Verfahren zur Herstellung von Kunststoffen enthaltend Nukleinsäuren in

komplexierter Form

Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind Verfahren zur Herstellung eines Kunststoffs enthaltend Komplexe aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation. Der so hergestellte Kunststoff kann als Beschichtung oder Bestandteil einer medizinischen Vorrichtung, z.B. eines Stents, realisiert sein, der beispielsweise nach Kontakt des Kunststoffs mit Zellen oder Gewebe die Nukleinsäuren wieder abgeben kann.

Stand der Technik

DE 601 15203T2 beschreibt ein beschichtetes Implantat, wobei die Beschichtung aus einem Kunststoff mit zwitterionischen und kationischen Gruppen besteht und Nukleinsäure enthält. Hergestellt wird dieses Implantat dadurch, dass das kunststoffbeschichtete Implantat in eine wässrige Lösung getaucht wird, die in Wasser gelöste Nukleinsäuren enthält. Dabei werden die Nukleinsäuren von dem Kunststoff aufgenommen und gebunden. Das Implantat kann nach dem Kontakt mit der wässrigen Nukleinsäure-Lösung getrocknet und sterilisiert werden. Nachteilig an diesem Verfahren ist, dass es auf einen einem Kunststoff mit zwitterionischen und kationischen Gruppen beschränkt ist, so dass andere für eine Beschichtung geeignete Kunststoffe nicht zur Verwendung kommen. Weiterhin nachteilig ist, dass der beschriebenen Kunststoff kationische Gruppen besitzt. Dadurch werden Zellen, die an ihrer Oberfläche Phosphate besitzen an diesen Kunststoff gebunden. Diese Eigenschaft kann der zu erzielenden Wirkung entgegengesetzt sein.

Ein weiterer Nachteil an dem in DE 601 1 5203T2 beschriebenen Verfahren ist der Kontakt der zur Aufnahme der Nukleinsäuren in den Kunststoff genutzt wird. Der Kontakt zur Aufnahme der Nukleinsäuren in den Kunststoff wird in DE 601 15203T2 in einem wässrigen Medium vorgenommen. Nachteilig an einem Kontakt in wässrigem Medium ist, dass z.B. bei der Verwendung einer siRNA als therapeutischer Nukleinsäure ein sehr hoher Aufwand betrieben werden muss, um die Aktivität von ubiquitär in wässrigen Medien vorkommenden Nukleasen, insbesondere RNAsen, zu unterdrücken. Nukleasen können sowohl bei der Herstellung als auch bei der Lagerung der Implantate die enthaltenen Nukleinsäuren abbauen und somit die Wirkung und Zuverlässigkeit der therapeutischen Nukleinsäuren negativ beeinflussen. Ein weiteres Ziel ist es einen nukleinsäurehaltigen Kunststoff zu beschreiben, der sowohl bei der Herstellung als auch im fertigen Implantat die Stabilität der Nukleinsäuren fördert und insbesondere die Nukleinsäuren gegen Nuklease-Abbau schützt.

Ein weiterer Nachteil der an dem in DE 601 15203T2 beschriebenen Verfahren ist, das bei der Freisetzung der Nukleinsäure keine Hilfsmittel zur Aufnahme der Nukleinsäuren zur Verfügung stehen. In dem besagten Verfahren wird die Nukleinsäure als freie, sogenannte nackte Nukleinssäure freigesetzt, die nur eine geringe Aufnahme in Gewebezellen ermöglicht. Ein weiteres Ziel ist es einen nukleinsäurehaltigen Kunststoff zu beschreiben, der die Aufnahme der Nukleinsäuren in Zellen aktiv fördert.

Aus der US 2004/0058374 A1 ist eine Methode zum Mischen von Nukleinsäure mit einem wasserunlöslichen Medium bekannt, bei der Nukleinsäurelösung durch die Zugabe einer sogenannten intermediären Lösung in ein wasserunlösliches Medium eingemischt werden kann. Beispielsweise kann DNA in Wasser gelöst und mit einer Mischung aus Ethanol und Aceton als intermediärer Lösung gemischt und sodann mit organischem Lösungsmittel wie Chloroform gemischt werden. In Letzterem kann auch ein Kunststoff wie Polystyrol gelöst sein. Diese Lösung kann zum Markieren von Feststoffen oder Gegenständen verwendet werden, indem die Lösung darauf aufgetragen wird. Nachteilig an dem Verfahren der US 2004/0058374 A1 ist, dass der größte Teil der Nukleinsäure in der wässrigen Phase außerhalb des gegebenenfalls vorhandenen Kunststoffs verbleibt, d.h. in diesen nicht effizient eingebaut wird.

Die DE 696 37 1 71 T2 betrifft Zusammensetzungen zur Gentherapie, die mit Nukleinsäure beladene Mikropartikel aus Polymeren enthalten. Diese werden hergestellt, indem eine wässrige Nukleinsäurelösung mit einem Lösungsmittel wie Dichlormethan, das in Wasser nicht löslich ist und in dem ein Polymer gelöst ist, gemischt wird und das Wasser sodann durch Gefriertrocknung entzogen wird. Der so gebildete Nukleinsäure-Polymerkomplex wird in Lösungsmittel aufgenommen und mit einer weiteren Flüssigkeit wie Petrolether gemischt, um die gewünschten Mikropartikel zu erzeugen. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist, dass die Nukleinsäure ungeschützt auf der Oberfläche der Mikropartikel angeordnet und damit einem enzymatischen Abbau zugänglich ist. Ein weiterer Nachteil ist, dass keine Vermittler zur Aufnahme der Mikropartikel in die Zielzellen vorhanden ist.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, weitere Verfahren zur Herstellung von Kunststoffen mit darin enthaltenen Nukleinsäuren zur Verfügung zu stellen. Insbesondere ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Kunststoffe mit darin enthaltenen Nukleinsäuren zur Verfügung zu stellen, die für medizinische und pharmazeutische Anwendungen geeignet sind, oder die zu therapeutischen Zwecken mit Zellen oder Gewebe von Mensch und Tier in Kontakt gebracht werden können.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung eines Kunststoffs, der Komplexe aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation enthält. Vorzugsweise ist die Nukleinsäure derart komplexiert, dass die negativen Ladungen der Nukleinsäuren durch positive Ladungen der organischen Kationen im Wesentlichen vollständig kompensiert sind. Im Prinzip werden bei diesem Verfahren die in Frage kommenden Kunststoffe oder mit entsprechenden Kunststoffen versehenen Gegenstände mit einem organischen Lösungsmittel inkubiert, in dem die vorgenannten Komplexe in gelöster Form vorliegen. Nukleinsäuren, die ansonsten in organischen Lösungsmitteln nicht löslich sind, können in hohen Mengen in organischen Lösungsmitteln gelöst werden, wenn Ihre negativen Ladungen durch entsprechende Kationen neutralisiert werden. Die Nukleinsäurekomplexe dringen dann, ggf. mit Hilfe des Lösungsmittels, in den Kunststoff ein (z.B. über Diffusion). Da die Nukleinsäuren im Wege dieses Verfahrens nicht im Kunststoff immobilisiert werden, können die Nukleinsäuren auch zu einem späteren Zeitpunkt wieder in gleicher Weise (z.B. per Diffusion) wieder an die Umgebung abgegeben werden. In den Kunststoffen des vorliegenden Verfahrens befinden sich die Nukleinsäuren bzw. Nukleinsäurekomplexe im Wesentlichen innerhalb des Kunststoffpolymers und nicht, zumindest nicht vorwiegend, auf der Oberfläche des Kunststoffpolymers.

Ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst folgende Schritte: a) In-Kontakt-Bringen:

i) von Komplexen aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation;

ii) einer Flüssigkeit umfassend mindestens ein organisches Lösungsmittel, wobei die Flüssigkeit so gewählt ist, dass sich die Komplexe aus i) bei Kontakt mit der Flüssigkeit in dem organischen Lösungsmittel lösen; und

iii) mindestens einem Kunststoff und/oder einem Kunststoff umfassenden Gegenstand wobei der Kunststoff in der Flüssigkeit aus ii) quellbar aber vorzugsweise nicht löslich ist;

c) ggf. Abtrennen des Kunststoffs von der Flüssigkeit.

