Beschreibung

Technisches Gebiet der Erfindung:

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von reinem oder angereichertem Coenzym Qi ₀ durch Trennung von Stoffgemischen enthaltend Coenzym Q ₁₀ und ein Konstitutionsisomeres des Coenzyms Qi ₀ -

Coenzym Qi ₀ (Ubichinon) der Formel (I)

ist ein wichtiger Bestandteil der menschlichen Atmungskette und hat in jüngerer Zeit zunehmende Bedeutung als Nahrungsergänzungsmittel bzw. Therapeutikum erlangt.

Totalsynthetische Zugänge zu Coenzym Qi ₀ verfolgen aufgrund der Größe des Moleküls oft eine konvergente Strategie. Demnach werden üblicherweise der aromatische bzw. chinoide Kern des Moleküls und die polyisoprenoide Seitenkette zunächst separat voneinander aufgebaut und auf einer späten Stufe der Synthese miteinander gekoppelt.

Stand der Technik:

Die Kupplungsreaktion kann nach einem von Negishi et al. in Organic Letters, 2002, Vol. 4, No. 2, 261 - 264 bzw. für die Synthese von Coenzym Q ₆ oder Q ₇ von Lipshutz et al. in J. Am. Chem. Soc. 1999, 121 , 11664 - 11673 beschriebenen Verfahren durch Nickel-katalysierte Kupplung eines Vinylalans der Formel (III)

mit einem geeigneten, Chinon, beispielsweise einem solchen der Formel (IV)

wobei X eine Abgangsgruppe wie z.B. Halogen, speziell Chlor darstellt, vorgenommen werden.

Das dabei einzusetzende Vinylalan der Formel (III) ist seinerseits zugänglich durch Carboaluminierung des terminalen Alkins der Formel (V)

mit Trimethylaluminium in Gegenwart eines geeigneten Katalysators, beispielsweise eines Zirkon- oder Titankatalysators.

Die WO 2005/056812 offenbart ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Ubichi- nonen, speziell Coenzym Q10 durch Übergangsmetall-katalysierte Kupplung eines geeigneten Chinons mit einem Alkinderivat der jeweiligen Ubichinon-Seitenkette. Die Anmeldung offenbart darüber hinaus Gemische von Ubichinonen bzw. Ubichinonderi- vaten mit isomeren Verbindungen, die eine konstitutionsisomere Seitenkette aufweisen.

Aufgabe der Erfindung:

Es hat sich gezeigt, dass die so durchgeführte Carboaluminierung nicht ausschließlich zum gewünschten Carboalumierungsprodukt der Formel (III) führt, sondern außerdem zu einem regioisomeren Vinylalan der Formel (VI)

Aus den Gemischen der regioisomeren Vinylalane der Formeln (V) bzw. (VI) werden durch die oben genannte Ni-katalysierte Kupplung Gemische von Coenzym Q ₁₀ der Formel (I) und der Verbindung der Formel (II)

erhalten.

Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zu Grunde ein Verfahren zu entwickeln, das es erlaubt, Gemische von Verbindungen der Formel (I) und (II) so zu behandeln, dass sie sich für weitere Anwendungen, insbesondere für eine Anwendung als Nah- rungsergänzungsmittel bzw. Therapeutikum am Menschen eignen.

Beschreibung der Erfindung sowie deren bevorzugter Ausführungsformen:

Die Aufgabe wurde erfindungsgemäß gelöst durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von reinem oder angereichertem Coenzym Qi ₀ der Formel (I)

durch Trennung von Stoffgemischen enthaltend Coenzym Qi ₀ und die Verbindung der Formel (II)

Die genannten Gemische sind, wie eingangs erwähnt, durch Ni-katalysierte Kupplung eines Gemisches der isomeren Vinylalane der Formeln (III) und (VI) mit einem geeig- neten Kupplungspartner, wie beispielsweise einem Chinon der Formel (IV),

wobei X für eine Abgangsgruppe wie beispielsweise Halogen, bevorzugt Chlor oder Brom, insbesondere Chlor oder einen Rest -OR steht, wobei R beispielsweise Was- serstoff, einen verzweigten oder unverzweigten Alkylrest mit 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Hexyl, Cyclohexyl, oder gemeinsam mit dem Sauerstoffatom des Restes OR Sulfonyl wie Methylsulfonyl, Triflu- ormethylsulfonyl, p-Toluolsulfonyl und dergleichen mehr bedeuten können.

Die genannten Gemische können weitere Nebenprodukte, z.B. aus vorangegangenen Synthesestufen der Ausgangsverbindungen enthalten. Insbesondere können sie Nebenprodukte oder Verunreinigungen enthalten, die bei der Herstellung des Alkins der Formel (V) beispielsweise durch Propargylierung von Solanesolderivaten entstehen, wie beispielsweise Eliminierungsprodukte wie z.B. die Verbindung der Formel (VII)

Daneben können die erfindungsgemäß zu trennenden Stoffgemische beispielsweise auch Reagenzien bzw. Katalysatoren enthalten, die bei der Carboaluminierung der Verbindung der Formel (V) bzw. der Kupplung der daraus erhaltenen Vinylalane der Formeln (III) und (VI) eingesetzt werden wie beispielsweise Zr-, Ti- oder Ni-Salze oder auch Phosphine.

