磷 (P)是生长的必需元素， 常规动物饲料例如谷粒、 油粕饼、 和来源于种子 的副产品中发现的大量的磷以植酸的分子中共 价结合的磷酸酯形式存在。 对于 非反刍动物， 这种形式的磷的生物利用度通常非常低， 例如家禽和猪， 因为它 们缺乏从植酸分子中分离出无机磷的消化酶。 注意到非反刍动物不能利用植酸的几个重要后 果， 例如， 为了满足动物对 磷的营养需要， 加入无机磷 （例如， 磷酸二氢钙、 脱氟磷酸盐） 或动物产品 (例如， 肉类和骨粉、 鱼粉） 产生了花费。 另外， 植酸能结合或螯合胃肠道中 的许多矿物质 （例如， 钙、 锌、 铁、 镁和铜） ， 因此使得所述矿物质不能被吸 收。 此外， 饲料中的大部分植酸经过胃肠道， 排泄物中的磷含量提高了， 这导 致增加了环境中的生态学的磷负担。 微生物的植酸酶作为饲料添加剂改善了典型的 非反刍动物饲料中植酸磷的 生物利用率。 结果是向动物饲料中添加无机磷减少了， 排泄物中的磷水平也降 低了。 除了饲料添加剂之外， 植酸酶还可以用于含量低的植酸钙镁饲料组分 的 生产。 尽管植酸酶有上述用途的优点， 将其添加至动物包括人类的食料中的优点 也是公知的， 令人惊讶的是很少有已知的植酸酶得到广泛接 受的应用于饲料、 淀粉液化和醇发酵工业中， 其原因是酶的性能和成本不能满足应用环境的 要 求。 如果要使植酸酶在工业应用中引起广泛关注， 其必须满足许多酶标准。 较 重要的酶标准包括高的比活性、 低的 pH最适度、 对胃肠道蛋白酶的耐受和热 稳定性， 热稳定性是植酸酶作为饲料酶成功应用和淀粉 液化中最重要的前提条 件之一， 因为在饲料和， 或工艺中植酸酶暴露于升高的温度。 例如， 在饲料造 粒工艺中温度在 70到 95°C之间， 在淀粉液化工艺中温度在 75到 12CTC之间。 来自大肠杆菌的植酸酶 appA 基因的序列由 Dassa 等 （ J.Bact.P5497- 5500,1990)公开于 1990年。 与曲霉来源的植酸酶相比， 大肠杆菌植酸酶在比活 性上具有明显的优越性， 其比活性是黑曲霉植酸酶的 30-40倍以上， 但是热稳 定性差限制了其在饲料和淀粉糖工业的广泛应 用。 基于多个固有的特性， 大肠 杆菌植酸酶代表了一个很好的开端， 从此为不同的商业应用开始了热稳定植酸 酶的诱变方案， 本发明的目的是提供具有修饰的， 优选改良的温度性质的植酸 酶。 此类性质的非限定性实例为热稳定性和最适反 应温度。 发明目的 本发明的一个目的是提供具有植酸酶活性的替 代性多肽 （植酸酶） 和编码 所述多肽的多核苷酸。 本发明的大肠杆菌植酸酶变体与亲本植酸酶相 比呈现修 饰的或改变的， 优选改良的性质。 例如： 稳定性 （如酸碱定性， 热稳定性， 蒸 汽稳定性， 造粒稳定性和 /或蛋白酶稳定性， 特别是胃蛋白酶稳定性） ， 最适 反应温度， pH特性， 比活性， 在动物饲料中的性能。

