CAMPO DA INVENÇÃO

[1] A presente invenção refere-se a um processo de obtenção de solução polimérica injetável duplamente f otoreticulável capaz de gelificar in situ, sob condições fisiológicas e incidência de luz visivel, e de liberar óxido nitrico (NO) de maneira prolongada no espaço intraarticular, de modo a promover a regeneração de tecido cartilaginoso, bem como proporcionar um efeito condroprotetor e anti-inf lamatório em indivíduos acometidos por osteoartrite .

[2] A presente invenção se insere no campo da Quimica, mais precisamente na área de Materiais.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[3] A osteoartrite (OA) é a forma mais comum de artrite e afeta milhões de pessoas no mundo todo. Esta doença é caracterizada pela degradação progressiva da cartilagem, diminuição do espaço articular, alteração do contorno ósseo e inflamação sinovial. Seus fatores desencadeantes são traumas, excesso de peso, instabilidade articular, estresse mecânico excessivo e envelhecimento. A dor gerada pelo processo inflamatório limita a movimentação dos indivíduos, reduzindo sua qualidade de vida. Embora pessoas com mais de 60 anos sejam as mais atingidas, a OA também afeta pessoas na faixa etária de 15 a 60 anos.

[4] O ácido hialurônico (HA) , cuja base conjugada é o hialuronato, é um dos principais constituintes da matriz extracelular (MEC) do tecido cartilaginoso e do fluido sinovial. Na MEC o HA suporta a integridade do tecido e interage com os condrócitos por meio de receptores especificos, modulando atividades como migração, diferenciação e proliferação celular. No fluido sinovial, ele é responsável pelas propriedades reológicas, lubrificantes e amortecedoras. O HA endógeno é sintetizado por uma classe de proteínas integrais de membrana denominadas HA sintases. Estas proteínas estruturam o HA por meio da adição sequencial de moléculas de ácido D- glicurônico e n-acetilglucosamina, podendo produzir cadeias poliméricas com cerca de 9.000 kDa .

[5] Em processos inflamatórios, como na osteoartrite, o HA é despolimerizado, o que aumenta a sua taxa de degradação. Em articulações saudáveis, por exemplo, a meia- vida do hialuronato intrassinovial é de aproximadamente 20 horas. No entanto, em articulações inflamadas este tempo é reduzido para 11 horas. Esta diminuição no comprimento das cadeias e, consequentemente, na meia-vida do hialuronato, reduz a viscoelasticidade do fluido sinovial e induz uma resposta inflamatória.

[6] A utilização exógena de HA por meio de injeções intra-articulares é capaz de aumentar a concentração do HA e o comprimento médio das cadeias poliméricas, restaurando dessa maneira a capacidade de lubrificação e as propriedades viscoelásticas do fluido sinovial. Além disso, a inserção de HA exógeno reduz a produção e a atividade de mediadores pró-inflamatórios e metaloproteinases de matriz, propiciando efeito analgésico e condroprotetor .

[7] Diante dos benefícios promovidos pelo uso exógeno de HA no tratamento da OA, diversos estudos já foram reali zados para estabili zar as formulações de HA e aumentar sua meia-vida no espaço articular . Um maior tempo de residência intra-articular pode ser obtido por meio da modi ficação quimica da estrutura do HA para introduzir grupos químicos capazes de formar ligações covalentes entre si , gerando ligações cruzadas entre as cadeias poliméricas . Estas ligações levam à formação de hidrogéis reticulados com alta capacidade de absorção de água e fluidos biológicos .

[ 8 ] Hidrogéis são os materiais mais utili zados para a regeneração de tecidos moles devido à fácil modulação de seus precursores , que permite o desenvolvimento de estruturas muito similares aos tecidos nativos . Para a regeneração de tecido cartilaginoso , hidrogéis hibridos podem ser formados ao combinar HA com outras moléculas que também integram a MEC da cartilagem, como sul fato de condroitina, colágeno ou gelatina, por exemplo . Esta combinação mimeti za a MEC, potenciali zando os efeitos e o tempo de residência do hidrogel no espaço intra-articular . A adição de gelatina, obtida pela hidrólise parcial do colágeno , é capaz de modular as propriedades fisico- quimicas do hidrogel a base de HA e , adicionalmente , facilitar a adesão celular por meio de ligações especi ficas com integrinas .

[ 9 ] Hidrogéis formados in si tu implantados através da inj eção de uma solução polimérica viscosa que subsequentemente é reticulada no local , têm ganhado destaque devido à sua entrega minimamente invasiva e capacidade de encapsulamento homogêneo de moléculas bioativas , além da facilidade no preenchimento de defeitos locais . Estes hidrogéis podem ser formados utili zando polímeros termossensiveis , a partir de reações de adição de Mi chael e de reações de bases de Schiff ou por meio de reações radicalares f otoinduzidas , na presença de f otoiniciadores . A f otoreticulação de polímeros contendo grupos vinilicos e/ou sul fidrila em suas rami ficações , é uma das técnicas mais promissoras para a formação in si tu de hidrogéis no espaço intra-articular devido ao maior controle sobre a cinética de geli ficação . Estes materiais podem ser formados localmente por incidência de luz provinda da inserção de uma fibra ótica .

[ 10 ] Na prática clinica, o tratamento inicial para a osteoartrite é baseado no alivio da dor por meio do uso de anti-inf lamatórios não esteroidais (AINEs ) ou corticosteroides administrados por meio de inj eções intra- articulares . No entanto , este tratamento oferece apenas alivio dos sintomas a curto prazo porque os fármacos são rapidamente eliminados do espaço sinovial . Estudos têm demonstrado que a combinação de anti-inf lamatórios com hidrogéis de HA pode trazer um efeito sinérgico no tratamento da OA. Além disso , a liberação lenta dos anti- inf lamatórios a partir dos hidrogéis pode sustentar seu efeito terapêutico a longo prazo .

[ 11 ] A utili zação de AINEs e corticosteroides gera uma série de efeitos colaterais , principalmente em pessoas com uso recorrente . Os AINES , por exemplo , agem por meio do bloqueio da produção de prostaglandinas , ao inibir a atividade das enzimas ciclo-oxigenases ( COX ) . No local da inflamação , esta inibição tem efeito analgésico e antipirético . Entretanto , com a absorção sistêmica, estas moléculas também bloqueiam a produção de prostaglandinas essenciais para a homeostase do estômago , dos rins e do coração , podendo gerar sérios danos a estes órgãos . Assim, a utili zação de corticosteroides não é indicada para pessoas com hipertensão ou diabetes mellitus . Diante disso , moléculas alternativas que apresentem eficácia terapêutica com efeitos colaterais reduzidos ou nulos podem ser utili zadas em substituição a esses anti-inf lamatórios , como é o caso de moléculas doadoras de óxido nitrico (NO) .

[ 12 ] O NO é uma molécula radicalar gerada endogenamente a partir da conversão de L-arginina a L- citrulina por meio de enzimas denominadas óxido nitrico sintetases (NOS ) . Ele é responsável por promover a vasodilatação , regular o tônus muscular e o processo de apoptose celular . O NO é uma molécula gasosa com curta meia-vida, limitada solubilidade em água e é instável na presença de agentes oxidantes devido ao seu caráter radicalar . Estes fatores di ficultam sua administração exógena e tem motivado o desenvolvimento de dispositivos contendo moléculas doadoras de NO, capazes de liberá-lo de forma local e controlada . Os S-nitrosotióis (RSNOs ) , como a S-nitrosoglutationa ( GSNO) , atuam como armazenadores e doadores de NO devido à sua melhor estabilidade em comparação com o NO livre , podendo ser utili zados como carreadores endógenos de NO ou doadores exógenos . Dessa forma, a incorporação de RSNOs a partir de simples mistura fisica ou através de ligações moleculares com matri zes poliméricas , como hidrogéis , pode proporcionar formas de liberação controlada de NO .