Als Ausgangsstoffe zur Isolierung von Coenzym Q ₁₀ nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugte Gemische sind solche, in denen Coenzym Qi ₀ , neben der Verbindung der Formel (II) bzw. etwaigen Verunreinigungen als gewichtmäßige Hauptkomponente, bevorzugt zu mehr als 30 Gew.-%, insbesondere zu mehr als 40 Gew.-% vorliegt. Als Ausgangsstoff wiederum bevorzugte Gemische sind solche, die zu mindestens etwa 50 Gew.-%, bevorzugt zu mehr als etwa 80 Gew.-% und insbesondere zu etwa 90 bis etwa 99 Gew.-% aus Coenzym Qi ₀ und der isomeren Verbindung der Formel (II) bestehen.

In den genannten, als Ausgangsstoffe zur Isolierung von Coenzym Qi ₀ geeigneten Gemischen beträgt das molare Verhältnis von Coenzym Q ₁₀ zum Isomeren der Formel (II) vorteilhaft etwa 85 zu 15 bis etwa 99,7 zu 0,3, bevorzugt etwa 85 zu 15 bis etwa

99,5 zu 0,5, besonders bevorzugt etwa 90 zu 10 bis etwa 99,5 zu 0,5, ganz besonders bevorzugt etwa 95 zu 5 bis etwa 99,5 zu 0,5.

Die erfindungsgemäße Trennung kann bevorzugt durch selektive Kristallisation von Coenzym Q ₁₀ aus Lösungen, die Coenzym Qi ₀ und die Verbindung der Formel (II) enthalten durchgeführt werden. Unter dem Begriff selektiv ist dabei zu verstehen, dass eine der beiden Verbindungen der Formeln (I) bzw. (II) in dem erhaltenen Kristallisat in, im Vergleich zum eingesetzten Gemisch, angereicherter Form vorliegt, d.h. dass das molare Verhältnis der genannten Verbindungen im Rohprodukt zu Gunsten einer der beiden Verbindungen im Kristallisat verschoben wird. Bevorzugt ist dabei die selektive Kristallisation bzw. Anreicherung von Coenzym Qi ₀ der Formel (I) im Kristaliisat.

Bevorzugte Lösungsmittel zur Durchführung der genannten selektiven Kristallisation sind Alkohole, insbesondere solche mit 1 bis etwa 10 Kohlenstoffatomen wie bei- spielsweise Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, n-Butanol, Isobutanol, tert.- Butanol, Hexanol Ethylenglycol, Propandiol, Butandiol und dergleichen mehr.

Weitere bevorzugte Lösungsmittel sind Carbonylverbindungen, wie beispielsweise Aceton, Diethylketon, Methylethylketon, Essigsäureethylester oder Cyclohexanon.

Als weitere bevorzugte Lösungsmittel seien die cyclischen oder acyclischen Ether wie beispielsweise Diethylether, Tetrahydrofuran, Dioxan, Methyl-tert.-butylether oder Diglyme genannt.

Als weitere geeignete Lösungsmittel zur Durchführung der erfindungsgemäßen Trennung seien auch halogenierte Lösungsmittel wie beispielsweise Dichlormethan oder Dichlorethan sowie aromatische Lösungsmittel wie etwa Toluol oder XyIoI genannt.

Darüber hinaus seien als geeignete Lösungsmittel auch Kohlenwasserstoffe wie bei- spielsweise Petrolether, Pentan, Hexan, Heptan, Cyclohexan und dergleichen mehr genannt.

Weitere im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugte Lösungsmittel sind Aceto- nitril und Wasser.

Die genannten Lösungsmittel können auch in Form von Gemischen eingesetzt werden, insbesondere in Form von binären oder ternären Gemischen der genannten Lösungsmittel. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Lösungsmittel bevorzugt ist Ethanol oder Lösemittelgemische die Ethanol enthalten. Unter den genannten Lösemittelgemi- sehen sind solche bevorzugt, die als gewichtsmäßige Hauptkomponente Ethanol enthalten, insbesondere solche, die zu mehr als etwa 70 Vol.-%, bevorzugt zu etwa 80 bis etwa 100 Vol.-% aus Ethanol bestehen. Ein im Rahmen der vorliegenden Erfindung

besonders bevorzugtes Lösungsmittel ist reines, d.h. mindestens etwa 95 Vol.-%iges Ethanol.

Daneben sind erfindungsgemäß bevorzugt insbesondere solche Lösungsmittelgemi- sehe, die Ethanol und/oder Aceton und Wasser enthalten.

In Abhängigkeit vom gewählten Lösungsmittel bzw. Lösungsmittelgemisch kann die Konzentration des eingesetzten Stoffgemisches im Lösungsmittel in breiten Grenzen variiert werden. Vorteilhaft setzt man zur Isolierung von Coenzym Q ₁₀ nach dem erfin- dungsgemäß bevorzugten Trennverfahren durch Kristallisation solche Lösungen ein, die, bezogen auf die gesamte Lösung, zu etwa 1 bis etwa 50 Gew.-%, bevorzugt von etwa 1 bis etwa 35 Gew.-%, insbesondere bevorzugt von etwa 1 bis etwa 10 Gew.-% aus den genannten, Coenzym Q ₁₀ und die Verbindung der Formel (II) enthaltenden Stoffgemischen bestehen.

