【발명의 명칭】

사이코스의 제조방법 【기술분야】

본 발명은 사이코스 제조 공정에서 얻어지는 과당 라피네이트의 활용에 관한 것으로서, 사이코스 제조 공정에서 얻어지는 과당 라피네이트를 사이코스 전환 반웅의 원료로 재순환하여 사이코스를 제조하는 방법 및 이에 사용되는 장치에 관한 것이다.

【발명의 배경이 되는 기술】

사이코스 (Psc i cose)는 과당 (D-f ructose)의 에피머로서 회소당으로 알려진 기능성 당류의 일종으로, 설탕의 약 60 내지 70%의 높은 감미도를 나타내면서도 열량은 거의 제로 칼로리에 가까워 당뇨병의 예방 및 개선에 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 또한 사이코스는 용해성도 우수한 것으로 알려져 있에 식품에의 활용이 주목되고 있는 소재 중 하나이다.

사이코스를 제조하는 방법은 화학적 방법 및 생물학적 방법이 있으며 최근 생물학적 방법으로 사이코스를 제조하는 방법은, 과당 -함유 기질 용액과 사이코스 에피머화 효소 또는 상기 효소를 생산하는 균체와 접촉하여 사이코스 전환반응을 수행한다. 사이코스 전환 공정에 사용되는 반응 원료인 과당 함유 용액이 전분 등의 분해로부터 얻어지는 포도당을 이성화 반웅으로 얻어진 과당 이성화 반응물일 수 있다.

그러나, D-사이코스를 포함하는 반응액은 저순도 제품이기 때문에 고순도로 사이코스를 분리하는 것이 요구된다. 실제로 산업적으로 생산되는 소재들은 고순도로 분리하기 위해 다양한 방법들이 적용되고 있으며， 당의 경우 주로 크로마토그래피를 사용하여 고순도 용액을 만든 후， 결정화하여 제품을 생산하고 있다.

상기 사이코스 전환 반응액으로부터 고순도 사이코스 제품을 얻기 위해서는 고순도 분리공정을 수행하며， 사이코스 분리공정에는 사이코스 분획뿐만 아니라 과당을 고농도로 포함하는 과당 라피네이트가 얻어지므로 상기 과당 라피네이트를 재활용하여 사이코스 순도 및 수율을 향상시키고 원료의 이용를을 높이는 방법이 필요한 실정이다.

【발명의 내용】

【해결하고자 하는 과제】

이에， 본 발명의 일 예는 과당 라피네이트를 재활용하여 사이코스 순도 및 수율을 향상시키고 원료의 이용를을 높이고자, 사이코스 제조 공정에서 얻어지는 과당 라피네이트를 사이코스 전환 반웅의 원료로 재순환하여 사이코스를 제조하는 방법 및 이에 사용되는 장치에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 일예는 사이코스 제조 공정에서 얻어지는 과당 라피네이트의 이온 농도를 조절하여 과당 라피네이트를 사이코스 전환 반웅의 원료로 재순환하여 사이코스를 제조하는 방법 및 이에 사용되는 장치에 관한 것이다.

【과제의 해결 수단】

본 발명의 일예는 사이코스 제조 공정에서 얻어지는 과당 라피네이트를 사이코스 전환 반응의 원료로 재순환하여 사이코스를 제조하는 방법 및 장치에 관한 것이다. 사이코스 분리공정에는 과당을 고농도로 포함하는 과당 라피네이트가 얻어지므로 상기 과당 라피네이트를 재활용하여 사이코스 순도 및 수율을 향상시키고 원료의 이용률을 높이는 방법이다.

본 발명의 일예는 사이코스 전환 반웅물을 모사 이동층 (s imul ated moving bed , SMB) 크로마토그래피로 분리하여 사이코스 분획과 과당 라피네이트를 얻고， 상기 과당 라피네이트를 사이코스 전환 반응의 원료로 재순환되는 단계를 포함하는 사이코스의 제조방법에 관한 것이다.

상기 사이코스 전환 공정은， 사이코스 전환 반응을 수행하여 과당- 함유 원료로부터 사이코스를 전환하는 공정으로서， 공정의 산물로서 과당으로부터 전환된 사이코스를 함유하는 반웅액을 얻는다. 따라서， 사이코스 전환 반웅에는 종래에 전환 반응에 사용되지 않는 신규 과당 -함유 원료를 사용하여 생물학적 방법으로 수행된다. 이에, 본 발명에서는 사이코스 전환 반웅에 투입되는 과당 -함유 원료로서， 상기 사이코스 전환 반웅물을 모사 이동층 ( s imul ated moving bed , SMB) 크로마토그래피로 분리하여 얻어진 과당 라피네이트 또는 이의 가공물을 사이코스 전환 반웅의 과당 -함유 원료로 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 과당- 함유 원료는， 상기 사이코스 전환 반응물을 모사 이동층 크로마토그래피로 분리하여 얻어진 과당 라피네이트 또는 이의 가공물 (이하， 제 1 과당 원료) 단독， 또는 사이코스 전환 반웅에 사용되지 않는 신규 과당 -함유 원료 (이하， 제 2과당 원료)와 흔합한 원료를 포함하는 의도이다. 상기 과당 라피네이트의 가공물은 다양한 공정을 처리하여 얻어지는 과당—함유 원료일 수 있으며, 예를 들면 상기 과당 라피네이트는 사이코스 전환 반응에 재순환되기 전에, 넁각， pH 조절 이온정제 및 농축 공정으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 공정올 처리하여 얻어진 산물일 수 있다.

본 발명의 일예에서, 사이코스 제조의 고순도 분리 공정에서 얻어진 과당 라피네이트는 사이코스 전환 반웅의 원료로 활용할 수 있으며， 예를 들면 이온정제와 함께 또는 이온정제 후에 농축하여 과당 함량을 증가시키는 공정을 추가로 수행할 수 있다.

상기 사이코스 분리 공정에서 얻어지는 과당 라피네이트를 그대로 사이코스 전환 공정에 투입할 경우， 모사 이동층 크로마토그래피 분리 공정에서 사용하는 강이온성 수지의 영향으로 양이온， 특히 칼슘이온이 과량으로 포함되어 있어 사이코스 전환 반응에 좋지 않은 영향을 미칠 수 있다. 따라서， 과당 라피네이트를 이온 정제하여 특정 농도 범위 이하로 칼슴이온 농도를 조절하거나， 전기 전도도 수치 이하로 양이온 농도를 조절할 수 있다.

본 발명의 일예에서 , 상기 과당 라피네이트를 사이코스 전환 반응에 투입하기 전에, 상기 과당 라피네이트 또는 상기 과당 라피네이트와 신규 과당 원료의 흔합 원료의 칼슴이온 농도를 0 .05mM이하의 농도로 조절하는 이온 농도의 조절단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 또한， 상기 과당 라피네이트를 사이코스 전환 반응에 투입하기 전에, 과당 라피네이트의 처리 산물이 전기 전도도가 0 내지 15 / s/cm를 갖도록 상기 크로마토그래피 분리공정에서 얻어지는 과당 라피네이트를 이온정제하는 공정을 추가로 포함하는 것이 바람직하다 .

본 발명의 또 다른 일예는 생물학적 촉매를 이용하여 과당 원료로부터 사이코스 전환반웅을 수행하는 사이코스 전환 반웅기; 활성기가 부착된 양이온교환수지가 층진된 칼럼올 포함하고, 원료 투입구， 및 사이코스 분획과 과당 라피네이트를 배출하는 배출구를 구비한 모사 이동층 (simulated moving bed, SMB) 크로마토그래피 분리기; 및 상기 분리기에서 배출된 과당 라피네이트를 이온교환수지가 충진된 칼럼을 구비한 이은정제기 및 농축기를 포함하며, 상기 농축기를 통과한 처리 산물을 사이코스 전환 반응기로 재순환시키는 것인, 사이코스의 제조 장치에 관한 것이다.

본 발명은 과당 라피네이트를 활용하여 효율적으로 사이코스를 생산하고, 과당 라피네이트를 과당 이성화 시럽과 흔합하여 액상과당 제품의 품질 저하를 막고, 사이코스 시럽 생산에 사용되는 고과당 시럽의 과당 함량을 유지할 수 있다. 이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명에 따른 사이코스 제조 방법은， 사이코스 전환 반응물을 모사 이동층 (simulated moving bed, SMB) 크로마토그래피로 분리하여 사이코스 분획과 과당 라피네이트를 얻고, 상기 과당 라피네아트를 사이코스 전환 반웅의 원료로 재순환되는 단계를 포함하는 사이코스의 제조방법에 관한 것이다.

