei 210 nm. Butanol wird im RID Chromatogramm ausgewertet.

2-Hydroxyisobuttersäure

Die Bestimmung erfolgt mittels quantitativer ¹ H-NMR-Spectroskopie. Als interner

Quantifizierungsstandard dient Trimethylpropionsäure.

Aceton, 2-Propanol und 1 -Propen

Die Bestimmung der Analyten Aceton, Isopropanol und 1 -Propen in der wässerigen Phase erfolgt mittels Headspace GC/FID Messung und Standardaddition. Die wichtigsten

chromatographischen Parameter sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengefasst. Säule DB-Wax, 30 m x 250 μηι, Filmdicke: 0,25 μηι

GC System Agilent 7890

Gasfluss He, 0,9 mL/min

Säulenofen Equilibrierzeit: 0,5 min, Temperaturgradient: 0-4 min: 40 °C, 5 °C/min von 50 bis 130 °C, 30 °C/min von 130 bis 250 °C, 250 °C für 12 min

Detektor FID, 250 °C

Injektion Headspace, Temperatur: 90 °C, Septum Purge Flow 2 mL/min, Split 1 :2

Kalibrierung Die Kalibrierung erfolgt über Standardaddition mit den entsprechenden

Analyten (interne 1 -Punkt Kalibrierung), linearer Messbereich 1 - 100 mg/L

Ausführungsbeispiel 9: Herstellung von Aceton, 2-Propanol, 1 -Sutanol, Butyrat und 1 -Propen mit rekombinanten Ralstonia eutropha-Zellen

Die in Beispiel 7 beschriebenen plasmidtragenden C. necaior-Stämme werden zur

Untersuchungen der Bildung von Aceton, 2-Propanol, 1 -Butanol, Butyrat und 1 -Propen zur Vorkultur in 2 x 250ml Schüttelkolben mit Schikanen in 25 ml Medium nach Vollbrecht et al., 1978 kultiviert. Das Medium besteht aus (NH ₄ ) ₂ HP0 ₄ 2,0 g/l; KH ₂ P0 ₄ 2,1 g/l; MgS0 ₄ * 7 H ₂ 0 0,2 g/l; FeCI ₃ * 6 H ₂ 0 6 mg/l; CaCI ₂ x 2 H ₂ 0 10 mg; Spurenelement-Lösung (Pfennig and Lippert, 1966) 0,1 ml. Die Spurenelementlösung setzt sich aus Titriplex III 10 g/l, FeS0 x 7 H ₂ 0 4 g/l, ZnS0 ₄ x 7 H ₂ 0 0,2 g/l, MnCI ₂ x 4 H ₂ 0 60 mg/l, H ₃ B0 ₃ 0,6 g/l, CoCI ₂ x 6 H ₂ 0 0,4 g/l, CuCI ₂ x 2 H ₂ 0 20 mg/l, NiCI ₂ x 6 H ₂ 0 40 mg/l, Na ₂ Mo ₄ x 2 H ₂ 0 60 mg/l zusammen. Das Medium der Vorkultur wurde zusätzlich mit Fructose 5 g/l, Kanamycin 300 μg/ml supplementiert. Die Kolben wurden 1 %ig (v/v) aus einer Cryokultur angeimpft. Die Kulturen werden auf einem Schüttler bei 30 °C und 150 rpm für 24h inkubiert. Danach werden die Kulturen vereinigt und eine OD ₆ oo von ca. 3,5 bestimmt.