Im Prinzip umfassen die Verfahren der vorliegenden Erfindung drei„Komponenten", nämlich den Kunststoff, das Lösungsmittel und die Nukleinsäurekomplexe. Das In-Kontakt-Bringen der einzelnen Komponenten kann parallel (alle 3 Komponenten werden gleichzeitig zusammengebracht) oder sequentiell erfolgen (2 Komponenten werden zunächst in Kontakt gebracht und die Dritte anschließend hinzugegeben).

Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann z.B. die folgenden Schritte umfassen: a) Bereitstellen einer Flüssigkeit umfassend mindestens ein organisches Lösungsmittel, wobei das organische Lösungsmittel darin gelöste Komplexe aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation enthält, b)ln-Kontakt-Bringen eines Kunststoffs und/oder eines einen Kunststoff umfassenden Gegenstands mit der Flüssigkeit, wobei der Kunststoff in der Flüssigkeit quellbar aber vorzugsweise nicht löslich ist;

c) ggf. Abtrennen des Kunststoffs von der Flüssigkeit.

Ebenso kann beispielsweise folgende Reihenfolge gewählt werden: a) Bereitstellen von Komplexen aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation,

b) In-Kontakt-Bringen der Komplexe aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation mit einer Flüssigkeit, die: i) mindestens ein organisches Lösungsmittel enthält, wobei bei Kontakt der Flüssigkeit mit den Komplexen aus a) diese Komplexe in dem organischen Lösungsmittel löslich sind, und

ii) einen Kunststoff oder einen Kunststoff umfassenden Gegenstand enthält, wobei der Kunststoff in der Flüssigkeit quellbar aber vorzugsweise nicht löslich ist; c) ggf. Abtrennen des Kunststoffs von der Flüssigkeit.

In den erfindungsgemäßen Verfahren umfasst das In-Kontakt-Bringen (also den Schritt, in dem alle 3 Komponenten zusammen vorliegen) vorzugsweise eine Inkubationsphase von 1 Minute oder mehr, z.B. 5 Minuten oder mehr, 10 Minuten oder mehr, 20 Minuten oder mehr, 30 Minuten oder mehr, eine Stunde oder mehr, zwei Stunden oder mehr, oder ggf. sogar 12 Stunden oder mehr.

Je nach Inkubationszeit, Dicke und Dichte des zu durchdringenden Kunststoffs und der Flüssigkeit mit dem Lösungsmittel zugänglichen Oberfläche etc., können Kunststoffe entstehen, die einen Konzentrationsgradienten hinsichtlich der Nukleinsäurekomplexe aufweisen, d.h. die Konzentration der Nukleinsäurekomplexe nimmt ausgehend von der Oberfläche des Kunststoffs (d.h. der Einwirkungsseite des Lösungsmittels) hin zum Zentrum des Kunststoffs ab. In der Anfangsphase der Inkubation wird in der Regel häufig ein derartiger Konzentrationsgradient auftreten. Mit längerer Inkubationsdauer wird sich zunehmend ein Konzentrationsgleichwicht einstellen. Bei dünnen Kunststofffolien, die von beiden Seiten inkubiert werden, ist dies z.B. schnell erreichbar, bei dickeren Schichten, die nur einseitig mit dem Lösungsmittel in Berührung kommen, ist dies erst deutlich später erreicht.

Bevorzugte Ausführungsformen sind in der nachfolgenden Beschreibung offenbart. Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Erfindungsgemäß wird unter Kunststoff ein organisches Homopolymer oder Copolymer oder höheres Copolymer (z.B. ein Terpolymer) verstanden, das normalerweise als Festkörper (bei Standardbedingungen) vorliegt und dessen Grundgerüst synthetisch oder halbsynthetisch aus monomeren organischen Molekülen hergestellt wird. Mit Kunststoff werden vorliegend auch solche Polymere bezeichnet, die aus natürlichen Quellen stammen, aber chemisch-synthetisch, gegebenenfalls auch nur geringfügig, modifiziert worden sind. Die Kunststoffe der vorliegenden Erfindung umfassen mehr als 20 Monomereinheiten. Monomore oder Oligomere (mit bis zu 20 Monomeren) fallen erfindungsgemäß nicht unter die Definition Kunststoff. Ferner fallen unter den Begriff Kunststoff keine Nukleinsäure- und Proteinpolymere, selbst wenn sie synthetisch hergestellt sind. Ferner muss der Kunststoff nicht isoliert vorliegen, sondern kann beispielsweise Bestandteil eines Gegenstands bzw. einer Vorrichtung sein. So können beispielsweise mit dem erfindungsgemäßen Verfahren mit Kunststoff beschichtete (oder entsprechende Kunststoffbauteile aufweisende) Implantate wie Endoprothesen, chirurgisches Nahtmaterial, Stents, Katheter oder Kontaktlinsen behandelt werden. Ferner wird erfindungsgemäß unter einem Kunststoff ein Feststoff verstanden, nicht aber ein Kunststoff in Lösung.

In den Komplexen aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation sind die negativen Ladungen der Nukleinsäure vorzugsweise durch positive Ladungen organischer Kationen im Wesentlichen vollständig kompensiert.„Im Wesentlichen vollständig kompensiert" bedeutet hier insbesondere, dass das Verhältnis der Anzahl an positiven Ladungen der Kationen zu negativen Ladungen der Nukleinsäure vorzugsweise größer oder gleich 0,5 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,6 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,7 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,8 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,9 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,91 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,92 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,93 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,94 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,95 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,96 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,97 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,98 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,985 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,99 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,995 ist, oder sogar gleich 1 ist. Das Verhältnis der Anzahl an positiven Ladungen der Kationen zu negativen Ladungen der Nukleinsäure kann beispielsweise in dem Bereich 0,5 - 2 liegen, z.B. im Bereich 0,6 - 1 ,8 liegen, im Bereich 0,7 - 1 ,3 liegen, im Bereich 0,8 - 1 ,2 liegen, im Bereich 0,9 - 1 ,1 liegen, im Bereich 0,91 - 1 ,09 liegen, im Bereich 0,92 - 1 ,08 liegen, im Bereich 0,93 - 1 ,07 liegen , im Bereich 0,94 - 1 ,06 liegen, im Bereich 0,95 - 1 ,05 liegen, im Bereich 0,96 - 1 ,04 liegen, im Bereich 0,96 - 1 ,04 liegen, im Bereich 0,97 - 1 ,03 liegen, im Bereich 0,98 - 1 ,02 liegen, im Bereich 0,99 - 1 ,01 liegen, im Bereich 0,995 - 1 ,005 liegen, oder sogar gleich 1 ist. Letzterer Wert wird insbesondere dann erzielt, wenn Kationen bei der Fällung der Nukleinsäure im Überschuss vorliegt und das Präzipitat aus organischen Kation und Nukleinsäure mit Wasser gewaschen wird „Mindestens ein organisches Kation" bedeutet, dass mindestens ein Typ an organischem Kation vorliegt (z.B. CTAB). Es können aber auch Kationengemische von zwei oder mehr, drei oder mehr, vier oder mehr, fünf oder mehr, etc. unterschiedlichen organischen Kationen vorliegen (z.B. CTAB neben DDAB). Üblicherweise ist das mindestens eine organische Kation einfach positiv geladen. Dem Fachmann ist klar, dass der Ausdruck nicht auf die Stoffmenge abstellt.