구체적 일예에서, 본 발명의 사이코스 제조방법은 (1)과당 -함유 원료로 사이코스의 생물학적 전환 반웅을 수행하여 사이코스 전환 반웅물을 제조하는 사이코스 전환 공정; (2)상기 전환 반응물을 제 1차 이온정제 및 모사 이동층 (simuiated moving bed, SMB) 크로마토그래피를 이용한 분리를 수행하여 사이코스 분획과 과당 라피네이트를 얻는 사이코스 분리 공정 ; 및

(3) 상기 과당 라피네이트를 사이코스 전환 반웅에 투입하여 원료로 사용하는 공정을 포함할 수 있으며, 추가적으로 (4)상기 사이코스 분획을 이용하여 사이코스 결정을 얻는 공정을 포함할 수 있다. 본 발명의 사이코스 제조 공정은 연속식과 배치식 모두 사용가능하며 바람직하게는 연속식 공정이다.

본 명세서에서， 용어 "라피네이트 (raf f inate) "라 함은 추잔액이라고도 하며, 분리공정에 투입된 원료가 분리공정을 통과하여 얻어지는 산물에는 분리공정으로 함량을 높이고자 하는 목적 물질을 포함하는 목적 분획과, 분리공정에서 제거 또는 함량을 감소하고자 하는 물질등을 포함하는 잔류액을 포함하며， 상기 잔류액 라피네이트라고 한다. 본 발명의 일 예에서 사이코스 전환 공정에서 얻어지는 산물은 원료 기질인 과당과 생산물인 사이코스를 포함하는 흔합물이며, 고순도 분리공정을 거치면서 목적 물질인 사이코스의 함량이 증가된 사이코스 분획과 잔류액을 얻으며, 잔류액에는 사이코스 전환 반응의 기질인 과당이 다량 포함되므로 과량 라피네이트를 의미할 수 있다ᅳ 이하, 본 발명에 따라 사이코스 전환 반웅의 산물의 고순도 분리 공정에서 얻어지는 과당 라피네이트 재순환을 통한 사이코스 제조 공정을 각 단계별로 자세히 기술하고자 한다.

( 1) 사이코스 전환 공정

사이코스 전환 공정은， 사이코스 전환 반응을 수행하여 과당 -함유 원료로부터 사이코스를 전환하는 공정으로서， 공정의 산물로서 과당으로부터 전환된 사이코스를 함유하는 반응액을 얻는다.

본 발명의 일 구체예에서 , 생물학적 방법에 따라 사이코스를 제조하는 방법으로는 사이코스 에피머화 효소를 생산하는 균주 또는 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 유전자가 도입된 재조합 균주를 배양하고, 이로부터 얻어진 사이코스 에피머화 효소를 과당—함유 원료와 반웅하여 생산할 수 있다. 상기 사이코스 에피머화 효소는 액상 반웅 또는 고정화 효소를 이용한 고상 반웅으로 수행될 수 있다.

또는, 사이코스 에피머화 효소를 생산하는 균주 또는 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 유전자가 도입된 재조합 균주를 얻고， 균주의 균체, 상기 균주의 배양물， 상기 균주의 파쇄물， 및 상기 파쇄물 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 사이코스 생산용 조성물을, 과당 -함유 원료와 반웅하여 제조될 수 있다. 사이코스 에피머화 효소를 생산하는 균주의 균체를 이용하여 사이코스를 제조하는 경우 액상 반응 또는 고정화 균체를 이용한 고상 반응으로 수행될 수 있다. 본 발명의 구체적 일예에서， 사이코스 에피머화 효소를 생산하는 균주는 높은 안정성을 가지면서도 고수율로 과당으로부터 사이코스를 전환할 수 있거나 사이코스 에피머화 효소를 생산할 수 있는 균주일 수 있으며. 상기 균주는 자연에서 분리한 균주 또는 이의 돌연변이 균주인 non-GMO 균주, 또는 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 유전자를 숙주세포에 도입한 재조합 균주일 수 있다. 본 발명의 일예에서는， 상기 non-GMO 균주로는 알려진 다양한 균주를 사용할 수 있다. 상기 재조합 균주는 다양한 숙주세포 예컨대 대장균, 바실러스속 균주, 살모넬라속 균주 및 코리네박테리움속 균주 등을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 GRAS 균주인 코리네박테리움속 균주일 수 있으며, 코리네박테리움 글루타리쿰일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따른 사이코스 전환 공정은 생물학적 방법으로 수행하며, 예를 들어 고상반웅인 경우， 상기 사이코스 에피머화 효소 또는 균체를 담체에 고정화하고 컬럼에 충진시키는 단계 및 상기 층진된 컬럼에 과당 용액을 공급하는 단계를 더 포함할 수 있다ᅳ 효소나 균체가 고정화된 담체를 층진시킬 컬럼 및 상기 컬럼에 충진시키는 방법은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 사용된 효소나 균체， 또는 고정화 담체에 따라 적합한 것으로 용이하게 선택하여 수행할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 고정화된 효소 또는 균체를 컬럼에 충진시켜 충진상 컬럼 (packed— bed co l umn)을 제조할 수 있다. 층진상 컬럼에 기질인 과당 용액을 공급하는 것에 의해 효소 반웅, 즉， 과당의 사이코스로의 전환이 수행될 수 있다.

상기 사이코스의 전환반응에 있어서 , 상기 반웅은 pH 4.5 내지 7. 5 , 예컨대, pH 4. 7 내지 7.0， 또는 pH 5.0 내지 6.0 또는 pH 5.0 내지 5.5의 조건 하에서 수행될 수 있다. 또한， 상기 반웅은 30 ^° C 이상， 예컨대 40 ^° C 이상의 온도 조건 하에서 수행될 수 있다. 상기 과당을 사이코스로 전환시키는 효소 (예컨대， 에피머레이즈)는 금속 이온에 의하여 활성화가 조절될 수 있으므로, 상기 사이코스 생산에 있어서， 금속 이온을 첨가하면 과당에서 사이코스로의 전환 효율, 즉 사이코스 생산률이 증가될 수 있다. 따라서, 상기 사이코스 생산용 조성물은 구리 이온， 망간 이온， 칼슘 이온， 마그네슴 이온, 아연 이온, 니켈 이온， 코발트 이온， 철 이온， 알루미늄 이온 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 금속 이온을 추가로 포함하는 것일 수 있다.

사이코스 및 이의 제조방법에 관한 자세한 기술내용은 한국공개특허 제 2014一 0021974호, 한국공개특허 제 2014-0054997， 한국공개특허 게 2014— 0080282호, 또는 한국등록특허 제 10-1318422호에 기재되어 있다.

본 발명에 따른 사이코스 전환 공정에 투입되는 과당 원료는 생물학적 방법 또는 화학적 방법으로 제조될 수 있으며, 바람직하게는 생물학적 방법이다.

상기 과당 원료는 과당 시럽과 같은 액상 원료, 또는 과당 분말과 같은 분말 원료로 제공될 수 있으며, 상기 과당 시럽의 경우 생물학적 방법 또는 화학적 제조 공정에서 얻어진 산물일 수 있거나， 과당 분말을 물과 같은 용매에 용해하여 제조된 것일 수 있다.

상기 과당 원료를 생물학적 방법으로 제조하는 일예는， 포도당—함유 원료를 과당 이성화 효소 또는 상기 효소를 생산하는 균체를 이용하여 이성화하는 과당 이성화 공정을 수행하고， 상기 과당 이성화 공정의 반웅물을 제 1차 이온정제, 고순도 크로마토그래피 분리공정, 제 2차 이온정제 및 농축하는 공정을 통해 분리하여 얻을 수 있다. .

상기 사이코스 생산 방법에 있어서, 효율적인 사이코스 생산을 위하여 , 기질로서 사용되는 과당의 농도는 전체 반응물 기준으로 85 w/v% 이상, 90 w/v% 이상， 또는 95 w/v% 이상일 수 있으며, 예를 들면 85 내지

99 w/v% , 88 내지 99 w/v% , 88 내지 99w/v% , 85 내지 87 %(w/v) , 88 내지

90 %(w/v) , 91 내지 93 %(w/v) , 94 내지 99 %(w/v) 또는 97 내지

99 %(w/v)일 수 있다. 과당의 농도는 공정의 경제성 및 과당의 용해성올 고려하여 결정할 수 있으며, 상기 과당은 완충용액 또는 물 (예컨대 증류수)에 용해된 용액 상태로 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따른 과당 제조 공정을 구체적으로 설명하면， 과당은 설탕 또는 포도당으로부터 얻어질 수 있다. 이를 통해, 포도당， 과당, 설탕과 같이 보편화되고 저렴한 원료를 사용하여 높은 수율의 사이코스를 제조하는 방법을 제공하여 사이코스의 대량 생산을 가능하게 할 수 있다.