Die Hauptkultur erfolgt chemolithoautotroph in einem 21 Edelstahl - Reaktor, Biostat B von Sartorius, gefüllt mit 1 -2 I Medium mit der Zusammensetzung (NH ₄ ) ₂ HP0 2,0 g/l, KH ₂ P0 2,1 g/l, MgS0 ₄ x 7 H ₂ 0 3 g/l, FeCI ₃ * 6 H ₂ 0 6 mg/l, CaCI ₂ x 2 H ₂ 0 10 mg, Biotin 1 mg/l, Thiamin- HCI 1 mg/l, Ca-Pantothenat 1 mg/l, Nicotinsäure 20mg/l, Spurenelement-Lösung 0,1 ml und Polypropylenglykol (PPG 1000 1 :5 mit Wasser verdünnt). Die Kultivierung erfolgt bei 30 °C, 500 - 1500 rpm, pH 7. Der pH wird einseitig mit 1 M NaOH geregelt. Die Begasung erfolgt mit einem Gasgemisch aus H ₂ 90 %, C0 ₂ 6 %, 0 ₂ 4 % bei einem Überduck von 0 - 2 bar mit einer Begasungsrate von 0,19 vvm. Der Reaktor wird mit 0,1 % der Vorkultur angeimpft. Dazu wird das benötigte Volumen der Vorkultur in 50 ml Falcontubes 10 min, bei 20 °C und 4500 rpm abzentrifugiert und in 10 ml phosphatgepufferten Salzlösung resuspendiert. Das Waschen wird 3x wiederholt, das letzte Resuspendieren erfolgt in 10 ml Hauptkulturmedium. Die Kultivierungsdauer beträgt 76 - 150 h. Zur Probennahme werden über ein Septum mit einer Spritze mit steriler Kanüle jeweils 10 ml Probe entnommen. Bestimmt wird OD ₆ oo, BTM und das je nach Stamm zu erwartende Produkt nach Beispiel 7.

Nach Kultivierung folgender Stämme kann die Bildung von Aceton nachgewiesen werden:

• C. necator H16 pBBR-EcatoDAB|Caadc (siehe Abbildung 1 )

• C. necator H16 pBBR-RephaA-CactfAB|adc

• C. necator H16 pBBR-CathlA-ctfAB|adc

· C. necator PHB-4 pBBR-EcatoDAB|Caadc

• C. necator PHB-4 pBBR-RephaA-CactfAB|adc

• C. necator PHB-4 pBBR-CathlA-ctfAB|adc

Nach Kultivierung folgender Stämme kann die Bildung von 2-Propanol nachgewiesen werden: · C. necator H16 pBBR-EcatoDAB|Caadc (siehe Abbildung 1 )

• C. necator H16 pBBR-EcatoDAB|Caadc|Cbadh

• C. necator H16 pBBR-RephaA-CactfAB|adc| Cbadh

• C. necator H16 pBBR-CathlA-ctfAB|adc| Cbadh

• C. necator PHB-4 pBBR-EcatoDAB|Caadc|Cbadh

· C. necator PHB-4 pBBR-RephaA-CactfAB|adc| Cbadh

• C. necator PHB-4 pBBR-CathlA-ctfAB|adc| Cbadh

Nach Kultivierung folgender Stämme kann die Bildung von 1 -Butanol nachgewiesen werden:

• C. necator H16 pBBR-RephaABJ-CaadhE2 (siehe producer Abbildung 2)

· C. necator H16 pBBR-RephaABJ

• C. necator H16 pBBR-CathlA-hbd-adhE2-ctfAB

• C. necator H16 pBBR-CathlA-hbd-ctfAB

• C. necator H16 pBBR-RephaABJ-CaadhE2|ReetfBA-bcd C. necator H16 pBBR-RephaABJ|ReetfBA-bcd