„Mindestens ein organisches Lösungsmittel" bedeutet, dass mindestens ein organisches Lösungsmittel vorliegt. Es können aber auch Lösungsmittelgemische (z.B. unter Bildung einer homogenen Phase) eines organischen Lösungsmittels mit einem oder mehr, zwei oder mehr, drei oder mehr, vier oder mehr, fünf oder mehr, etc. weiteren Lösungsmitteln, insbesondere weiteren organischen Lösungsmitteln vorliegen. Die Nukleinsäuren werden dann entsprechend in diesen Lösungsmittelgemischen gelöst. Bei Vorliegen eines nichthomogenen Gemisches mit mehreren Phasen liegen die Nuklei nsäurekomplexe erfindungsgemäß in einer organischen Phase eines organischen Lösungsmittels oder Lösungsmittelgemisches innerhalb des nichthomogenen Gemisches vor. Bei einem Öl/Wasser Gemisch würden erfindungsgemäß beispielsweise die Nukleinsäurekomplexe in der Ölphase vorliegen.

. Der Kunststoff kann z.B. als eigenständiger Feststoff vorliegen, er kann aber auch z.B. als Bestandteil eines Gegenstands oder einer Vorrichtung vorliegen, z.B. in Form einer Beschichtung. Üblicherweise wir der Kunststoff in den erfindungsgemäßen Verfahren direkt mit dem Lösungsmittel mit den darin enthaltenen Nukleinsäurekomplexen inkubiert. In solchen Ausführungsformen liegt nicht nur kein anderes organisches Lösungsmittel vor, sondern gar kein anderes Lösungsmittel.

Der im Verfahren vorgesehene optionale Schritt des Abtrennens des Kunststoffs von der Flüssigkeit umfassend mindestens einen organischen Lösungsmittel kann z.B. bedeuten, dass der Kunststoff von dem mindestens einen organischen Lösungsmittel (zumindest im Wesentlichen) abgetrennt wird, d.h. zum Beispiel ein kunststoffhaltiger Gegenstand aus dem Lösungsm ittel bad entnommen wird. Der Schritt soll nicht bedeuten, dass zwingend auch Lösungsmittel, dass in den Kunststoff eingedrungen ist, entfernt werden muss. Selbstverständlich ist es aber auch möglich, diese Restlösungsmittelmengen ebenfalls zu verringern oder zu entfernen, z.B. durch Trocknung des Kunststoffs. „Mindestens eine Nukleinsäure" bedeutet, dass mindestens eine Nukleinsäure vorliegt. Es können aber auch Nukleinsäuregemische von zwei oder mehr, drei oder mehr, vier oder mehr, fünf oder mehr, etc. unterschiedlichen Nukleinsäuren vorliegen. Der Unterschied kann beispielsweise im Typ der Nukleinsäure (z.B. DNA neben RNA) und/oder der Sequenz der Nukleinsäuren (Länge und/oder Basenabfolge) begründet sein.

Unter einer „Nukleinsäure" ist erfindungsgemäß eine Nukleinsäure zu verstehen, deren Nukleoside durch Phosphatgruppen miteinander verknüpft sind, wobei die beteiligten Phosphatreste üblicherweise negativ geladen sind, wie es bei natürlich verkommender DNA oder RNA der Fall ist.

Mit anderen Worten handelt es sich bei den geladenen Nukleinsäuren um polyanionische Säuren (Polyelektrolyte), in denen die anionischen Gruppen durch die negativ geladenen Sauerstoffreste der Phosphatgruppen gebildet werden, die die Phosphordiestherbindungen bilden. Grundsätzlich kann es sich bei den die negativen Ladungen tragenden Resten der Nukleinsäuren auch um die negativen Reste von Phosphorthioaten oder Phosphordithioaten oder auch um andere negativ geladene Gruppen von Nukleinsäuren handeln.

Eine Nukleinsäure bzw. ein Nuklei nsäurekomplex aus Nukleinsäure und organischem Kation wird im Sinne der Erfindung als gelöst erachtet, wenn sie/er sich durch eine 5-minütige Zentrifugation bei 15000 x g nicht abzentrifugieren lässt.

Die Größe der Nukleinsäure ist erfindungsgemäß unkritisch. In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der Nukleinsäure um ein Oligonukleotid, d.h. um einzelsträngige oder doppelsträngige DNA oder RNA (oderDNA/RNA Hybride) mit einer Kettenlänge von etwa 2 bis etwa 150 Nukleotiden, bevorzugt von etwa 5 bis etwa 100 Nukleotiden, bevorzugt etwa 10 bis etwa 80 Nukleotiden, besonders bevorzugt etwa 20 bis etwa 60 Nukleotiden. Das Oligonukleotid ist vorzugsweise ein synthetisch hergestelltes Oligonukleotid mit bekannter Sequenz. Bei den Nukleinsäuren kann es sich beispielsweise um DNA, cDNA, mRNA, sRNA, Ribozyme, Antisense-DNA, RNA, Antisense RNA, siRNA, Decoys, tRNA, rRNA, snRNA, snoRNA, oder miRNA handeln. In einer besonderen Ausführungsform ist die Nukleinsäure keine siRNA. Für eine therapeutische Anwendung ist es besonders vorteilhaft, wenn die Nukleinsäuren zumindest einen Teil einer Sequenz eines (z.B. humanen oder tierischen) Genoms oder auch Gens enthalten. Für die kosmetische Anwendung kann es wiederum vorteilhaft sein, wenn die Nukleinsäuren keine Sequenz eines (humanen) Genoms oder auch Gens enthalten.

In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der Nukleinsäure um einen Vektor oder um ein Plasmid, z.B. mit einer Größe von mehr als 1 kb (1000 Nukleotide). Die Größe des Vektors oder des Plasmids wird in der Regel mehr als 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 1 1 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb oder sogar mehr als 20 kb betragen. Es kann sich bei der Nukleinsäure, die in den Kunststoff eingebracht werden soll, z.B. um einen Gentherapie-Vektor handeln, der für die Expression in einem Säugetier verabreicht wird. Beispiele für Gentherapie-Vektoren, die sich für die erfindungsgemäße Einbringung eignen, umfassen beispielsweise virale und nicht-virale Vektoren. Virale Vektoren leiten sich von verschiedenen Viren ab, z.B. von Retroviren, Herpesviren, Adenoviren oder von Adeno- assoziierten Viren (AAV), siehe Lundstrom, Trends Biotechnol. (2003), 21 (3):1 1 7-22. Vorzugsweise handelt es sich bei den viralen Vektoren um solche, die nicht mehr in der Lage sind, sich in den damit transfizierten Zellen zu replizieren. Neben den viralen Vektoren können auch nicht-virale Vektoren, z.B. eukaryontische Expressionsvektoren, in die Zellen oder Gewebe eingebracht werden. Die Vektoren oder Plasmide umfassen vorzugsweise einen eukaryotischen Promotor, der in dem Säugetier aktiv ist.

Geeignete organische Kationen im Rahmen der vorliegenden Erfindung (bzw. Quellen für die Kationen) sind dabei beispielsweise kationische Detergenzien, Lipide und Stickstoffverbindungen mit quartärem Stickstoff, wie z.B. organische Ammoniumsalze. Insbesondere können als Quelle für organische Kationen eine oder mehrere Verbindungen der Formel NR ₄ X verwendet werden, wobei R jeweils unabhängig voneinander ein Kohlen wasserstoffrest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, der verzweigt oder unverzweigt sein kann, ist und X ein Halogen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Chlor, Brom, lod ist, insbesondere Chlor oder Brom, vorzugsweise Brom. Insbesondere enthält der Kohlenwasserstoffrest jedoch vorzugsweise nur C- und H-Atome.

Gemäß weiteren Ausführungsformen der Erfindung können die Quelle für das mindestens eine organische Kation eine oder mehrere Verbindungen der Formel NR ¹ R ² R ³ R ⁴ X sein, wobei R ¹ , R ² , R ³ und R ⁴ organische Reste darstellen, insbesondere Kohlenwasserstoffreste wie vorstehend definiert, und wobei zumindest R ¹ ein C1 -Rest ist und R ² bis R ⁴ längerkettige Reste sind, oder

R ¹ und R ² jeweils ein C1 -Rest sind und R ³ sowie R ⁴ längerkettige Reste sind, oder

R\ R ² und R ³ jeweils ein C1 -Rest sind und R ⁴ ein längerkettiger Rest ist.