Das erfindungsgemäß bevorzugte Trennverfahren durch Kristallisation kann bei Temperaturen im Bereich von etwa -2O ⁰ C bis etwa 8O ⁰ C bevorzugt bei etwa O ⁰ C bis etwa 60°C, insbesondere bei etwa 0 ⁰ C bis etwa 40°C durchgeführt werden.

Je nach Wahl der Kristallisationsbedingungen kann es vorteilhaft sein, die Kristallisationslösung mit einem geeigneten Kristallisationskeim, z.B. einem Kristall der bevorzugt zu kristallisierenden Verbindung anzuimpfen.

Vorteilhaft geht man zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens so vor, dass man eine Lösung des zur trennenden Stoffgemisches in dem gewählten Lösungsmittel bzw. Lösungsmittelgemisch gegebenenfalls unter Rühren erwärmt, beispielsweise, in Abhängigkeit vom gewählten Lösungsmittel- bzw. Lösungsmittelgemisch, auf Temperaturen von etwa 40 ⁰ C bis etwa 60 ⁰ C, und dann langsam, d.h. über einen Zeitraum von etwa 0,5 h bis etwa 20 h auf eine Temperatur abkühlt, bei der die selektive Kristallisation des Coenzyms Q ₁₀ einsetzt (etwa 0-20 ⁰ C). Gewünschtenfalls kann die Kristallisation durch weiteres Absenken der Temperatur vervollständigt werden.

Alternativ oder in Ergänzung dazu ist es auch möglich, eine wie vorstehend beschrie- bene Lösung des zur trennenden Stoffgemisches in einem geeigneten Lösungsmittel bzw. Lösungsmittelgemisch vorzulegen und die erfindungsgemäß bevorzugte selektive Kristallisation durch Zugabe eines weiteren Lösungsmittels bzw. Lösungsmittelgemisches auszulösen. Dabei können u.a. sowohl die Kristallisationstemperatur als auch die Zugabeweise variiert werden.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren gelingt es, Coenzym Qi ₀ in reiner bzw. angereicherter Form, d.h., in Abhängigkeit von der Reinheit bzw. dem Gehalt an Coenzym

Q ₁₀ des Ausgangsstoffgemisches, mit einem Gehalt von mindestens etwa 70 Gew.-%, bevorzugt von etwa 80 bis etwa 100 Gew.-%, insbesondere von etwa 90 bis etwa 99,5 Gew.-%, besonders bevorzugt von etwa 95 bis etwa 99,5 Gew.-% und am meisten bevorzugt von etwa 98 bis etwa 99,5 Gew.-% bereitzustellen.

Weiterhin lässt sich das erfindungsgemäße Trennverfahren auch durch Kristallisation aus einer Schmelze eines Stoffgemisches enthaltend Coenzym Q ₁₀ der Formel (I) und die Verbindung der Formel (II) durchführen. Derartige Schmelzkristallisationen unter zumindest weitgehender Abwesenheit von Lösungsmitteln sind dem Fachmann an sich bekannt und umfassend beispielsweise in G. F. Arkenbout, MeIt Crystallization Technology, Lancaster/PA, Technomic Publ. Co., 1995 beschrieben. Dabei können erfindungsgemäß sowohl statische als auch dynamische Verfahren der Suspensions- oder Schichtkristallisation durchgeführt werden.

Die Analyse der als Ausgangsstoffe bzw. als Produkte des erfindungsgemäßen Verfahrens genannten Gemische von Verbindungen der Formeln (I) und (II) ist aufgrund der großen chemischen und physikalischen Ähnlichkeit der Moleküle, die sich nur durch die Anordnung von wenigen der 50 Kohlenstoffatome der Seitenkette unterscheiden, nur mit großem apparativem Aufwand möglich. Geeignete Verfahren zur Analyse ähn- licher, Coenzym Q ₁₀ enthaltender Stoffgemische sind beschrieben in USP 27, Official Monographs, Seite 2039 sowie in European Pharmacopeia 5.0, Seite 2657.

Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens betrifft die Herstellung von reinem oder angereichertem Coenzym Q ₁₀ durch Trennung von Stoff- gemischen enthaltend Coenzym Q ₁₀ und die Verbindung der Formel (II) mittels chromatographischer Methoden, vorzugsweise in präparativem Maßstab, wobei insbesondere Verfahren der Normalphasen- sowie der Umkehrphasenchromatographie in Betracht kommen. Dabei sind die Verfahren zur Normalpasenchromatographie als erfindungsgemäß bevorzugt zu betrachten.

Unter einer Trennung im präparativem Maßstab ist dabei eine solche zu verstehen, bei der im Gegensatz zu analytischen Trennungen die erhaltenen Fraktionen in geeigneter Weise gesammelt und isoliert werden, so dass sie für weitere Umsetzungen oder zum Gebrauch zur Verfügung stehen. Dabei sind insbesondere Trennungen interessant, bei denen Substanzmengen im Bereich von oberhalb etwa 1g bis in den Produktionsmaßstab durchgeführt werden können. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von reinem oder angereichertem Coenzym Qi ₀ handelt es sich demzufolge generell sowie bezüglich der genannten Ausführungsformen um ein Verfahren zur Isolierung des genannten Stoffes in reiner oder angereicherter Form, vorzugsweise in präparati- vem bzw. technischen Maßstab und unterscheidet sich dadurch von analytischen Verfahren, bei denen kleinste Stoffmengen getrennt, jedoch nicht isoliert werden.

