A presente invenção se refere a um processo de obtenção de esponjas cerâmicas. Mais especificamente o presente invento trata do processo de obtenção de esponjas de hidroxiapatita e fosfato tricálcico. Além disso, a presente invenção refere-se ao uso das referidas esponjas na engenharia tecidual óssea e têm a sua aplicação direcionada no preenchimento de defeitos ósseos causados por doenças ou acidentes, podendo ser implantadas com ou sem células.

Fundamentos da Invenção

A engenharia tecidual é um campo de estudo considerado multidisciplinar que engloba principalmente as áreas médicas, biológicas e engenharias. Cada área representa uma parte importante, como é descrito a seguir: i) engenharia produz os scaffoids que são utilizados como guia e suporte para as células, ii) biologia é responsável pela aquisição, crescimento, proliferação, diferenciação e pelo ato de semear as células tronco nos scaffoids, íii) medicina é responsável por realizar os testes in vitro, in vivo e testes clínicos.

Para a engenharia tecidual óssea é necessário utilizar suportes celulares {scaffoids) confeccionados a partir de biomateriais com as dimensões do defeito ósseo presente na região injuriada do paciente, além de ser necessário semear os scaffoids com uma grande quantidade de células para poder aumentar a probabilidade das células aderirem em toda a superfície do scaffold, e assim acabar por regenerar o tecido defeituoso [BUENO, D. F., Tese de Doutorado. Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo, São Paulo, Brasil, 2007].

Os suportes celulares utilizados recebem o nome de scaffoids, que são objetos tridimensionais com poros interconectados, esses poros devem ser controlados em tamanho e forma, devido a sua aplicação que é de suporte e guia para o crescimento celular e quando semeados com células tronco mesenquimais possuem condição de formar tecidos naturais.

As biocerâmicas apresentaram grandes avanços nesta área durante os últimos anos, mas ainda existem muitos assuntos a serem explorados tendo como finalidade estudos direcionados a engenharia tecidual óssea.

Os fosfatos de cálcio são biocerâmicas conhecidas como substitutos ósseos sintéticos, porém muito semelhantes com a fase mineral do tecido ósseo.

A hidroxiapatita (HA) sintética Caio(PO ₄ ) ₆ (OH) ₂ com massa molecular de 1004,657g/mol é um material cerâmico bioativo e que não é absorvido pelo organismo, já o fosfato tricálcico (TCP - [Ca ₃ (PO ₄ )2],) é considerado reabsorvível, e por este motivo se pensou em unir os dois na formação de um compósito.

A hidroxiapatita induz o crescimento do tecido ósseo ao mesmo tempo em que mantém uma estrutura com poros interconectados para guiar e dar suporte as células, já o fosfato tricálcico é reabsorvido e transformado em tecido ósseo.

Beta-fosfato tricálcico [p-Ca ₃ (PO ₄ ) ₂ ] (β-TCP), é considerado um biomaterial reabsorvível, esta propriedade garante o equilíbrio entre absorção do material e a formação do novo tecido ósseo [SAGAWA, H.; et al. Artificial Organs. 34, 6: 491-497, 2010].

O alfa-fosfato tricálcico [a-Ca ₃ (PO ₄ ) ₂ ] (α-TCP), é utilizado para promover a nova formação óssea e promover a calcificação de forma mais rápida. A fase alfa-TCP é gerada a partir de um tratamento térmico na fase beta-TCP, a mudança de fase se inicia quando o material atinge a temperatura de 1 150 ^< €.

Um dos objetivos que se deseja atingir na regeneração ortopédica é a rápida remineralização dos defeitos ósseos e, para atingir este objetivo, tem- se estudado a aplicação de células tronco mesenquimais com a intenção de diferenciá-las em osteoblastos. O estudo de várias condições que levam à máxima mineralização no menor tempo possível tem sido o alvo de algumas pesquisas [THIMM, B.W.; et. al. Acta Biomaterialia. 7: 2218-2228, 201 1 ]. Esta técnica vem como altemativa a enxertos e aloenxertos na área de tratamento ortopédico.

A seguir são citados os principais documentos do estado da técnica envolvendo processos de obtenção de esponjas cerâmicas.

O artigo publicado por KOH-ICHI UDOH e colaboradores (Dental Materials Journal, 29, (2), 154-159, 2010) demonstra os efeitos da sinterização na composição química do alfa-fosfato tricálcico. Neste artigo foi utilizado o método de replicação de esponja, porém foi utilizado somente alfa-TCP e o processo consistiu na formação de uma pasta cerâmica viscosa utilizando apenas água destilada com o pó de TCP, onde o material é imerso e revestido. O scaffold formado une as características da HA e do TCP, pois enquanto a HA induz o crescimento do tecido ósseo e mantém a estrutura estável o TCP é reabsorvido formando HA natural, isso é importante para ajudar a guiar as células durante a neoformação óssea. Além disso, no presente invento a utilização da solução coloidal de hidroxiapatita aplicada na barbotina ao invés de água como foi citado no artigo de UDOH, auxilia na melhora das propriedades mecânicas da esponja formada. As temperaturas de 1500 ⁹ C e 1550 ^Q C utilizadas na sinterização do scaffold apresentado no artigo de UDOH elimina a microporosidade das superfícies dos scaffolds, diferentemente da presente invenção que utiliza temperaturas mais baixas e assim mantém a microporosidade, ajudando na fixação celular.

