L'invention concerne la production de pigments par des cellules capables de photosynthèse.

Ces pigments comprennent les pigments photosynthétiques capables de capter la lumière et les pigments photoprotecteurs qui ne captent pas la lumière ou très peu et qui protègent les cellules exposées à un excès de photons, ou plus largement à un stress oxydant.

Les pigments photosynthétiques sont des composés chimiques permettant la transformation de l'énergie lumineuse en énergie chimique chez les organismes effectuant la photosynthèse. Lorsqu'un photon heurte une molécule de pigment photosynthétique, son énergie excite un atome de cette molécule, et la fait passer à un état excité, de niveau énergétique élevé. L'énergie accumulée dans la molécule de pigment est libérée lors du retour à l'état fondamental de la molécule par un dégagement de chaleur, et par un phénomène de fluorescence, par la transmission de l'état d'excitation à une autre molécule et/ou par la conversion de l'énergie.

Les pigments photosynthétiques se divisent essentiellement en deux types, les pigments actifs, capables d'effectuer les trois modes de libération de l'énergie accumulée ci-dessus, qui sont notamment aptes à transférer l'énergie lumineuse dans la chaîne de transport des électrons photosynthétiques où l'énergie lumineuse est convertie en énergie chimique, et dont la chlorophylle a est le représentant, et les pigments accessoires incapables d'effectuer directement cette conversion de l'énergie et qui comprennent notamment les phycobilines et certains caroténoïdes comme la néoxanthine, la siphonoxanthine, la diadinoxanthine, la fucoxanthine, la violaxanthine, la péridinine et l'échinénone.

Les pigments photoprotecteurs comprennent les caroténoïdes non photosynthétiques et en particulier les carotènes dont le lycopène et le bêta- carotène, et des xanthophylles comme l'anthéraxanthine, la zéaxanthine, la néoxanthine, la lutéine, la loroxanthine, l'astaxanthine, la canthaxanthine, et la diatoxanthine.

L ^' invention concerne plus particulièrement la production des pigments photosynthétiques accessoires ainsi que les pigments phot.oprotect.eurs.

Au-delà de leurs fonctions colorantes largement exploitées dans l'industrie agroalimentaire, nombre de ces pigments possèdent des propriétés biologiques d'intérêt, et notamment une activité anti-oxydante, trouvant ainsi diverses utilisations en pharmacie et en cosmétique. A titre d'exemple, différentes études sur la fucoxanthine, un pigment de la famille des xanthophylles, rapportent qu'en plus de ses applications en tant qu'anti-oxydant, elle présente des propriétés antiinflammatoires, anti-cancer, anti-obésité, anti-diabète, anti-angiogénèse et peut même être employée pour traiter la malaria.

L'avenir de ces pigments est donc prometteur et il est indispensable de disposer d'outils pour leur production à l'échelle industrielle, en particulier pour les pigments photosynthétiques accessoires pour lesquels aucune voie rentable n'est encore disponible.

A titre d'exemple, la fucoxanthine est uniquement synthétisée par certaines macroalgues et certaines microalgues.

La production de fucoxanthine par les macroalgues est problématique de par le caractère saisonnier d'une telle production, la contamination par les éléments présents dans le milieu naturel marin (polluants chimiques, métaux lourds, iode, etc.) et la faible teneur en fucoxanthine des biomasses obtenues qui sont en moyenne de 0,09% (m :m) par rapport à la biomasse sèche.

Quant à la production de fucoxanthine par microalgues, les concentrations atteintes au sein de la biomasse sèche sont en moyenne de 0,70% (m :m). Une seule étude fait état d'une teneur de 1,98% (m :m) dans le cas de la microalgue Isochrysis sp. (P. Crupi et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 2013, 27, 1027-1035).

A l'heure actuelle, certains spécialistes suggèrent que la seule possibilité de surproduire ces pigments serait l'ingénierie moléculaire (KJM M ulders et al., 2014, J. Phycol. 2014, 50(2), 229-242), et ce, malgré la faible connaissance des voies métaboliques et des enzymes impliquées dans leur synthèse et le faible degré de maturité des outils moléculaires disponibles pour certains microorganismes.