C. necator H16 pBBR-RephaABJ-CaadhE2|crt-etfBA-bcd

C. necator H16 pBBR-RephaABJ|crt-etfBA-bcd

C. necator H16 pBBR-RephaABJ-CaadhE2|etfBA-bcd

C. necator H16 pBBR-RephaABJ|CaetfBA-bcd

C. necator H16 pBBR-CathlA-hbd-adhE2-ctfAB|crt-etfBA-bcd

C. necator H16 pBBR-CathlA-hbd-ctfAB|crt-etfBA-bcd

c. necator PHB- -4 pBBR- ^■ RephaABJ-CaadhE2

c. necator PHB- -4 pBBR- ^■ RephaABJ

c. necator PHB- -4 pBBR- ^■ CathlA-hbd-adhE2-ctfAB

c. necator PHB- -4 pBBR- ^■ CathlA-hbd-ctfAB

c. necator PHB- -4 pBBR- ^■ RephaABJ-CaadhE2|ReetfBA-bcd

c. necator PHB- -4 pBBR- ^■ RephaABJ | Reetf BA-bcd

c. necator PHB- -4 pBBR- ^■ RephaABJ-CaadhE2|crt-etfBA-bcd

c. necator PHB- -4 pBBR- ^■ RephaABJ |crt-etf BA-bcd

c. necator PHB- -4 pBBR- ^■ RephaABJ-CaadhE2|etfBA-bcd

c. necator PHB- -4 pBBR- ^■ RephaABJ|CaetfBA-bcd

c. necator PHB- -4 pBBR- ^■ CathlA-hbd-adhE2-ctfAB|crt-etfBA-bcd

c. necator PHB- -4 pBBR- ^■ CathlA-hbd-ctfAB|crt-etfBA-bcd

Nach Kultivierung folgender Stämme kann die Bildung von Butyrat nachgewiesen werden:

C. necator H16 pBBR-RephaABJ|etfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk

C. necator H16 pBBR-RephaABJ|CaetfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk

C. necator H16 pBBR-CathlA-hbd-ctfAB|crt-etfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk

C. necator PHB-4 pBBR-RephaABJ|etfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk

C. necator PHB-4 pBBR-RephaABJ|CaetfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk

C. necator PHB-4 pBBR-CathlA-hbd-ctfAB|crt-etfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk

Nach Kultivierung folgender Stämme kann die Bildung von 1 -Propen nachgewiesen werden: · C. necator H16 pBBR-RephaABJ|etfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk

• C. necator H16 pBBR-RephaABJ|CaetfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk

• C. necator H16 pBBR-CathlA-hbd-ctfAB|crt-etfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk • C. necator PHB-4 pBBR-RephaABJ|etfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk

• C. necator PHB-4 pBBR-RephaABJ|CaetfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk

• C. necator PHB-4 pBBR-CathlA-hbd-ctfAB|crt-etfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk Ausführungsbeispiel 9: Herstellung von 2-Hydroxyisobuttersäure mit rekombinanten

Cupriavidus necator-Zellen

Für die Biotransformation von Knallgas zu 2-Hydroxyisobuttersäure (2HIB) wurde eine

Produktionsphase von einem plasmidtragenden Cupriavidus necator verwendet. In diesem Ansatz nimmt das Bakterium H ₂ und C0 ₂ aus der durchgeleiteten Gasphase auf und bildet 2HIB. Für die Kultivierung wurden druckfeste Glasflaschen, die mit einem Butylgummistopfen luftdicht verschlossen werden können, benutzt. Als plasmidtragende C. necator Stämme wurden die Stämme C. necator pBBR1 MCS2::HCM und C necator pBBR1 MCS2::HCM-phaA verwendet.

Die plasmidtragenden C. necaior-Stämme wurden zur Untersuchung der Bildung von 2-

Hydroxyisobuttersäure zunächst auf LB-R-Agarplatten mit Antibiotikum ausgestrichen und für 3 Tage bei 30°C inkubiert.

Zur Vorkultur wurden die Stämme in 200 ml H16-Mineralmedium (modifiziert nach Schlegel et al.,1961 ) in druckfesten 500 ml-Glasflaschen kultiviert. Das Medium bestand aus Na ₂ HP04 x 12 H ₂ 0 9,0 g/l; KH ₂ P0 ₄ 1 ,5g/l; NH ₄ CI 1 ,0 g/l; MgS04 ^χ 7 H20 0,2 g/l; FeCI ₃ * 6 H ₂ 0 10 mg/l; CaCI ₂ x 2 H ₂ 0 0,02 g/l; Spurenelement-Lösung SL-6 (Pfennig, 1974) 1 ml/l.

Die Spurenelementlösung setzte sich aus ZnS0 ₄ x 7 H ₂ 0 100 mg/l, MnCI ₂ x 4 H ₂ 0 30 mg/l, H ₃ BO ₃ 300 mg/l, CoCI ₂ x 6 H ₂ 0 200 mg/l, CuCI ₂ x 2 H ₂ 0 10 mg/l, NiCI ₂ x 6 H ₂ 0 20 mg/l, Na ₂ Mo ₄ x 2 H ₂ 0 30 mg/l zusammen. Der pH-Wert des Mediums wurde durch Zugabe von 1 M NaOH auf 6,8 eingestellt.