[ 13 ] No tratamento da osteoartrite , o NO pode atuar no combate à inflamação . A entrega de NO no espaço intra-articular apresenta inúmeros benefícios potenciais , tais como a modulação da ação enzimática e da liberação de mediadores inflamatórios , que contribuem para a redução da resposta inflamatória de várias classes celulares , como por exemplo , leucócitos , macrófagos , mastócitos , células endoteliais e plaquetas . Martins et al . ( 2016 ) demonstraram que a liberação de NO, a partir de aplicações tópicas de soluções de hidroxipropilmetilcelulose (HPMC ) contendo GSNO, reduziu o processo inflamatório em doenças periodontais em ratos por meio da diminuição do estresse oxidativo no tecido gengival e dos niveis de citocinas como TNF-a e IL- l p . Além da inibição destas moléculas , Botta et al . ( 2018 ) apresentaram um estudo no qual moléculas contendo grupos doadores de NO foram capazes de reduzir a expressão da isoforma induzivel da NOS , diminuindo os niveis de NO gerado durante o processo de inflamação .

[ 14 ] Vários doadores de NO são f otossensiveis , podendo liberar NO mediante incidência de luz . Além disso , devido à sua natureza antioxidante , o NO, caso estej a livre na solução polimérica, pode reagir com o f otoiniciador homolisado , aumentando o tempo de geli ficação dos hidrogéis . Desta forma, para que ocorra liberação controlada NO a partir de hidrogéis f otoreticulados in si tu é essencial proteger os doadores de NO da ação da luz durante o processo de f otoreticulação .

ESTADO DA TÉCNICA

[ 15 ] Até o presente momento , o estado da técnica na f otoreticulação in si tu de hidrogéis para regeneração de tecido cartilaginoso inclui hidrogéis de ácido hialurônico e de ácido hialurônico combinado com gelatina, sul fato de condroitina, quitosana, poli ( etileno glicol ) dentre outras combinações poliméricas . Além disso , a produção de hidrogéis de ácido hialurônico para regeneração de tecido cartilaginoso , formados por diversos mecanismos de reticulação é descrita em diversos artigos cientí ficos e documentos patentários , por exemplo :

[ 16 ] O documento de autoria de Lin et al . ( 2019 ) , intitulado " OPTIMIZATION OF PHOTOCROSSIINKED GEIATIN/ HYAIURONIC ACID HYBRID SCAFFOÍD FOR THE REPAIR OF CARTHAGE DEFECT" descreve hidrogéis f otoreticulados formados por ácido hialurônico e gelatina modi ficados , com potencial efeito de regeneração da cartilagem, onde a gelatina é o componente maj oritário . Entretanto , tal documento não apresenta conflito com a presente invenção , visto que os hidrogéis são fabricados a partir de gelatina metacrilada com ácido hialurônico metacrilado em uma reação radicalar envolvendo os grupos vinilicos de ambos os polímeros , enquanto na presente invenção , o hidrogel é formado a partir de ácido hialurônico metacrilado como componente maj oritário da matri z e de gelatina sul f idrilada, ao invés de metacrilada . A utili zação de gelatina sul fidrilada leva a hidrogéis formados por duas reações de f otoreticulação distintas : a reação radicalar entre os grupos vinilicos do ácido hialurônico e a reação tiol-eno dos grupos sul fidrila da gelatina com os grupos metacrilato do ácido hialurônico . A ausência de ligação tiol-eno na formação do hidrogel produzido por Lin et al . ( 2019 ) leva a um maior tempo de f otoreticulação . A longa exposição à luz ultravioleta pode causar dano ao tecido cartilaginoso saudável presente no entorno da lesão que está sendo reparada . Além disso , a presente invenção contém nanoparticulas doadoras de NO que promovem a proteção dos grupos doadores de NO durante o processo radicalar de geli ficação , garantindo a liberação controlada de NO após a formação do hidrogel .

[ 17 ] O documento de autoria de Li et al . ( 2019 ) , intitulado " THE APPLICATION OF HYALURONIC ACID-BASED HYDROGELS IN BONE AND CARTILAGE TISSUE ENGINEERING" descreve a aplicação de hidrogéis baseados em ácido hialurônico nos ossos e no tecido cartilaginoso . Adicionalmente , vários tipos de modi ficações químicas que levem à reticulação das cadeias de ácido hialurônico são propostos . Entretanto , veri fica-se que tanto a presente invenção , quanto o referido documento apresentam soluções di ferentes para promover a reticulação do ácido hialurônico a partir das modi ficações quimicas das cadeias poliméricas . Enquanto no referido documento são apresentadas inúmeras estratégias para a modi ficação do ácido hialurônico , utili zando metacrilato de glicidila, ácido metacrilico , divinilsul fona, epóxidos poli funcionais , carbodiimida, hidrazina e aldeidos , que levam a formação de reticulações ( ligações cruzadas ) de um único tipo , a presente invenção propõe a estratégia de dupla reticulação envolvendo a formação de ligações grupos vinilicos do ácido hialurônico metacrilado e ligações tiol-eno entre as cadeias de ácido hialurônico metacrilado e de gelatina sul f idrilada . Adicionalmente , o referido documento não descreve composições que contenham compostos liberadores de NO para auxiliar no processo de regeneração do tecido cartilaginoso , tais como as nanoparticulas doadoras de NO que promovem a proteção dos grupos doadores de NO durante o processo radicalar de gelificação, que compõe a presente invenção .

[18] 0 documento de autoria de Xing et al . (2020) , intitulado "HYALURONIC ACID AS A BIOACTIVE COMPONENT FOR BONE TISSUE REGENERATION: FABRICATION, MODIFICATION, PROPERTIES, AND BIOLOGICAL FUNCTIONS" descreve a utilização de ácido hialurônico como componente bioativo para a regeneração do tecido ósseo, inclusive, propondo sua reticulação com metacrilato de glicidila. Apesar disso, tal documento propõe um método de fabricação e reticulação do material diferente daquele proposto na presente invenção. Enquanto no referido documento se refere à fabricação de dispositivos porosos de ácido hialurônico para a regeneração de tecido ósseo, na presente invenção o ácido hialurônico é utilizado em combinação com a gelatina sulfidrilada para fabricar soluções injetáveis e duplamente f otoreticuláveis in situ com potencial aplicação na regeneração de tecido cartilaginoso. O mecanismo proposto na presente invenção, de dupla reticulação e, particularmente, o uso de ligações do tipo tiol-eno entre as cadeias de ácido hialurônico metacrilado e gelatina sulfidrilada não é descrito no referido documento. Também não é descrita a utilização de compostos bioativos, como as nanoparticulas doadoras de NO que promovem a proteção dos grupos doadores de NO durante o processo radicalar de gelificação, como ocorre na presente invenção.

[19] O documento de autoria de Chen et al .