Verfahren zur chromatographischen Aufreinigung von Rohprodukten bzw. zur Trennung von Stoffgemischen sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise in Prepara- tive Chromatography of Fine Chemicals and Pharmaceutical Agents, edited by Henner Schmidt-Taub, Wiley-VCH, 2005, umfassend beschrieben.

Die erfindungsgemäßen chromatographischen Trennverfahren können bei Normaldruck oder unter erhöhtem Druck durchgeführt werden. Bevorzugt führt man die erfindungsgemäße Trennung bei einem Druck von 1 bar (absolut, d.h., ohne Überdruck) bis 100 bar (abs.), besonders bevorzugt von etwa 5 bar (abs.) bis etwa 80 bar (abs.) durch.

Die Chromatographie kann im Temperaturbereich von etwa 15 bis etwa 80°C durchgeführt werden, d.h. die Säulen und das Fließmittel werden vorteilhaft im Temperaturbereich von etwa 15 bis etwa 80 ⁰ C, bevorzugt bei etwa 20 bis etwa 40 ⁰ C gehalten, ganz besonders bevorzugt bei Raumtemperatur, d.h. bei etwa 20 bis etwa 25°C.

Zur Durchführung der erfindungsgemäßen Trennung durch Normalphasenchromatographie eignen sich übliche, zur Anwendung als stationäre Phasen geeignete Materialien wie beispielsweise Kieselgel (SiO ₂ ) oder Aluminiumoxid (AI ₂ O ₃ ), bevorzugt Kie- selgel. Dabei kann die Korngröße in Abhängigkeit von der gewählten mobilen Phase bzw. dem jeweiligen Trennproblem oder dem zu trennenden Probenvolumen in einem breiten Bereich gewählt werden, beträgt üblicherweise jedoch etwa 5 μm bis etwa 200 μm, bevorzugt etwa 15 bis etwa 100 μm.

Im Rahmen des erfindungsgemäßen Trennverfahren bevorzugte Trennmaterialien sind beispielsweise solche mit der Bezeichnung Kieselgel 60 oder Kieselgel 100 (Merck KgaA), LiChroprep® (Merck KGaA), beispielsweise LiChroprep® Si, LiChroprep® RP- 2, LiChroprep® RP-8, LiChroprep® RP-18, LiChroprep® CN, LiChroprep® Diol, LiChroprep® NH2 (jeweils Merck KGaA) oder LiChrospher® (Merck KGaA), beispielsweise LiChrosper® Si, LiChrosper® CN, LiChrosper® NH2, LiChrosper® Diol (Merck KGaA) und LiChrosper® RP, sowie weitere, dem Fachmann als vergleichbar bekannte Materialien. Besonders bevorzugt im Rahmen des erfindungsgemäßen Trennverfahrens sind LiChroprep Si 60 und Kieselgel 60.

Im Rahmen der erfindungsgemäß bevorzugten Trennung durch Normalphasenchromatographie eignen sich als mobile Phase organische Lösungsmittel oder Gemische von verschiedenen organischen Lösungsmitteln, in denen die zu trennenden Isomeren der Formeln (I) bzw. (II) oder die gegebenenfalls noch vorhandenen weiteren Komponenten oder Verunreinigungen ausreichend löslich sind. Beispielsweise seien als geeigne- te Lösungsmittel die vorstehend zur Durchführung der erfindungsgemäßen Kristallisation aufgeführten Lösungsmittel genannt. Bevorzugt sind darunter die Kohlenwasserstoffe wie beispielsweise Petrolether, Pentan, n-Hexan, n-Heptan, Cyclohexan, bevorzugt

n-Heptan, sowie Carbonylverbindungen, wie beispielsweise Aceton, Diethylketon, Me- thylethylketon, Essigsäureethylester oder Cyciohexanon, bevorzugt Essigsäureethyles- ter, sowie cyclische oder acyclische Ether wie beispielsweise Diethylether, Tetrahydro- furan, Dioxan oder Methyl-tert.-butylether

Die genannten Lösungsmittel können, falls in Form von Gemischen eingesetzt, in beliebigem Verhältnis miteinander gemischt werden. Dabei können die gewählten Mischungsverhältnisse im Verlauf der Trennung konstant gehalten (isokratische Fahrweise) oder kontinuierlich bzw. graduell verändert werden (Gradientenfahrweise). Erfin- dungsgemäß als mobile Phase bevorzugte Lösungsmittelgemische bestehen aus Essigsäureethylester und einem Kohlenwasserstoff, vorzugsweise n-Heptan oder n- Hexan. Bei isokratischer Fahrweise beträgt der Anteil von Essigsäureethylester in diesen Lösemittelgemischen bevorzugt bis zu etwa 10 Vol.-%, besonders bevorzugt bis zu etwa 5% und ganz besonders bevorzugt etwa 0.5 bis etwa 5 Vol.-%.

Zusätzlich kann der pH-Wert der mobilen Phase durch Zusatz von Säuren oder Basen variiert werden. Beispielsweise kann der pH-Wert der jeweils eingesetzten mobilen Phase durch Zusatz von Säuren, z.B. Trifluoressigsäure, auf einen pH-Wert von weniger als 7 eingestellt werden. Bei Einsatz der vorstehend genannten Lösungsmittelge- mische von Kohlenwasserstoffen, vorzugsweise n-Heptan oder n-Heptan und Essigsäureethylester setzt man beispielsweise vorteilhaft Trifluoressigsäure, üblicherweise in einer Menge von bis zu etwa 1 Vol.-%, bevorzugt etwa 0,05 bis etwa 1 VoI.-%, zu.