发明概述

根据本发明的技术方案， 所述植酸酶是编码植酸酶的突变的 DNA序列的 表达产物， 突变的 DNA序列衍生自大肠杆菌植酸酶 appA。 根据本发明的具体 实施方式， 涉及产生变体植酸酶的方法， 所述变体植酸酶与 SEQ ID NO:2具有 至少 70%—致性， 并与 SEQ ID NO:2相比包含至少一个或多个脯氨酸的引入， 所述至少一个或多个脯氨酸的引入位置 ： A) S80P, B) S151P, C) T161P, D) N176P, E) S187P, 和 F) A380P。 其中 A指第 80位氨基酸的位置引入脯氨酸， B指第 151位氨基酸的位置引入脯氨酸， C指第 161位氨基酸的位置引入脯氨 酸， D指第 176位氨基酸的位置引入脯氨酸， E指第 187位氨基酸的位置引入 脯氨酸， F指第 380位氨基酸的位置引入脯氨酸。 根据本发明的技术方案， 第一脯氨酸引入优选在位置第 80位的丝氨酸残基 的位置； 第二脯氨酸引入优选在位置第 151位的丝氨酸残基的位置； 第三脯氨 酸引入优选在位置第 161位的苏氨酸残基的位置； 第四脯氨酸引入优选在位置 第 176位的天冬酰胺残基的位置， 第五脯氨酸引入优选在位置第 187位的丝氨 酸残基的位置； 第六脯氨酸引入优选在位置第 380位的丙氨酸残基的位置。 位置编号指 SEQ ID NO:2中的位置编号。 一致性百分比如段落 "植酸酶多 肽， 一致性百分比" 中所述确定。 根据本发明的实施方式， 引入的脯氨酸的数量是 2， 3， 4， 5， 和 /或 6。 其中 A意指 S80P， B 意指 S151P, C意指 T161P, D意指 N176P, E意指 S187P, F意指 A380P。 当引入的脯氨酸的数量是 2时， 可构建下述位置的组合： A+B， A+C， A+D， A+E， A+F, B+C， B+D， B+E， B+F, C+D， C+E， C+F, D+E， D+F, 禾口 E+F。 当引入的脯氨酸的数量是 3 时， 可构建下述位置的组合： A+B+C , A+B+D , A+B+E , A+B+F , A+C+D , A+C+E , A+C+F , A+D+E , A+D+F , A+E+F , B+C+D , B+C+E , B+C+F , B+D+E , B+D+F , B+E+F , B+E+G , C+D+E, C+D+F, C+E+F, 禾口 D+E+F。 当引入的脯氨酸的数量是 4时， 可构建下述位置的组合： A+B+C+D , A+B+C+E， A+B+C+F， A+B+D+E， A+B+D+F， A+B+E+F， A+C+D+E， A+C+D+F , A+C+E+F , A+D+E+F , B+C+D+E， B+C+D+F , B+C+E+F , B+D+E+F, 禾口 C+D+E+F。 当引入的脯氨酸的数量是 5时， 可构建下述位置的组合： A+B+C+D+E, A+B+C+D+F, A+B+C+E+F, A+B+D+E+F, A+C+D+E+F, 禾口 B+C+D+E+F。 当引入的脯氨酸的数量是 6 时， 可构建下述位置的组合： 本发明的方法可提供具有改良性质的植酸酶变 体， 所述性质如热稳定性， 热活性稳定性， 蒸汽稳定性， 造粒稳定性， 酸稳定性， pH特性， 和 I或蛋白酶 稳定性， 特别是胃蛋白酶稳定性， 比活性， 底物特异性， 最适反应温度， 在动 物饲料中的性能 （如改良的植酸 （盐） 释放和 /或降解） 。 由本发明提供的变 体呈现特别改良的热性质， 如热稳定性、 热活性稳定性、 最适反应温度、 造粒 稳定性或在动物饲料中的改良的性能。

本发明因此涉及具有改良的热性质的植酸酶变 体， 所述热性质如热稳定 性， 酸稳定性， 最适反应温度， 抗蛋白酶降解的稳定性和 /或造粒稳定性。 本发明进一步涉及包含编码上述植酸酶变体的 核苷酸序列的多核苷酸， 包 含所述多核苷酸可操作地连接于一个或多个指 导所述多肽在表达宿主中产生的 调控序列的核酸构建体， 包含此种核酸构建体的重组表达载体， 和包含核酸构 建体和 /或表达载体的重组宿主细胞。 在另一方面， 本发明涉及分离的编码本发 明所述植酸酶变体的 DNA和包括所述 DNA的表达载体。 本发明进一步涉及产生所述植酸酶变体的方法 ， 包括：