De plus, il a été démontré que dans le cas d'une production en lumière naturelle, la quantité et la concentration en pigments photosynthétiques accessoires de la production est dépendante du moment de la récolte du système au cours de la journée du fait des différentes variations d'intensités lumineuses au cours de la phase ensoleillée et de la valeur des intensités lumineuses (Obata et Taguchi, 2012, Plankton Benthos Res 7(3), 101-110). Ceci rend l'exploitation industrielle difficile à optimiser et à rationnaliser dans le cadre d'une reproductibilité des caractéristiques d'une production.

Selon WQ2013/136025A1, on connaît un procédé de production d'acide docosahexaénoïque et d'acide éicosapentaénoïque par une culture d'une microalgue du genre Nitzschia, soumise à un éclairement discontinu et/ou va riable de lumière au cours du temps, ce procédé permettant, aussi de produire de la fucoxanthine. L'éclairement présente des variations d'intensité, dont l'amplitude est comprise entre 5 μmoles de photon.m ^-2 de biomasse exposée.s ^-1 et 1000 μmoles.m ^{- 2} .s ^-1 et les variations intervenant entre 2 et 3600 fois par heure, Ce mode de culture ne permet d'enrichir la biomasse en fucoxanthine qu'à hauteur de 0,2% (m:m) en matière sèche et ne permet donc pas de résoudre le problème de trop faibles rendements.

A ce jour, il existe un réel besoin d'un procédé de production plus performant.

L ^' invention apporte une solution avec un procédé rentable et d'une mise en œuvre simple pour une production de pigments impliqués, directement ou non, dans la photosynthèse, et en particulier les pigments photosynthétiques accessoires et les pigments photoprotecteurs.

De manière inattendue, les auteurs ont découvert qu'en soumettant une culture de cellules capables de photosynthèse à une puissance lumineuse normalisée par rapport à la biomasse sèche, la production de pigment était fortement augmentée.

Ainsi l'invention concerne un procédé de production de pigments par des cellules capables de photosynthèse, selon lequel on cultive lesdites cellules dans des conditions appropriées à leur développement, pour obtenir une biomasse, ledit procédé comprenant une étape de surproduction desdits pigments selon laquelle on applique auxdites cellules une puissance lumineuse normalisée par rapport à la biomasse sèche, dépendante desdits pigments, ladite puissance lumineuse, exprimée en μmoles de photons par gramme de ladite biomasse sèche et par seconde, étant d'au moins 2 μmoles.g ^_1 .s ^-1 et d'au plus 200 μmoles

Avant d'exposer l'invention plus en détail, certains termes employés sont définis.

Selon l'invention, on entend par biomasse, la masse de la matière biologique présente dans le milieu de culture qui est essentiellement constituée des cellules. Cette biomasse étant dépendante de son biotope, sa quantité évolue au cours du procédé en fonction des conditions qui lui sont appliquées. Cette quantité, généralement exprimée en gramme, à un instant donné est déterminée en biomasse sèche, par des techniques classiques connues de l'homme du métier. A titre d'exemple, l'homme du métier peut se reporter au document publié par la Algae Biomass Organisation (ABO), industrial Algae Measurements, Octobre 2013, Version 6.0, notamment mais pas uniquement, disponible à l'adresse

qui est un recueil des méthoiogies standard employées et approuvées par les principaux acteurs mondiaux dans le secteur des algues, et en particulier à son Annexe A, aux pages 7-8 où est décrit le protocole de mesure de la biomasse sèche d'une culture de cellules.

Par puissance lumineuse normalisée par rapport à la biomasse sèche, on entend une intensité lumineuse exprimée en μmoies de photons appliquées par gramme de biomasse sèche et par seconde. Cette valeur est dite normalisée car du fait de sa dépendance au pigment à produire, cette valeur est prédéterminée. L'exemple 1 illustre une méthode de prédermination de cette valeur pour la production de la fucoxanthine et pour deux espèces de microalgue, Tisochrysis lutea et Phaedactylum tricornutum.