Segundo o artigo publicado por Emilie Chevalier e colaboradores no Journal of Pharmaceutical Sciences, 97, 3, 1 135-1 154 em 2008 é um review que cita diversos métodos de produção de scaffolds, como por exemplo, o método de replicação de esponjas poliméricas junto com agentes de ligação para reforçar a estrutura dos scaffolds. Qualquer elemento adicionado (agentes de ligação) ao processo pode acarretar em contaminações com elementos químicos que podem modificar as características biocompatíveis dos fosfatos de cálcio ou outro biomaterial utilizado.

A presente invenção utilizou nanopartículas que facilitam o recobrimento de estruturas complexas como a esponja polimérica, além de proporcionar ao scaffold formado uma maior área superficial especifica. Essas qualidades associadas as propriedades dos biomateriais utilizados (HA e TCP) nos leva a acreditar que a velocidade da neoformação óssea é maior do que quando se utiliza outros materiais (por exemplo: alumina, zircônia, alumina, entre outros) micro ou nanoparticulados.

O documento WO2012039592-A1 de 19/09/201 1 descreve um processo para obtenção de scaffolds formados por HA e TCP. O cimento ósseo pode ser obtido com uma grande variação de composição. O cimento é aplicado como preenchimento e/ou fixador do tecido ósseo. Já no presente invento (esponja de HA/TCP) a produção é realizada utilizando o método de replicação de esponjas poliméricas onde se mergulha a esponja polimérica na barbotina que é feita a partir dos pós de HA e TCP misturados com a solução coloidal de HA ao invés de água (padrão). Segundo estudos realizados indicam que a utilização da solução coloidal associada a temperatura de sinterização confere ao scaffold maior resistência mecânica do que quando se utiliza apenas água na mistura da barbotina e temperaturas abaixo da faixa de sinterização [RODRIGUES, L.R. Tese de Doutorado. Faculdade de Engenharia Mecânica, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, São Paulo, Brasil, 2012].

Diante das informações disponíveis no estado da técnica o processo descrito na presente invenção apresenta vantagens em vários aspectos. Primeiro, descreve um processo simples capaz produzir esponjas cerâmicas (com poros interconectados) com HA/TCP ou com outras biocerâmicas, além de ter a capacidade de criar compósitos unindo as características dos materiais utilizados. Neste caso foi utilizada a HA e o TCP, a HA é uma biocerâmica bioativa e com características osteoindutoras e o TCP um material bioreabsorvível com capacidade se transformar em cimento ósseo quando em contato com os fluídos corpóreos, fato que confere ao scaffold maior resistência mecânica. Outro ponto crucial do processo é o emprego, vantajosamente, de uma pasta cerâmica viscosa (barbotina) capaz de criar um recobrimento total e homogéneo na superfície da esponja polimérica e por consequência os scaffoids formados a partir da esponja apresentam um melhor acabamento superficial facilitando ainda mais a adesão e espalhamento celular. Para o preparo da barbotina é utilizada uma solução coloidal de HA ao invés de somente água que é o método tradicional. A solução coloidal é utilizada com o intuito de reforçar a estrutura após a secagem e posterior sinterização. Outro diferencial do processo aqui descrito está na utilização de nanopartículas de fosfatos de cálcio, mais versáteis e fáceis de serem compactadas que as micropartículas, além de facilitar a moldagem de geometrias mais complexas e produzir scaffoids com melhor acabamento superficial.

A maior resistência mecânica do scaffold originada da adição da solução coloidal no processo de fabricação das esponjas acaba por garantir uma fácil manipulação do scaffold durante todo o processo tanto no de fabricação quanto nos testes biológicos.

As esponjas obtidas pelo presente processo apresentam inúmeras aplicações, como: na área de engenharia tecidual óssea, como substituição óssea em pequenos defeitos, na área odontológica, na área bucomaxilofacial e na liberação controlada de fármacos.

Breve Descrição da Invenção

A presente invenção refere-se a um processo de obtenção de esponjas cerâmicas. São objetos adicionais o produto obtido pelo processo descrito e o uso das referidas esponjas.

A invenção descreve um processo compreendendo as etapas de preparo da barbotina com hidroxiapatita (HA), fosfato tricálcico (TCP) e solução coloidal de hidroxiapatita (HA), imersão de um substrato com poros interconectados e com o tamanho do poro conhecido é imerso na barbotina, seguida de uma etapa de expansão volumétrica empregando álcool etílico, secagem em estufa e sinterização.