(a)培养宿主细胞， 以产生包含所述植酸酶的上清； 和

(b)回收所述植酸酶。 在另一方面， 本发明涉及大肠杆菌的具有改良的植酸酶特性 的变体。 在一 个实施方案中， 改良的植酸酶特性是相比于天然大肠杆菌增加 的热稳定性。 本发明进一步涉及通过将上述植酸酶变体添加 至饲料而改良动物饲料的营 养价值的方法。 在另一方面， 本发明涉及包含具有植酸酶活性的蛋白质的酶 组 合物， 其中酶组合物用于商业应用。 在一个实施方案中， 该酶组合物是动物饲 料组合物。 在另一个实施方案中， 该酶组合物可用于淀粉水解 （如液化） 工 艺。

发明内容

本发明的方法可用于构建任何野生型或变体植 酸酶的变体。 根据本申请， 植酸酶是具有植酸酶活性的多肽， 即催化植酸盐 （肌醇六磷酸盐） 水解成 （1) 肌醇和 /或 （2) 它的单、 二、 三、 四和 /或五磷酸盐和 （3) 无机磷酸盐的酶。

植酸酶活性是以国际酶活单位 U测定的， 一个 U是在以下条件下每分钟释 放 1微摩尔无机磷酸根的酶量： pH5.5 ； 温度 37°C; 底物植酸钠 （购自 Sigma 货号为 P0109) ： 浓度为 4mM/L。

两个氨基酸序列之间的相似性用参数 "一致性 "来描述。 在本发明中， 两 个氨基酸序列的比对是通过使用来自 Vector NTI软件 (Invitrogen公司） 的 Align 程序版本 10.0确定的。

在本发明的植酸酶的具体实施方案中， 与 SEQ ID NO:2的一致性程度为， 至少 70%， 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 或至少 99%。 在仍进一步的具体实施方 案中， 一致性程度为至少 98.0% , 98.2% , 98.4% , 98.6% , 98.8%, 99.0% , 99.1% , 99.2% , 99.3% , 99.4% , 99.5% , 99.6 % , 99.7% , 99.8% , 或至少 99.9%。 在其它实施方案中， 一致性程度为至少 70%， 71% , 72% , 或至少 73%。

根据本发明的具体实施方案， 本发明的植酸酶具有与 SEQ ID NO:2或任何 其它亲本植酸酶相比， 不多于 2， 3， 4， 5， 6， 7， 8， 9， 或不多于 10个修 饰； 与 SEQ ID NO:2相比不多于 11， 12， 13， 14， 15， 16， 17， 18， 19， 或不 多于 20个修饰； 与 SEQ ID NO:2相比不多于 21， 22， 23， 24， 25， 26， 27， 28， 29， 或不多于 30个修饰 ； 与 SEQ ID NO:2或任何其它亲本植酸酶相比， 不多于 31， 32， 33， 34， 35， 36， 37， 38， 39， 或不多于 40个修饰； 与 SEQ ID NO:2或任何其它亲本植酸酶相比， 不多于 41， 42， 43， 44， 45， 46， 47， 48， 49， 或不多于 50个修饰 ； 与 SEQ ID NO:2或任何其它亲本植酸酶相比， 不多于 51， 52， 53， 54， 55， 56， 57， 58， 59， 或不多于 60个修饰； 与 SEQ ID NO:2或任何其它亲本植酸酶相比， 不多于 61， 62， 63， 64， 65， 66， 67， 68， 69， 或不多于 70个修饰； 与 SEQ ID NO:2或任何其它亲本植酸酶相比， 不多于 71， 72, 73， 74, 75, 76, 77, 78， 79， 或不多于 80个修饰 ； 与 SEQ ID NO:2或任何其它亲本植酸酶相比， 不多于 81， 82， 83， 84， 85， 86， 87， 88， 89， 或不多于 90个修饰； 与 SEQ ID NO:2或任何其它亲本植酸酶相比， 不 多于 91， 92, 93， 94， 95， 96， 97， 98， 99， 或不多于 100个修饰。