(2012) , intitulado "IN SITU FORMING HYDROGELS COMPOSED OF

OXIDIZED HIGH MOLECULAR WEIGHT HYALURONIC ACID AND GELATIN FOR NUCLEUS PULPOSUS REGENERATION" descreve hidrogéis de ácido hialurônico e gelatina modi ficados formados in si tu para regeneração do núcleo pulposo . Entretanto , tanto o referido documento quanto a presente invenção apresentam di ferenças nas estratégias para modi ficar a estrutura polimérica do ácido hialurônico e na presença, no caso da presente invenção , de nanoparticulas doadoras de NO que promovem a proteção dos grupos doadores de NO durante o processo radicalar de geli ficação . No referido documento , a formação dos hidrogéis ocorre por meio da formação de ligação amida envolvendo aminas primárias pendentes da gelatina e os grupos carboxila pendentes do ácido hialurônico , seguida de oxidação e reação com ácido adipico dihidrazina, um agente reticulante . Não há liberação de NO dos materiais descritos no referido documento . Já na presente invenção , o hidrogel é formado pela dupla reticulação de ácido hialurônico metacrilado e gelatina sul f idrilada, gerando reações radicalares f otoinduzidas entre os grupos vinilicos do metacrilato e reações tiol-eno entre os grupos vinilicos do metacrilato e os grupos tiol da gelatina sul f idrilada . Na presente invenção foram incorporadas nanoparticulas doadoras de NO que promovem a proteção dos grupos doadores de NO durante o processo radicalar de geli ficação .

[ 20 ] O documento intitulado " INTRA- ARTICULAR DRUG DELIVERY: A FAST GROWING APPROACH (ALY, 2008 ) " faz uma revisão sobre os sistemas de liberação de drogas/ substâncias e cita, entre outras coisas , a utili zação de sistemas baseados no ácido hialurônico contendo nano/micro carreadores , como poli ( ácido láctico- co-ácido glicólico ) ( PLGA) , para a liberação intraarticular de fármacos no tratamento de osteoartrite e artrite reumatoide . Entretanto , são percebidas diversas di ferenças entre tal documento e a presente invenção , como ausência de gelatina na formulação , ausência de grupos metacrilato ou sul fidrila, tanto no ácido hialurônico quanto na gelatina, ausência de uma reação de f otoreticulação e ausência da incorporação de nanoparticulas doadoras de NO que promovem a proteção dos grupos doadores de NO durante o processo radicalar de geli ficação , que são componentes presentes na presente invenção . Além disso , as soluções à base de ácido hialurônico descritas no referido documento resultam em hidrogéis termossensiveis formados por interações fisicas , enquanto na presente invenção , os hidrogéis formados são reticulados f otoquimicamente .

[ 21 ] O documento CN109701073A intitulado "A KIND OF INJECTABLE CARTILAGE REPAIR HYDROGEL AND PREPARATION METHOD THEREOF" refere-se a hidrogéis inj etáveis de ácido hialurônico e gelatina modi ficados para o tratamento e regeneração da cartilagem . Apesar disso , tal documento apresenta algumas di ferenças em relação a presente invenção , como a composição da matri z do hidrogel , as reações envolvidas na formação do hidrogel e o fármaco utili zado . No referido documento , os hidrogéis são fabricados a partir de gelatina metacrilada, sendo o componente maj oritário , e de ácido hialurônico metacrilado , utili zando o Irgacure 2959 como f otoiniciador e luz ultravioleta para induzir a fotoreticulação in si tu . A reticulação quimica é obtida por uma reação radicalar envolvendo os grupos vinilicos de ambos os polímeros . Além disso , plasma rico em plaquetas é adicionado ao hidrogel para acelerar a regeneração de tecido cartilaginoso . Na presente invenção , o hidrogel é formado a partir de ácido hialurônico metacrilado , que é o componente maj oritário da matri z , e de gelatina sul f idrilada . A utili zação de gelatina sul fidrilada resulta em hidrogéis formados por duas reações distintas : a reação radicalar dos grupos vinilicos do ácido hialurônico e a reação tiol-eno dos grupos sul fidrila da gelatina com os grupos metacrilato do ácido hialurônico , o que acelera o processo de geli ficação . Cabe ressaltar ainda que no referido documento não é descrita a utili zação de nanopartí cuias doadoras de NO que promovem a proteção dos grupos doadores de NO durante o processo radicalar de geli ficação , como acontece na presente invenção .

[ 22 ] O documento US 9889226B2 intitulado " PHOTOCROSSLINKED HYALURONIC ACID DERIVATIVES, AND THE PREPARATION PROCESS AND USE THEREOF" refere-se a derivados f otoreticulados de ácido hialurônico (HA) , principalmente na forma de hidrogéis úteis no tratamento intra-articular de osteoartrite e danos à cartilagem . Entretanto , neste documento , a f otoreticulação ocorre por meio da utili zação de um composto fotoreativo derivado de cumarina e propiof enona, que reage com trietilenoglicol , um agente espaçador bi funcional e com os grupos carboxila pendente do ácido hialurônico . Estes compostos modi ficados para conter grupos fotoreativos são posteriormente expostos à luz ultravioleta para a f otoreticulação . Na presente invenção , o hidrogel é formado a partir de ácido hialurônico modificado para conter grupos metacrilato e de gelatina modificada para conter grupos sulfidrila. A utilização de gelatina sulfidrilada leva à hidrogéis formados por duas reações distintas: a reação radicalar entre grupos vinilicos do ácido hialurônico e a reação tiol-eno entre os grupos sulfidrila da gelatina e os grupos metacrilato do ácido hialurônico. Além disso, não há no referido documento a utilização de nanoparticulas doadoras de NO que promovem a proteção dos grupos doadores de NO durante o processo radicalar de gelificação.

[23] O documento EP2353612B1, intitulado "INJECTABLE IN-SITU CROSSLINKED HYDROGEL AND THE PREPARATION METHOD AND USE THEREOF" refere-se a hidrogéis injetáveis reticuláveis in situ compreendendo, entre outros componentes, um ou mais polissacarideos ou proteínas modificados, por exemplo, ácido hialurônico e gelatina. Apesar disso, tal documento apresenta diferenças consideráveis em relação à presente invenção. Por exemplo, no referido documento o processo de gelificação se baseia exclusivamente na oxidação dos grupos tióis, previamente inseridos nas cadeias de ácido hialurônico, sulfato de condroitina e/ou gelatina, por meio de moléculas de oxigênio dissolvidas na solução polimérica com geração de ligações do tipo dissulfeto, uma reação que não está envolvida na presente invenção. Além disso, essa ligação é iniciada na seringa, antes da aplicação, e pode levar até 7 dias para se completar. Os hidrogéis formados no referido documento são descritos como veiculos para a entrega de antibióticos, drogas antitumorais , fatores de crescimento ou corticosteroides . Na presente invenção, o hidrogel é formado rapidamente, em 2 minutos , a partir de ácido hialurônico metacrilado e de gelatina sul fidrilada por meio de duas reações distintas e que ocorrem simultaneamente : a reação radicalar entre grupos vinilicos do ácido hialurônico e a reação tiol-eno entre grupos sul fidrila da gelatina e grupos metacrilato do ácido hialurônico . Além disso , não há descrição em tal documento sobre a utili zação de nanoparticulas doadoras de NO que promovem a proteção dos grupos doadores de NO durante o processo radicalar de geli ficação , como ocorre na presente invenção .