Die Flaschen wurden mit einer Einzelkolonie von den bebrüteten Agarplatten angeimpft und die Kultivierung erfolgte chemolithoautotroph auf einem N ₂ /H ₂ /0 ₂ /C0 ₂ -Gemisch (Verhältnis

80 %/10 %/4 %/6 %). Die Kulturen wurden in einem offenen Wasserbadschüttler bei 28 °C, 150 rpm und einer Begasung von 1 l/h für 137 h inkubiert bis zu einer OD >1 ,0. Der Gaseintrag ins Medium erfolgte durch eine Begasungsfritte mit einer Porengröße von 10 μηη, die in der Mitte des Reaktors an einem Begasungsrohr angebracht war. Die Zellen wurden anschließend abzentrifugiert, mit 10 ml Waschpuffer (0,769 g/L NaOH, mind. 1 h bei 28°C und 150 rpm mit einem Gas mit 6% C0 ₂ durchgast) gewaschen und erneut abzentrifugiert. Für die Produktionsphase wurden so viele gewaschene Zellen aus der Wachstumskultur in 200 mL Produktionspuffer (NaOH 0,769 g/l, wird mind. 1 h bei 28°C und 150 rpm mit einem Gas mit 6% C0 ₂ durchgast, wobei sich ein pH von etwa 7,4 einstellt) überführt, dass eine OD ₆ oonm von 1 ,0 eingestellt wurde. Die Hauptkultur erfolgte chemolithoautotroph in druckfesten 500 ml- Glasflaschen bei 28 °C und 150 rpm in einem offenen Wasserbadschüttler mit einer Begasung von 1 l/h mit einem N ₂ /H ₂ /0 ₂ /C0 ₂ -Gemisch (Verhältnis 80 %/10 %/4 %/6 %) für 1 16 h. Der Gaseintrag ins Medium erfolgte durch eine Begasungsfritte mit einer Porengröße von 10 μηη, die in der Mitte der Reaktoren an einem Begasungsrohr angebracht war. Bei Probenahme wurden jeweils 5 ml Probe entnommen zur Bestimmung von OD ₆ oonm, pH und des

Produktspektrums. Die Bestimmung der Produktkonzentration erfolgte mittels semi-quantitativer 1 H-NMR-Spektroskopie. Als interner Quantifizierungsstandard diente

Natriumtrimethylsilylpropionat (T(M)SP).

Über die Kultivierungsdauer in der Produktionsphase bildeten sich bei dem Stamm C. necator pBBR1 MCS2::HCM bis zu 0,3 mg/l 2HIB, während sich bei dem Stamm C. necator pBBR1 MCS2::HCM-phaA bis zu 0,8 mg/l 2HIB bildeten.

Für die Biotransformation von Knallgas zu 2-Hydroxyisobuttersäure (2HIB) wird eine

Produktionsphase von einem plasmidtragenden Cupriavidus necator verwendet. In diesem Ansatz nimmt das Bakterium H ₂ und C0 ₂ aus der durchgeleiteten Gasphase auf und bildet 2HIB. Für die Kultivierung werden druckfeste Glasflaschen, die mit einem Butylgummistopfen luftdicht verschlossen werden können, benutzt. Als plasmidtragende C. necator Stämme werden die Stämme C. necator pBBR1 MCS2::meaBhcmA-hcmB und C. necator pBBR1 MCS2::meaBhcmA-hcmB-phaA verwendet.

Die plasmidtragenden C. necaior-Stämme werden zur Untersuchung der Bildung von 2-

Hydroxyisobuttersäure zunächst auf LB-R-Agarplatten mit Antibiotikum ausgestrichen und für 3 Tage bei 30°C inkubiert.

Zur Vorkultur werden die Stämme in 200 ml H16-Mineralmedium (modifiziert nach Schlegel et al.,1961 ) in druckfesten 500 ml-Glasflaschen kultiviert. Das Medium besteht aus Na ₂ HP0 ₄ x 12 H ₂ 0 9,0 g/l; KH ₂ P0 ₄ 1 ,5g/l; NH ₄ CI 1 ,0 g/l; MgS0 ₄ * 7 H ₂ 0 0,2 g/l; FeCI ₃ * 6 H ₂ 0 10 mg/l;

CaCI ₂ x 2 H ₂ 0 0,02 g/l; Spurenelement-Lösung SL-6 (Pfennig, 1974) 1 ml/l.