在本申请中， 用于限定氨基酸位置的命名法基于以编号 ABF60232保藏于 GenBank的大肠杆菌的植酸酶的氨基酸序列， 其作为 SEQ ID NO:2在序列表中 给出 （SEQ ID NO:2的氨基酸 1-410)。 因此， 在本上下文中， 用于位置编号的 基础是 SEQ ID NO:2， 始于 Ql (Glnl ) 并且止于 L410 (Leu410) 。 （SEQ ID NO:2)作为位置编号的标准， 并因此作为命名的基础。

术语 "成熟"部分序列是指多肽在切割去信号肽部分� ��后残余的部分。 信 号肽部分可通过本领域已知的程序预测 （例如 SignalP 4.0)。 一般而言， 酶的成 熟多肽的第一个氨基酸可通过纯化的酶的 N端测序来确定。 有时通过连接到表 达载体后分泌表达载体可能会含有限制性核酸 内切酶所翻译的氨基酸在前端。

植酸酶变体， 可以相对于模板 （即参照或比较性氨基酸序列例如 SEQ ID NO:2)包含多种类型的修饰： 可以将一个氨基酸用另一个氨基酸取代； 可以缺 失氨基酸； 可以插入氨基酸； 以及任何数目的这些修饰的任意组合。 在本上下 文中， 术语 "插入"还包括 N末端和 /或 C末端延伸。 位置号 80的苏氨酸 S被 脯氨酸 P取代， 可以标识 "S80P" 。

对用什么取代或延伸没有进行任何指定的取代 或延伸是指除了在模板中占 据该位置的氨基酸以外， 插入任何天然的， 或非天然的氨基酸。

本发明的植酸酶具有修饰的， 优选改良的性质。 术语 "修饰的"和 "改良 的" 指与其它植酸酶的比较， 可用于比较的植酸酶的实例为 ： 来自 WO 2009/073399 的野生型， 来自 WO 2009/073399 的变体 Nov9X， 来自 WO 2008/036916的 SEQ ID NO:2或来自 WO 2008/036916的 SEQ ID NO:4。

热稳定性的确定方法参见具体实施例， 对于每个植酸酶， 残余活性相对于 在温育之前 （0分钟处） 所见的活性来计算。 本发明的植酸酶变体具有高于参 照植酸酶剩余的酶活力， 表明其热稳定性越高。 本发明的植酸酶的残余活性优 选为至少参照植酸酶的残余活性的 105%， 更优选至少 110%， 115% , 120% , 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 或至少 200%。

植酸酶的最适反应温度测定参见具体实施方式 ， 在每个温度的活性优选表 示为标准化至最适温度的值的相对活性 (以％表示） 。

植酸酶的 pH特性的测定参见具体实施方式， 在每个 pH的活性优选表示为 标准化至最适 pH的值的相对活性 （以％表示） 。 修饰的 pH特性的实例是当 pH曲线移向较高或较低的 pH时。

植酸酶变体相对于参照植酸酶具有改良的比活 性。 更具体而言， 本发明的 植酸酶的比活性相对于用同样方法确定的参照 植酸酶的比活性是至少 105%、 110、 115、 120、 125、 130、 140、 145、 150、 160、 170、 180、 190、 或甚至 200%, 仍是相对于用同样方法确定的参照植酸酶的比 活性而言。 或者， 术语高 比活性指至少 200 U/mg酶蛋白的比活性。 比活性是对高度纯化的样品 （SDS聚 丙烯酰胺凝胶应该显示只有一个组分存在） 测量的。 酶蛋白浓度可以通过 Bradford蛋白浓度测定试剂盒来测定， 并且植酸酶活性以 U为单位， 如实施例 中所述确定。 比活性是所述的特定植酸酶的特征， 并且计算为以每 mg植酸酶 变体酶蛋白的植酸酶活性 （U) ， 即为比活性。

术语 "表达载体"在本文中定义为直链或环状的 DNA分子， 其包含编码 本发明的多肽的多核苷酸， 且其可操作地连接于提供其表达的其他多核苷 酸。 编码本发明的植酸酶变体的核酸序列可使用表 达载体表达， 所述表达载体通常 包括编码启动子、 核糖体结合位点、 翻译起始信号和任选地阻抑物基因或多种 激活子基因的调控序列。 携带编码本发明的植酸酶变体的 DNA序列的重组表达载体可为任何载 体， 可便利地对其进行重组 DNA步骤， 且载体的选择通常会取决于其要导入 的宿主细胞。 例如在毕赤酵母中表达通常采用的 pPIC9、 pPICZaA、 pGAPZaA 等表达质粒， 连上植酸酶变体的 DNA序列的重组表达载体。