본 발명의 과당 제조 공정의 일예를 설명하면, 옥수수 전분을 30 내지 35 중량 %가 되도록 물과 흔합한 후， 효소 가수분해를 진행하여 포도당 함량 88 중량 ¾ 이상의 당화액을 수득한다. 그 다음， 상기 당화액의 불순물을 제거하는 공정과 과당 이성화 공정을 거쳐 과당 함량 40 내지 44 중량 %의 과당 시럽을 수득한다. 그 다음, 모사 이동층 흡착 분리 방법 ( s imu l at ed movi ng bed , SMB)을 이용하여 포도당 라피네이트와 과당 분획을 얻고， 상기 과당 분획을 제 2차 이은정제 및 농축 공정을 수행하여 과당 함량이 85 중량 %이상， 예를 들면 85 내지 99 중량 %의 과당 -함유 용액을 얻는다. 모사 이동층 흡착 분리 방법은 하기 (2)번 항목에서 상술한 바와 같다. 상기 불순물을 제거하는 공정은 여과로 불용성 물질의 제거 공정, 및 활성탄을 이용한 탈색 공정, 유색 성분과 이온 성분 등의 불순물을 제거하기 위해 이온교환 수지가 층진된 컬럼에 통액시켜 수행할 수 있다 _:

과당 분리 공정의 구체적인 예는 제 1차 이은정제， 고순도 크로마토그래피 분리， 제 2차 이온정제， 농축 및 결정화 공정을 포함할 수 있으며, 선택적으로 과당 이성화 반웅물의 불순물을 제거하는 공정은 탈염공정, 탈색공정 또는 탈색과 탈염 공정을 수행할 수 있다.

본 발명의 과당 제조 공정에 포함된 농축 공정은 다양한 방법으로 농축하여 과당 함량을 85중량 % 이상으로 포함하도록 한다. 예를 들면, 모사 이동층,.흡착 분리 방법으로 얻어진 과당 분획 (예를 들면 고형분 농도 20〜 30%)올 농축 공정올 통해 고형분 농도 45 내지 55% 농축할 수 있다.

(2) 사이코스 전환 반웅물의 분리공정

본.발명에 따른 사이코스 제조 공정은, 상기 사이코스 전환 반응물을 이온정제 및 모사이동층 (SMB) 크로마토그래프 분리 공정을 포함하는 사이코스 전환 반응물의 분리공정을 포함할 수 있다. 구체적인 일예에서， 상기 사이코스 전환 반웅물을 SMB 크로마토그래피 분리를 수행하여, 전환 반응물보다 사이코스 함량이 높은 사이코스 분획과 과당 라피네이트로 분리하고, 상기 사이코스 분획은 사이코스 농축 공정 또는 결정화 공정으로 투입되고， 과당 라피네이트는 과당—함유 원료로서 사이코스 전환 공정으로 투입되어 재순환된다.

상기 사이코스 분획 내 사이코스의 함량은 85중량 % 이상， 예를 들면 85 중량 % 내지 95 %(w/w) 이상이 되도록 분리 /정제 하는 것을 포함할 수 있다. 상기 고순도 분리 공정에서 얻어지는 과당 라피네이트 내 과당 함량은 85 중량 %이상, 예를 들면 85 중량 % 내지 98 중량 %일 수 있으며, 사이코스 함량은 2중량%이하인 것이 바람직하다. 과당 라피네이트 중에서 과당과 포도당을 제외한 기타 이당류 이상의 당류의 함량은 전체 당류의 총고형분 함량을 기준으로 10 중량 % 미만이 바람직하다. 상기 불순물중 이당류 이상의 당류는 말토오스, 이소말토오스 등을 포함하며， 말토오스 또는 이소말토오스 관련 올리고사카라이드를 포함할 수 있다.

상기 과당 라피네이트를 사이코스 전환 반응으로 재순환할 경우， 재순환 횟수가 증가할수록 _. 불순물의 함량이 증가한다. 상기 과당 라피네이트의 불순물 함량이 특정 수치 범위 이하로 유지할 수 있도록 공정을 수행하는 것이 바람직하며, 상기 불순물 함량이 특정 수치 범위를 초과할 경우， 사이코스 제조 공정에서 일부 또는 전부를 배출하여 제거될 수 있다. 예를 들면, 과당 라피네이트 내 이당류 이상의 당류 함량이， 과당 라피네이트의 총 당류 고형분 100중량 % 기준으로 10 중량 %미만， 예를 들면 8 중량 %미만， 6 증량 %미만， 또는 5 중량 ¾ 미만으로 유지되는 것이 바람직하다.

상기 사이코스 제조 공정에서 이온 정제 공정은 반웅물 내 포함된 이온을 제거하는 공정으로서, SMB 크로마토그래피 분리 공정 이전 및 /또는 이후에 수행할 수 있다. 상기 SMB 크로마토그래피 분리를 수행하기 전에 이온정제 공정을 수행하는 제 1차 이온정제는 하기 사이코스 분획의 제 2차 이온정제와 동일 또는 상이한 방법으로 수행할 수 있으며, 예를 들면 동일 종류 또는 상이한 종류의 이온교환수지가 층진된 분리탑을 1개 또는 2이상 사용하여 수행할 수 있다. 상기 이온 정제 공정은 이온정제에 사용되는 수지의 물성 및 이온 정제 효율을 고려하여 35 내지 50 ^° C 은도， 예를 들면 38 내지 58 ^° C에서 수행될 수 있다.

본 발명의 일예에서， 상기 사이코스 전환 반웅물의 제 1차 이온 정제 공정을 수행하기 전에, 선택적으로 사이코스 전환 반웅물을 활성탄으로 처리하는 공정을 추가로 수행할 수도 있다.

본 발명의 일 예에서， SMB 크로마토그래피를 이용한 고순도 분리 공정은 분리과정에서 상 변화가 없어 물질의 안정성 확보에 용이한 분리방법이다. 이러한 흡착 분리방법 중에서 액상 흡착 분리방법으로는 크로마토그래피 분리방법이 많이 사용되고 있다. 이중， 모사 이동층 흡착 분리 방법 ( s imu l ated moving bed , SMB)은 1961년 미국특허 제 2 , 985 , 589호 에서 제안된 분리 기술로, 다수의 컬럼을 이용하여 연속적으로 분리함으로써 기존의 희분식 크로마토그래피에 비해 순도 및 생산성이 우수하고, 적은 용매의 사용이 가능하다는 장점을 지닌다. 상기 모사 이동층 (SMB) 흡착 분리 공정은 분리대상 흔합물의 주입과 라피네이트 및 추출물의 생산이 연속적으로 이루어지는 공정이다.

SMB의 기본 원리는 칼럼 사이의 위치를 일정 시간 간격으로 움직임으로써 고정상과 이동상의 향류의 흐름을 모사하고 연속적인 분리를 가능하게 _. 하는 것이다. 흡착제와 친화력이 약해서 빨리 .움직이는 물질은 액상의 흐름 방향으로 움직여서 ext ract로 모이고 흡착제와 친화력이 강해서 느리게 움직이는 물질은 고정상의 흐름 방향으로 움직여서 라피네이트 ( raf f inat e)로 모인다. 칼럼은 연속적으로 연결되어 있으며 입구는 흔합물과 이동상, 출구는 ^' 목적 추출물 (ext ract )과 라피네이트로 구성된다.

상기 SMB에서 분리수지로서 단당 분리 공정에도 널리 사용되고 있는 염이 첨가된 강산의 양이온 교환수지를 사용하므로 분리공정을 수행 후 얻어지는 산물에는 금속이온이 포함된다. 상기 강산의 양이온 교환수지의 예는 칼슴 활성기가 부착된 양이온교환수지일 수 있다.