Die Spurenelementlösung setzt sich aus ZnS0 ₄ x 7 H ₂ 0 100 mg/l, MnCI ₂ x 4 H ₂ 0 30 mg/l, H3B03 300 mg/l, CoCI2 x 6 H20 200 mg/l, CuCI ₂ x 2 H ₂ 0 10 mg/l, NiCI ₂ x 6 H ₂ 0 20 mg/l, Na ₂ Mo ₄ x 2 H ₂ 0 30 mg/l zusammen. Der pH-Wert des Mediums wird durch Zugabe von 1 M NaOH auf 6,8 eingestellt. Allen verwendeten Medien werden 300 μg ml Kanamycin und 76 nM CoB ₁₂ zugeführt.

Die Flaschen werden mit einer Einzelkolonie von den bebrüteten Agarplatten angeimpft und die Kultivierung erfolgt chemolithoautotroph auf einem N ₂ /H ₂ /0 ₂ /C0 ₂ -Gemisch (Verhältnis

80 %/10 %/4 %/6 %). Die Kulturen werden in einem offenen Wasserbadschüttler bei 28 °C, 150 rpm und einer Begasung von 1 l/h für 137 h inkubiert bis zu einer OD >1 ,0. Der Gaseintrag ins Medium erfolgt durch eine Begasungsfritte mit einer Porengröße von 10 μηη, die in der Mitte des Reaktors an einem Begasungsrohr angebracht ist. Die Zellen werden anschließend abzentrifugiert, mit 10 ml Waschpuffer (0,769 g/L NaOH, mind. 1 h bei 28°C und 150 rpm mit einem Gas mit 6% C0 ₂ durchgast) gewaschen und erneut abzentrifugiert.

Für die Produktionsphase werden so viele gewaschene Zellen aus der Wachstumskultur in 200 mL Produktionspuffer (NaOH 0,769 g/l, wird mind. 1 h bei 28°C und 150 rpm mit einem Gas mit 6% C0 ₂ durchgast, wobei sich ein pH von etwa 7,4 einstellt) überführt, dass eine OD ₆ oonm von 1 ,0 eingestellt wird. Die Hauptkultur erfolgt chemolithoautotroph in druckfesten 500 ml- Glasflaschen bei 28 °C und 150 rpm in einem offenen Wasserbadschüttler mit einer Begasung von 1 l/h mit einem N ₂ /H ₂ /0 ₂ /C0 ₂ -Gemisch (Verhältnis 80%/10%/4%/6%) für 1 16 h. Der Gaseintrag ins Medium erfolgt durch eine Begasungsfritte mit einer Porengröße von 10 μηη, die in der Mitte der Reaktoren an einem Begasungsrohr angebracht ist. Bei Probenahme werden jeweils 5 ml Probe entnommen zur Bestimmung von OD ₆ oonm, pH und des Produktspektrums. Die Bestimmung der Produktkonzentration erfolgt mittels semi-quantitativer 1 H-NMR- Spektroskopie. Als interner Quantifizierungsstandard dient Natriumtrimethylsilylpropionat (T(M)SP).

Über die Kultivierungsdauer in der Produktionsphase bilden sich bei dem Stamm C. necator pBBR1 MCS2::meaBhcmA-hcmB bis zu 1 13 mg/l 2HIB, während sich bei dem Stamm C.

necator pBBR1 MCS2::meaBhcmA-hcmB-phaA bis zu 156 mg/l 2HIB bilden.

Nach Kultivierung folgender Stämme konnte die Bildung von 2-Hydroxyisobuttersäure nachgewiesen werden:

• C. necator PHB-4 pBBR1 MCS-2::HCM-phaA • C. necator H76 pBBR1 MCS-2::HCM-phaA

• C. necator PHB-4 pBBR1 MCS-2::meaBhcmA-hcmB-phaA

• C. necator H16 pBBR1 MCS-2:: meaBhcmA-hcmB-phaA