术语 "表达宿主细胞"包括任何对于用包含本发明的� ��核苷酸的核酸构建 体进行的转化、 转染、 转导等， 最终用于植酸酶变体表达的细胞。 本发明的重 组表达载体可设计用于在原核或真核细胞中表 达植酸酶蛋白。 例如， 植酸酶基 因可在细菌 （如大肠杆菌） 、 酵母 （如毕赤酵母） 、 曲霉 （如木霉） 、 昆虫细 胞 （如 Sf9细胞、 家蚕细胞） 或植物细胞 （如拟南芥、 玉米等） 中表达。 从 而， 本发明涉及已导入本发明的重组表达载体的宿 主细胞。 宿主细胞可为任何 原核或真核细胞， 其包括但不限于上述的那些宿主细胞， 优选毕赤酵母细胞。

本发明的宿主细胞 （如培养的原核或真核宿主细胞） 可用于产生 （即表 达） 植酸酶蛋白。 因此， 本发明还提供了使用本发明的宿主细胞来产生 植酸酶 蛋白的方法。 根据具体实施方式， 该方法包括在适于植酸酶表达的条件下， 在 合适的培养基中培养本发明的宿主细胞 （其中已导入了编码植酸酶蛋白的重组 表达载体， 或其基因组中已导入了编码野生型或改变的植 酸酶蛋白的基因） ， 直至产生植酸酶蛋白。 该方法还包括从培养基或宿主细胞分离植酸酶 蛋白。

根据本发明的具体实施方式， 本发明的植酸酶与参照植酸酶相比在动物饲 料中具有改良的性能。 动物饲料中的性能可通过体外模拟实验来确定 。 例如， 根据本发明的实施例， 在模拟的人工胃液中添加豆粕日粮， 并在其中添加一定 单位的纯化的植酸酶变体蛋白， 水浴摇床保温反应 1小时后， 测定释放的无机 磷 （Huang et al.,Appl Microbiol Biotechnol. 2008, 80(3):417-26. ) 。

进一步地， 本发明还涉及所述植酸酶在制备饲料添加剂中 的用途， 以及相 应的饲料添加剂， 所述饲料添加剂的有效成分可以是所述植酸酶 多肽、 表达植 酸酶多肽的宿主细胞、 或者本发明筛选到的植酸酶变体。 所述饲料添加剂可制 备为干粉或液体制剂， 并且可额外地包括一种或多种酶制品， 包括但不限于： 角蛋白酶、 脂解酶 （如脂肪水解酶） 、 淀粉酶、 磷酸酶、 麦芽糖酶、 转化酶、 木聚糖酶、 羧甲基纤维素酶等等。 除了植酸酶和 /或产植酸酶微生物， 本发明的 饲料添加剂还可额外包括其它非致病性的有益 微生物， 例如包括但不限于： 益 生菌乳酸菌、 双歧杆菌等， 有助于消化和饲料吸收的酵母菌， 有助于增重的米 曲霉菌， 能够产生有益蛋白酶的枯草芽孢杆菌等等。 附图说明

图 1 : 纯化的不同植酸酶变体， 两条电泳条带都是植酸酶， 不同的糖基化 修饰。

图 2: 植酸酶变体在 80°C的热稳定性 具体实施方式 实施例 1、 植酸酶变体脯氨酸引入的理性设计， 突变体表达载体的构建及 其在毕赤酵母中的表达

( 1 ) 突变体的理性设计： 以蛋 白质结构数据库 PDB 中 (http://www.rcsb.org/pdb/) 提供的大肠杆菌植酸酶 APPA的三维结构 （PDB: 1DKQ ) 作为植酸酶的结构模型， 进行三维立体模型浏览分析。 蛋白质的 B- factor主要用来反应蛋白质中特定氨基酸的稳定 性的一个指标， 如果某个氨基的 B-Factor的值比较大， 则表示该氨基酸或该区段结构不够稳定。 计算得出了每 个氨基酸的 B-factor值， 并对其排序， 进一步对 B值较大的氨基酸及其区域进 行分析， 结合试验结果， 优化设计， 最终确定了大肠杆菌植酸酶 APPA中以下 柔韧性较大的位点： A) S80， B) S151 , C) T161 , D) N176 , E) S187 , 和 F) A380。 然后对这些点进行脯氨酸的引入， 进而增大该区域的刚性， 进而提高其 热稳定性。