[ 24 ] O documento US 9980977B2 , intitulado "MODIFIED HYAIURONIC ACID POIYMER COMPOSITIONS AND REIATED METHODS" refere-se a um material inj etável de ácido hialurônico reticulado destinado ao tratamento de osteoartrite e entrega de triancinolona acetonida, um corticosteroide . No referido documento , o ácido hialurônico foi modi ficado com divinil sul fona para introdução de grupos vinilicos pendentes , com grau de substituição de 10 % , e na sequência um hidrogel com baixo grau de reticulação foi formado ao reagir o ácido hialurônico modi ficado com poli ( etileno glicol ) ditiol , mediante a formação de ligações de tiol-eno unicamente . O corticosteroide foi previamente adicionado à solução de ácido hialurônico modi ficado para ser aprisionado no hidrogel . As ligações covalentes foram formadas na ausência de f otoiniciadores e incidência de luz , devido à alta reatividade dos grupos sul fidrila . O material foi extrudado e misturado a uma solução salina de ácido hialurônico sem modi ficações químicas para ser inj etado no espaço intra-articular como uma dispersão de hidrogel particulado . [ 25 ] A inj eção deste material , assim como os demais materiais de ácido hialurônico destinados a viscossuplementação , repõem somente as propriedades reológicas do liquido sinovial . Além disso , devido ao baixo grau de reticulação o material é rapidamente eliminado do espaço intra-articular , sendo necessárias repetidas inj eções semanais . A liberação de corticosteroide do hidrogel proporciona efeito antinociceptive imediato , entretanto , seu uso não é prescrito para todos os pacientes devido aos seus efeitos colaterais . Di ferentemente , a presente invenção relata o desenvolvimento de um hidrogel duplamente f otoreticulado in si tu com alto grau de reticulação capaz de suportar a adesão e proli feração celular, sendo constituído por componentes da MEC da cartilagem e capaz de liberar NO . Dessa forma, o material da presente invenção , tem potencial para modular a liberação de mediadores inflamatórios , protegendo a cartilagem do processo de degradação .

[ 26 ] Em resumo , o desenvolvimento de hidrogéis destinados à regeneração de tecido cartilaginoso por meio da f otoreticulação in si tu, bem como o desenvolvimento de plataformas poliméricas para entrega prolongada de NO por meio da incorporação de doadores exógenos j á são de dominio público . Entretanto , não há ainda na literatura cienti fica e/ou patentária, a descrição de hidrogéis f otoreticuláveis in si tu que sej am capazes de liberar NO no espaço intra- articular após a formação do hidrogel . A presente invenção é a primeira a combinar as duas tecnologias , uma vez que a decomposição fotoquimica dos doadores de NO tem sido , até então , uma barreira para a combinação dos métodos . [ 27 ] Além disso , a presente invenção reúne vantagens signi ficativas sobre as demais tecnologias j á descritas , visto que a utili zação da f otoreticulação ín si tu representa uma redução dos efeitos adversos da formação in si tu de hidrogéis , quando comparada com a f otoreticulação termoinduzida, devido à redução da toxicidade do processo . Em especial , a presente invenção apresenta uma solução original para a proteção de doadores de NO em formulações de HA e HA/Gelatina inj etáveis , baseada na inserção quimica dos doadores de NO no interior de nanoparticulas de PLGA funcionali zado com GSNO, de forma a proteger a GSNO, tanto da f otodecomposição durante a f otoreticulação do HA metacrilado e gelatina sul f idrilada, bem como dos radicais livres gerados no processo de fotoreticulação , a partir do f otoiniciador , ao mesmo tempo em que proporciona uma liberação lenta e prolongada de NO das nanoparticulas , governada pela hidrólise da matri z de PLGA que , em seu processo , mobili za as moléculas de GSNO, levando à sua dimerização e liberação de NO . Além disso , os componentes f otoreticuláveis dessas formulações permitem a aceleração do processo de fotoreticulação trazendo benefícios ao procedimento hospitalar . Desta forma, a presente invenção resolve o problema da preservação dos doadores de NO durante o processo de fotoreticulação da matri z de HA/Gelatina, potenciali zando as ações analgésica, anti-inf lamatória e condroprotetora associadas à atenuação da degradação do tecido cartilaginoso , devido às potenciais vantagens da liberação locali zada de NO . Finalmente , a presente invenção combina materiais totalmente biodegradáveis e biocompativeis para o tratamento da osteoartrite e regeneração do tecido cartilaginoso.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[28] A presente invenção se refere a um processo para fabricação de uma solução polimérica injetável duplamente f otoreticulável , capaz de gelificar in situ sob condições fisiológicas e incidência de luz visivel, e de liberar óxido nitrico (NO) de maneira prolongada no espaço intra-articular , de modo a promover a regeneração de tecido cartilaginoso, bem como proporcionar um efeito condroprotetor e anti-inf lamatório em indivíduos acometidos por osteoartrite, sem causar efeitos colaterais como aqueles causados pela administração usual de anti- inf lamatórios não esteroidais. O referido processo compreende as seguintes etapas:

(a) modificação quimica do ácido hialurônico (HA) com metacrilato de glicidila (GMA) para obtenção do hialuronato metacrilado (HAM) ;

(b) modificação quimica da gelatina com N-acetil- homocisteina tiolactona (Cys-SH) para obtenção da gelatina sulfidrilada (Gel-SH) ;

(c) obtenção das nanoparticulas de PLGA doadoras de óxido nitrico (NP-PLGA-GSNO) ; e

(d) obtenção da solução polimérica injetável.

[29] Conforme observado, a solução polimérica proposta na presente invenção é constituída por ácido hialurônico modificado quimicamente para conter grupos vinilicos f otossensiveis , gelatina modificada quimicamente para conter grupos sulfidrila (SH) pendentes e nanoparticulas de PLGA conjugadas com GSNO. As nanoparticulas de PLGA conjugado com GSNO proporcionam proteção da GSNO contra o ataque das espécies radicalares geradas na f otoreticulação dos polímeros. A presença de grupos SH na gelatina funcionalizada proporciona um aumento da velocidade de gelificação.

[30] Após o processo de f otoreticulação e gelificação, a partir da irradiação com luz visível, as nanopartí cuias dispersas na matriz do hidrogel formado passam a liberar óxido nítrico (NO) em um processo lento e prolongado, governado pela velocidade de hidrólise das nanopartí cuias e pela concomitante reação de dimerização da GSNO conjugada ao PLGA.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[31] A Figura 1 apresenta os espectros de ressonância magnética nuclear (RMN) do ácido hialurônico (HA) e do ácido hialurônico modificado (HAM) , bem como a estrutura polimérica do HAM. No espectro do HAM há picos característicos de hidrogénios vinílicos em 5, 68 e 6,10 ppm, que confirmam a incorporação dos grupos metacrilato.

[32] A Figura 2 apresenta os espectros Raman da gelatina pura (Gel) e gelatina modificada (Gel-SH) . No espectro da Gel-SH, a banda de deformação axial em 2567 cri

¹ é atribuída à ligação S-H, comprovando a conjugação de homocisteína tiolactona na cadeia da gelatina.

[33] A Figura 3 apresenta os espectros de infravermelho de reflectância total atenuada com transformada de Fourier (FTIR-ATR) de PLGA e PLGA-GSNO. No espectro de PLGA-GSNO, a banda em 1530 cnf ¹ é atribuída à deformação angular de N-H da amida secundária, o que comprova a incorporação de GSNO na cadeia do PLGA por meio da formação de uma ligação amida. [34] A Figura 4 apresenta em (I) uma criomicrograf ia eletrônica de transmissão (crio-TEM) representativa das nanoparticulas NP-PLGA-GSNO e em (II) a curva de distribuição de tamanho das nanoparticulas obtida a partir da análise de crio-TEM.