Die Chromatogaphie kann sowohl diskontinuierlich, d.h. als Batch-Chromatographie als auch kontinuierlich durchgeführt werden. Im Rahmen einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens lässt sich unter geeigneten Trennbedingungen auch eine besonders für Anwendungen im präparativen bzw. technischen Maßstab vorteilhafte kontinuierliche Trennung unter sogenannten simulated moving bed (SMB)- Bedingungen durchführen, wie sie beispielsweise in Preparative Chromatography of Fine Chemicals and Pharmaceutical Agents, edited by Henner Schmidt-Taub, Wiley- VCH, 2005 oder bei Strube et al., Org. Proc. Res. Dev. 2 (5), 305-319, 1998 beschrieben sind. Bei der SMB-Chromatographie werden mobile und stationäre Phase im simulierten Gegenstrom geführt. Vorteil ist der geringere Verbrauch an Lösungsmitteln und stationärer Phase und die hohe Reinheit des Produktes und Wiederfindungsrate. Im Fall der Trennung des Gemisches von Conezym Q ₁₀ und der isomeren Verbindung der Formel (II) durch SMB-Chromatographie ist es von Vorteil, vor der eigentlichen Chro- matograhpie polarere Komponenten durch eine Filtration über Kieselgel oder durch Extraktion aus dem Rohproduktgemisch zu entfernen.

Das erfindungsgemäß durch SMB-Chromatographie zu trennende Stoffgemisch wird üblicherweise in Form einer Lösung, vorteilhaft in dem als mobile Phase gewählten Lösungsmittel bzw. Lösungsmittelgemisch eingesetzt. Die Konzentration dieser Lösung

des zu trennenden Ausgangsstoffgemisches (Feed) für die SMB-Chromatographie kann von etwa 10 g/l bis zur Löslichkeitsgrenze des Eduktes im jeweiligen Lösungsmittel bzw. Lösungsmittelgemisch gewählt werden, bevorzugt beträgt sie etwa 100 bis etwa 120 g/l (bezogen auf das Stoffgemisch).

Die mobile Phase wird im Rahmen der erfindungsgemäßen SMB-Chromatographie üblicherweise mit einer Lehrrohrgeschwindigkeit von etwa 100 bis 2000 cm/h, bevorzugt von etwa 800 bis1200 cm/h durch die Säule gefahren. Der Druck kann etwa 1 bar, d.h. ohne Überdruck, bis etwa 100 bar, bevorzugt 35 bis 60 bar (abs.) betragen. Das Lösungsmittelgemisch ist bevorzugt eine Mischung aus Essigsäureethylester und n- Heptan oder n-Hexan mit einem Anteil von bis zu 5 Vol.-% Essigester. Ganz besonders bevorzugt beträgt das auf das Volumen bezogene Verhältnis von Essigsäureester zu n-Heptan oder n-Hexan 98 : 2.

Die vorstehend genannten Verfahren zur chromatographischen Trennung der isomeren Verbindungen (I) bzw. (II) lassen sich im Rahmen einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens auch mit den zuvor genannten Kristallisationsverfahren kombinieren. So kann es von Vorteil sein, beispielsweise im Anschluss an eine wie vorstehend beschriebene chromatographische Trennung bzw. Anreicherung des gewünschten Isomeren der Formel (I) das so erhaltene angereicherte Produkt einer Kristallisation oder einer Folge von wie vorstehend beschriebenen Kristallisationen zu unterwerfen.

Dabei lässt sich die vorgeschaltete chromatographische Trennung bzw. Anreicherung beispielsweise auch in Form einer sogenannten Flash-chromatographie oder Säulenfiltration durchführen, bei der das Isomerengemisch zunächst von weiteren, gegebenenfalls vorhandenen Verunreinigungen, Reagenzien oder Nebenprodukten teilweise oder ganz befreit werden kann und gegebenenfalls auch bereits eine Abreicherung des Isomeren der Formel Il stattfindet.

Beispielsweise kann in einer ersten chromatographischen, als Vorreinigung zu bezeichnenden Stufe ein Rohproduktgemisch der chemischen Synthese von Coenzym Q ₁₀ mit einem Gehalt an Coenzym Q ₁₀ der Formel (I) von typischerweise etwa 60 bis etwa 70 Gew.-% eingesetzt werden. Man erhält daraus in der Regel, beispielsweise durch Normalphasen-Flash-Chromatographie an Kieselgel mit Gemischen aus Essigester und einem Kohlenwasserstoff, ein Stoffgemisch mit einem Gehalt von etwa 80 bis etwa 95 Gew.-%, oft von etwa 85 bis etwa 95 Gew.-% Coenzym Qi ₀ der Formel (I). Dieses angereicherte Produktgemisch kann dann durch erfindungsgemäß durchzuführende Kristallisation bzw. eine Folge von Kristallisationen weiter aufgereinigt werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft demnach auch ein Verfahren zur Herstellung von reinem oder angereichertem Coenzym Q ₁₀ der Formel (I)

durch Trennung von Stoffgemischen enthaltend Coenzym Qi ₀ und die Verbindung der Formel (II)

wobei man zur Trennung mindestens eine Chromatographie und mindestens eine Kris- tallisation durchführt.