Breve Descrição das Figuras

O processo e a estrutura da invenção, juntamente com vantagens adicionais da mesma, poderão ser melhor entendidas mediante referência aos desenhos em anexo e às seguintes descrições:

A Figura 1 apresenta um fluxograma geral do processo de obtenção das esponjas.

A Figura 2 apresenta difratogramas individualizados do compósito HA/TCP (esponja cerâmica) e dos materiais (HA e TCP) que foram utilizados na produção das esponjas, onde "a" indica o pico referente ao alfa-fosfato tricálcico e "HA" indica o pico referente a hidroxiapatita.

Breve Descrição dos Anexos

O Anexo 1 apresenta uma imagem de microscopia eletrônica de varredura do gel de hidroxiapatita antes de calcinar e sem recobrimento por plasma, onde é possível visualisar várias partículas dispersas no gel de HA.

O Anexo 2 mostra as imagens obtidas por microscopia eletrônica de transmissão (MET) e por espectroscopia por perda de energia de elétrons (EELS) do gel de HA sem sacarose. Detalhe MET: Tamanho de uma nanoestrutura em forma de bastão. Detalhe EELS: Detecção de componente elementar da amostra. A sigla Ca/P indica que a amostra possui indícios que a amostra é um fosfato de cálcio devido a presença das bordas L ₃ e L ₂ que são características do cálcio.

O Anexo 3 apresenta as imagens obtidas por microscopia eletrônica de transmissão (MET) e por espectroscopia por perda de energia de elétrons (EELS) da amostra do gel de HA com sacarose. Detalhe MET: nanoestrutura com aproximadamente 10 nm de espessura e esferas com aproximadamente 5 nm de diâmetro. Detalhe EELS: bordas L ₃ e L ₂ características do cálcio.

O Anexo 4 apresenta a imagem obtida por microscopia eletrônica de transmissão (MET) da amostra gel de TCP com sacarose. O Anexo 5 apresenta a imagem de hidroxiapatita sintentizadas e calcinadas a 725 ^e C.

O Anexo 6 apresenta a imagem obtida por microscopia eletrônica de varredura das nanopartículas de beta-fosfato tricálcico sintentizado e calcinado a 725 ⁹ C.

O Anexo 7 mostra uma microtomografia da esponja HA/TCP.

Imagem 2D.

O Anexo 8 é uma imagem virtual da esponja cerâmica 3D obtida através da junção de várias imagens criadas pelo equipamento de microtomografia e tratadas pelo software do equipamento.

O Anexo 9 mostra a imagem de uma esponja cerâmica com 3 mm de diâmetro obtida pelo método de replicação de esponjas poliméricas e que foi cortada para ser utilizada nos testes in vitro.

O Anexo 10 mostra a imagem da esponja, onde 1 é a esponja em formato cúbico, 2 indica os detalhes da superfície da esponja, 3 indica a boa distribuição de poros e 4 indica a morfologia dos poros em detalhe.

O Anexo 11 apresenta uma imagem obtida por estéoscopio (lupa) da morfologia celular do grupo controle após 13 dias de cultura. A objetiva tem aumento de 4x.

O Anexo 12 apresenta uma imagem obtida por estéoscopio (lupa) da morfologia celular após 13 dias de contato com a esponja, indicando que a amostra não é citotóxica. A objetiva tem aumento de 4x.

O Anexo 13 apresenta uma imagem de microscopia eletrônica de varredura (MEV) da esponja antes da cultura celular.

O Anexo 14 apresenta uma imagem de microscopia eletrônica de varredura (MEV) da esponja com as células aderidas na superfície.

O Anexo 15 apresenta uma imagem de microscopia eletrônica de varredura (MEV) da esponja com células aderidas e contornando a parede da esponja. O Anexo 16 apresenta uma imagem de microscopia eletrônica de varredura (MEV) da esponja, onde é possível visualizar as células aderidas na superfície de uma região interna da esponja.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção trata-se de um processo de obtenção de esponjas cerâmicas.

Os processos de preparação das nanopartículas de hidroxiapatita (HA) e de fosfato tricálcico (TCP) são conhecidos do estado da técnica. No presente invento esse processo utiliza três tipos de reagentes e um tipo de solvente (água purificada). Os reagentes foram: nitrato de cálcio tetrahidratado [Ca(NO ₃ )2 -4H ₂ O], ácido fosfórico (H ₃ PO ) e sacarose (C ₁₂ H ₂ 2On ).

Para a síntese da hidroxiapatita [Caio(PO ₄ )6(OH) ₂ ] é necessário manter a relação cálcio e fósforo em aproximadamente 1 ,67 (Ca/P=1 ,67). O solvente é água destilada (H ₂ O) [RODRIGUES, L.R. Dissertação de Mestrado. Faculdade de Engenharia Mecânica, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, São Paulo, Brasil, 2008].