L'invention est plus spécifiquement décrite en référence aux pigments photosynthétiques accessoires tels que définis ci-dessus, car à ce jour, aucun procédé de production à l'échelle industrielle n'existe. Mais comme dit précédemment, le procédé de l'invention s'applique aussi aux pigments photoprotecteurs.

L'invention est ci-après exposée plus en détail et ses variantes, notamment variantes préférentielles, présentées.

La valeur de la puissance lumineuse normalisée par rapport à la biomasse sèche, à appliquer à la culture, que l'on désignera par paramètre dans la suite de la description, est dépendante de la nature du pigment à produire.

Les auteurs ont observé qu'elle devait être d'au moins 2 μmoles.g ^{- 1} .s ^-1 et d'au plus 200 μmoles.g ^{- 1} .s ^-1 . Dans cette fourchette, sa valeur est avantageusement plus élevée pour la production de pigments photoprotecteurs comparativement à celle de pigments photosynthétiques accessoires.

Ainsi, selon une mise en œuvre préférée du procédé de l'invention appliqué à la production de pigments photosynthétiques, la valeur du paramètre est d'au moins 2, de préférence d'au moins 5, et d'au plus 150, de préférence d'au plus 130, μιmoles e photons par gramme de biomasse sèche et par seconde. Dans cette variante, les pigments sont choisis parmi les caroténoïdes et les phycobilines photosynthétiques. Avantageusement, le procédé est appliqué à la production de xanthophilles photosynthétiques, comme la fucoxanthine, et la valeur du paramètre est choisie parmi les valeurs de 5 à 30 μmoles.g ^{- 1} .s-. ¹

Selon une mise en œuvre préférée du procédé de l'invention appliqué à la production de pigments photoprotecteurs, la valeur du paramètre est d'au moins 30, de préférence d'au moins 50, et d'au plus 200, de préférence d'au plus 190, μmoles de photons par gramme de biomasse sèche et par seconde. Dans cette variante, les pigments sont de préférence choisis parmi les caroténoïdes photoprotecteurs, tels que la bêta-carotène et l'asthaxanthine. La gestion du paramètre s'effectue lors des phases lumineuses ou de façon pertinente dans un laps de temps suffisant avant la récolte de la production. De préférence, on applique la puissance lumineuse normalisée par rapport à la biomasse sèche, pendant tout ou partie de la phase exponentielle de croissance de la culture cellulaire.

Le paramètre est caractérisé en cours de production par la mesure du flux de photons moyen, exprimé en μmoles de photon par m ² et par seconde, appliqué au système de production retranché du flux de photons moyen absorbé par le système de production et normalisé par la quantité de biomasse contenue dans le système de production au temps de la mesure. Les mesures de la puissance lumineuse normalisée par rapport à la biomasse sèche peuvent être effectuées par un dispositif de type quantum-mètre. Les mesures de biomasses sèches peuvent être effectuées après filtration ou centrifugation de la culture, rinçage et séchage de la biomasse ainsi récupérée, ou par des mesures en ligne d'absorbance aux longueurs d'ondes adéquates après détermination de la corrélation entre l'absorbance à une longueur d'onde donnée et la biomasse sèche.

La source lumineuse appliquée au système de production est d'origine naturelle ou artificielle ou une combinaison des deux.

La source lumineuse a un fonctionnement continu et/ou un fonctionnement en mode jour/nuit selon les photopériodes naturellement rencontrées. Le spectre d'émission de la source lumineuse peut être choisi, modifié, adapté afin de répondre à des caractéristiques particulières propres aux pigments à produire.

La modification du spectre d'émission de la source lumineuse peut survenir en cours de production.