도 1은 일반적인 모사 이동층 (SMB) 흡착 분리 장치의 공정도를 나타낸다. 일반적인 모사 이동층 (SMB) 흡착 분리 장치는 하나 또는 그 이상의 컬럼으로 구성된 4개의 구간과 각 구간 사이에 위치한 탈착제 (desorbent ) 유입 포트， 강 흡착질인 추출물 (ext ract ) 배출 포트， 분리대상 흔합물 ( feed) 유입 포트 및 약 흡착질인 라피네이트 (raf f inat e) 배출 포트로 구성된다. 유사 이동층 (SMB) 흡착 분리 장치를 사용한 흔합물의 분리방법은 방향족 탄화수소의 흔합물의 분리， 에틸벤젠의 분리 공정, 키랄 화합물의 분리 공정 등에 적용될 수 있으며， 의약품 제조 과정 중 최종 산물 혹은 중간 물질인 라세미 흔합 의약품의 분리 공정 등에 적용될 수 있다.

상기 고순도 분리 공정은 45 내지 70 ^° C 온도， 예를 들면 50 내지 65 ^° C에서 수행될 수 있다.

(3) 과당 라피네이트의 재순환 공정

본 발명에 따른 사이코스 제조방법은, SMB 크로마토그래피 분리 공정에서 얻어자는 과당 라피네이트를 사이코스 전환 공정으로 재순환하여 반웅 원료로 사용함으로써, 사이코스의 생산 수율을 최대로 높이고 사이코스의 제조원가를 낮출 수 있다. 사이코스 제조의 분리공정에서 얻어지는 과당 라피네이트를 사이코스 제조 공정으로 재순환하는 경우， 재순환하지 않는 경우에 비해 과당 원료의 투입량이 감소되어 원료 생산 부하를 줄일 수 있다. 상기와 같은 사이코스 제조 공정의 운영으로 사이코스와 같은 목적 산물을 연속적으로 생산하기 위해 생물 전환 반응기를 초기 활성 대비 적합한 수준의 생산성을 유지하면서 운전할 수 있다.

또한, 과당 라피네이트를 활용하여 과당 이성화 시럽의 혼합을 통한 액상과당 제품의 품질 저하를 막고 사이코스 시럽 생산에 사용되는 고과당 시럽의 과당 함량을 유지할 수 있다.

상기 사이코스 제조의 분리공정에서 얻어지는 _. 과당 라피네이트를 사이코스 전환 반응의 원료로 사용하기 전에， 사이코스 전환 반웅의 원료로 사용하기에 적합한 조건을 갖도록, 넁각, 농축, 이온 정제 및 pH 조절로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 공정을 추가로 수행할 수 있다. 본 발명의 바람직한 일예에서， 과당 라피네이트는 고순도 분리 정제 공정에서 배출되어, 넁각, 1차 이온 정제， 농축, 및 pH 조절단계를 수행하여， 신규 과당원료와 유사한 고형분 함량 (브릭스) 및 pH (예를 들면， 중성 pH)로 조절하고, 칼슘 이온 농도가 감소한 과당 원료로 사이코스 전환 반응에 투입될 수 있다.

본 발명의 일예에서， 사이코스 제조의 고순도 분리공정에서 얻어지는 과당 라피네이트는 사이코스 전환 반응의 원료로 단독， 또는 신규 과당 원료와 함께 투입될 수 있다. 상기 과당 라피네이트와 신규 과당 원료의 흔합물을 사이코스 전환 반응의 반응 원료로 사용하는 경우， 과당 라피네이트의 활용을 최대화하고 공정에서 얻어지는 사이코스의 수율을 최대로 유지할 수 있도록， 과당 라피네이트와 신규 과당 원료의 혼합비를 적절히 조절할 수 있다. 공정의 유지 면에서는 신규 과당 함량을 최대로 설정할 수 있으나 과당 라피네이트의 재활용 이라는 면에서는 적절하지 아니하며. , 고순도 분리 공정에서 얻어지는 과당 라피네이트를 최대한 활용할 수 있도록 흔합비를 설정하는 것이 바람직하다. 예를 들면， 사이코스 전환 반응에 공급되는 원료로 전화반웅을 수행한 후에， 감소된 과당 부족분을 보층하는 함량으로 과당 라피네이트를 흔합할 수도 있고, 사이코스의 수율을 특정 수치이상으로 유지 가능한 함량까지 과당 라피네이트 흔합량을 증가시킬 수 있다.

또한, 과당 라피네이트의 재순환 횟수가 증가할수록 과당 라피네이트에서 과당과 함께 얻어지는 포도당 및 이당류 이상의 과당 이외의 불순물의 함량이 높아지는 문제점이 있으므로 이들 불순물의 함량이 특정 함량 이하로 유지될 수 있도록 재순환 횟수 및 신규 과당 원료와 흔합비를 적절히 조절할 수 있다.

과당 라피네이트와 흔합되는 신규 과당 원료의 흔합량은, 과당 원료를 사이코스로 전환하는 전환율 또는 수율을 결정하는 생물학적 전환 수단, 예컨대 효소， 균체， 추출물 또는 파쇄물 등의 생물학적 촉매의 전환율을 고려하거나， 사이코스 제조 공정상의 다양한 인자， 예를 들면 과당 함량 등을 고려하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 신규 과당 원료내 과당 함량 및 /또는 과당 라피네이트 내 과당 함량을 고려하여 신규 과당 원료의 흔합량을 결정할 수 있다. 즉, 신규 과당 원료내 과당 함량이 높을 경우， 과당 라피네이트와 흔합 시 얻어지는 흔합 원료의 과당 함량이 높아지므로 , 상대적으로 낮은 과당 함량을 갖는 신규 과당 원료를 사용하는 경우에 비해 과당 라피네이트의 흔합량올 많게 조절할 수 있다.

본 발명에 따른 사이코스 제조 공정의 분리 과정에서 얻어지는 과당 라피네이트는 과당 함량 85 중량 ¾이상, 예를 들면 85 중량 % 내지 99 중량 %일 수 있다. 또한, 사이코스 전환 반응에 투입되는 과당 원료의 신규 과당 함량은 85 중량>이상, 예를 들면 85 중량 ¾ 내지 99 중량 %일 수 있다. 상기 과당 라피네이트와 신규 과당 원료의 흔합물을 사이코스 전환 반응의 반응 원료로 사용하는 경우, 상기와 같은 다양한 영향 인자를 고려하여 과당 라피네이트와 흔합되는 신규 과당 원료의 흔합량을 결정할 수 있으며, 통상 과당 함량, Br ix , 사이코스 생산 시스템의 운영방식， 수율 등을 고려하여 적절히 조절할 수 있다. 사이코스 제조의 분리 공정에서 얻어지는 과당 라피네이트의 활용도를 고려하면， 과당 라피네이트를 전부 사용하고， 사이코스 전환으로 감소된 원료 분을 신규 과당 원료로 보충하여 운영될 수 있으며, 신규 과당 원료만으로 가동되는 사이코스 제조 시스템에서 과당 라피네이트의 일부를 과당 원료로. 사용할 수도 있다. 따라서, 과당 라피네이트의 전부를 사용할 수도 있고， 과당 원료에 최소한의 함량으로 첨가하고 나머지는 시스템에서 배출할 수도 있다. 따라서, 과당 라피네이트를 사이코스 전환 반웅에 투입하는 함량은 분리공정에서 얻어지는 과당 라피네이트 전부를 최대한의 함량으로 해서， 시스템 운영이 허용되는 한 과당 라피네이트 일부를 재순환할 수 있다.

구체적으로， 과당 라피네이트의 최대 활용도를 고려한다면 과당 라피네이트 전부를 사용하는 경우가 바람직하며， 이 경우 사이코스 전환 공정과 분리 공정에서 감소된 과당 원료분 만큼의 부족분을 신규 과당 원료로 보층할 수 있다. 예를 들면, 과당 라피네이트와 신규 과당 원료를 모두 동일하게 50 브릭스로 조정한 경우， 신규 과당 원료 부피 100을 기준으로 5 부피비 내지 .150 부피비, 바람직하게는 50 내지 130부피비로 사용될 수 있다.