Para a síntese de fosfato tricálcico [Ca ₃ (PO ) ₂ ] é necessário manter a relação cálcio/fósforo em aproximadamente 1 ,5 (Ca/P=1 ,5). O solvente foi água destilada (H ₂ O). Para a conversão do beta fosfato tricálcico em alfa fosfato tricálcico foi necessário submeter o material a temperaturas acima de 1150 ^e C [RODRIGUES, LR.; et al. 21st International Congress of Mechanical Engineering, 201 1 , Natal, Rio Grande do Norte, Brasil].

Para o preparo da solução coloidal de HA é necessário ácido fosfórico 85% LAFAN e nitrato de cálcio tetrahidratado 99% Synth [DEAN-MO, L; et al. Biomaterials. 22: 1721 -1730, 2001] [SANTOS, M.L.; et al. Eclética Química. 30, 3: 29-35, 2005] [RODRIGUES, L.R. Dissertação de Mestrado. Faculdade de Engenharia Mecânica, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, São Paulo, Brasil, 2008].

É objeto da presente invenção um processo de obtenção esponjas de hidroxiapatita e fosfato tricálcico, de acordo com a Figura 1 , que compreende as seguintes etapa: a) Preparo da barbotina;

b) Imersão de um substrato poroso na barbotina;

c) Expansão volumétrica;

d) Secagem;

e) Sinterização.

A barbotina é preparada na etapa (a) por uma simples mistura dos seguintes componentes:

- uma quantidade variável entre 1 a 99 %, preferencialmente 50% de

HA,

- uma quantidade variável entre 1 e 99 %, preferencialmente 50% de

TCP e

- um volume de solução coloidal de HA variável de acordo com o volume de HA/TCP utilizado.

A viscosidade da barbotina é variável, e é controlada pela quantidade de solução coloidal de HA adicionada a mistura. E a proporção hidroxiapatita/fosfato tricálcico é variável de acordo com a aplicação específica, por exemplo, caso a esponja precise ser reabsorvida de forma mais rápida, então deve ser adicionado mais TCP, caso precise de uma estrutura que suporte a forma porosa por mais tempo após ser implantada, então se adiciona mais hidroxiapatita.

Em seguida um substrato com poros interconectados e com o tamanho do poro conhecido é imerso na barbotina (etapa b). Este substrato pode ser polimérico, selecionado dentre etileno-vinil acetato, polietileno, polipropileno, policloreto de vinila, preferencialmente de poliuretano; metálico, selecionado dentre titânio ou aço inoxidável; também podem ser utilizados cera ou parafina expandida. Os substratos podem ser utilizados em diversos formatos e a porosidade das esponjas é dependente do substrato empregado.

Após a imersão do substrato na barbotina é realizada uma expansão volumétrica (etapa c) a partir de uma gota de álcool etílico adicionada à esponja (de 1 cm ³ ) seguida de pequenas compressões sobre a esponja, com o objetivo de expandir o substrato e facilitar o escoamento da barbotina, e assim acabar por recobrir todas as paredes da esponja.

A esponja obtida na etapa (c) passa pela etapa de secagem (etapa d) em estufa a temperatura variando entre 40 ⁹ C e 60 °C, preferencialmente 50 ^Q C e o tempo é dependente do volume da esponja obtida na etapa (c).

Em seguida o material é submetido à sinterização (etapa e), seguindo as seguintes etapas:

e1 ) Elevar a temperatura ambiente até 600 ^Q C com taxa de aquecimento de 1 ⁹ C/min.;

e2) Manter a temperatura em 600 ^e C por 3 horas;

e3) Elevar a temperatura até 1330 ^e C com taxa de aquecimento de

1 ^Q C/min.); e

e4) Manter a temperatura em 1330 ^S C por 3 horas.

O resfriamento é de forma lenta dentro do forno, mas sem a necessidade de controle.

A temperatura ideal de sinterização é da ordem de 2/3 a 3/4 da temperatura de fusão do material, porém a temperatura utilizada pode ser modificada, mas antes se deve ter em mente que quanto menor a temperatura do tratamento térmico realizado mais microporos e menor resistência mecânica a esponja apresentará. Já com temperaturas mais elevadas as esponjas terão menos microporos e maior resistência mecânica.

Mais especificamente, o processo de obtenção de esponjas de hidroxiapatita e fosfato tricálcico em sua modalidade preferencial compreende o preparo de barbotina que compreende a mistura de HA/TCP com 50% em massa de cada um em uma mesma quantidade em volume de solução coloidal de hidroxiapatita (HA). Em seguida um substrato polimérico é imerso na barbotina e depois submetido à expansão volumétrica com uma gota de álcool etílico para cada 1 cm ³ de esponja seguida de pequenas compressões sobre a esponja. Após a expansão as esponjas são secas em estufa a 50 ⁵ C, por 40 a 60 minutos. Em seguida o material é submetido à sinterização. A esponja porosa de hidroxiapatita/fosfato tricálcico obtida pelo presente processo apresenta um valor aproximado de 85% de porosidade, espessura média da estrutura de 45 μιτι e diâmetro médio dos poros de 216μηι. Exemplo 1 : Fluorescência de raios X

Para fluorescência de raios X foi utilizado o equipamento Rigaku

RIX 3100 varredura completa para análise de possíveis impurezas presentes no material. Esta é uma técnica não destrutiva de análise qualitativa e semi- quantitativa da composição química de amostras. O equipamento emite um feixe de raios X sobre a amostra que reflete a radiação, essa radiação é captada por um detector, os dados captados são convertidos em forma de gráficos e visualizados no computador [BELMONTE, E.P. Dissertação de Mestrado, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brasil. 2005].