La régulation de ce paramètre à maintenir constant peut s'effectuer par la variation d'un ou de plusieurs facteurs :

- augmentation ou diminution du flux de photons appliqué au système, ou

- augmentation ou diminution de la biomasse sèche au sein du système de production, ou

- couplage de ces actions

L'augmentation ou la diminution du flux de photons appliqués au système peut s'effectuer par des systèmes de voilages mobiles mécanisés ou manuels entre la source lumineuse et le système de production. L'augmentation ou la diminution du flux de photons appliqués au système peut s'effectuer par action directe sur la source lumineuse dans le cas d'une source artificielle.

L'augmentation de la biomasse sèche au sein du système de production peut s'effectuer par des ajouts contrôlés de nutriments qui auront une influence directe sur la quantité de biomasse.

La diminution de la biomasse sèche au sein du système de production peut s'effectuer par dilutions du système de production.

Le paramètre décrit par le procédé, peut être contrôlé et maintenu constant pendant tout ou partie de la production via un dispositif automatisé relié à des capteurs d'intensité lumineuse et des capteurs permettant la quantification de la biomasse sèche, en agissant sur l'intensité lumineuse appliquée à la culture, selon les modalités décrites précédemment, et/ou sur la biomasse sèche au sein du système de production.

Le procédé décrit permet la production de pigments par des cellules capables de photosynthèse selon les modes de conduite de culture de type batch, fed-batch, continu, semi-continu, turbidostat ou chemostat au sein d'un système de culture de type photobioréacteur ou tout type de système de production de microalgues permettant un mélange important et contrôlé du milieu réactionnel afin d'assurer l'homogénéité du flux de photon reçu par cellule.

Les cellules capables de photosynthèse peuvent être des cellules d'organismes procaryotes ou eucaryotes comme des algues, et notamment microalgues ou macroalgues. Selon une variante de l'invention, lesdits organismes sont des microalgues, telles que celles appartenant aux classes des Pinguiophyceae, Chrysophyceae, Bacillariophyceae, Mamiellophyceae, Prymnesiophyceae, Haptophyceae ou Coccolithophyceae.

Aux fins de la production de fucoxanthine selon l'invention, avantageusement les cellules sont des cellules de microalgue de l'espèce Tisochrysis lutea de la classe des Prymnesiophyceae ou de l'espèce Phaedactylum tricornutum de la classe des Bacillariophyceae et la puissance lumineuse normalisée par rapport à la biomasse sèche appliquée est d'au moins 2 μmoles.g ^{- 1} .s ^-1 et d'au plus 30 μmoles.g ^{- 1} .s-. ¹ Un tel procédé est illustré dans les exemples suivants à l'appui de la figure qui représente une courbe étalon de la concentration en fucoxanthine produite dans la biomasse en fonction de la valeur du paramètre.

Dans une application intéressante du procédé de l'invention, le pigment est la fucoxanthine, les cellules sont des cellules de microalgue de l'espèce Tisochrysis lutea ou de l'espèce Phaedactylum tricornutum et la puissance lumineuse normalisée par rapport à la biomasse sèche appliquée est d'au moins 15 μmoles.g ^{- 1} .s ^-1 et d'au plus 25 μmoles.g ^{- 1} .s ^-1 . Exemple 1 : Détermination de la puissance lumineuse normalisée par rapport à la biomasse sèche à appliquer à la culture

Comme indiqué précédemment, le paramètre quantité de photons par unité de biomasse sèche dans le système de production et par unité de temps, est dépendant du pigment considéré. Dans une moindre mesure, il est aussi dépendant de l'organisme dont les cellules sont cultivées.

C'est pourquoi la détermination de ce paramètre s'effectue par expérimentation, qui relève toutefois des compétences générales de l'homme du métier. Une technique de détermination parfaitement reproductible, est ci-après décrite.

Différentes valeurs de ce paramètre, c'est-à-dire de μιηοΐθ de photons par gramme de biomasse séchée et par seconde, sont appliquées à des productions de pigments par des cellules capables de photosynthèse et les teneurs en pigments ainsi produites sont quantifiées.