Insbesondere sind die Reste R ¹ , R ² , R ³ und R ⁴ jeweils und unabhängig voneinander wie nachstehend für "R" definiert.

R ist in den Verbindungen der Formel NR ₄ X vorzugsweise ein Alkylrest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, der verzweigt oder unverzweigt sein kann. Insbesondere können einer oder mehrere, insbesondere zwei oder drei, von R relativ kurzkettige Reste wie C1 bis C3, wie Methyl, Ethyl und Propyl sein, während ein R ein längerer Rest wie C8 oder C10 bis C20, insbesondere C10 bis C1 6, wie Octyl, Nonyl, Decyl, Undecyl, Dodecyl, Tridecyl, Tetradecyl, Pentadecyl, Cetyl, Heptadecyl, Icosanyl, Stearyl oder Nonadecyl ist. Eine bevorzugte Kombination von Resten R ist drei Methylreste und ein längerkettiger Rest, insbesondere ein wie vorstehend definierter C10 bis C20-Kohlenwasserstoffrest wie insbesondere ein Cetylrest wie in Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB). Vorzugsweise umfasst R keine aromatischen und/oder nicht-aromatischen Ringsysteme.

Vorzugsweise handelt es sich bei dem mindestens einen organischen Kation (bzw. der Quelle für das Kation) um ein oder mehrere quartäre Amine, wobei CTAB besonders bevorzugt ist. Andere Verbindungen, die sich erfindungsgemäß für die Komplexierung der Nukleinsäuren eignen, umfassen Benzethoniumchlorid, Benzalkonium, Benzalkoniumchlorid, Didecyldimethylammoniumbromid (DCAB), Dodecyltrimethylammoniumbromid (DCTAB), DOTAP, Lipofectin, Lipofectamin N-[1 -(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium- chloride (DOTMA), Dimethyldioctadecyl-ammoniumbromid (DDAB), dioleyl- dimethylammoniumchloride (DODAC), 2,3-Dioleoyloxy-N-[2-(spermidin carboxy- amido)ethyl]-N-Ndimethyl-1 -propaniniumtrifluoracetat (DOSPA), Diheptadecylamidoglycyl- spermidin (DHGS) und Ähnliche. Vorzugsweise ist das organische Kation nicht Polylysin und oder TC-Chol.

Ein geeignetes Verfahren zur Herstellung von Komplexen aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischem Kation umfasst die Lösung mindestens einer Nukleinsäure in einer wässrigen Flüssigkeit, insbesondere Wasser (z.B. demineralisiert.es Wasser), und Präzipitation der mindestens einen Nukleinsäure durch Zugabe von mindestens einem organischem Kation, das mit der Nukleinsäure einen in der wässrigen Lösung unlöslichen Komplex bildet. Die derartig gewonnen Komplexe kann dann in einem organischen Lösungsmittel gelöst werden und anschließend ggf. mit weiteren Flüssigkeiten vermischt werden.

Insbesondere kann ein solches Verfahren die folgenden Schritte umfassen:

a') Bereitstellen einer Lösung mit mindestens einer in einer wässrigen Flüssigkeit gelösten Nukleinsäure,

b') Präzipitieren der mindestens einen Nukleinsäure durch Zusatz mindestens eines mit der Nukleinsäure in der wässrigen Flüssigkeit unlösliche Komplexe bildenden organischen Kations (Komplexbildner) zu der wässrigen Flüssigkeit,

c') Abtrennen der Komplexe von der wässrigen Flüssigkeit, und

d') optional Lösen der Komplexe in mindestens einem organischen Lösungsmittel, und e') ggf. Vermischen des mindestens einen organischen Lösungsmittels aus d') mit den darin gelösten Komplexen mit einer weiteren Flüssigkeit.

Vorzugsweise wird der Komplexbildner der wässrigen Flüssigkeit in Schritt b') in gelöster Form zugesetzt. Dadurch wird eine schnellere Präzipitation ermöglicht als beim Zusatz eines ungelösten Komplexbildners. Die Nukleinsäure wird dabei mit dem mindestens einen organischen Kation vorzugsweise so komplexiert, dass ein Verhältnis von im Wesentlichen 1 :1 (d.h. im Wesentlichen vollständig kompensiert) zwischen den negativen Ladungen (d.h. den anionischen Gruppen) der mindestens einen Nukleinsäure und den Ladungen des mindestens einen organischen Kations vorliegt. Insbesondere organische Kationen wie die oben erwähnten, z.B. CTAB, sind in der Lage, die positiv geladene Gruppe in einen ausreichend kleinen Abstand an das negativ geladene Sauerstoffatom der Nukleinsäure anzunähern, sodass eine ausreichende (lokale) Abschirmung der Gesamtladung beider Ionen bewirkt wird.

Vorteilhaft an der Einstellung eines solchen Verhältnisses ist, dass der Komplex aus organischen Kationen und Nukleinsäure insgesamt annähernd ladungsneutral ist, d.h. im Wesentlichen vollständig komplexiert ist. Die komplexierte Nukleinsäure ist daher in einem wässrigen Medium unlöslich und kann bei der Herstellung in wässrigen Medien als unlösliches Präzipitat abgetrennt werden. Diese Eigenschaft erleichtert somit die Herstellung der gewünschten, stöchiometrisch komplexierten Nukleinsäure. Das Abtrennen der Komplexe gemäß Schritt c') erfolgt daher vorzugsweise mittels Zentrifugati on oder Filtration. Diese Verfahren stellen eine besonders einfache und effiziente Art der Abtrennung der präzipitierten Komplexe dar. Das Präzipitat kann z.B. durch Zentrifugation zum Beispiel für 1 bis 10 Minuten, vorzugsweise 5 Minuten, bei 10000 bis 20000 g, vorzugsweise 15000 g, abgetrennt werden. Gegebenenfalls kann dieser Vorgang nach erneuter Aufnahme des gefällten Niederschlags in Wasser mehrmals durchgeführt werden. Vorteilhaft an der Einstellung eines solchen Verhältnisses ist ferner, dass bei Kontakt der so komplexierten Nukleinsäure mit einer lebenden Zelle oder einem Organ eines Lebewesens keine bzw. nur wenige freie organische Kationen mit den Zellen oder dem Organismus wechselwirken können. Als Folge davon können die organischen Kationen keine cytotoxischen Effekte oder andere Störungen des Metabolismus bei den Zellen auslösen, was ansonsten häufig vorkommen kann.

Ein weiterer Vorteil der Einstellung einer stöchiometrischen Komplexierung ist die resultierende Löslichkeit in einer Vielzahl von organischen Lösungsmitteln einschließlich solchen, die allgemein als Fällungsmittel für Nukleinsäure aus wässriger Lösung gelten. Dies betrifft insbesondere die Verwendung von niederen Alkoholen wie Ethanol, Propanol oder Butanol. In derartigen Lösungsmitteln kann sogar eine Konzentration an komplexierter Nukleinsäure wie in neutralen oder wässrigen Medien erreicht werden, d.h. es können Konzentrationen von mehr als 10 pg Nukleinsäure pro μΙ Lösungsmittel erreicht werden, zum Beispiel in Methanol, Ethanol, Butanol, Dimethylsulfoxid oder Ethylenglykolethylether (EGE).

Ein weiterer Vorteil der Einarbeitung von Nukleinsäuren in organische Lösungsmittel ist die daraus resultierende Stabilität. Dies ist im Wesentlichen darauf zurückzuführen, dass Nukleasen in nicht-wässriger Umgebung inaktiv sind. Dies ist vor allem bei Verwendung von Ribonukleinsäure (RNA) als Nukleinsäure von Bedeutung, da in allen wässrigen Systemen mit einer hohen RNAse-Aktivität gerechnet werden muss. Außerhalb einer speziellen, RNAse-freien Umgebung, die praktisch nur unter speziellen Laborbedingungen realisiert werden kann, ist ansonsten mit einem schnellen Abbau der RNA zu rechnen, was insbesondere den Einsatz von RNA als Pharmakon erschwert. Dieses Problem wird durch die bei der vorliegenden Erfindung verwendete Komplexierung mit anschließendem Einbau in einen Kunststoff gelöst.