Erfindungsgemäß werden die genannten Trennverfahren dabei zweckmäßigerweise hintereinander durchgeführt, wobei das im ersten Trennschritt erhaltene angereicherte Produktgemisch dem zweiten Trennschritt zugeführt wird. Bevorzugt führt man zu- nächst eine Chromatographie als Vorreinigung durch und unterwirft im Anschluss daran das so erhaltene angereicherte bzw. vorgereinigte Produktgemisch einer wie vorstehend beschriebenen Kristallisation. Gewünschtenfalls können die genannten Trennschritte, falls durch einmalige Durchführung des jeweiligen Trennschritts keine zufriedenstellende Anreicherung erzielt wurde, auch mehrmals, bevorzugt 2 oder 3 mal hin- tereinander durchgeführt werden.

Bei wiederholter Durchführung einzelner Trennstufen, unabhängig davon ob diese in Form von Kombinationen verschiedener Trennverfahren oder als Wiederholung des selben Trennverfahrens vorgenommen werden, können die Trennbedingungen, bei- spielsweise die Wahl von Lösungsmitteln, stationären Trennphasen oder sonstigen

Parametern wie Druck oder Temperatur, unter denen die einzelnen Trennstufen durchgeführt werden, jeweils variiert oder konstant gehalten werden.

Darüber hinaus lassen sich die genannten Gemische auch in erfindungsgemäßer Wei- se dadurch trennen bzw. anreichern, dass man sie mit einem Medium in Kontakt bringt, das Gruppen, Strukturen bzw. Funktionalitäten aufweist, die in der Lage sind, eine selektive Wechselwirkung mit bevorzugt einem der beiden Verbindungen der Formeln (I) und (II) auszubilden, wie sie etwa in der Affinitätschromatographie eingesetzt werden.

Zur Erzielung des gewünschten Ergebnisses kann es vorteilhaft sein, die genannten bevorzugten Trennverfahren wiederholt hintereinander, in der Regel 2 bis etwa 5 mal, bevorzugt 2 bis 3 mal hintereinander durchzuführen.

Die Leistungsfähigkeit der erfindungsgemäßen Verfahren ist überraschend, da sich die beiden zu trennenden Konstitutionsisomeren Verbindungen der Formeln (I) und (II) nur in der Anordnung von zwei der insgesamt 50 Kohlenstoffatome umfassenden polyi- soprenoiden Seitenkette unterscheiden. Der Fachmann hätte daher die Möglichkeit der erfindungsgemäßen Trennung der genannten Verbindungen auf den vorstehend be- schriebenen Wegen nicht in Betracht gezogen.

Das erfindungsgemäße Verfahren eröffnet somit die Möglichkeit der Bereitstellung von isomerenreinem bzw. isomerenangereichertem Coenzym Q ₁₀ , das sich zur Anwendung bzw. Verabreichung an Mensch und Tier eignet. Derartiges Material wäre durch die einleitend dargestellten konvergenten Syntheseverfahren durch Übergangsmetall- katalysierte Kupplung zweier Synthesebausteine ansonsten nicht zugänglich gewesen.

Beispiele:

Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung, ohne sie in irgend einer Weise zu beschränken. Zur Analyse der genannten Stoffgemische wurden die vorstehend genannten Methoden gemäß USP 27 herangezogen:

Beispiel 1 :

2,43 g eines säulenchromatographisch gereinigten Gemisches, das zu 91,28 Gew-% aus Coenzym Q ₁₀ und dessen Isomeren der Formel (II) im relativen Verhältnis 91 ,3 zu 8,7 bestand, wurden in 50 ml Ethanol gelöst, die Lösung unter Rühren auf 50 ⁰ C erwärmt und anschließend innerhalb von 2 h auf Raumtemperatur abgekühlt. Anschlie- ßend wurde die Lösung auf 0 ⁰ C abgekühlt und die entstandenen Kristalle abfiltriert, mit gekühltem Ethanol nachgewaschen und im Vakuumtrockenschrank bei 40 ⁰ C getrocknet. Man erhielt 2,01 g eines gelben Feststoffes, der zu 98,86 Gew.-% aus Coenzym Q ₁₀ und dem Isomeren der Formel (II) im relativen Verhältnis von 96,7 zu 3,3 bestand.

Beispiel 2:

1 ,32 g des in Beispiel 1 erhaltenen Produktes wurden in 25 ml Ethanol gelöst, die Lösung unter Rühren auf 5O ⁰ C erwärmt und anschließend innerhalb von 2 h auf Raumtemperatur abgekühlt. Anschließend wurde die Lösung auf 0 ⁰ C abgekühlt und die ent- standenen Kristalle abfiltriert, mit gekühltem Ethanol nachgewaschen und im Vakuumtrockenschrank bei 40 ⁰ C getrocknet. Man erhielt 1 ,28 g eines gelben Feststoffes, der

zu 96,9 Gew.-% aus Coenzym Q ₁₀ und dem Isomeren der Formel (II) im relativen Verhältnis von 98,7 zu 1,2 bestand.