[35] A Figura 5 apresenta o gráfico dos tempos de gelificação dos hidrogéis de ácido hialurônico (HHA) , ácido hialurônico contendo Gel-SH (HHAG) e de ácido hialurônico contendo gelatina e nanoparticulas de PLGA-GSNO (HHAGNP) obtidos pelo método de inclinação do tubo. Os hidrogéis contendo gelatina, HHAG e HHAGNP, são formados com um menor tempo de incidência de luz (1,7 vezes menor) em relação ao hidrogel HHA.

[36] A Figura 6 apresenta os hidrogéis HHA, HAG e HAGNP durante o ensaio de tempo de gelificação, antes (tempo 0) , durante (tempos de 120 e 203 s) e após a incidência de luz visivel. A coluna da direita representa as fotografias dos hidrogéis após sua remoção do tubo, demonstrando que são materiais autosuportados .

[37] A Figura 7 apresenta em (I) a curva de liberação de NO em tempo real, medida por quimiluminescência, de uma suspensão de nanoparticulas liofilizadas (NP-PLGA-GSNO) em tampão fosfato (pH 7,4) durante 420 minutos e, em (II) a curva de liberação cumulativa de NO.

[38] A Figura 8 apresenta em (I) a curva de liberação de NO em tempo real medida por quimiluminescência do hidrogel HHAGNP durante 40 minutos e, em (II) a curva de liberação cumulativa de NO por 40 minutos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [ 39 ] A presente invenção se refere a um processo de obtenção de solução polimérica inj etável duplamente f otoreticulável , capaz de geli ficar in si tu sob condições fisiológicas e incidência de luz visivel , e de liberar óxido nitrico (NO) de maneira prolongada no espaço intraarticular, de modo a promover a regeneração de tecido cartilaginoso , bem como proporcionar um efeito condroprotetor e anti-inf lamatório em indivíduos acometidos por osteoartrite .

[ 40 ] Conforme será observado , a denominação "hialuronato metacrilado" (HAM) se refere ao ácido hialurônico modi ficado quimicamente por metacrilato de glicidila para conter grupos vinilicos pendentes ; a denominação "gelatina sul f idrilada" ( Gel-SH) se refere à gelatina modi ficada quimicamente por N-acetil-homocisteina tiolactona para conter grupos sul fidrila pendentes , capazes de formar ligações do tipo tiol-eno com os grupos vinilicos do HAM; a denominação genérica "nanoparticula nitrosada" (NP-PLGA-GSNO) , se refere às nanoparticulas doadoras de óxido nitrico (NO) obtidas a partir da nanoprecipitação de poli ( ácido láctico-co-glicólico ) conj ugado com S- nitrosoglutationa ( PLGA-GSNO) .

[ 41 ] O referido processo de obtenção da solução polimérica compreende as seguintes etapas :

( a ) modi ficação quimica do ácido hialurônico (HA) com metacrilato de glicidila ( GMA) para obtenção do hialuronato metacrilado (HAM) ;

(b ) modi ficação quimica da gelatina com N-acetil- homocisteina tiolactona ( Cys-SH) para obtenção da gelatina sul fidrilada ( Gel-SH) ; (c) obtenção das nanoparticulas de PLGA doadoras de óxido nítrico (NP-PLGA-GSNO) ; e

(d) obtenção da solução polimérica injetável.

[42] As referidas etapas serão mais bem detalhadas a seguir.

Modificação química do ácido hialurônico (HA) com metacrilato de glicidila (GMA) para obtenção do hialuronato metacrilado (HMA)

[43] Inicialmente, o ácido hialurônico (HA) , cu a massa molar pode variar de 2kDa a 3 MDa, foi dissolvido em água ultrapura para obtenção de uma solução de concentração de 0,5 a 2,0 % m/v, preferencialmente 1,0 % m/v, utilizando agitação magnética na faixa de 900 a 1500 rpm, preferencialmente 1500 rpm, por um período de 5 a 12 horas, preferencialmente 12 horas.

[44] Em seguida, a solução de ácido hialurônico (HA) foi aquecida a uma temperatura na faixa de 50 a 55 °C, preferencialmente 55 °C, onde o pH foi ajustado para 3,5 utilizando ácido clorídrico (1 mol IH ¹ ) .

[45] Metacrilato de glicidila (GMA) foi adicionado à solução de HA para se obter uma concentração de GMA na faixa de 1,0 a 7,0 % m/v, preferencialmente 3,5 % m/v, resultando em uma solução de GMA e HA de razão molar GMA:HA na faixa de 5:1 a 9:1, preferencialmente 9:1, onde o número de mols de HA se refere ao número de mols da unidade repetitiva, ou mero.

[46] O meio reacional foi mantido a uma temperatura na faixa de 50 a 55 °C, preferencialmente 55 °C, sob agitação magnética na faixa de 1000 a 1500 rpm, preferencialmente 1500 rpm, por um período de 24 horas, em seguida transferido para saco de diálise de celulose (cut off de 12 a 14 kDa) e dialisado contra água ultrapura por urn periodo minimo de 72 h.

[47] Subsequentemente, foi realizada a secagem do conteúdo do saco de diálise. Preferencialmente, a secagem é realizada por congelamento rápido em nitrogênio liquido, seguido de liofilização por um periodo de pelo menos 48 h utilizando-se uma pressão na faixa de 40 a 60 mTorr (5,33 a 7,99 Pa) , preferencialmente 50 mTorr (6, 67 Pa) . Entretanto, tal procedimento pode ser substituído por congelamento lento em congeladores de refrigeradores convencionais. Cabe ressaltar que a utilização de métodos de secagem lenta, ou que envolvam aquecimento, como rotaevaporação, podem prejudicar a estabilidade e a ressolubilização do HAM.

[48] Conforme observado, a inserção de grupos vinilicos na cadeia polimérica do ácido hialurônico é feita utilizando-se o metacrilato de glicidila (GMA) . Este reagente é amplamente empregado para modificação de macromoléculas . A reação com GMA pode acontecer por transesterif icação ou abertura do anel do grupo epóxi . O mecanismo é modulado pelo pH do meio reacional, quando a água é utilizada como solvente. Na presente invenção, a reação foi realizada em meio ácido. Desta forma, o GMA reagiu com os grupos hidroxila e carboxila pendentes da estrutura do HA por meio da abertura do anel do grupo epóxi .

Modificação quimica da gelatina com N-acetil- homocisteina tiolactona (Cys-SH) para obtenção da gelatina sulfidrilada (Gel-SH)

[49] Inicialmente, grânulos de gelatina, foram hidratados em tampão carbonato (pH 10,0) , por um período de 10 a 12 horas, preferencialmente 12 horas. Em seguida, a pasta formada pelos grânulos hidratados foi aquecida a uma temperatura de 37 a 55 °C, preferencialmente 40 °C, por um período de 3 a 5 horas, preferencialmente 5 horas, ou até a completa solubilização da gelatina, gerando uma solução de gelatina de concentração entre 10 e 15 % m/v, preferencialmente 10 % m/v.