Ainsi de telles expérimentations sont exemplifiées dans le cas d'une production de fucoxanthine par une culture de la microalgue T. lutea et illustrées par la courbe représentée à la figure.

Il ressort de cette courbe que le pic de production est obtenu avec une valeur du paramètre de l'ordre de 20 μmoles de photons par gramme de biomasse sèche par seconde.

Exemple 2 : Procédé de production de fucoxanthine à partir de cultures de microalgues

Cet exemple porte sur la production de fucoxanthine à partir de cultures de microalgues des espèces Tisochrysis lutea de la classe des Prymnesiophyceae et Phaedactylum tricornutum de la classe des Bacillariophyceae.

Les cultures sont réalisées dans les mêmes conditions qui sont détaillées ci- après :

Le milieu de culture utilisé est minéral, classiquement utilisé pour la culture des espèces de microalgues marines, de type f/2 (RRL Guillard et JH Ryther, 1962, Gran. Can. J. Microbiol. 8, 229-239) stérilisé par autoclavage. Les cultures sont effectuées dans des photobioréacteurs de 10 L de capacité, préalablement stérilisés.

L'aération et l'agitation des cultures sont assurées par un système de bullage avec un débit de 10 L/h ±1 d'air dont 1,5% de ce débit est du C0 ₂ .

La température de culture est de 25°C ±1°C.

Le pH des cultures est de 7,5 ± 0,5.

L'éclairage des cultures est fourni par des néons et l'éclairage est assuré 24h/24.

Les taux d'inoculation appliqués permettent une densité cellulaire initiale des cultures de l à 2.10 ⁶ cellules/ml.

Les suivis des cultures sont journaliers après prélèvements stériles.

Les paramètres quantifiés sont :

- La densité cellulaire par comptage sur lame de Malassez

- L'absorbance à 880 nm par spectrophotométrie

- La concentration en biomasse sèche par centrifugation d'un volume connu, rinçage du culot et séchage à l'étuve jusqu'à stabilisation de la masse résiduelle

- La concentration en P0 ₄ ^2" par test colorimétrique

- La concentration en N0 ₃ ^" par test colorimétrique

- L'intensité lumineuse entrante et sortante des cultures via un quantum- mètre.

Deux cultures de la microalgue P. tricornutum sont réalisées de manière identique et sans carence en nutriments, à l'exception du mode de gestion de l'intensité lumineuse appliquée : une culture étant menée de façon classique et une culture étant menée selon le procédé de l'invention.

Six cultures de la microalgue T. lutea sont réalisées de manière identique et sans carence en nutriment, à l'exception du mode de gestion de l'intensité lumineuse appliquée : trois cultures étant menées de façon classique et trois cultures étant menées selon le procédé de l'invention.

La gestion de la lumière dite classique se caractérise par l'application d'une intensité lumineuse constante de 100 μΐΎΐοΙ.ητ ² ^ ^"1 à la culture et donc d'une valeur de μιηοΐθ de photons par cellule par seconde, qui va diminuer au cours de la culture du fait de l'augmentation de la densité cellulaire.

Le procédé de gestion de la lumière de l'invention implique l'adaptation de l'intensité lumineuse appliquée à la culture, par la détermination d'une puissance lumineuse normalisée par rapport à la biomasse sèche en fonction de la concentration cellulaire ; la quantité de photon par cellule et par seconde est ainsi maintenue constante. Le pigment à surproduire étant un pigment photosynthétique, elle est avantageusement choisie dans un intervalle compris entre 2 et 30 μmoles de photons par gramme de biomasse sèche et par seconde. I l ressort de l'exem ple 1 qu'elle est de l'ordre de 20 μmol.g ^-1. s ^-1 . Elle est appliquée dès la phase de croissance de culture amorcée.

Pour chacune des cultures, la biomasse est récoltée en début de phase stationnaire, la fucoxanthine est extraite puis quantifiée par HPLC. Les concentrations en fucoxanthine des biomasses sèches issues des cultures, exprimées en pourcentage (m :m), ainsi que les productivités en fucoxanthine, exprimées en mg par litre de milieu de culture et par jour, sont comparées en fonction du mode de gestion de la lumière suivi. Les résultats sont présentés dans le tableau 1 suivant.