Com a fluorescência de raios X foi possível identificar e semiquantificar os elementos que contaminaram as amostras durante o processo, alguns podem estar presentes na água e outros nos próprios reagentes. Os resultados obtidos estão na Tabela 1.

Tabela 1 - Análise semiquantitativa das amostras HA e TCP. Valores referentes à (%) em massa. A precisão do equipamento é de até 10 ^"4 .

Norma ASTM

Impurezas Hidroxiapatita Fosfato Tricálcico Fl 185-03

K ald ald X

Na 0,018 0,011 X

Sr 0,028 0,018 X

S 0,007 0,006 X

Ni ald 0,003 X

Fe 0,004 ald

Cl 0,028 ald

AI ald 0,005 X

Zr ald 0.006 X

As ald ald 0,0003

Cd ald ald 0,0005

Hg ald ald 0,0005

Pb ald ald 0.0030 ald: abaixo do limite de detecção. Os resultados de fluorescência demonstraram que nenhum material aplicado neste trabalho apresentou elementos químicos considerados perigosos para aplicação como biomaterial, segundo a norma ASTM F1 185-03. Exemplo 2: Microscopia eletrônica de varredura ambiental

A microscopia eletrônica de varredura ambiental (ESEM) é utilizada para a análise de superfície de amostras não-metálicas. A amostra é colocada numa câmara com níveis elevados de pressão positiva. Este tipo de microscópio eletrônico neutraliza a carga negativa sobre a superfície da amostra quando o feixe interage com o gás. O tipo de gás pode ser variado de acordo com a necessidade. Neste tipo de microscópio a metalização da amostra é desnecessária. O modelo do equipamento foi FEI Quanta 400 FEG ESEM CEMUP-PT com detector de elétrons secundários para visualizar a estrutura de gel e morfologia das nanopartículas [RODRIGUES, L.R. Tese de Doutorado. Faculdade de Engenharia Mecânica, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, São Paulo, Brasil, 2012].

No Anexo 1 foi possível verificar as imagens do gel de hidroxiapatita antes de calcinar e sem recobrimento por plasma, onde é possível visualizar várias partículas dispersas no gel de HA. As imagens foram obtidas pelo microscópio eletrônico de varredura ambiental (ESEM). Nestas amostras não foram feitos recobrimentos por plasma com o objetivo de não mascarar o tamanho real das partículas, e foi possível verificar que o gel forma uma camada que separa e recobre as nanopartículas e de acordo com a imagem essas nanopartículas são esféricas. Devido à viscosidade do gel a visualização das partículas não foi perfeita, mas por comparação com a escala foi fácil encontrar partículas nesta amostra com o tamanho aproximado de 100nm. Portanto os materiais utilizados são nanoparticulados.

Exemplo 3: Microscopia eletrônica de transmissão e espectroscopia por perda de energia de elétrons

Microscopia eletrônica de transmissão (MET) é uma técnica de microscopia na qual um feixe de elétrons é direcionado a uma amostra ultrafina que se encontra fixa no interior do equipamento. O feixe direcionado atravessa a amostra e interage com a mesma, formando uma imagem que é ampliada e focada em um dispositivo de imagem, podendo ser detectado por uma câmera CCD.

Espectroscopia por perda de energia de elétrons (EELS) é uma técnica que está vinculada ao microscópio eletrônico de transmissão. O material analisado é exposto a um feixe de elétrons com uma faixa de energia cinética estreita e conhecida. Os elétrons sofrem espalhamento inelástico perdendo energia e por consequência tem sua direção de espalhamento modificada de forma aleatória. As interações inelásticas incluem entre outros fatores a ionização de camadas internas, essa ionização é útil para a detecção dos componentes elementares de um material [EGERTON, R.F. Reports on Progress in Physics. 72, 1 : 25pp, 2009] [EGERTON, R.F. Electron Energy-Loss Spectroscopy in the electron microscope. 3 ^rd Edition, Springer, 491 pp. 201 1].

O Anexo 2 mostra os resultados obtidos por microscopia eletrônica de transmissão (MET) e espectroscopia por perda de energia de elétrons (EELS) do gel de HA sem sacarose, onde é possível visualizar a distribuição de vários nanocristais em forma de bastão com aproximadamente 50 nm de comprimento e 12 nm de largura, como é mostrado no detalhe.