Ferner ist die Stabilität der komplexierten, gelösten Nukleinsäuren auch dadurch erhöht, dass in dem eingesetzten organischen Lösungsmittel bzw. Kunststoff keine saure oder alkalische Umgebung mehr vorliegt. Dies vermeidet eine etwaige saure oder alkalische Hydrolyse der Nukleinsäurestrukturen.

Schließlich wirkt es sich auf die Stabilität der Nukleinsäure vorteilhaft aus, dass verglichen mit Wasser die optischen Eigenschaften des Lösungsmittels bzw. des Kunststoffs durch eine vergleichsweise höhere UV-Strahlungsabsorption gekennzeichnet sind. Dadurch wird die bei Verwendung von wässrigen Medien ansonsten mögliche UV-Schädigung der Nukleinsäurestrukturen vermindert bzw. vollständig vermieden. Zum Beispiel führt die Verwendung von Kunststoffen, die aromatische Strukturen enthalten, die bei einer Wellenlänge von um 260 nm absorbieren, zu einer weitestgehenden Abschirmung der für die Nukleinsäure schädigenden UV-Strahlung.

Im Zuge der Komplexierung der mindestes einen Nukleinsäuren können selbstverständlich wie oben erwähnt auch verschiedene organische Kationen Verwendung finden, indem man Mischungen unterschiedlicher organischer Kationen zu der nukleinsäurehaltigen wässrigen Flüssigkeit gibt, um die Nukleinsäure-Komplexe zu präzipitieren.

Die durch Präzipitation erhaltenen Komplexe werden bevorzugt in einem organischen Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch gelöst. Nach Aufnahme in einem organischen Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch enthält dieses im Wesentlichen vorzugsweise keine organischen Kationen, die über die zur Kompensation der negativen Ladungen der Nukleinsäure erforderliche Menge hinaus gehen. Dies bedeutet, dass die Anzahl der gesamten positiven Ladungen der organischen Kationen in dem organischen Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch im Wesentlichen mit der Anzahl der negativen Ladungen der Nukleinsäure identisch ist.

Organische Lösungsmittel, die besonders geeignet zur Aufnahme der Nuklei nsäurekomplexe sind, umfassen insbesondere ein- oder mehrwertige Alkohole oder teilweise veretherte Alkohole. Bevorzugt enthalten das oder die zusätzlichen Lösungsmittel daher mindestens eine Ether-Gruppe und/oder mindestens eine Hydroxyl-Gruppe. Als Lösungsmittel besonders gut geeignete (amphiphile) Verbindungen können durch die Formel HO-R1 -O-R2 beschrieben werden. Dabei ist R1 und R2 jeweils ein Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen. Insbesondere sind C1 bis C5-Alkohole geeignet, wie z.B. Methanol, Ethanol, 1 -Propanol oder 2-Propanol, Butanol, wie 1 -Butanol, oder Pentadiol, wie 1 -Pentadiol. Ferner sind mehrwertige Alkohole, wie Ethylenglykol oder teilweise veretherte Derivate davon, wie z.B. Ethylenglykol, das mit Methanol, Ethanol, Propanol oder Butanol verethert ist, wie beispielsweise Ethylenglykolether, wie insbesondere Ethylenglykolmonobutylether, -ethylether oder methylether, verwendbar. Alternativ können gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffe, wie Pentan, Hexan oder Heptan oder auf Benzol basierende aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Xylol oder Styrol, verwendet werden, also insbesondere mit C1 bis C3- Resten substituierte Benzole. Alternativ können halogenhaltige Lösungsmittel wie Chloroform, Dichlormethan oder Tetrachlorkohlenstoff oder andere heteroatomhaltige Lösungsmittel, wie Dimethylformamid oder Tetrahydrofuran, verwendet werden. Ferner können Carbonsäurederivate wie Ester wie insbesondere Essigsäureethylester oder, Methacrylsäuremethylester, Ketone wie Aceton, Butanon, Amine, wie Ethanolamin, Amiden, wie Ν,Ν-Dimethylformamid; Sulfoxide wie Dimethylsulfoxid; Nitrile, wie Acetonitril; Fette und Öle, wie Mandelöl, Distelöl, Walnussöl, Weizenkeimöl, Leinöl, oder Rizinusöl Verwendung finden.

Die nachstehende Tabelle 1 gibt eine Übersicht über die Löslichkeit komplexierter Nukleinsäure am Beispiel von DNA in einer Reihe von speziellen Lösungsmitteln.

Tabelle 1 :

Nach Herstellung der komplexierten Nukleinsäure kann diese erfindungsgemäß durch Kontaktierung mit einem Kunststoff zu dem erfindungsgemäßen Kunststoff verarbeitet werden. Dazu wird im Allgemeinen vorzugsweise die wie zuvor beschrieben hergestellte komplexierte Nukleinsäure mit dem Kunststoffkörper unmittelbar in Kontakt gebracht und inkubiert.

Wie oben erwähnt, können als Kunststoffe Homopolymere, d.h. Polymere mit Einheiten, die von nur einem Monomer abgeleitet sind, oder Co-Polymere eingesetzt werden, d.h. Kunststoffe die von zwei oder mehreren Monomeren abgeleitete unterschiedliche Einheiten aufweisen. Geeignete Polymere bzw. Copolymere sind beispielsweise Polyolefine mit aliphatischen oder aromatischen Einheiten, Polyalkylene, Polyalkylene mit Ungesättigtheiten, halogensubstituierte Polyalkylene, Polyoxyalkylene, Polystyrol und Styrol-Copolymere, Polyester, Polyether, Polyamide, Polycarbonate, Polyurethane, Polysiloxane, Poly(meth)acrylsäure und deren Ester und weitere Derivate wie Polyacrylnitril, Polyvinylmaterialen wie Polyvinylacetate, -alkohole, -halogenide, etc. und Copolymere oder höhere Copolymere mit einer Kombination von Einheiten der vorstehenden Polymere wie Styrol-Acrylnitril-Copolymere oder Acrylnitril- Butadien-Styrol-Terpolymere sowie von natürlichen Polymeren abgeleitete Kunststoffe wie Celluloseester oder -ether. Besonders vorteilhaft ist, dass auch biologisch abbaubare Polymere wie z.B. Polylactide Verwendung finden können. Geeignet für dieses Verfahren sind alle Kunststoffe die in der genannten mindestens ein organisches Lösungsmittel umfassenden Flüssigkeit quellbar sind. Unter der Quellbarkeit ist die Aufnahme der Flüssigkeit in den Kunststoff zu verstehen. Geeignet sind alle Kunststoffe, die bei Kontakt mit der Flüssigkeit die Flüssigkeit zu einer Konzentration von mehr als 0,1 Gewichtsprozent (1 mg Flüssigkeit mit komplexierter Nukleinsäure) aufnehmen können.

Erfindungsgemäß werden die Nukleinsäurekomplexe in Kunststoffe eingebracht, die im entsprechend für die Lösung der Nukleinsäure-Komplexe verwendeten Lösungsmittel quellbar aber vorzugsweise unter den Bedingungen des Kontakts mit den gelösten Nukleinsäurekomplexen nicht löslich sind. Falls der Kunststoff im gewählten Lösungsmittel löslich sein sollte, so wird die Inkubationszeit zwischen Nukleinsäurekomplexlösung und Kunststoff so gewählt, dass der Kunststoff (zumindest im Wesentlichen) noch nicht gelöst ist und noch als Feststoff abgetrennt werden kann. Weil der Kunststoff nicht gelöst werden soll, behält der Kunststoff bzw. kunststoffhaltige Gegenstand also vorzugsweise - zumindest im Wesentlichen - seine Form, z.B. die für seine (medizinische) Nutzung notwendige Form. Eine Kunststoffkontaktlinse bleibt eine Kunststoffkontaktlinse, ein chirurgischer Kunststofffaden bleibt ein Kunststofffaden, etc. Alternativ können die entsprechenden lösungsgefährdeten Kunststoffe auch als quervernetzte Kunststoffe eingesetzt werden, so dass die Lösung des Kunststoffs nicht mehr gegeben ist.