예를 들면, 과당 라피네이트와 신규 과당 원료를 모두 동일하게 50 브릭스로 조정한 경우, 과당 라피네이트와 신규 과당 원료의 흔합비는 과당 라피네이트: 신규 과당원료 =1 : 0.9 내지 1.5부피비일 수 있다. 신규 과당 원료의 과당 농도에 따라 흔합비가 달라질 수 있다. 예를 들면 과당 라피네이트과 신규 과당 원료를 모두 동일하게 50 브릭스로 조정한 경우, 과당 라피네이트과 신규 과당 원료의 흔합비는 1 : 0.9 내지 1.5부피비， 또는 과당 라피네이트: 신규 과당원료 =1 : 0.95 내지 1. 15부피비 또는 1 : 0.98 내지 1.05부피비일 수 있으며， 또한 과당 라피네이트: 신규 과당원료의 흔합은 1 : 1.05 내지 1.2 또는 1 : 1 .08 내지 1. 13 부피비일 수 있다.

상기 과당 라피네이트에 대한 신규 과당 원료의 첨가량이 상기 범위보다 적은 경우에는， 과당 라피네이트의 재순환 횟수가 증가될수록 사이코스 전환공정에 투입되는 라피네이트 원료의 과당 순도가 떨어지게 되어 사이코스 전환율이 감소하게 되고 사이코스 최종 생산 수율이 저하된다. 따라서, 생산 소요시간 및 사이코스 수율을 고려하여 적절한 사이코스 생산 수율이 유지되도록 공정을 최적화하여야 한다. 상기 흔합비가 상기 범위조건을 만족하는 경우， 사이코스 전환 공정을 계속 수행하여도 사이코스 이성화 공정에 투밉되는 원료의 과당 순도를 적정 범위로 유지할 수 있으며 사이코스 전환율도 안정적으로 유지할 수 있다. 본 발명의 일예에서, 과당 라피네이트의 재순환은 칼슘 함량이 증가하게 되며 이러한 칼슴은 사이코스 전환 반응의 활성을 떨어뜨리게 될 수 있어, 칼슘 이온 농도를 조절하기 위한 공정을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 이온 농도를 조절하는 단계는 이온교환수지가 충진된 크로마토그래피를 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 금속이온를 결합할 수 있는 히드록시기 (0H— )로 치환된 강염기성 또는 약염기성 음이온 수지를 이용한 이온교환공정을 수행할 수 있다.

상기 과당 라피네이트를 사이코스 전환 반응에 투입하기 전에， 상기 과당 라피네이트 또는 상기 과당 라피네이트를 함유하는 과당 원료의 칼슘이온 농도를 0.05mM 이하의 범위， O . OlmM 이하， 0.005mM, 또는 O . OOlmM이하의 농도 범위로 칼슘 농도를 조절할 수 있다. SMB 크로마토그래피 공정에서 발생되는 과당 라피네이트를 재사용하는데 있어서 SMB 크로마토그래피 공정에서 흔입되는 칼슘 (Ca) 이온을 정제하지 않올 경우에는 망간을 단독으로 사용한 것보다 활성이 떨어지므로 사이코스 생산량에 부정적인 영향을 줄 수 있다.

사이코스 전환 반응물의 SMB 고순도 분리공정에서 분리수지로서 단당 분리 공정에도 널리 사용되고 있는 염이 첨가된 강산의 양이온 교환수지를 사용하므로, 사용함에 따라 수지에 붙어있는 금속 일부가 유출되고， 이에 따라 분리공정을 수행 후 얻어지는 산물에는 금속이온이 포함된다. 특히 칼슘이온이 과량으로 포함되어 있어 사이코스 전환 반웅에 좋지 않은 영향을 미친다. 따라서, 과당 라피네이트를 이온 정제하여 특정 농도 범위 이하로 칼슘이온 농도를 조절할 필요성이 있다. 이는 수지의 내구성과도 연관이 있는데 점도가 있는 당액이 들어오면서 점도에 의한 마찰이 발생되어 수지의 표면에 붙어있는 금속 이온들이 소량씩 유출이 된다. 그러한 이유로 이온교환수지를 층진 후 장기간 사용 시에는 일정 주기에 따라 수지를 교체한다..

상기 과당 라피네이트의 이온정제는 상기 (2)항목의 사이코스 전환 반응물의 분리 공정에서 수행하는 이온정제 공정과 동일한 방법으로 수행할 수 있다.

상기 크로마토그래피 분리공정에서 얻어지는 과당 라피네이트는 전기 전도도가 20 내지 200 z^s/cm이며, 상기 과당 라피네이트를 이은정제공정으로 처리할 수 있으며， 상기 처리 산물의 전기 전도도가 0 내지 15 /cm인 것일 수 있다.

본 발명의 일예에서, 사이코스 제조의 분리 공정에서 얻어진 과당 라피네이트는 이온정제와 함께 또는 이온정제 후에 농축하여 과당 함량을 증가시키는 공정을 추가로 수행할 수 있다. 사이코스 제조의 고순도분리 공정에서 얻어지는 과당 라피네이트가 낮은 브릭스를 갖는 경우 농축 공정을 수행하여 신규 과당 원료와 동일 _. 또는 유사한 브릭스가 되도록 고형분 함량을 조절할 수 있다. 사이코스 제조의 고순도 분리공정에서 얻어지는 과당 라피네이트는 15 내지 25 Br i x 정도이므로, 사이코스 전환 공정에 공급되는 통상의 과당 함유 원료가 45—55 브릭스, 예컨대 약 50 브릭스 임을 고려하면, 농축공정을 수행하여 과당 함량을 증가시키는 것이 바람직하다. 상기 농축 공정은 포도당을 원료로 과당 이성화를 수행하여 과당 원료를 제조하는 과당 제조 공정에서 사용되는 농축 과정과 동일하거나, 사이코스 제조의 SMB 고순도 분리 후에 얻어지는 사이코스 분획의 농축 공정과 동일한 방법으로 수행할 수 있다. 상기 과당 제조 공정에서 농축하는 공정은 사이코스보다 열안정성이 높기 때문에 70 내지 85 ^° C의 온도 하에서 10 내지 15 분 동안 농축하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 구체적 일예에서, 사이코스 제조의 분리 공정에서 얻어지는 과당 라피네이트를 사이코스 전환 공정에 투입하기 전에， 이온정제 공정 및 /또는 과당 농축 공정을 수행하는 것은 사이코스 제조 장치에 연결된 별도 장치를 이용하여 수행할 수 있다.

상기 냉각， 농축, 이온 정제 및 pH 조절로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 공정을 추가로 처리한 과당 라피네이트를 저장조에 투입하여， 온도 조절하는 단계， 또는 상기 사이코스 전환 공정에 제공되는 과당 라피네이트의 투입량을 조절하는 단계를 추가로 수행할 수 있다.

(4) 사이코스 농축 또는 결정화 공정

본 발명의 사이코스 제조 공정에서 SMB 크로마토그래피를 이용한 고순도 분리공정에서 얻어진 사이코스 분획은 사이코스 농축 공정을 거쳐 액상 시럽으로 제품화하거나, 사이코스 결정화 공정을 거쳐 사이코스 결정으로 제품화할 수 있다.

상기 단계 (2)에서 SMB 크로마토그래프 분리 공정에서 얻어진 사이코스 분획을 이온정제하고 농축하여 얻어진 농축물을 제조하는 단계이다. 상기 농축물은 사이코스 시럽제품으로 사용되거나， 결정화 공정에 투입되어 사이코스 결정으로 제조될 수 있다.

본 발명의 일예에서, 상기 SMB 크로마토그래피를 이용한 고순도 분리공정에서 얻어진 사이코스 분획을 제 2차 이온정제 공정을 수행할 수 있으며， 상기 분리 공정에서 수행한 제 1차 이온정제와 동일 또는 상이한 방법으로 수행할 수 있다.

사이코스 결정을 수득하기 위한 사이코스 용액 중 사이코스의 함량은 과포화 상태로 높은 농도로 포함되어야 하나， 사이코스 전환 반웅물의 사이코스의 함량은 낮기 때문에 직접 결정화를 수행할 수 없으며 결정화 단계 전에 사이코스를 함량을 증가시키기 위해 정제하고 원하는 수준까지 농축하는 공정을 수행해야 한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 정제된 사이코스 용액을 농축시키는 단계는 55 내지 75 ^° C에서 수행될 수 있다. 농축액의 온도가 75 ^° C보다 높아지면 D-사이코스의 열변성이 일어날 수 있으며, 55 ^° C보다 낮아지면 원하는 수준의 농축을 달성하기 어렵다. 농축이 진행되면서 증발열에 의해 반응물의 온도가 급격히 증가되므로， 농축액의 온도를 75 이하로 유지하면서 신속하게 농축해야 한다.