Segundo a literatura, as bordas L ₃ e L ₂ do cálcio obtidas por EELS são representadas no Anexo 2 e indicam a perda de energia na região entre 340 a 360 eV referentes a amostra gel HA. As bordas L _3,2 obtidas são características do cálcio [SZ-CHIAN, L; et al. Biomaterials. 25, 2: 189-196, 2004].

Com esta análise foi possível quantificar aproximadamente o tamanho inicial das partículas antes de ser realizado o tratamento térmico de calcinação, que modifica o tamanho das partículas.

O Anexo 3 mostra os resultados obtidos por MET e EELS da amostra gel HA com sacarose onde foi possível verificar a presença de muitos nanocristais em forma de agulhas (com ~ 10 nm de espessura) que é a morfologia característica dos fosfatos de cálcio. Também foi possível verificar a presença de nanopartículas de aproximadamente 5 nm, e deduzimos que este é o tamanho inicial das nanopartículas presentes no gel no início do processo e conforme a solução se torna mais viscosa as partículas que não estão isoladas pelo gel se juntam formando nanocristais maiores. É importante salientar que a sacarose introduzida ao processo ajudou a isolar as partículas, e desta forma acabou evitando que elas se agrupassem. A análise EELS comprovou a presença de cálcio nas amostras por conter as bandas L ₃ e L ₂ de perda de energia na região entre 340 e 360 eV [AHN, C.C.; et al. EELS ATLAS: A reference collection of electron energy loss spectra covering ali stable elements, ASU HREM Facility and Gatan, inc. USA, 1983].

No Anexo 4 são apresentados os resultados de MET da amostra gel TCP com sacarose e foi possível verificar que as nanopartículas foram envolvidas por uma espécie de filme fino de sacarose. A sacarose foi introduzida no gel de TCP durante a síntese das partículas e com as imagens foi possível fazer uma estimativa da espessura das agulhas formadas (de 20 a 45 nm).

Exemplo 4: Microscopia eletrônica de varredura

O microscópio eletrônico de varredura (MEV) é um equipamento capaz de produzir imagens com boa ampliação e resolução. A imagem visualizada no monitor acoplado ao MEV é a transcodificação da energia emitida pelos elétrons. O princípio do funcionamento do MEV consiste na emissão de feixes de elétrons por um filamento capilar de tungsténio que representa o eletrodo negativo, onde existe a aplicação de uma diferença de potencial que pode variar de 0,5 a 30kV. A variação de voltagem permite a mudança na aceleração dos elétrons, que acaba provocando o aquecimento do filamento. A parte positiva em relação ao filamento do microscópio (eletrodo positivo) atrai fortemente os elétrons gerados, resultando em uma grande aceleração em direção ao eletrodo positivo.

A correção dos feixes é realizada pelas lentes condensadoras que alinham os feixes em direção à abertura da lente objetiva. A lente objetiva ajusta o foco dos feixes de elétrons antes dos elétrons atingirem a amostra analisada [RODRIGUES, L.R. Dissertação de Mestrado. Faculdade de Engenharia Mecânica, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, São Paulo, Brasil, 2008]. O microscópio eletrônico de varredura utilizado foi o Carl Zeiss modelo EVO MA15 do DEMA-FEM-UNICAMP.

No Anexo 5 são apresentadas as nanopartículas de hidroxiapatita sintetizadas no laboratório e calcinadas a 725 ^e C, e no detalhe da figura foi possível verificar que as partículas têm aproximadamente 82 nm. Imagem feita por MEV.

No Anexo 6 foram apresentadas as nanopartículas de TCP sintetizadas no laboratório e calcinadas a 725 ^Q C, onde foi possível ver também que elas estão muito aglomeradas. No detalhe foi possível verificar que as nanopartículas têm aproximadamente 80 nm. Imagem feita por MEV.

Exemplo 5: Microtomografia

A microtomografia foi utilizada para verificar a interconectividade dos poros, distribuição, diâmetro e qual é a porcentagem total da porosidade em relação o volume da estrutura. Com as imagens geradas pelo microtomógrafo de raios X (Micro-CT) SKYSCAN 1074 foi possível criar modelos 3D que puderam ser cortados e assim visualizar a porosidade interna do material. O software de captação de imagem foi o control skycan 1074. O software de análise de dados para geração dos gráficos foi o CTAn. O software utilizado para criar o modelo 3D foi o ANT.

Para obtenção das imagens os scaffolds (esponjas cerâmicas) utilizaram 1080ms de exposição à radiação com 40kV, 1000mA e com um passo de 0,9° a cada avanço. A reconstrução escolhida foi de 360°.

O funcionamento do microtomógrafo de raios-X baseia-se na propriedade dos materiais em absorver a radiação de forma diferenciada dependendo de sua composição química e densidade. A tomografia computadorizada (TC) é uma técnica que permite a visualização de seções transversais (cortes internos) de um objeto de forma não destrutiva.