Beispiel 3:

45,6 g eines Stoffgemisches, welches zu 55,2 Gew.-% aus Coenzym Q ₁₀ und dessen Isomeren der Formel (II) bestand, wobei die zu trennenden Verbindungen der Formeln (I) und (II) in einem relativen Verhältnis von 98,8 zu 1 ,2 (HPLC-Flächen-%) vorlagen, wurden über eine Drucksäule (Durchmesser: 8 cm, Länge: 50 cm, gefüllt mit Kieselgel, 0,04 - 0,063 mm) chromatographiert. Als Lösungsmittel wurde ein Gemisch von Hexan und Essigsäureethylester verwendet, wobei der Anteil an Essigester während der Chromatographie von 2 auf 4 Vol.-% erhöht wurde. Nach Entfernen des Lösungsmittels erhielt man 23,9 g eines Gemisches, welches zu 94,8 Gew.-% aus Coenzym Qi ₀ und dessen Isomeren der Formel (II) bestand und deren relatives Verhältnis 99,1 : 0,9 be- trug (HPLC-Flächen%).

Das so erhaltene Gemisch wurde bei 60°C in 300 ml Ethanol gelöst. Anschließend wurde die Lösung mit einer Rate von 5K/h auf 10°C abgekühlt. Der dabei ausfallende orange Feststoff wurde abgesaugt, mit 40 ml Ethanol gewaschen und im Vakuumtro- ckenschrank bei Raumtemperatur getrocknet. Man erhielt 21 ,5 g eines Feststoffs, der zu 97,7 Gew% aus Coenzym Qi ₀ und dessen Isomeren der Formel (II) bestand und deren relatives Verhältnis 99,7 : 0,3 betrug (HPLC-Flächen%).

Beispiel 4:

15,6 g eines Stoffgemisches, welches zu 94,6 Gew% aus Coenzym Qi ₀ und dessen Isomeren der Formel (II) bestand, wobei die zu trennenden Verbindungen der Formeln (I) und (II) in einem relativen Verhältnis von 91 ,8 zu 8,2 (HPLC-Flächen%) vorlagen, wurden in 80 ml Ethanol suspendiert und auf 45°C erwärmt. Dann wurden weitere 300 ml Ethanol zugegeben und nach 30 min Rühren wurde mit einer Rate von 5 K/h auf 10 ⁰ C abgekühlt. Nach 2 h Rühren bei 10 ⁰ C wurde der Feststoff abfiltriert und mit 20 ml kaltem Ethanol gewaschen. Nach Trocknen erhielt man 12,7 g eines Gemisches, welches zu 100 Gew.-% aus Coenzym Q ₁₀ und dessen Isomeren der Formel (II) bestand und deren relatives Verhältnis 97,6 : 2,4 betrug (HPLC-Flächen%).

Der so erhaltene Feststoff wurde in 190 ml Ethanol aufgenommen und bei 55°C gelöst. Anschließend wurde 2 h bei 45°C gerührt und dann mit einer Rate von 5K/h auf 1O ⁰ C abgekühlt. Nach Rühren über Nacht bei 10 ⁰ C wurde der Feststoff abfiltriert, mit 20 ml kaltem Ethanol gewaschen und getrocknet. Man erhielt 11 ,9 g eines Gemisches, wel- ches zu 100 Gew.-% aus Coenzym Q ₁₀ und dessen Isomeren der Formel (II) bestand und deren relatives Verhältnis 99,1 : 0,9 betrug (HPLC-Flächen%).

Der so erhaltene Feststoff wurde erneut in 200 ml Ethanol aufgenommen und wie zuvor kristallisiert. Man erhielt 11 ,2 g eines Gemisches, welches zu 100 Gew.-% aus Coenzym Q ₁₀ und dessen Isomeren der Formel (II) bestand und deren relatives Verhältnis 99,6 : 0,4 betrug (HPLC-Flächen%).

Beispiel 5:

23,8 g eines Rohgemisches enthaltend 51 ,7 Gew.-% eines Gemisches aus Coenzym Q ₁₀ der Formel (I) und der Verbindung der Formel (II) im relativen Verhältnis 97,9 : 2,1 (HPLC-Flächen%) wurden über eine mit 250 g Kieselgel befüllte Nutsche filtriert (4,5 cm Höhe). Zu Beginn wurde mit n-Hexan eluiert und im Verlauf der Filtration langsam bis zu 10 Vol.-% Diethylether zugesetzt. Man erhielt 12,3 g eines Gemisches, welches zu 87,7 Gew.-% aus Coenzym Qi ₀ und dessen Isomeren der Formel (II) bestand und deren relatives Verhältnis 98,5 zu 1 ,5 betrug (HPLC-Flächen%).

8,8 g des so erhaltenen Feststoffes wurden in 200 ml Ethanol auf 55°C erwärmt und mit weiteren 100 ml Ethanol versetzt. Die Lösung wurde mit einer Rate von 5K/h auf 1O ⁰ C abgekühlt, wobei bei 45°C mit 2 mg reinem Coenzym Q ₁₀ angeimpft wurde. Der Feststoff wurde abgesaugt und mit 20 ml Ethanol gewaschen. Man erhielt 7,4 g Fest- stoff, bestehend aus 95,6 Gew.-% Coenzym Qi ₀ und dessen Isomeren der Formel (II), deren relatives Verhältnis 99,2 : 0,8 betrug (HPLC-Flächen%).