본 발명의 일 구체예에서, 사이코스의 열변성 및 원하는 수준의 농축을 달성하기 위하여, 55 내지 75 ^° C 온도, 바람직하게는 60 내지 70 ^° C범위에서 농축할 수 있다. 상기 농축 공정은 원하는 농축 수준을 달성할 때까지 1회 또는 2회 이상 반복 수행할 수 있다.

구체적으로, 상기 SMB 크로마토그래피 분리공정에서 얻어진 사이코스 분획의 농축 공정은 다양한 방법으로 수행할 수 있으며， 농축물의 고형분 함량이 70브릭스 이상이 되도록 할 수 있다. 예를 들면, 모사 이동층 흡착 분리 방법으로 얻어진 사이코스 분획 (예를 들면， 고형분 함량 20 30 중량 %)을 농축 공정을 통해 고형분 함량 70 브릭스 이상으로 농축할 수 있다. 상기 사이코스 농축물의 고형분 함량은 70브릭스 이상, 예를 들면 70 브릭스 내지 85브릭스일 수 있다.

상기 사이코스 제조 공정에서 농축하는 공정은 55 내지 75 ^° C 온도 범위에서 10 내지 15 분 동안 농축하는 것을 포함할 수 있다. 상기 농축은 연속진공농축장치 (Fal l ing Fi lm Evaporator ) 또는 박막진공농축기 (Thin Fi lm Evaporator)를 이용하여 감압 또는 진공 조건하에서 농축할 수 있다. 상기 사이코스 농축물에 포함된 사이코스 함량은 상기 SMB 크로마토그래피 분리 공정에서 얻어진 사이코스 분획의 사이코스 함량과 ^' 변동이 거의 없으며， 고형분 함량이 증가하여 이후 결정화 공정을 수행할 수 있도록 한다. 상기 사이코스 농축물에 포함된 사이코스 함량은 고형분 총함량 100중량 %를 기준으로 94 중량 ¾이상， 95 중량 %이상， 96 중량 %이상， 97 중량%이상, 98 중량?。이상 또는 99중량 %이상일 수 있다. 상기 사이코스 결정화 공정은， 상기 고순도 분리 공정에서 얻어진 사이코스 분획을 제 2차 이온정제하는 단계， 상기 이온 정제된 사이코스 분획을 농축하는 단계 , 상기 농축물로부터 사이코스를 결정화하여 사이코스 결정과 사이코스 결정화 모액을 얻는 단계를 포함한다. 상기 사이코스 분리공정의 구체적인 예는, 제 1차 이온정제， 고순도 크로마토그래피 분리, 제 2차 이온정제, 농축 및 결정화 공정을 포함할 수 있으며， 선택적으로 사이코스 전환 반웅물을 탈염공정， 탈색공정 또는 탈색과 탈염 공정을 수행할 수 있다.

상기 사이코스 분획 내 사이코스의 함량은 85중량 % 이상， 90중량 % 이상, 91중량 ¾> 이상, 92중량 % 이상， 93중량 % 이상， 94증량 % 이상 또는 95중량 % 이상, 예를 들면 85 중량 % 내지 99 .9 %(w/w) 이상이 되도록 분리 /정제하는 것을 포함할 수 있다.

상기 사이코스 결정에 포함된 사이코스는 순도 90중량 %이상, 95 중량 %이상, 또는 99중량%이상이며， 상기 결정화 모액 내 사이코스 함량은 85중량 %이상, 90중량 %이상， 93중량 %이상, 또는 95 중량 %이상, 예를 들면 85 중량 % 내지 95 중량 %일 수 있다.

본 발명의 방법에 의하여 과당으로부터 수득된 사이코스는 통상적인 방법에 의해 정제될 수 있으며， 이러한 결정은 당업자에게 통상적인 기술에 속한다. 예를 들어 원심분리, 여과, 결정화， 이온교환 크로마토그래피 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의하여 이루어질 수 있다.

일예에서, 상기 SMB 크로마토그래피를 이용한 고순도 분리공정에서 얻어진 사이코스 분획을 제 ₂ 차 이온정제할 수 있으며, 상기 사이코스의 분리 공정에서 사용한 제 1차 이온정제와 동일 또는 상이한 방법으로 수행할 수 있다.

본 발명에 따른 D-사이코스 결정을 제조하는 방법은 정제된 D- 사이코스 용액를 농축시키는 단계를 포함할 수 있다. 사이코스 결정을 수득하기 위한 사이코스 용액 중 사이코스의 함량은 70 중량¾이상이어야 한다. 사이코스 에피머화 효소에 의해 제조된 사이코스 용액 중 사이코스의 순도는 20 내지 30% 정도로 낮기 때문에 직접 결정화를 수행할 수 없으며 결정화 단계 전에 사이코스를 정제하고 원하는 수준까지 농축해야 한다. 본 발명의 일 구체예에서, 사이코스의 열변성 및 원하는 수준의 농축을 달성하기 위하여， 55 내지 75 ^° C 온도 범위에서 농축할 수 있다. 상기 농축 공정은 원하는 농축 수준을 달성할 때까지 1회 또는 2회 이상 반복 수행할 수 있다.

상기 넁각시켜 결정화하는 단계는， 열 교환기를 통하여 10 내지 25 ^° C온도 범위로 급속히 냉각시킨 후， 승온과 넁각을 반복적으로 수행하여 결정성장을 유도시키는 것을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 D—사이코스 결정을 제조하는 방법은 상기 결정화 단계에서 수득된 사이코스 결정을 원심분리에 의해 회수하고, 탈이온수로 세척한 후, 건조시키는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일예에서, 과당 원료를 이용한 생물학적 사이코스 전환 반웅 및 사이코스 분리 공정을 수행하는 사이코스 제조 장치로서,

과당 원료로부터 사이코스 전환반응을 수행하는 사이코스 전환 반응기 ,

. 상기 전환 반응기에서 얻어진 사이코스 전환 반웅물을 이온정제하는 이온교환수지가 충진된 칼럼을 구비한 이온정제기,

활성기가 부착된 양이온교환수지가 충진된 칼럼을 포함하고 이온정제기를 통과한 반웅물을 투입하는 투입구， 사이코스 분획과 과당 라피네이트를 배출하는 배출구를 구비한 모사 이동층 (s imu l ated moving bed,

SMB) 크로마토그래프 분리기， 및 상기 분리기에서 배출된 과당 라피네이트를 이온교환수지가 층진된 칼럼을 구비한 이온정제기 및 농축기를 통과하여 사이코스 전환 반응기로 재순환시키는 것인 사이코스 제조 장치를 제공한다.

상기 사이코스 제조 장치는, 사이코스 전환 반응기에 연결되며， 농축기로부터 배출된 과당 라피네이트와 신규 과당 원료를 흔합하는 흔합조를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 제조 장치는 상기 크로마토그래프 분리기에서 배출된 과당 라피네이트의 넁각을 위한 열교환기를 추가로 구비할 수 있다. 【발명의 효과】

본 발명에 따른 과당 라피네이트의 활용으로 효율적인 사이코스 생산 및 액상과당을 생산할 수 있으며 , 특히 라피네이트와 신규 과당원료의 흔합비를 조절하여 액상과당 제품의 품질 저하를 막고 사이코스 시럽 생산에 사용되는 고과당 시럽의 과당 함량을 유지시켜 장기간 안정적으로 높은 수율로 사이코스를 생산할 수 있다.

【도면의 간단한 설명】

도 1는 일반적인 SMB 공정의 일예를 나타내는 도면이다.

도 2은 본 발명의 일 실시예에 따라 얻어지는 과당 라피네이트 전량을 사이코스 전환반응에 투입하는 사이코스 제조방법에 대한 모식도이다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 얻어지는 과당 라피네이트 일부를 사이코스 전환반응에 투입하는 사이코스 제조방법에 대한 모식도이다.