Die folgende Liste von Kunststoffen in Tabelle 2 nennt erfindungsgemäß geeignete Beispiele für Kunststoffe, wobei diese Liste nicht einschränkend zu verstehen ist. Die nachstehende Tabelle gibt ferner Lösungsmittel an, die zur Lösung des jeweiligen Kunststoffs führen könnten.

Tabelle 2:

Polymer Losung sjrflittel

Dimethyl-

Dichlormethan formamid Methanol Tetrahydrofuran Xylol

Acylnitril-Butadien-Styrol x X X

Celluloseacetat X X X X

Cellulosetriacetat X

Cellulosemethylether X

Polyacrylester X

Polyacrynitril X

Polyacrylsäure X X

Polyacrylsäureester X X

Polymethacrylsäureester X X

Polybutadien X X X X

Polybuten-1 X

Polycarbonat X X X

Poly-e-caprolacton X

Polydimethylsiloxan X

Polyester

(aliphatisch) X

Polyethylen X

Polyethylenoxid X

Polyformaldehyd X

Polyisobutylen X

Polymethacrylat X X X

Polyoxymethylen X X

Polypropylen

(isotaktisch) X

Polystyrol X X X X X

Polytrifluorchlorethylen X

Polyvinylacetat X X

Polyvinylalkohol X

Polyvinylchlorid X X

Polyvinylfluorid X

Polyisobutylether X

Styrol-Acrylnitril-

Copolymere X X X X

Polylactid X

Die abschließende optional Abtrennung des Lösungsmittels erfolgt dann beispielsweise durch Abziehen unter Vakuum oder durch Waschen in einer physiologischen Lösung wie z.B. 0,9% (w/v) Kochsalzlösung. Derartige Verfahren sind dem Fachmann bekannt. Es ist bevorzugt, wenn bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung der Kunststoff nicht erst polymerisiert wird, während er mit der komplexierten Nukleinsäure kontaktiert wird.

Die erfindungsgemäßen Kunststoffe können vorteilhaft beispielsweise als Mikropartikel, Nanopartikel, Pellets, Granulat, Faser (z.B. als Faden), Folie etc. vorliegen oder entsprechend zu selbigen nach Aufnahme der Nukleinsäurekomplexe verarbeitet werden. Die Kunststoffe können so beispielsweise Implantate, Herzklappen, Prothesen und ähnlichen Gegenstände sein oder Teile davon sein oder dazu verarbeitet werden und/oder auf diesen Gegenständen als Beschichtungen aufgebracht werden. Z.B. kann ein erfindungsgemäß hergestellter Kunststoff mit einer komplexierten DNA, die für Proteine kodiert, als Teil (z.B. als Beschichtung oder als Bauteil) eines Implantats verwendet werden, um ein besseres Anwachsen im Körper zu ermöglichen. Genauso kann ein Ansiedeln von Zellen auf dem Implantat verhindert werden. Z.B. ist eine Ansiedlung von Zellen auf Stents unerwünscht. Wie bereits erwähnt müssen die erfindungsgemäßen Kunststoffe nicht notwendigerweise weiterverarbeitet werden, z.B. wenn es sich bei dem Kunststoff bereits um ein kunststoffhaltiges Endprodukt handelt, dass nur noch Nukleinsäuren aufnehmen soll.

In besonders bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Kunststoffe noch mindestens ein pharmazeutisch oder kosmetisch verträglicher Hilfsstoff zugesetzt, z.B. um später die pharmazeutische bzw. kosmetische Wirksamkeit einer vom Kunststoff freigesetzten Nukleinsäure zu gewährleisten. Dem Fachmann sind zahlreiche derartige Hilfsstoffe bekannt. Besonders bevorzugt ist der Hilfsstoff ein pharmazeutisch oder kosmetisch verträgliches Öl, Wachs oder Fett.

Geeignete Öle, die als Hilfsstoff Anwendung finden können, umfassen beispielsweise synthetische, tierische und pflanzliche Öle. Ebenso umfassen geeignete Wachse bzw. Fette synthetische, tierische und/oder pflanzliche Wachse bzw. synthetische, tierische und/oder pflanzliche Fette.

Besonders bevorzugt ist es jedoch, wenn die Öle keine synthetischen Öle sind, sondern z.B. tierische und/oder pflanzliche Öle. Geeignete pflanzliche Öle sind z.B. Nussöle und Samenöle. Geeignete pflanzliche Öle umfassen insbesondere Erdnussöl, Walnussöl, Mandelöl, Haselnussöl, Kokosnussöl, Sojabohnenöl, Olivenöl, Mohnöl, Hanföl, Kürbiskernöl, Sonnenblumensamenöl, Sesamsamenöl, Baumwollsamenöl, Distelöl, Leinöl, Rapsöl, Ricinusöl und Ähnliche. Auch aus Getreide gewonnene Keimöle können vorliegend als Träger verwendet werden. Bevorzugte Keimöle umfassen z.B. solche, die aus Mais, Weizen, Hafer, Roggen, Reis und Triticale gewonnen werden. Als geeignete pflanzliche Fette können beispielsweise Kokosfett oder Kakaobutter verwendet werden. Mögliche pflanzliche Wachse umfassen bspw. Zuckerrohrwachs, Carnaubawachs, Jojobaöl, Candelillawachs und Japanwachs.

Neben pflanzlichen Ölen, Wachsen und Fetten können auch tierische Fette, Wachse und Öle, wie z.B. Fischöle oder aus Nerzen oder Hirschen gewonnene Öle und Fette, eingesetzt werden. Lebertran und Walöl (wie beispielsweise aus Spermaceti) sind Beispiele für Fischöle, die vorliegend verwendet werden können. Mögliche Quellen für tierische Wachse sind beispielsweise Walrat, Wollwachs und Bienenwachs. Geeignete Verfahren zur Gewinnung reiner Öle, Wachse und Fette tierischen Ursprungs sind im Stand der Technik bekannt.

Ggf. können auch pharmazeutisch bzw. kosmetisch verträgliche synthetische Öle, Fette und Wachse eingesetzt werden. Geeignete synthetische Öle und Fette basieren zum Beispiel auf Silikon- oder Paraffinverbindungen. Ein Beispiel ist Vaseline. Sojawachs kann durch Hydrierung aus Soja gewonnen werden und ist ein Beispiel für ein synthetisches Wachs.

Der Hilfsstoff kann zu einem geeigneten Zeitpunkt bei der Herstellung der Kunststoffe mit verarbeitet werden. Z.B. können die Nuklei nsäurekomplexe vor Kontakt mit dem Kunststoff gelöst in einem Gemisch aus organischem Lösungsmittel und Öl vorliegen, z.B. einem DMSO- Öl Gemisch. Der Hilfsstoff wird dann gemeinsam mit den Nukleinsäuren in den Kunststoff aufgenommen. Alternativ kann der Hilfsstoff beispielsweise nachträglich dem Kunststoff zugesetzt werden, z.B. der Kunststoff mit einem Öl beschichtet werden, dass ggf. die Nukleinsäuren wieder aus dem Kunststoff lösen kann.