Tableau 1

I l ressort du Tableau 1 que, comparativement aux cultures menées selon un procédé classique, le procédé de l'invention permet :

— » Une augmentation des teneurs en fucoxanthine d'un facteur 2 à 2,4 et — » Une augmentation des productivités en fucoxanthine d'un facteur 2 à 2,4, du fait d'une conservation des productivités en biomasse.

Exemple 3 : Procédé de production de fucoxanthine à partir de cultures de microalgues à l'échelle industrielle

Les travaux portent sur la gestion de la puissance lumineuse normalisée par rapport à la biomasse sèche apportée à une culture de microalgue (Tisochrysis lutea).

Le milieu de culture utilisé est minéral, de type f/2 comme dans l'exemple 2.

Les systèmes de culture sont des photobioréacteurs industriels (CAMARGUE) de 4730 L de capacité, préalablement stérilisés. L'aération des cultures est assurée avec un débit de 20L/min d'air à co-courant de la culture tel que décrit dans la demande de brevet WO2010/109108A1.

La température de culture est de 25°C ±5°C.

Le pH des cultures est de 7,5 ± 0,5. Le pH des cultures est automatiquement régulé par l'injection de C0 ₂ .

L'éclairage des cultures est d'origine naturelle (soleil), l'intensité lumineuse entrante est régulée par ouverture-fermeture de rideaux protecteurs constitutifs de la serre climatique dans laquelle est implanté le photobioréacteur.

Les taux d'inoculation appliqués permettent une densité cellulaire initiale des cultures de l à 2.10 ⁶ cellules/ml.

Les suivis des cultures sont journaliers après prélèvements stériles.

Les paramètres quantifiés sont :

- La densité cellulaire par comptage sur lame de Malassez

- L'absorbance à 880nm par spectrophotométrie

- La concentration en biomasse sèche par centrifugation d'un volume connu, rinçage du culot et séchage à l'étuve jusqu'à stabilisation de la masse résiduelle

- La concentration en P0 ₄ ^2- par test colorimétrique

- La concentration en N0 ₃ - par test colorimétrique

- L'intensité lumineuse entrante et sortante des cultures via un quantum- mètre

Deux cultures de la microalgue T. lutea sont réalisées de manière identique et sans carence en nutriments, à l'exception du mode de gestion de l'intensité lumineuse appliquée : une culture étant menée de façon classique et une culture étant menée selon le procédé de l'invention.

La gestion de la lumière dite classique se caractérise par l'application d'une intensité lumineuse non régulée à la culture et donc d'une valeur de μmole de photons par cellule par seconde variable au cours de la culture du fait de l'augmentation de la densité cellulaire.

A contrario, le procédé de gestion de la lumière implique l'adaptation de l'intensité lumineuse appliquée à la culture en fonction de la concentration cellulaire : la quantité de photon par cellule et par seconde est donc maintenue constante, et ce, à une valeur de l'ordre de 20 μmoles de photons par gramme de biomasse sèche et par seconde, dès la phase de croissance de culture amorcée.

Pour chacune des cultures, la biomasse est récoltée en début de phase stationnaire, la fucoxanthine est extraite puis quantifiée par HPLC. Les concentrations en fucoxanthine des biomasses sèches issues des cultures, exprimées en pourcentage (m :m), ainsi que les productivités en fucoxanthine, exprimées en mg par litre de milieu de culture et par jour, sont comparées en fonction de la modalité de la gestion de la lumière. Les résultats sont présentés dans le tableau 2 suivant.

De façon surprenante, il ressort du Tableau 2 que, comparativement aux cultures menées selon un procédé classique, le procédé de l'invention permet :

— » Une augmentation des teneurs en fucoxanthine, d'un facteur 1,8 et — » Une augmentation des productivités en fucoxanthine d'un facteur 2,4.