【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】

이하， 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며， 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다. 제조예 1. 사이코스 시럽의 제조

한국공개특허 제 2014-0054997에 기재된 제조방법과 실질적으로 동일한 생물학적 방법으로 과당 기질로부터 사이코스 시럽을 제조하였다. 구체적으로， 크로스트리디움 신댄스 (Cl ost r idi uim sc indens ATCC

35704)로부터 유래된 사이코스 에피머화 효소의 암호화 유전자 (DPE gene ; Gene bank : EDS06411 . 1)를 재조합 백터 (pCES_sodCDPE)에 도입하여， 상기 제조된 재조합 백터 (pCES_sodCDPE) 플라스미드를 전기천공법 (e l ect roporat i on)을 사용하여 코리네박테리움 글루타리쿰을 형질전환시켰다. 상기 형질전환된 코리네박테리움 글루타리쿰 세포를 포함하는 비드를 제조하고 고정화 반웅 컬럼에 충진하고, 40브릭스의 88 중량 % 과당 또는 95 중량 % 과당으로부터 사이코스 시럽을 제조하였다. 즉， 88 중량 % 과당함유 기질로부터 포도당 :과당 :시 ^> 이코스 :올리고당 = 41 : 39 : 15 : 5인 21~23(w/w)% 사이코스 시럽을 수득하였고 (사이코스 시럽 A)， 과당 함량 95 중량 %로 포함하는 원료로 부터 포도당:과당:사이코스:올리고당 = 6 : 67 : 25 : 2인 24~26(w/w)% 사이코스 시럽을 수득하였다 (사이코스 시럽 B) . 제조예 2. 과당 라피네이트의 제조

제조예 1에서 얻어진 2 종류의 사이코스 시럽올 유색 및 이온 성분 등의 불순물을 제거하기 위해 양이온 교환수지， 음이온 교환수지 및 양이온과 음이온교환수지가 흔합된 수지로 층진된 상온의 컬럼에 시간당 이온교환수지 2배 부피의 속도로 통액시켜 탈염시켰다.

그 다음, 칼슘 (Ca ²⁺ ) 타입의 이온교환수지로 충진된 크로마토그래피를 이용하여 고순도의 사이코스 분획을 분리한 후， 남은 것을 라피네이트로 수득하였다. 88 중량 % .과당 함량의 원료로부터 얻어진 사이코스 시럽 (사이코스 시럽 A)으로부터 수득한 과당 라피네이트는 당류 고형분 총 100중량 %를 기준으로 과당 85 내지 95 중량 % , 포도당 1 내지 10 증량 % 및 환원당 1 내지 5 중량 %를 포함하고 있었다.

95 중량 % 과당 함량의 원료로부터 얻어진 사이코스 시럽 (사이코스 시럽 B)으로 부터 수득한 과당 라피네이트는 당류 고형분 총 100중량 %를 기준으로 과당 88 내지 98 중량 %， 포도당 1 내지 8 중량 % 및 환원당 1 내지 4 중량 %를 포함하고 있었다.

실시예 1 : 과당 라피네이트를 이용한 사이코스 생산

제조예 1 및 _, 제조예 2와 같이 과당 함량 88 중량 %의 시럽을 이용하여 사이코스 함량 95 중량 %의 고형분 10톤을 생산하기 위해, 유량 3.8 mVhr로 사이코스 전환 공정과 분리 공정을 수행하였다. · 구체적으로, 과당 함량 88 중량 %의 원료 기질용액 (시 ^{^} 이코스 시럽 A)으로 사이코스 전환 공정을 거쳐 수득한 사이코스 시럽의 사이코스 함량은 20 내지 23 중량 %이었다. 상기 사이코스 전환 반웅물을 양이온 교환수지， 음이온 교환수지 및 양이온과 음이은교환수지가 흔합된 수지로 층진된 상온의 컬럼에 시간 당 이온교환수지 2배 (1~2배 ) 부피의 속도로 통액 시켜 탈염시킨 후에 농축 공정을 수행하여 45 내지 50 중량 %의 사이코스 농도의 시럽을 만들었다. Ca ²⁺ -유형 분리 수지를 이용하여 고순도 크로마토그래피를 수행한 결과 과당 라피네이트는 시간당 3.1 m ³ 씩 발생하였다ᅳ

사이코스 전환 공정과 분리 SMB 크로마토그래프의 매시간마다 부족한 0.9 m ³ 는 과당 공정에서 얻어지는 과당 함량 88 중량 의 신규 과당 원료와 흔합하였다. 즉， 신규 과당 원료와 과당 라피네이트의 총 고형분 함량을 50중량 %(50 브릭스)로 맞춘 경우에, 신규 과당 원료와 과당 라피네이트의 흔합 부피비가 0.9:3.1(신규 과당: 과당 라피네이트 =0.29:1)로 흔합한 흔합물을 사이코스 전환 공정에 투입하여 사이코스 생산 공정을 수행하였다. 상기 공정을 10회 반복하여 수행하였으며， 각 공정별 흔합 원료 및 라피네이트의 당류 조성을 분석하여 하기 표 1에 나타내었다.

【표 1】

7차혼합액 2.0% 10.4% 79.6% 0.2% 7.4% 20.7%

7차 라피네이트 2.5% 12.7% 75.0% 0.3% 9.0%

8차혼합액 2.2% 11.1% 78.1% 0.3% 7.9% 20.3%

8차 라피네이트 2.6% 13.5% 73.3% 0.3% 9.6%

9차흔합액 2.3% 11.9% 76.6% 0.3% 8.4% 19.9%

9차 라피네이트 2.8% 14.5% 71.4% 0.3% 10.2%

10차혼합액 2.5% 12.7% 75.0% 0.3% 9.0% 19.5%

10차 라피네이트 3.0% 15.5% 69.4% 0.4% .10.9% 상기 표 1에 나타낸 것과 같이， 신규 과당 원료와 라피네이트의 흔합 부피비가 0.9:3.1(0.29:1)인 경우에는， 재순환 횟수가 증가될수록 사이코스 전환공정에 투입되는 라피네이트 원료의 과당 순도가 떨어지게 되어 사이코스 전환율이 감소하게 되고 사이코스 최종 생산 수율이 저하되는 것을 확인하였다. 실시예 2: 과당 라피네이트를 이용한 연속적 사이코스 생산

실시예 1과 동일한 방법으로 수행하되， 고순도 분리공정에서 얻어지는 과당라피네이트 1.8 m ³ /hr는 신규 과당 원료 (과당 순도 88¾>， 고형분 농도 50 중량 2.0 mVhi ^" 와 흔합하여 이온정제 공정에 공급하였다. 상기 신규 과당 원료와 라피네이트 흔합비는 5.2 내지 5.3: 4.7 내지 4.8 (신규 과당: 라피네이트 =1.08~1.13:1)비율이다.

상기 공정을 10회 반복하여 수행하였으며， 각 공정 별 흔합 기질 및 라피네이트의 당류 조성을 분석하여 하기 표 2에 나타내었다.

【표 2]

2차 라피네이트 1.6% 7.8% 83.0% 0.1% 7.3%

3차흔합액 1.3% 6.3% 85.7% 0.0% 6.5% 21.9%

3차 라피네이트 1.6% 7.7% 82.5% 0.1% 7.9%

4차흔합액 1.4% 6.3% 85.4% 0.0% 6.8% 21.9%

4차 라피네이트 1.6% 7.6% 82.1% 0.0% 8.3%

5차흔합액 1.4% 6.3% 85.3% 0.0% 7.0% 21.5%

5차 라피네이트 1.7% 7.6% 82.0% 0.0% 8.5%

6차혼합액 1.4% 6.2% 85.2% 0.0% 7.1% 21.5%

6차 라피네이트 1.7% 7.6% 81.9% 0.0% 8.6%

7차혼합액 1.4% 6.2% 85.1% 0.0% 7.1% 21.5%

7차 라피네이트 1.7% 7.6% 81.8% 0.0% 8.7%

8차흔합액 1.4% 6.2% 85.1% 0.0% 7.2% 21.5%

8차 라피네이트 1.7% 7.6% 81.8% 0.0% 8.7%

9차 흔합액 1.4% 6.2% 85.1% 0.0% 7.2% 21.5%

9차 라피네이트 1.7% 7.6% 81.7% 0.0% 8.7%

10차혼합액 1.4% 6.2% 85.1% 0.0% 7.2% 21.5%

10차 라피네이트 1.7% 7.6% 81.7% 0.0% 8.7% 상기 표 2에서 확인할 수 있듯이， 신규 과당 원료과 라피네이트 흔합비는, 신규 과당 원료과 라피네이트를 50 브릭스로 조절할 경우， 신규 과당 원료: 라피네이트의 흔합비는 5.2 내지 5.3: 4.7 내지 4.8 부피비 (신규 과당 원료 : 과당 라피네이트 =1.08~1.13 :1)인 경우에는 사이코스 전환 공정이 계속적으로 수행되어도 사이코스 전환공정에 투입되는 원료의 과당 순도가 크게 떨어지지 않으며, 사이코스 전환율은 5차 흔합액부터 안정적으로 유지가 될 수 있음을 확인하였다.