Os parâmetros físicos para a análise da densidade e a porosidade são mapeados pelo equipamento através da análise das fatias geradas em forma de figura bidimensionais e quando juntas se obtém objetos 3D através de algoritmos de computador. Esta técnica é muito utilizada na engenharia tecidual e na produção de próteses através da prototipagem rápida.

O Anexo 7 apresenta a imagem 2D de uma fatia no interior do scaffold (HA/TCP), essa imagem foi gerada pelo microtomógrafo e com ela foi possível visualizar a grande porosidade presente na esponja.

O Anexo 8 apresenta a projeção 3D da esponja obtido por software do equipamento Micro-CT, e foi possível visualizar que a esponja possui uma boa distribuição e interconexão dos poros. Essas características são importantes quando se pretende obter um bom espalhamento e uma boa proliferação celular.

A Tabela 2 mostra que a esponja possui aproximadamente 85% de porosidade, com espessura média da estrutura de 45 pm e com diâmetro médio de 216 pm.

Tabela 2 - Valores médios da porosidade, espessura da estrutura e diâmetro dos poros obtidos a partir dos resultados de microtomografia computadorizada.

Porosidade total Espessura da estrutura Diâmetro dos poros

Amostras

(%) (Mm) (μπι)

Esponja 85 ± 1 45 ± 1 216 ± 13

As esponjas apresentaram boa distribuição dos poros e foi possível verificar isso em cada fatia gerada pelo equipamento (Micro-CT), e foi o substrato polimérico que deu origem a boa distribuição e interconexão dos poros.

Exemplo 6: Difração de raios X

A difração de raios X é utilizada para identificar as fases cristalinas através de picos gerados pelo equipamento e os resultados dos materiais sintetizados são comparados com os resultados dos materiais comerciais, além de ser possível consultar a biblioteca JCPDS e comparar os resultados obtidos com os picos já padronizados e citados na literatura [RODRIGUES, LR. Dissertação de Mestrado. Faculdade de Engenharia Mecânica, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, São Paulo, Brasil, 2008]. [RODRIGUES, LR. Tese de Doutorado. Faculdade de Engenharia Mecânica, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, São Paulo, Brasil, 2012].

Para a análise da cristalinidade dos materiais foi utilizado o equipamento DMAX 2200-Rigaku Co - radiação Cu-Κα (λ= 1 ,5406), com filtro de Ni do DEMA-FEM-UNICAMP. O equipamento foi ajustado em 40kV e 30mA.

Nas amostras hidroxiapatita, fosfato tricálcico e scaffolds a dif ração de raios X foi realizada com um passo de 0,02° a cada 2 segundos, em 2 Teta/Teta, sendo estes parâmetros aplicados em um intervalo de 20° até 50°, pois é onde se localizam os principais picos da HA, beta-TCP e alfa- TCP.

A Figura 2 apresenta a fase cristalina da hidroxiapatita, do alfa- fosfato tricálcico e do compósito submetidos ao tratamento térmico de sinterização a 1330 ^S C. Esta análise foi realizada utilizando os dados obtidos pelo equipamento de difração de raios X para comparar os resultados dos difratogramas individualizados (HA e TCP) com os picos apresentados pelo compósito em forma de esponja.

A hidroxiapatita apresentou boa cristalinidade e a fase beta (β) do TCP após a sinterização a 1330°C apresentou modificação para a fase alfa (a). Acredita-se que o processo de mudança de fase teve início após o aquecimento ultrapassar a temperatura de 1150 ⁹ C.

Exemplo 7: Ensaio mecânico de compressão axial

Para o ensaio mecânico de compressão axial realizado nos scaffolds (esponja cerâmica) foi utilizado o equipamento da marca Hounsfiel test modelo HT400 Pneumatic Grip Controller H localizado na FEM-UNICAMP. A velocidade de trabalho do equipamento foi de 5mm/min. com a célula de carga de 5000N.

A Tabela 3 mostra os resultados obtidos com o ensaio mecânico de compressão axial realizados nas esponjas. A tabela apresenta valores do módulo de elasticidade (E), carga máxima (P) e valor médio da tensão a compressão axial (o _ca ).

Tabela 3 - Valores dos resultados obtidos no ensaio mecânico por compressão axial. Amostras E (MPa) P (N) ₀₃ (MPa)

Esponja 8,7 ± 2,2 5,7 ± 1,3 0,1 ± 0,03

A esponja atingiu um valor médio de 5,7 N de carga máxima. Os valores de carga máxima sofreram influência direta da porosidade elevada (85%). Conforme o equipamento comprimia a esponja as paredes superiores fragmentavam, mas as camadas seguintes se mantinham estáveis, demonstrando que a estrutura suporta as cargas através de camadas formadas por conjuntos de vários poros.

O resultado para a tensão máxima de ruptura foi de 0,1 MPa, valor semelhante aos encontrados na literatura [UDOH, K.I.; et al. Dental Materials Journal. 29, 2: 154-159, 2010], onde esponjas de alfa-fosfato tricálcico com porosidade entre 90 e 95% apresentaram resultados de resistência mecânica a compressão de 0,05 MPa a 0,25 MPa.