(2) 突变体的表达： 通过利用 ¾ I处理和同源重组结合的方法进行定点 突变。 该方法只需两条突变引物， 一般在 4 h 内就可完成突变分子的构建， 比 通过 Overlap PCR方法进行突变更加方便快捷。 突变后的植酸酶基因， 经测序 正确后， 通过限制性内切酶 EcoR I和 Not I酶切位点， 连接进入表达载体 pPIC9 (Invitrogen, San Diego),使植酸酶变体基因以正确的方式插入到� �述表达 载体的信号肽序列的下游， 与信号肽形成正确的阅读框架， 构建成酵母表达载 体， 转化大肠杆菌感受态细胞 JM109。 提取制备重组质粒约 8微克的用限制性 内切酶 BgUI进行线性化表达质粒载体 DNA， 电击转化酵母 GS115感受态细 胞， 涂布于组氨酸缺陷性的 RDB平板， 30°C培养 2-3天， 挑取在 RDB平板上 生长的转化子进行进一步的表达实验

( 3 ) 高活性菌株的筛选： 用灭过菌的牙签从长有转化子的 RDB板上挑取 单菌落， 按照编号先点到 MM上， 再点到相应编号的 MD平板上； 将点有转化 子的 MM、 MD平板置于 30°C培养箱中培养 1~2天， 至菌落长出。 按编号从 MD平板上挑取转化子接种于装有 3mL BMGY培养基的离心管中， 30°C、 260rpm摇床培养 48h; 将摇床培养 48h的菌液 3,000xg离心 15min， 去上清， 离 心管中再加入 lmL含有 0.5%甲醇的 BMMY培养基， 在 30°C、 260rpm诱导培 养； 诱导培养 48h后， 3,000xg离心 5min， 取上清用于植酸酶酶活性检测， 从 中筛选出具有最高植酸酶活性的转化子。

实施例 2、 突变体的制备， 和活性的确定

( 1 ) 浓缩： 将植酸酶变体诱导培养后的 BMMY培养液在 4°C、 10,000 rpm离心 10 min， 收集上清、 浓缩， 将 3 L上清粗酶液浓缩到 250 mL左右； 进 一步超滤浓缩 (截留量为 5kDa): 上清粗酶液浓缩到 50 mL左右；

( 2) 硫酸铵分级沉淀： 将上述浓缩后的粗酶液进行 40-75%硫酸铵沉淀， 硫酸铵的饱和度达到 75%时， 上清中已剩下很低的植酸酶活性。 离心收集沉 淀， 并溶于 5 mL pH 8.0 Tris-HCl缓冲液， 透析， 透析后的酶液用 PEG 8000进 行浓缩。

( 3 ) 阴离子交换层析： 对透析后的酶液用 HiTmp Q Sepharose XL阴离子 交换层析柱进行纯化， 平衡缓冲液为 20 mmol/L的 Tris-HCl溶液 (pH 8.0)， 洗脱 液为含 1 mol/L NaCl的 20 mmol/L Tris-HCl溶液 (pH 8.0)， 上样量为 2 mL, 进行 从 0-100%的线性梯度洗脱， 流速 4 mL/min, 分部收集洗脱峰， 并进行 SDS- PAGE , 最后得到电泳纯的目的蛋白分子量根据 SDS-PAGE估计为大约 48- 53kDa， 而纯度为 >95%， 如图 1所示。 纯化后的酶蛋白利用 Bradford方法检测 蛋白浓度。