In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen Kunststoff, der gemäß einem erfindungsgemäßem Verfahren hergestellt wurde. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung daher auch einen Kunststoff, der Nukleinsäurekomplexe wie hierein beschrieben und ggf. ein organisches Lösungsmittel umfasst, wobei der Kunststoff vorzugsweise einen Konzentrationsgradienten bzgl. der Nukleinsäurekomplexe aufweist (siehe oben). Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäß hergestellten Kunststoffs in einem Verfahren zur chirurgischen oder therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers, oder zur Verwendung in einem Diagnostizierverfahren, das am menschlichen oder tierischen Körper vorgenommen wird.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 Einbringung von komplexierter DNA in chirurgische Fäden (Polyamid-Faden); A) EtBr- CTAB-DNA in Methanol; B) EtBr-CTAB-DNA in Ethanol; C) EtBr-CTAB-DNA in Butanol; D) EtBr-CTAB-DNA in DMSO; E) EtBr-CTAB-DNA in EGE; F) Kontrolle Ethanol ohne EtBr-CTAB-DNA. Der Nachweis erfolgte über Fluoreszenzmikroskopie.

Fig. 2 Einbringung von komplexierter DNA in Kontaktlinsen; A) Kontaktlinse nach Inkubation in Ethanol mit EtBr-CTAB-DNA (links) und ohne EtBr-CTAB-DNA (rechts); B) Freigabe der EtBr-CTAB-DNA. Gezeigt ist das Eluat nach 2 Monaten Elution in Kochsalzlösung mit behandelter Linse (links) und die Kontrolle (rechts); C) Segmente einer Kontaktlinse nach Inkubation in verschiedenen EtBr-CTAB-DNA-haltigen Flüssigkeiten: obere Reihe von links nach rechts: Methanol; Ethanol; Butanol; Chloroform; untere Reihe von links nach rechts: DMSO, EGE; Benzylalkohol.

Fig. 3 Aufnahme von komplexierter DNA in Kunststoffgranulate mit verschiedenen Lösungsmitteln; A) Aufnahme in Polyamid, PA-6: Von links nach rechts: Kontrolle; Methanol; Ethanol; Butanol; leer; DMSO; EGE; Chloroform; Kontrolle; B)Aufnahme in Polycarbonat PC: Von links nach rechts: Kontrolle; Methanol; Ethanol; Butanol; Benzylalkohol; leer; EGE; leer; Kontrolle.

Die folgenden Ausführungsbeispiele veranschaulichen weitere bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.

Beispiele

Soweit nicht anders bezeichnet stammen alle Chemikalien von der Firma Sigma Aldrich Chemie GmbH, Eschenstrasse 5, 82024 Taufkirchen, Deutschland. Beispiel 1

Herstellung von komplexierter Nukleinsäure in Butanol

10 mg Heringssperma DNA wurden in 1 ml demineralisiertem Wasser gelöst.. Zu der entstandenen Lösung wurde ein gleiches Volumen 100 mM wässriger Lösung von Cetyltrimethylammoniumbromid gegeben und die Flüssigkeit gemischt. Es entstand ein gelber Niederschlag, der durch 5 min Zentrifugation bei 15.000 Upm abzentrifugiert wurde. Die flüssige Oberphase wurde verworfen und der Niederschlag in 1 ml demineralisiertem Wasser suspendiert und erneut wie oben zentrifugiert. Die wässrige Phase wurde verworfen und der Niederschlag über Nacht im Vakuum getrocknet. Der getrocknete Niederschlag wurde in 1 ml Butanol gelöst.

Beispiel 2

Herstellung von komplexierter Nukleinsäure in Ethylenglycolmonoethylether

10mg Heringssperma DNA wurden in 1 ml demineralisiertem Wasser gelöst. Zu der entstandenen Lösung wurde ein gleiches Volumen 100 mM wässriger Lösung von Cetyltrimethylammoniumbromid gegeben und die Flüssigkeit gemischt. Es entstand ein gelber Niederschlag, der durch 5 min. Zentrifugation bei 15.000 g abzentrifugiert wurde. Die flüssige Oberphase wurde verworfen und der Niederschlag in 1 ml demineralisierten Wasser suspendiert und erneut wie oben zentrifugiert. Die wässriger Phase wurde verworfen und der Niederschlag über Nacht im Vakuum getrocknet. Der getrocknete Niederschlag wurde in 1 ml Ethylenglycolmonoethylether gelöst.

Beispiel 3

Ermittlung der Mindestlöslichkeit von komplexierter Nukleinsäure in verschiedenen Lösungsmitteln

1 g Heringssperma-DNA wurden in 100 ml demineralisiertem Wasser gelöst. Je 0,5 ml wurden in Kunststoffreaktionröhrchen überführt. In jedes Röhrchen wurde 0,5 ml wässrige 100mM CTAB-Lösung zugefügt. Die Röhrchen wurden gevortext. Es entstand ein weißer Niederschlag, der durch Zentrifugation für 5 min bei 10.000 x g sedimentiert wurde. Der Überstand wurde verworfen, der Niederschlag in Wasser suspendiert und erneut zentrifugiert. Der Überstand wurde erneut verworfen und der Niederschlag über Nacht unter Vakuum getrocknet.

Je 0,5 ml der folgenden Lösungsmittel: Methanol, Ethanol, Butanol, Ethylenglykolmonobutylether, Propanol wurden in jeweils ein Röhrchen gegeben und mit dem Niederschlag bei Raumtemparatur geschüttelt. Der Niederschlag wurde durch die Lösungsmittel gelöst. Um zu prüfen, ob die komplexierte Nukleinsäure als Suspension vorliegt, wurden die Röhrchen für 5min bei 10.000xg zentrifugiert. Nach der Zentrifugation war kein Niederschlag sichtbar.

Je 100 μΙ der komplexierten DNA in Butanol und Ethylenglykolmonobutylether (10 mg/ml) wurden zu je 900 μΙ der folgenden Lösungsmittel:, Chloroform, Dichlormethan, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, , Styrol, Tetrachlorkohlenstoff, Tetrahydrofuran gegeben und gemischt. Es entstanden klare Lösungen. Um zu prüfen, ob die komplexierte Nukleinsäure als Suspension vorliegt, wurden die Röhrchen für 5 min bei 10.000 xg zentrifugiert. Nach der Zentrifugation war kein Niederschlag sichtbar.

Beispiel 4

Herstellung von CTAB-DNA mit Ethidiumbromid

In ein 50ml Schraubdeckel-Röhrchen wurde 300mg Lachssperm-DNA eingeführt und in 30ml Wasser gelöst. Die DNA-Lösung wurde mit 20ml einer 100mM CTAB- Lösung, die 5mM Ethidiumbromid enthielt versetzt und gemischt. Die entstandene Trübung der Ethidium-CTAB- DNA wurde durch 15min Zentrifugation bei 5000 x g niedergeschlagen. Der Niederschlag wurde in 30ml Wasser suspendiert und erneut zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und der der Ethidium-CTAB-DNA-Niederschlag im Speedvac über Nacht getrocknet. Der getrocknete Niederschlag wurde in den gewünschten Lösungsmittel (Ethanol, DMSO) zu einer Konzentration von 1 oder 10mg/ml aufgenommen.

Beispiel 5

Einbringung von komplexierter DNA in chirurgische Fäden

Ethidiumbromid-CTAB-DNA (EtBr-CTAB-DNA) wurde wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt und zu einer 1 % (w/v) CTAB-DNA Lösung in DMSO aufgenommen. Je 10μΙ 1 % EtBr-CTAB- DNA in DMSO wurden mit je 90μΙ folgender Lösungsmittel versetzt: Methanol, Ethanol, Butanol, Benzylalkohol, DMSO, Ethylenglycolmonoethylether (EGE). So entstanden Lösungen mit einer Konzentration von 0,1 % (w/v) EtBr-CTAB-DNA in den oben genannten Lösungsmitteln mit 10% (v/v) DMSO-Anteil. Die gleichen Mischungen mit den Lösungsmitteln wurden mit DMSO ohne EtBr-CTAB-DNA hergestellt.