【표 3】

고순도 분리후 사이코스 0.0% 0.0% 1.8% 97.2% 1.0% 고순도 분리후 1.5% 8.3% 85.6% . 0.3% 4.3% 라피네이트 분획

액상과당 시럽 (55¾ 2.4% 39.5% 56.5% 0.0% 1.6% 사이코스 분획의 0.0% 0.0% 1.8% 97.2% 1.0% 정제 /농축

사이코스 결정화 0.0% 0.0% 0.1% 99.9% 0.0% 사이코스 결정화 모액 0.0% 0.0% 7.6% 89.5% 2.9% 상기 표 3에 나타낸 것과 같이, 과당 원료의 과당 순도 88 중량 %를 이용하여 사이코스 제조 공정을 운영할 경우， 사이코스 전환율 약 23%를 나타내며 고순도 분리를 통해서 사이코스 순도 95 중량 % 이상의 사이코스. 시럽을 제조하였다. 이때 분리 수율은 원료의 사이코스 함량 90% 이상을 분리할 수 있었다.

분리된 고순도 사이코스 분획은 정제를 거쳐 액상 제품으로 출시되거나 결정화 공정올 진행하여 사이코스 함량 99.9중량¾의 결정화 제품을 만들 수 있다. 결정화 공정을 수행할 경우 상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 사이코스 함량 95 중량 % 이상이었다. 또한 고순도 분리 후에 얻어진 과당 라피네이트를 고형분 함량 50 내지 77 중량 %로 농축하여 과당 함량 42중량 % (고형분 함량 50 내지 77 중량 %)의 신규 과당 원료와 흔합하여 과당 순도 56.5 중량 %의 액상 과당 시럽을 제품으로 수득하였다. 실시예 3. 과당 라피네이트를 이용한 사이코스 생산

실시예 1과 동일한 방법으로 진행하되 , 과당 함량 95 중량 %의 시럽을 이용한 사이코스 함량 95 중량 %의 고형분 10톤을 생산하기 위해 유량 3.8 m ³ /hr로 사이코스 전환 공정과 분리 공정을 수행하였다.

사이코스 전환 공정을 거쳐 수득한 시럽의 사이코스 함량은 21 내지 25 중량 % 이며, 이온정제 후 45 내지 50 중량 ¾>의 농도로 분리 공정을 통과한다. Ca ²⁺ type 분리 수지를 이용하여 분리 시 발생되는 과당 라피네이트는 시간당 3 m ³ 씩 발생하였다. 사이코스 전환 공정과 분리 크로마토그래프의 매시간마다 부족한 0.8 m ³ 는 과당 공정에서 공급되어 흔합하였다. 즉, 신규 과당 원료과 라피네이트를 50 브릭스로 조절할 경우， 신규 과당 원료와 라피네이트의 흔합 부피비가 0.9:3.1 (신규 과당 원료: 라피네이트 =0.29:1)로 사이코스 생산 공정을 수행하였다.

상기 공정을 10회 반복하여 수행하였으며， 각 공정 별 흔합 기질 및 라피네이트의 당류 조성을 분석하여 하기 표 4에 나타내었다.

【표 4】

7차 라피네이트 0.1% 3.9% 94.2% 1.3% 0.5%

8차혼합액 0.1% 3.7% 94.7% 0.8% 0.7% 26.9%

8차 라피네이트 0.1% 3.9% 94.3% 1.3% 0,4%

9차혼합액 0.1% 3.7% 94.8% 0.8% 0.6% 26.9%

9차 라피네이트 0.1% 3.9% 94.2% 1.4% 0.4%

10차흔합액 0.1% 3.7% 94.8% 0.8% 0.6% 26.9%

10차 라피네이트 0.1% 3.9% 94.2% 1.5% 0.3% 상기 표 4에 나타낸 것과 같이， 과당 순도 95 중량 ¾>를 이용하여 사이코스를 생산하였을 때는 실시예 1과 달리 과당의 함량 변화가 없음을 확인하였다. 사이코스 전환 공정으로 주입되는 과당 순도 95 중량 % 이상의 과당 원료는， 과당 라피네이트의 재순환 횟수가 증가될수록 사이코스 전환 공정에 투입되는 원료의 과당 순도가 차이가 없어 사이코스 최종 생산이 유지가 될 수 있는 것을 확인하였다. 이는 포도당 및 이당류의 함량이 높지 않고 환원당 일부가 사이코스 분획으로 빠져나가면서 과당의 함량이 유지되는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 원료의 과당 함량이 95% 이상의 고순도 조건에서 높은 사이코스 전환율을 가지면서 라피네이트의 재순환이 가능하였다. 실시예 4. 과당 라피네이트를 이용한 연속적 사이코스 생산

실시예 3과 동일한 방법으로 수행하되， 과당 42%와 흔합 후 남은 라피네이트 1.9 m ³ /hr는 신규 과당 원료 1.9 m ³ /hr와 흔합하여 사이코스 전환 공정과 분리 크로마토그래피에 공급하였다. 신규 과당 원료과 라피네이트를 50 브릭스로 조절할 경우， 신규 과당 원료과 과당 라피네이트 흔합비는 5.0 내지 5.1 ： 4.9 내지 5.1 부피비 (과당 라피네이트:신규 과당 원료 =1: 0.98-1.05)이다. 상기 공정을 10회 반복하여 수행하였으몌 각 공정별 흔합 기질 및 라피네이트의 당류 조성을 분석하여 하기 표 5에 나타내었다. 【표 5]

9차 라피네이트 0. 1% 3.9% 94. 1% 1.3% 0.6%

10차 흔합액 0. 1% 3.5% 94.9% 0.5% 1.0% 27.0%

10차 라피네이트 0. 1% 3.8% 94.2% 1.2% 0. 7% 상기 표 5에 나타낸 것과 같이 , 라피네이트 일부를 액상과당 55 중량 ¾> 시럽으로 사용하고 , 라피네이트의 또 다른 일부는 신규 과당 원료와 흔합하면서 연속적인 사이코스 전환공정에 투입하여 고순도 사이코스 생산이 안정적으로 유지가 될 수 있음을 확인하였다. 각 공정별로 당조성의 변화를 확인하여 하기 표 6에 나타냈다.

【표 6】

상기 표 6에서 확인할 수 있듯이， 라피네이트를 일부 액상과당 생산 공정 으로 보내도, 사이코스 생산이 안정적으로 유지가 될 수 있다.

분리된 고순도 사이코스는 실시예 3과 동일하게 정제를 거쳐 액상 제품으로 출시되거나 결정화 공정을 진행하여 사이코스 함량 99.9% 의 결정화 제품을 만들 수 있다. 다른 사항들은 실시예 3과 동일하게 나타났다. 결정화 공정을 수행할 경우 상기 표 6에 나타낸 바와 같이， 사이코스 함량이 99.9% 이었다. 액상과당 (55% 시럽) 또한 기존 액상과당 95%와 4 를 흔합했올 때의 품질과 동등한 품질의 산물이 얻어졌다. 실시예 6 . 흔합 금속이온에 따른 사이코스 전환율 비교 실험

과당 라피네이트와 유사한 조성에서의 사이코스 전환율을 평가하였다. 즉, 과당 순도 95 중량 % 시럽을 50 중량 ¾>로 희석하여 Ca ²⁺ 이온을 0.005~0.01mM로 첨가 후 1.0 mM의 Μη을 추가로 첨가하여 사이코스 전환 공정을 확인하여 표 7에 나타내었다.

【표 7】

사이코스 전환 반웅의 활성을 증가시키는 망간을 처리한 경우 상대활성 152¾>에서, 칼슘을 추가로 첨가한 칼슘과 망간이 흔합되어 있는 상태에서 사이코스 전환 반응의 상대활성은 망간을 단독 처리한 것보다 최대 약 16%까지 감소되며， 칼슘이온의 농도가 높아질 수록 상대활성은 점차 감소하는 경향을 확인하였다.

이러한 결과는 고순도 분리 크로마토그래피 공정에서 발생되는 과당 라피네이트를 재사용하는데 있어서 분리 크로마토그래피 공정에서 석출되는 O . OlmM 이하의의 Ca 이은을 정제해야 되는 이유로 볼 수 있다. 이온정제를 하지 않을 시에는 망간을 단독으로 사용한 것보다 활성이 떨어지므로 사이코스 생산량에 부정적인 영향을 줄 수 있다.