(4) 植酸酶活性的确定： 将酶液用 0.25 mol/L含有 0.05% BSA和 0.05% Triton X-100的 pH 4.5 NaAc-HAc缓冲液进行稀释， 将 50 稀释后的酶液加入 到 950 μL 1.5 mmol/L植酸钠底物 (用 0.25 mol/L的 pH 4.5的 1.5 mmol/L植酸钠 缓冲液配制 （Sigma Cat.No.P0109))中， 在 37 °C水浴锅中反应 15 min, 加入 1 mL 10% ( m/v) TCA终止反应， 最后加入 2 mL显色液进行显色。 对照则是在加 酶液之前先加入 TCA混匀使酶变性， 其他相同。 显色后， 在 700 nm光吸收下 测定 OD值， 计算酶活。 植酸酶活性以 U的单位表示， 一个 U为在上述条件下 每分钟释放 1微摩尔无机正磷酸的酶量。 测量的植酸酶活性的绝对值可通过参 照从无机磷酸的适当稀释准备的标准曲线， 计算获得。

实施例 3： 植酸酶变体的反应最适温度及热稳定性

( 1 ) 温度特性测定： 将大肠杆菌植酸酶变体 （如实施例 2中所述纯化） 的 蛋白样品稀释到所需浓度， 在 0.25mol/L pH值 5.5的醋酸钠缓冲体系及不同温 度 （30°C〜90°C ) 下测定酶活， 计算相对酶活， 以确定该酶的最适反应温度， 每一温度下的测定重复 3次，取平均值。 结果总结于下表 1。 对于每个温度给出 的数值是处理后平均值的相对活性 (以％计)。

表 1

(2) 热稳定性测定： 将大肠杆菌植酸酶变体的蛋白样品稀释到所需 浓度， 取 2 mL在不同温度 （60 °C、 65 °C、 70 °C、 75 °C、 80 °C、 85 °C ) 下分别处理 30min， 并在不同时间 2min、 4min、 10min、 15min、 20min、 30min取样后迅速 置于冰上， 进一步稀释 10倍后， 以未处理的原酶液作为 100%的对照， 在 37°C 最适 _P H条件下进行酶活性测定。 以确定该酶的最适反应温度， 每一温度下的 测定重复 3次，取平均值。 热稳定性提高的不同变体的热稳定性数据如图 2所 示。

多个植酸酶变体的热稳定性有了明显的提高， 在 80°C处理 10 min还能保留 40%的酶活性， 处理 30 min后还有 25.8%的剩余酶活性。 而野生型植酸酶 appa, 只能在 65时比较温度， 当温度提高时热稳定性明显下降， 在 80°C处理 2 min酶活性就几乎完成损失。 多个植酸酶变体在 85°C的稳定性实验结果表明， 该突变体能够抵御饲料高温 （80°C左右） 制粒时短暂的高温处理。 由于多个植 酸酶变体在高温 80°C和 85°C下， 仍然能保持较好的热稳定性， 因此， 本发明的 优化改良的植酸酶变体可在工业应用中显示出 巨大的潜力。 实施例 4 : 植酸酶变体的反应最适 pH及 pH稳定性

经脱盐处理的植酸酶发酵液上清在不同 pH ( 1.0〜10.0) 下进行酶促反应以 测定其最适 pH。 所用缓冲液为 O.lmol/L的 pH1.0〜3.0的甘氨酸-盐酸系列缓冲 液； pH3.5〜5.5醋酸-醋酸钠系列缓冲液； pH6.0〜6.5 的 Tris-醋酸缓冲液； pH7.0〜8.5的 Tris-Hcl缓冲液及 pH9.0〜10.0的甘氨酸 -氢氧化钠缓冲液。 在 37

°C下测定酶活性。

将酶液在不同 pH值的缓冲液中于 37°C下处理 lh， 在 37°C、 O.lmol/L pH 值 4.5的醋酸钠缓冲液条件下测定酶活性以研究酶 的 pH稳定性。

植酸酶变体的最适合 pH以及 pH稳定性均没有发生显著性变化， 最是 pH 均为 4.5， 只是部分变体在酸性条件下， 稳定性和催化活性略有提高。 植酸酶变 体在 pH特性上， 与参照植酸酶基本相似， 能够较好的在动物胃肠道发挥植酸 的水解作用。 实施例 5 : 植酸酶变体的比活性测定