Beispiel 6:

103,4 g eines Stoffgemisches, enthaltend 60,9 Gew.-% Coenzym Q ₁₀ und dessen Isomeren der Formel (II) im relativen Verhältnis von 99,1 : 0,9, wurden mittels MPLC (Medium pressure liquid chromatography) bei einem Druck von 8-10 bar mit einem Lösungsmittelstrom von 100 bis120 ml/min chromatographiert (Säule: Durchmesser: 10 cm, h = 45 cm, gefüllt mit Kieselgel (Lichroprep® Si 60 15-25 μm, Merck). Die Chroma- tographie wurde mit reinem Hexan begonnen. Während der Chromatographie wurde Essigsäureethylester bis zu einem Anteil von 6 VoI.-% zugesetzt (Gradientenfahrwei- se). Man erhielt 59,7 g eines Produktes, welches zu 97,5 Gew.-% aus Coenzym Qi ₀ und dessen Isomeren der Formel (II) bestand und deren relatives Verhältnis 99,3 : 0,7 betrug (HPLC-Flächen%).

44 g des so erhaltenen Feststoffes wurden bei 60 ⁰ C in 500 ml Ethanol gelöst. Anschließend wurde mit einer Rate von 10 K/h auf 1O ⁰ C abgekühlt. Bei 40 ⁰ C wurde die trübe Lösung mit einer Spatelspitze Coenzym Q ₁₀ angeimpft, woraufhin die Feststoffbildung einsetzte. Bei 10 ⁰ C wurde der Feststoff abfiltriert, mit 95 ml Ethanol gewaschen und bei 20 mbar bei RT getrocknet. Man erhielt 39,7 g eines Feststoffes, der zu 95,7 Gew.-% aus Coenzym Q ₁₀ und dessen Isomeren der Formel (II) bestand und deren relatives Verhältnis 99,6 : 0,4 betrug (HPLC-Flächen%).

Beispiel 7

60,3 g eines Stoffgemisches, welches zu 77,6 Gew.-% aus Coenzym Q ₁₀ und dessen Isomeren der Formel (II) bestand und deren relatives Verhältnis 98 : 2 (HPLC-

Flächen%) betrug, wurden bei 50°C in 180 ml eines Lösungsmittelgemisches aus E- thanol und Toluol im Volumenverhältnis von 9 zu 1 gelöst. Anschließend wurde die Mischung mit einer Rate von 5K/h auf 10 ⁰ C abgekühlt. Der entstandene Feststoff wurde bei 10°C abgesaugt und mit 30 ml kaltem Ethanol/Toluol nachgewaschen. Nach Trocknen erhielt man 9,5 g eines Gemisches, welches zu 84,9 Gew.-% aus Coenzym Q ₁₀ und dessen Isomeren der Formel (II) bestand und deren relatives Verhältnis 97,9 : 2,1 betrug (HPLC-Flächen%).

Beispiel 8

30 g eine Stoffgemisches, welches zu 71 ,7 Gew.-% aus Coenzym Q ₁₀ und dessen I- someren der Formel (II) bestand und deren relatives Verhältnis 92,1 : 7,9 (HPLC- Flächen%) betrug, wurden bei 50 ⁰ C in 180 ml eines Lösungsmittelgemisches aus E- thanol und Aceton im Volumenverhältnis von 7 zu 3 gelöst. Anschließend wurde die Lösung auf 30 ⁰ C abgekühlt und nach Animpfen weiter mit 5K/h auf 10°C abgekühlt. Der entstandene Feststoff wurde abgesaugt und mit 30 ml der Ethanol/Aceton- Mischung nachgewaschen. Nach Trocknen erhielt man 22,8 g eines Gemisches, welches zu 80,3 Gew.-% aus Coenzym Qi ₀ und dessen Isomeren der Formel (II) bestand und deren relatives Verhältnis 96,5 : 3,5 betrug (HPLC-Flächen%).

Beispiel 9:

Zur Trennung eines Gemische von Coenzym Q10 und dem Isomeren der Formel (II) im Verhältnis von 94 zu 6 wurde unter Verwendung von n-Heptan als Hauptkomponente des Laufmittels sowie unter Verwendung der folgenden stationären Phasen untersucht: LiChroprep® RP-2, 25-40 μm; LiChroprep® Si 60, 5-20 μm; LiChroprep® Si 60, 12 μm; LiChroprep® CN, 25 - 40 μm; LiChrospher® 100 CN, 10 μm; LiChrospher® 100 NH2, 15 μm; LiChrospher® 100 Diol, 10 μm.

Die beste Trennleistung wurde mit der LiChroprep® Si 60-Säule als stationäre Phase erzielt. Tabelle 1 fasst die in diesem System eingesetzten Laufmittelzusammensetzungen und erzielten Trennergebnisse zusammen:

Tabelle 1 :

Zugabe von 0,1 Vol.-% Trietyhlamin Zugabe von 0,1 % Trifluressigsäure

Abkürzungen:

RT: Raumtemperatur; MtBE: Methyl-tert.butylether; EtOAc: Essigsäureethylester k'-Wert: Retentionsfaktor alpha: Selektivität (k'-Wert Coenzym Q ₁₀ / k'-Wert (Isomer)

Die besten Ergebnisse wurden im Laufmittel Heptan/Essigester 98/2 unter Zusatz von 0,1 % Trifluoressigsäure erzielt. Die genauen Trennbedingungen sind in Tabelle 2 angegeben; die Eluenten A und B wurden nach dem in Tabelle 3 angegebenen Gradienten gemischt:

Tabelle 2:

Tabelle 3:

Abbildung 1 zeigt ein für eine diskontinuierliche Trennung gemäß Beispiel 9 typisches Chromatogramm.