Os valores médios de tensão a compressão axial da esponja produzido são próximos ao valor de resistência mecânica das matrizes porosas de hidroxiapatita observados na literatura [JUN, Y.-K..; et al. Biomaterials. 24: 3731-3739, 2003] [COSTA, H.S.; et al. Journal of Material Science. 43: 510- 524, 2008], que são entre 0,3 a 3,3 MPa com porosidade entre 65% a 95%.

O Anexo 9 mostra a esponja cerâmica com 3 mm de diâmetro utilizada nos testes in vitro. As esponjas foram cortadas com o auxílio de um tubo com a ponta afiada, deixando as amostras com um diâmetro de aproximadamente 3 mm. A altura foi limitada em 1 ,5 mm e para realizar este corte foi utilizada uma lâmina de bisturi.

O Anexo 10, no item 1 , mostra a esponja 3D em forma de cubo após a sinterização, no item 2 é mostrada a superfície da esponja, no item 3 é possível visualizar a distribuição de poros e no item 4 é possível visualizar a morfologia dos poros.

Exemplo 8: Testes de citotoxicidade

Foram utilizadas células tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo. Foram utilizados os resultados obtidos por nós (Rodrigues, L. R.; Rodas, A. C. D.; Bassi, E. J.; Almeida, D. C; Câmara, N.O.S.; Monteiro, F.J.; Zavaglia, C. A. C.) no trabalho com o título "Síntese de nanopartículas de fosfatos de cálcio aplicadas na produção de scaffolds: avaliação in vitro da interação de células tronco mesenquimais para engenharia tecidual óssea" e publicado no 7 ^s COLAOB em Natal, Rio Grande do Norte, 2012. As células mesenquimais foram isoladas pela desagregação enzimática com solução de colagenase - IA do tecido adiposo epididimal de camundongos (C57BLJ6) e cultivadas em meio DMEM - high glucose (Gibco) suplementado com 10% de soro fetal bovino (HyClone) e 1% de solução de antibiótico (Gibco). As células foram amplificadas até a passagem 12, e foram semeadas nos scaffolds. As amostras foram esterilizadas por calor úmido (120 ^S C por 20 minutos) e colocadas uma em cada poço da placa de cultura (placa de 2 poços). Foram semeadas 50000 células por poço de cultura e colocadas na incubadora com 5% de C0 ₂ a 37- C por 3 dias, com troca do meio a cada 3 dias (Tabela 4).

Após o tempo de cultivo, as amostras foram retiradas das placas, fixadas com formol 4% em solução salina (0,9%), congeladas e liofilizadas. As amostras com as células foram guardadas após a liofilização a 4 ^S C até a análise por microscopia eletrônica de varredura (MEV). O material de controle foi a própria placa de cultura.

Tabela 4 - Descrição dos grupos e análises realizadas nos scaffolds e nos grupo controle - teste in vitro.

Tempo de Número de

Grupos Material Análises

seguimento (dias) amostras

Controle Placa de cultura 13 Lupa, MEV 3

Experimental scaffold 13 Lupa, MEV 3

Total de amostras 6

Com o Anexo 1 1 obtido por estereoscópio (lupa) foi possível visualizar a morfologia celular do grupo controle após 3 dias de cultura de células tronco mesenquimais com o objetivo de realizar uma comparação com os resultados obtidos com as esponjas. O Anexo 12 apresenta os resultados das esponjas em contato com as células tronco mesenquimais e por comparação com os resultados do grupo controle (Anexo 1 1 ) deduziu-se que o material não é citotoxico, pois a morfologia das células em ambos os casos foram semelhantes. A cultura celular realizada foi de 13 dias de contato com a esponja, e indicaram que as células estão viáveis, comprovando que o material não é citotoxico. Os resultados foram obtidos por estereoscópio (lupa) com a objetiva de 4x de aumento.

As imagens de microscopia feitas no material após 13 dias de cultura apresentaram células muito bem aderidas e espalhadas na superfície e nos poros da esponja cerâmica.

O Anexo 13 apresenta a esponja antes da cultura celular para poder ajudar na comparação e identificação dos pontos onde ocorreram a adesão e espalhamento celular.

O Anexo 4 mostra a superfície da esponja com células aderidas a superfície, mostrando a afinidade da célula com o material.

O Anexo 5 mostra uma parte da parede estrutural do scaffold recoberta por células que aderiram e contornaram a estrutura porosa da esponja, indicando uma boa adesão e compatibilidade com o material, além de apresentar uma possível migração das células para o interior da esponja.

O Anexo 16 mostra uma região da esponja onde a célula está aderida e espalhada na superfície interna da esponja cerâmica.

Em geral as células interagiram bem com a esponja, pois elas aderiram em várias partes da esponja e se mostraram espalhadas.