为了确定该植酸酶变体的比活， 首先通过 Bradford蛋白浓度测定试剂盒来 确定了纯化后的植酸酶变体酶蛋白的浓度。 重组酶变体活力单位， 在 37°C， pH 5.5的条件下， 通过硫酸亚铁钼蓝法进行测定。 并通过计算， 对重组植酸酶变体 的比活性。 植酸酶活性以 U的单位表示， 一个 U为在在 37°C， pH 5.5, 底物植 酸钠浓度为 4mM的条件下， 每分钟释放 1微摩尔无机正磷酸的酶量。

植酸酶变体在 37°C， pH 5.5 的条件下， 所测定的比活性， 均在 2500-3100 U/mg, 与野生型的参照植酸酶比活性相差不大， 因此随着热稳定性的提高， 植 酸酶变体的比活性， 并没有受到影响。 实施例 6 : 蛋白酶对植酸酶变体活性的影响

为了确定动物胃肠道中主要的蛋白酶 （胃蛋白酶和胰蛋白酶） 对植酸酶变 体降解的分析， 纯化的植酸酶变体 （O.l mg/mL) 与 0.01 mg/ml的胃蛋白酶和胰 蛋白酶等体积混合， 保温在 37 °C。 接着分别在 5、 10、 20、 30、 60、 90、 120min取样。 在 37°C， pH5.5的条件下测定酶活性。 以未用蛋白酶处理酶液做 为 100%的对照， 计算相对酶活力， 其结果表 2所示。 植酸酶变体对胰蛋白酶的 抗性得到了明显的提高， 对胃蛋白酶的抗性变化不大。

表 2 植酸酶变体 胃蛋白酶 （处理时间 min) 胰蛋白酶 （处理时间 min)

5 10 30 60 120 5 10 30 60 120

Appa-WT 105.6 111.2 115 116.8 117.3 59.4 45.7 43.2 39.6 35.1

Appa-A 103.7 108.4 113.9 115.7 116.9 80.9 69.6 58.3 52.3 48.4

Appa-B 102.2 107.2 113.3 115.1 116.2 89.3 83.4 69.9 65.3 59.2

Appa-C 101.3 106.9 110.6 113.4 115.6 97.9 90.3 84.4 76.3 69.4

实施例 7： 在动物伺料中的性能和体外模型

为了比较植酸酶变体与野生型参照植酸酶， 在人工胃液中， 对豆粕中植酸 磷的降解能力。 因此， 被纯化的植酸酶变体酶蛋白进一步分别研究了 在人工胃 液中的稳定性及水解植酸的能力。

( 1 ) 植酸酶变体在人工胃液中的稳定性： 相同单位的植酸酶变体分别加入 到人工胃液中， 植酸酶的终浓度为 1 U/ml人工胃液， 在 37°C处理 20分钟后， 分别在最适 pH条件下检测剩余的植酸酶活性。 结果表明， 野生型的参照植酸 酶只剩下 30%的相对活性； 相对于参照而言， 热稳定性提高的植酸酶变体， 其 在人工胃液中更稳定， 处理一小时后， 多个植酸酶变体其中仍能达到 70%以上 的相对活性。 因此， 热稳定性提高的植酸酶变体， 结构稳定性更好能够抵抗强 酸性和高浓度的蛋白酶的水解作用， 稳定的存在于单位动物的胃中。

(2) 在人工胃液中水解植酸能力的分析： 将 1克豆粕日粮溶解在 9 ml的 人工胃液中， 37°C振荡 1小时后， 分别加入 1 ml用人工胃液稀释好的植酸酶参 照及其变体溶液 （整个稀释操作在冰上， 以防止植酸酶在人工胃液中的降 解） ， 37 °C振荡反应 1 小时。 通过检测释放的无机磷来衡量植酸酶的水解情 况， 为了进一步模拟胃中的作用环境， 同时做了 pH梯度累积效果试验。 结果 表明多个热稳定性的植酸酶变体所释放的无机 磷的量， 均高于参照菌植酸酶， 提高水平在 50-300%左右。 因此， 热稳定提高的植酸酶， 在模拟人工胃液中能 够更加有效的降解植酸， 具有非常好的应用前景。