[50] Ainda, ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) foi adicionado à solução gelatina em quantidade suficiente para se obter uma concentração final de EDTA na faixa de 0,01 a 0,03 % m/v, preferencialmente 0,03 % m/v. N-acetil-homocisteína tiolactona (Cys-SH) também foi adicionada à solução de gelatina, em quantidade suficiente para se obter uma concentração de Cys-SH na faixa de 1,9 a 17,0 % m/v, preferencialmente 11,5 % m/v, referente a uma razão molar Cys-SH : gelatina na faixa de 1:1 a 6:1, preferencialmente 6:1, onde o número de mols de gelatina se refere ao número de mols da unidade repetitiva, ou mero.

[51] O meio reacional foi mantido a uma temperatura na faixa de 40 a 50 °C, preferencialmente 40 °C, sob agitação magnética na faixa de 1000 a 1500 rpm, preferencialmente 1500 rpm, por um período de 3 a 5 horas, preferencialmente 3 horas.

[52] Para a purificação, o meio reacional foi diluído utilizando-se água destilada até que o pH do meio reacional estivesse na faixa de 6,0 a 7,0, preferencialmente 7,0 e transferido para um saco de diálise de celulose (cut off 12 a 14 kDa) , onde foi dialisado contra água ultrapura por um período mínimo de 48 h a uma temperatura na faixa de 37 a 50 °C, preferencialmente 40 °C.

[53] Subsequentemente, foi realizada a secagem do conteúdo do saco de diálise de celulose, preferencialmente por congelamento rápido em nitrogênio liquido seguido de liofilização por um periodo de pelo menos 48 h utilizando- se uma pressão na faixa de 40 a 60 mTorr (5,33 a 7,99 Pa) , preferencialmente 50 mTorr (6, 67 Pa) . Cabe ressaltar que o congelamento rápido pode ser substituído por congelamento lento em congelador de refrigerador convencional. Entretanto, a utilização de métodos de secagem lenta, ou que envolvam aquecimento, como rotaevaporação, podem prejudicar a estabilidade e resolubilização da Gel-SH.

Obtenção das nanoparticulas de PLGA doadoras de óxido nitrico (NP-PLGA-GSNO)

[54] Primeiramente, foi preparada uma solução em solvente dimetil sulfóxido (DMSO) contendo: poli (ácido láctico-co-glicólico ) (PLGA) em quantidade suficiente para a obtenção de uma solução de PLGA na faixa de 16,0 a 17,0 % m/V, preferencialmente 16, 6 % m/v; hidroxisuccinimida (NHS) em quantidade suficiente para a obtenção de uma solução de NHS na faixa de 2,0 a 2,5 % m/v, preferencialmente 2,2 % m/v; l-etil-3- ( 3-cloridrato ) dimetilaminopropil carbodiimida (EDC) em quantidade suficiente para a obtenção de uma solução de EDC na faixa 3,5 a 4,0 % m/v, preferencialmente 3,8 % m/v, e S-nitrosoglutationa (GSNO) , em quantidade suficiente para a obtenção de GSNO na faixa 6,5 a 7,0 % m/v, preferencialmente 6,7 % m/v.

[55] Em seguida, a mistura reacional foi mantida sob agitação magnética na faixa de 300 a 500 rpm, preferencialmente 500 rpm, à temperatura ambiente por um periodo de 20 a 24 horas, preferencialmente 24 horas.

[56] O sólido resultante (PLGA-GSNO) foi separado do meio reacional por precipitação, através da adição de água destilada gelada a uma temperatura na faixa de 4 a 10 °C, preferencialmente 4 °C, seguida de centrifugação utilizando-se uma rotação entre 3.000 e 5.000 rpm, preferencialmente 5.000 rpm para sedimentação do sólido. O sobrenadante foi descartado. Este procedimento foi repetido de 2 a 5 vezes, preferencialmente 3 vezes, para aumento do grau de purificação do sólido resultante, PLGA-GSNO.

[57] O precipitado obtido na centrifugação foi seco utilizando-se nitrogênio liquido e liofilizado por um periodo de pelo menos 24 h utilizando uma pressão na faixa de 40 a 60 mTorr (5,33 a 7,99 Pa) , preferencialmente 50 mTorr (6, 67 Pa) . O PLGA-GSNO resultante foi dissolvido em diclorometano (DCM) de forma a obter uma solução com concentração de PLGA-GSNO na faixa de 2,0 a 2,5 % m/v, preferencialmente 2,5 % m/v.

[58] Uma solução aquosa de poli (álcool vinilico) (PVA) de massa molar entre 8kDa e 15 kDa preferencialmente lOkDa e grau de hidrólise superior a 80%, preferencialmente 98%, foi preparada com concentração na faixa de 0,5 a 1,0 % m/v, preferencialmente 1,0 % m/v. A solução de PLGA-GSNO em DCM, preparada anteriormente, foi adicionada à solução de PVA em uma temperatura na faixa de 4 a 10 °C, preferencialmente 4 °C, e na razão volumétrica de 1 volume de solução de PLGA-GSNO para cada 5 volumes de solução de PVA. Em seguida a mistura foi sonicada por um periodo de 60 a 90 s, preferencialmente 90 s. [59] Cabe ressaltar que o PVA pode ser substituído por copolímeros em bloco de poli (etileno glicol ) -co-poli (propileno glicol ) -co-poli ( etileno glicol) da classe dos Pluronics, por exemplo, Pluronic F68 ou Poloxamer 188. Entretanto, a substituição do estabilizante, PVA, pode afetar diretamente o tamanho das partículas e a estabilidade das suspensões. Sabe-se que o tamanho das partículas é inversamente proporcional ao tempo e amplitude de sonicação. Uma sonicação em excesso pode provocar a decomposição da GSNO devido ao aquecimento.

[60] Após a sonicação, DCM foi removido a vácuo e na sequência a suspensão de nanopartí cuias foi centrifugada a uma rotação de 5.000 a 10.000 rpm, preferencialmente 10.000 rpm, e o sobrenadante descartado. O material sedimentado na centrifugação foi resuspendido em água ultrapura gelada (temperatura entre 4 e 10 °C preferencialmente 4 °C) e novamente centrifugado como descrito acima por 2 vezes para remover o material não reagido .

[61] Por fim, o precipitado obtido na centrifugação foi seco por congelamento rápido em nitrogênio líquido, seguido de liofilização por um período de pelo menos 24 h utilizando uma pressão na faixa de 40 a 60 mTorr (5,33 a 7,99 Pa) , preferencialmente 50 mTorr (6, 67 Pa) .

Obtenção da solução polimérica injetável

[62] Inicialmente, uma solução de gelatina sulfidrilada (Gel-SH) foi preparada em tampão fosfato (pH 7,4) , em uma concentração entre 0,01 e 1,2 % m/v, preferencialmente 0, 6 % m/v, utilizando-se agitação magnética de 900 a 1500 rpm, preferencialmente 1500 rpm e temperatura na faixa de 37 a 50 °C, preferencialmente 40 °C.

[63] Em seguida, ácido hialurônico metacrilado e liofilizado (HAM) foi adicionado à solução de Gel-SH em quantidade suficiente para obter uma solução com concentração de HAM na faixa de 1,2 a 2,0 % m/v, preferencialmente 2,0 % m/v que foi mantida sob agitação magnética na faixa de 1000 a 1500 rpm, preferencialmente 1500 rpm por um periodo de no minimo 5 horas.