Ein Polyamid-Faden (Ethilon, Ethicon, Norderstedt, Deutschland) wurde in ca. 0,5cm lange Stücke zerschnitten. Je ein Faden wurde in einem 500μΙ Kunststoff-Röhrchen mit je 100μΙ der verschiedenen EtBr-CTAB-DNA -haltige Lösungen aufgebracht. Parallel wurden Fäden im gleichen Volumen Lösungsmittel ohne EtBr-CTAB-DNA eingebracht. Die Proben wurden 24 Std. bei RT°C inkubiert. Zur Entfernung der freien EtBr-CTAB-DNA wurde die Fäden mit Ethanol gespült. Zum Nachweis der Aufnahme der EtBr-CTAB-DNA wurde die Fäden im Floureszenzmikroskop beobachtet und fotografiert. Die EtBr-CTAB-DNA konnte nach Kontakt der Fäden mit den EtBr-CTAB-DNA-haltigen Lösungen in den Fäden anhand ihrer Fluoreszenz nachgewiesen werden. Die Kontrollen ohne EtBr-CTAB-DNA zeigten keine Fluoreszenz. Beispiel 6

Einbringung von komplexierter DNA in Kontaktlinsen

EtBr-CTAB-DNA wurde wie oben beschrieben hergestellt und zu einer 0,1 % (w/v) EtBr- CTAB- DNA Lösung in Ethanol aufgenommen. Eine Kontaktlinse (Biomedics 55, Ocufilcon D, Copolymer von 2-Hydroxyethylmethacrylat und Methacrylsäure, Lensshop24.de, Vechelde, Deutschland ) wurde in ein 2ml Kunststoffgefäß überführt und mit EtBr- CTAB-DNA Lösung in Ethanol überschichtet. Die Kontaktlinse wurde über Nacht in der Lösung bei Raumtemperatur inkubiert. Durch die Inkubation wurde die Linse deutlich rot gefärbt. Die Kontaktlinse wurde aus dem Kunststoffgefäß entnommen und mehrfach in Ethanol gespült, um freies EtBr- CTAB- DNA Lösung in Ethanol zu entfernen. Zum Nachweis der aufgenommenen EtBr-CTAB-DNA wurde die Kontaktlinse auf einem UV-Kasten fotografiert. Anhand der Fluoreszenz der EtBr- CTAB-DNA konnte die Aufnahme der komplexierten DNA nachgewiesen werden. Eine Kontaktlinse, die wie oben beschrieben in Ethanol ohne EtBr- CTAB-DNA behandelt war, zeigte keinerlei Fluoreszenz. Um die Freigabe der EtBr-CTAB-DNA zu beobachten wurde die Linse in 1 ,5ml 0,9% (w/v) Kochsalzlösung eingelegt. Durch die Inkubation in Kochsalzlösung konnte ein Anteil der EtBr-CTAB-DNA wieder eluiert werden.

Eine weitere Kontaktlinse wurde in mehrere Fragmente zerschnitten und diese in den Vertiefungen einer 96well-Mikrotitelplatte mit 0,1 % EtBr-CTAB-DNA in verschiedenen Lösungsmitteln über Nacht inkubiert. Folgende Lösungsmittel wurden verwendet: Methanol; Ethanol, Butanol, Chloroform DMS, Ethylglycolmonoethylether (EGE) und Benzylalkohol. Danach wurden die Fragmente mit Methanol gewaschen und auf einem UV-Kasten fotografiert. Anhand der Fluoreszenz konnte in allen Fragmente die EtBr-CTAB-DNA nachgewiesen werden.

Beispiel 7

Aufnahme von komplexierter DNA in Kunststoffgranulate

EtBr-CTAB-DNA wurde wie oben beschrieben hergestellt und einer 1 % (w/v) CTAB-DNA Lösung in DMSO aufgenommen. Je Ί ΟμΙ 1 % (w/v) EtBr-CTAB-DNA in DMSO wurden mit je 900μΙ folgender Lösungsmittel versetzt: Methanol, Ethanol, Butanol, Benzylalkohol, DMSO, Ethylenglycolmonoethylether. So entstanden Lösungen mit einer Konzentration an 0,1 % (w/v) EtBr-CTAB-DNA in den oben genannten Lösungsmitteln mit 10% (v/v) DMSO-Anteil. Die gleichen Mischungen mit den Lösungsmitteln wurden mit DMSO ohne EtBr-CTAB-DNA hergestellt.

In je sieben 2ml Polypropylen-Kunststoff-Röhrchen wurden je 5 Granulatpartikel (Größe ca. 2mm x 1 mm x 1 mm) eines Polyamid-Granulats (PA-6, Zytel 7335F; DuPont, Bad Homburg, Deutschland) und eines Polycarbonat-Granulates (PC, Makroion AL2647, Bayer, Leverkusen, Deutschland) eingeführt. Die Granulate wurden mit ca. 1 ,5ml der 0,1 %igen EtBr-CTAB-DNA- Lösungen in den oben genannten Lösungsmitteln versetzt. Die Röhrchen wurden über mehrere Tage bei Raumtemperatur inkubiert. Nach definierten Zeiten (1 Std, 2 Std, 1 Tag, 4 Tage und 5 Tage) wurden je ein Granulat entnommen und das anhaftende Lösungsmittel durch Spülen mit Methanol entfernt. Die Granulate wurde auf einen UV-Kasten überführ und unter UV-Licht fotografiert. Als Kontrollen wurden Granulate verwendet. Anhand der Fluoreszenz zeigte es sich, dass sowohl das Polyamid-Granulat als auch das Polycarbonat-Granulat die Granulate bereits nach einer Inkubation von einer Std. EtBr-CTAB-DNA aufgenommen hatten.

Beispiel 8

Bestimmung der CTAB-DNA-Partikelgröße in DMSO-Wasser Mischungen

Für die Einbringung der Nukleinsäuren in Säugerzellen über die Haut ist die Partikelgröße der CTAB-DNA-Partikel von Bedeutung. Kleinere Partikel können leichte die Haut durchdringen und von der Zellmembran aufgenommen werden. Daher wurde die CTAB-DNA-Partikelgröße mittels dynamischer Lichtstreuung bestimmt.

200μΙ einer 1 % (w/v) Lachssperma-DNA - entsprechend 2mg - in Wasser wurden in ein 2ml Röhrchen eingefüllt. Die DNA wurde mit einem gleichem Volumen 100mM CTAB ausgefällt und der Niederschlag durch Zentrifugation (5min, 10.000 x g) präzipitiert. Das Pellet wurde in 500μΙ Wasser suspendiert und erneut zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde über Nacht im Speedvac getrocknet. In das Röhrchen wurde ein Volumen von 2ml DMSO eingefüllt und das CTAB-DNA-Pellet über Nacht geschüttelt (800 Upm). Es entstand eine klare Lösung. Die CTAB- DNA-Lösung in DMSO wurde 1 :10 mit DMSO und Wasser verdünnt, so dass verschiedene DMSO-Wasser-Mischungen im Konzentrationsbereich mit einem DMSO-Gehalt (v/v) zwischen 10 - 100% entstanden. Je 0,5 ml der verschiedenen CTAB-DNA Lösungen in den DMSO- Wasser Mischungen wurde in Kunststoffküvetten überführ und die die Partikelgröße mit Hilfe der dynamischen Lichtstreuung mit einem (Zetasizer, Malvern Instruments GmbH, 71083 Herrenberg ) gemessen.

Es ergab sich bei hohen DMSO-Konzentrationen größer als 80% (v/v) DMSO ein mittlerer Partikeldurchmesser von ca. 10nm, der sich bei zunehmendem Wassergehalt auf mehr als das 10fache erhöhte.

DMSO H20

Konzentration mittlerer Konzentration

Vol. Konz. Partikeldurchmesser Vol. Konz.

% (v/v) Nm (SD) % (v/V)

10 227 (6,7) 90

20 139 (7,1 ) 80

33 154 (5,5) 66

40 183 (6,2) 60

50 168 (4,0) 50

60 8 (3) 40

60 10 (3,1 ) 40

70 60 (4,5) 30

80 7 (1,5) 20

90 13 (2,1 ) 10

100 10 (1 ,2) 0