[64] Adicionalmente, uma suspensão de nanoparticulas nitrosadas (NP-PLGA-GSNO) foi preparada em tampão fosfato (pH 7,4) com concentração de NP-PLGA-GSNO na faixa de 0,75 a 1,5 % m/v, preferencialmente 1,5 % m/v, utilizando-se banho de ultrassom à temperatura ambiente, por um periodo de 5 a 10 minutos, preferencialmente 5 minutos. Essa suspensão foi imediatamente adicionada à solução de Gel-SH e HAM sob agitação magnética na faixa de 1000 a 1500 rpm, preferencialmente 1500 rpm, na proporção de 1 volume de suspensão (NP-PLGA-GSNO) para 4 volumes de solução de polímeros (Gel-SH + HAM) . O sistema foi mantido sob agitação por um periodo minimo de 10 minutos.

[65] As concentrações finais da solução de Gel- SH, HAM e NP-PLGA-GSNO em solvente tampão fosfato (0,01 mol L ^-1 , pH 7,4) são: de 1,0 a 1,5 % m/v, preferencialmente 1,5 % m/v de hialuronato metacrilado (HAM) ; de 0,008 a 1,0 % m/v, preferencialmente 0,5 % m/v de gelatina sulfidrilada (Gel-SH) ; de 0,20 a 0,45 %, preferencialmente 0,30 % m/v de nanoparticulas doadoras de óxido nitrico (NP-PLGA-GSNO) , o que corresponde a uma proporção de 10 a 30 %, preferencialmente 20 % m/m de nanoparticulas nitrosadas em relação a massa de HAM utilizada.

[66] O f otoiniciador hidrossolúvel fenil-2,4, 6- trimetilbenzoilfosf inato de litio (LAP) , que sofre homólise sob irradiação com luz de comprimento de onda de 405 nm, foi previamente dissolvido em 200 pL de tampão fosfato (pH 7,4) e adicionado à solução contendo Gel-SH, HAM e NP-PLGA- GSNO em uma concentração de LAP na faixa de 0,1 a 0,5 % m/v, preferencialmente 0,5 % m/v de modo a obter a solução polimérica injetável final.

[67] O processo de f otoreticulação ocorre através de um mecanismo radicalar na presença de f otoiniciador e envolve a formação de uma rede tridimensional com dupla reticulação, onde são formadas ligações químicas entre os carbonos vinilicos das ramificações do HA modificado (HA- HA) e entre os carbonos vinilicos das ramificações do HA modificado e os grupos tióis presentes na gelatina sulfidrilada (HA-Gel) . A ligação formada entre o carbono vinilico e o grupo tiol ocorre pela reação de tiol-eno que apresenta rápida taxa de reação em virtude da baixa energia de ativação para a abstração do hidrogênio do grupo sulfidrila (88 kcal mol ^-1 ) , que contribui para a aceleração do processo de gelificação, que pode ocorrer, na presente invenção, com apenas 2 minutos de incidência de luz visivel. Ressalta-se que o f otoiniciador LAP pode ser substituído por Irgacure 2959 ou qualquer outro que sofra f otodecomposição na faixa de 365 a 405 nm e seja solúvel em água. Entretanto, a substituição do f otoiniciador pode afetar diretamente o tempo de f otoreticulação . Além disso, o aumento da concentração de f otoiniciador aumenta a densidade de reticulação do hidrogel, tornando-o mecanicamente mais resistente.

EXEMPLOS DE CONCRETIZAÇÃO

[68] Para comprovar a obtenção da solução polimérica injetável f otoreticulável , os seguintes experimentos foram realizados.

EXEMPLO 1 - Modificação quimica do ácido hialurônico

[69] Em um balão de fundo redondo de 500 mL foram adicionados 200 mL de água ultrapura e 2,0 g de HA (1,0% m/v) . A solução foi agitada por 6 h a 1500 rpm por meio de um agitador magnético. Após completa solubilização, a temperatura foi elevada para 55 °C e o pH do meio foi ajustado para 3,5 com adição, gota-a-gota, de HC1 (1 mol L~L) . Em seguida, foram adicionados 6,5 mL de metacrilato de glicidila e a reação foi mantida por 24 h sob agitação a 1500 rpm. Decorrido este tempo, o produto foi dialisado em saco de diálise de celulose (cut off 12 a 14 kDa) contra água ultrapura por 72 h. Na sequência, o material foi congelado com nitrogênio liquido e liofilizado por 48 h.

[70] A modificação quimica do HA foi comprovada por análise de RMN de ¹ H. Na Figura 1 estão os espectros do HA e do HA modificado (HAM) . Os espectros foram obtidos em um espectrômetro Bruker AVANCE operando em 400 MHz . Para as análises, 15 mg de HA em pó e 15 mg de HAM liofilizado foram solubilizados separadamente em 700 pL de D2O. O grau de substituição também foi obtido por meio dos espectros de RMN integrando-se os picos dos hidrogénios vinilicos do grupo metacrilato (6,10 e 5, 68 ppm) e os picos dos hidrogénios metilicos do grupo n-acetil do ácido hialurônico (1,90 ppm) . De acordo com a Equação 1, o grau de substituição encontrado foi de 75%.

Grau de substituição (%) :

[3 (Ig,io + Is,6s) / 2 (li, 9o) J * 100 Equação (1)

EXEMPLO 2 - Modificação quimica da gelatina

[71] Em um balão de fundo redondo de 250 mL, 5 g de grânulos de gelatina foram hidratados em 50 mL de tampão carbonato (pH 10,0) sob agitação, durante a noite. Após a formação de uma pasta homogênea, a temperatura foi elevada para 40 °C para a completa solubilização da gelatina. Adicionou-se 0,015 g de ácido etilenodiaminotetraacético

(EDTA) e 3,81 g de N-acetil-homocisteina tiolactona à solução. A reação foi mantida a 40 °C por 3 h sob agitação magnética a 1500 rpm. Em seguida, a mistura reacional foi diluida em 100 mL de água ultrapura, dialisada em saco de diálise de celulose por 48 h a 40 °C e liofilizada.

[72] A inserção de grupos sulfidrila na cadeia polimérica da gelatina foi comprovada por espectroscopia Raman. Na Figura 2 estão os espectros da gelatina com e sem modificação quimica. As análises foram realizadas em espectrômetro Xplora One 785 nm da Horiba na faixa espectral de 4000-400 cri ¹ . Cada espectro foi obtido com tempo de exposição de 60 s e 2 varreduras, utilizando um laser de 785 nm.

[73] Os grupos sulfidrila foram quantificados por técnica colorimétrica utilizando o reagente de Ellman (ácido 5, 5' -ditiol-bis (2-nitrobenzóico) ) . Para isto, inicialmente preparou-se uma solução estoque composta por 4,0 mg de reagente de Ellman e 1,0 mL de tampão fosfato (pH 8,0) contendo 1,0 mmol L ^-1 de EDTA. Para o preparo da solução de gelatina sulf idrilada, 30,0 mg do material liofilizado foram adicionadas em 30,0 mL de água ultrapura, mantendo a solução a 40 °C por 2 h sob agitação. Após solubilização, 250 pL desta solução foram incubados por 15 min com 2,5 mL de tampão e 50 pL da solução estoque. Decorrido este tempo, a absorbância foi medida em 412 nm em um espectrof otômetro (Hewlett Packard/ Agilent 8453) .

[74] As análises foram feitas em triplicata. O procedimento realizado para a obtenção da curva de calibração foi semelhante ao descrito acima, apenas substituindo as soluções de gelatina modificada por soluções de cloridrato de cisteina monohidratado em solução

_ C _ -1 tampão com concentrações variando de 8.10 mol L a 11 x 10~ ⁴ mol L ^-1 . A concentração de grupos sulfidrila introduzidos na estrutura da gelatina foi de 9,4 pmol mg ^-1 .

EXEMPLO 3 - Modificação quimica do PLGA

[75] Em um balão de fundo redondo de 50 mL foram adicionados 2 g de PLGA, 0,268 g de N-hidroxisuccinimida (NHS) , 0,452 g de l-etil-3- ( 3-cloridrato ) dimetilaminopropil carbodiimida (EDC) e 0,8 g de GSNO. Os reagentes foram dissolvidos em 12 mL de dimetil sulfóxido (DMSO) . A solução foi agitada a 500 rpm em agitador magnético por 24 h à temperatura ambiente. O produto formado (PLGA-GSNO) foi precipitado e purificado pela adição de água ultrapura gelada seguida de centrifugação a 5000 rpm. A GSNO livre foi removida por sucessivas lavagens com água ultrapura gelada seguida de centrifugação. O material modificado foi liofilizado por 24 h. A modificação quimica foi comprovada por análise de FTIR-ATR (Figura 3) . Os espectros de PLGA, GSNO e PLGA-GSNO foram obtidos no espectrômetro Gary 660 da Agilent, entre 4000 e 400 cnf ¹ com urn total de 64 varreduras e 4 cut ¹ de resolução.

[76] Após a etapa de liof ilização, 100 mg de PLGA- GSNO foram dissolvidos em 4 mL de diclorometano (DCM) e a solução de PLGA-GSNO foi gotejada em 20 mL de solução gelada de PVA 1,0% (m/v) . A mistura foi sonicada por 90 s com 40 % de amplitude máxima no Sonicador VCX 500 da Sonics Vibra-cell. O solvente DCM foi evaporado a vácuo à temperatura ambiente. Em seguida, a dispersão de nanoparticulas foi centrifugada duas vezes, com remoção do sobrenadante e adição de água gelada, e liofilizadas por 24 h. As nanoparticulas formadas foram denominadas NP-PLGA-GSNO .

[77] A distribuição de tamanho das nanoparticulas de NP-PLGA-GSNO foi determinada por dispersão dinâmica de luz (DLS) utilizando-se um medidor de espalhamento de luz (Zetasizer Nano ZS da Malvern) , as análises foram feitas em triplicata a 25 °C com tempo de equilíbrio de 120 s, e também por criomicroscopia eletrônica de transmissão utilizando um microscópio Talos Árctica ( Thermofísher) operando a 200 kV. Na Figura 4 (1) é apresentada uma micrografia representativa das nanoparticulas, obtida por crio-TEM, e na Figura 4 (11) sua distribuição de tamanho obtida por Criomicroscopia Eletrônica de Transmissão (Crio- ME ou Cryo-EM) . As nanoparticulas formadas apresentaram diâmetro na faixa de 140 a 210 nm.

EXEMPLO 4 - Obtenção da solução polimérica injetável

[78] Em um frasco âmbar de 10 mL adicionou-se gelatina sulfidrilada liofilizada e 4 mL de tampão fosfato (pH 7,4) de forma a obter uma solução de 0, 6 % m/v de Gel- SH. A temperatura foi elevada para 40 °C e a solução foi mantida sob agitação magnética até a completa solubilização . Em seguida, a temperatura da solução foi reduzida até atingir a temperatura ambiente e, na sequência, o HAM liofilizado foi adicionado, de modo a obter uma solução com concentração de 1,9 % m/v de HAM, mantendo-se a agitação. Após a homogeneização da solução, uma suspensão de nanoparticulas de PLGA-GSNO foi adicionada .

[79] Para o preparo da suspensão, em um microtubo Eppendorf® de 2 mL foram adicionadas as nanoparticulas liofilizadas (20% em massa em relação à massa de HAM utilizada) e 1 mL de tampão fosfato (pH 7,40) . As nanoparticulas foram dispersas com auxilio de um banho ultrassónico por 5 min à temperatura ambiente.

[80] Após a inserção das nanoparticulas na solução polimérica, e homogeneização, as concentrações finais de Gel-SH, HAM e NP-PLGA-GSNO foram respectivamente de 0,5 % m/v, 1,5 % m/v e 0,30% m/v. A esta solução adicionou-se, 0,5% (m/v) do f otoiniciador LAP ( f enil-2 , 4 , 6- trimetilbenzoilfosf inato de litio) . O f otoiniciador foi previamente solubilizado em 200 pL de água ultrapura e adicionado à solução polimérica com auxilio de uma micropipeta. O tempo de gelificação dos hidrogéis foi obtido pelo método de inclinação do tubo. Para o ensaio, 0,5 mL de cada solução precursora dos hidrogéis foi adicionado em um tudo de ensaio de 9 mm de diâmetro e o tubo foi irradiado com luz visivel. Nesse teste, o tempo para a conversão da solução em hidrogel foi cronometrado e o tempo de gelificação foi caracterizado pelo exato momento em que não havia mais fluidez da solução pelas paredes do tubo, o ensaio foi realizado em quadruplicata . O tempo médio de gelificação está na Figura 5 e as fotografias das soluções antes e depois da incidência de luz estão na Figura 6. Neste ensaio foram produzidos hidrogéis de ácido hialurônico (HHA) , ácido hialurônico com gelatina (HHAG) e ácido hialurônico com gelatina e nanoparticulas de PLGA- GSNO (HHAGNP) .

EXEMPLO 5 - Liberação de NO

[81] A liberação de NO das nanoparticulas de PLGA-GSNO e dos hidrogéis contendo NP-PLGA-GSNO foi acompanhada por quimiluminescência em um analisador de oxido nitrico Sievers 2801, operando com pressão de nitrogênio de 6,0 psig e pressão de oxigênio de 8,0 torr, a fim de comparar a liberação de NO a partir das nanoparticulas livres e aprisionadas nos hidrogéis. A análise de NP-PLGA-GSNO livre foi realizada a partir de 10 mg de material liofilizado suspenso em tampão fosfato (pH 7,4) . Para a análise do hidrogel, uma solução polimérica injetável constituída por 1,5 % m/v de HAM, 0,5 % m/v de Gel-SH e 0,3 % m/v de NP-PLGA-GSNO foi irradiada com luz visivel por 2 minutos, formando um hidrogel cilíndrico com 1 cm de altura e 1 cm de diâmetro. Os materiais foram adicionados ao frasco térmico do analisador, contendo 10 mL de tampão fosfato (pH 7,4) e mantidos a 37 °C. Os dados de liberação de NO em tempo real e NO cumulativo das nanoparticulas e do hidrogel estão nas Figuras 7 e 8, respectivamente. Os valores de liberação cumulativa de NO para NP-PLGA-GSNO e HHAGNP foram de 13 pmol mg ^-1 e 0,048 pmol mg ^-1 , respectivamente.

[82] A principal inovação da presente invenção consiste na preservação da capacidade de liberação de NO dos hidrogéis duplamente f otoreticulados . A utili zação de nanoparticulas poliméricas que contêm doadores de NO conj ugados diretamente em sua cadeia conferiu fotoproteção aos grupamentos S-nitrosotióis , responsáveis por promover a liberação de NO . Além disso , a combinação de HAM com Gel-SH fez com que , além das ligações cruzadas formadas a partir da quebra da ligação vinilica, fossem formadas também ligações cruzadas do tipo tiol-eno que , devido à baixa energia de ativação , permitiram a redução do tempo de exposição à luz , auxiliando na preservação dos grupamentos

S-nitrosotióis .