【발명의 명칭】

₇ -아미노세팔로스포란산의 고농도 생산 재조합 아크레모니움 크리소제눔 균 주의 제조방법 및 이 방법으로 제조된 균주

【기술분야】

본 출원은 2016년 8월 26일에 출원된 대한민국 특허출원 계 10-2016_0109365 호를우선권으로 주장하고， 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다. 본 발명은 7-아미노세팔로스포란산의 고농도 생산 재조합 아크레모니움 크리 소제눔 균주의 제조방법 및 이 방법으로 제조된 균주에 관한 것이며， 보다 상세하 게는 7-ACA 고생산성 아크레모니움 크리소제눔 균주의 제조 방법， 이 방법으로 제 조된 재조합 아크레모니움 크리소제눔 균주， 상기 균주를 7-ACA를 생산할 수 있는 조건에서 배양하고, 이를 회수하는 7-ACA의 생산방법， 상기 제조방법에 이용된 아 크레모니움 크리소제눔 균주에서의 단백질 고발현용 프로모터， 아크레모니움 크리 소제눔 균주에서의 CPC 아실라제 고발현용 발현 백터， 상기 균주를 7-ACA 생산에 사용하는 용도， 상기 생산된 7-ACA를 항생제 제조에 사용하는 용도 및 상기 7-ACA 를 투여하는 것을 포함하는 세균 감염성 질환의 치료방법에 관한 것이다.

【배경기술】

세팔로스포린 C Cephalosporin C, 이하 "CPC"라고 약칭함)는 베타 -락탐 (beta-lactara)계 항생물질로서 사상균 곰광이인 아크레모니움 크리소제눔 (Acremonium chrysogenum)과 같은 일부 미생물에 의해서 생산된다. CPC는 그람음성 세균에 대해 세포벽 합성저해를 통해 항생활성을 나타내지만， 그 정도가 매우 미약 하기 때문에 주로 반합성 세팔로스포린계 항생제 (semi-synthetic cephalospori antibiotics, 이하 "세파계 항생제 "라고 약칭함)의 원료물질을 제조하는데 이용되 고 있다. 특히， CPC로부터 아미노아디포일 결가지 (D-aminoadipoyl side chain)가 제거된 7-아미노세팔로스포란산(7- ^0061)13105130 0 acid, "7-ACA"이하 라고 약칭함)이 전세계 항생제 시장의 40% 이상을 점유하는 대부분의 세파계 항생제의 원료물질로사용되고 있다.

CPC로부터 7-ACA를 제조하기 위한 종래의 공법으로서는 화학공법과 효소공법 이 있다. 화학공법은 반응조건이 복잡하고， 환경 처리 비용이 많이 들기 때문에 현 재 대부분의 기업은 환경 친화적인 효소공법으로 7-ACA를 생산하고 있다. 기존 기업들이 상업적으로 사용하였던 효소공법은 2단계로 구성되어 있었으 나， 첫 번째 단계 반응 부산물의 피드-백 저해로 인한 낮은 수율로 경제성이 낮았 다. 그러나， 최근에 고활성을 갖도록 개량된 CPC 아실라제를 이용한 1단계 효소법 이 개발되어 현재 많은 기업이 상업용으로 1단계 효소를 사용하고 있다. (대한민국 특허 출원번호 계 10-2003-0055259호 및 대한민국특허 출원번호 제 10-2013-0006483 호) 아크레모니움 크리소제눔이 갖는 CPC 생합성 경로는 오래전부터 다양한 연구 를 통해 그 전체 합성경로와 _C0 f actor 및 일부의 2차 대사조절 메커니즘이 밝혀져 있다. CPC의 최초 전구체는 L- lysine으로부터 유도된 L-2-aminoadipate와 L— cysteine 및 L-val ine의 3가지 물질이며， 이들 세 물질이 Del ta-(L-alpha- aminoadipyl )-L-cysteinyl-D-Val ine synthetase를 코딩하는 PcbAB에 의해 N-[ (5S)- 5-am i ηο-5-car boxy 1 pent anoy 1 ] -L ^~ cys t e i ny 1 -D-va 1 i ne (이하 ACV로 약칭)로 전환되 고， i sopenici l l in N synthase를 코딩하는 PcbC에 의해 이소페니실린 NC i sopeni ci l l in N, 이하 IPN으로 약칭)으로 전환된다. IPN은 i sopeni ci l l in N epimerase를 코딩하는 CefDl과 CefD2에 의해 페니실린 N(penici l l in N, 이하 PN)으 로 전환된 후 deace t oxycepha 1 ospor i n C synthase를 코딩하는 CefEF 및 deacetyl cephalospor in C를 코딩하는 CefG에 의해 디아세트옥시세팔로스포린 C (deaceoxyl cephalospor in C, 이하 D0-CPC로 약칭) 및 디아세틸세팔로스포린 C (deacetyl cephalospor in C, 이하 D-CPC로 약칭)를 거쳐 CPC로 전환된다. 현재 7-ACA와 생산은 아크레모니움 크리소제눔의 발효를 통해 생산된 CPC를 정제한 후 이를 1단계 효소법에 적용하여 이루어진다. 하지만， 발효를 통해 CPC를 생산 및 정제하여야 할 뿐 아니라， 대장균 등의 세균을 발효하여 효소를 생산 및 정제하고 이를 담체에 고정화한 후 1단계 효소법을 진행해야 하는 번거로움이 있었 다. 이러한 다수의 단계를 통해야 하는 7-ACA 생산방법을 간소화하기 위하여 CPC 로부터 7-ACA를 생산할 수 있는 효소를 CPC 생산균주인 아크레모니움 크리소제눔에 직접 도입하려는 시도가 다양한 연구 그룹에서 있어왔다.

하지만， 낮은 CPC 생산성 또는 7-ACA로의 낮은 전환율 때문에 사업화수준의 생산성에 미치지 못하고 있는 실정이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시 되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조 로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하 게 설명된다.

【발명의 상세한설명】

【기술적 과제】

이에 본 발명자들은 7-ACA의 효율적인 생산방법을 위해 지속적으로 연구하 던 중 CPC의 생산성이 증대된 아크레모니움 크리소제눔 균주를 발현능이 향상된 프 로모터가 포함된 CPC 아실라제의 발현백터로 반복적으로 형질전환하는 경우， 높은 수준의 7-ACA 생산성을 가진 재조합 아크레모니움 크리소제눔 균주를 제조할 수 있 음을 확인하여 발명을 완성하였다. 따라서 본 발명의 목적은

7-ACA고생산성 아크레모니움 크리소제눔 균주의 제조 방법을 제공하는 것이 다. 또한본 발명의 목적은

본 발명의 상기 제조 방법에 의해서 제조된 아크레모니움 크리소제눔 균주를 제공하는 것이다. 또한본 발명의 목적은

본 발명의 상기 균주를 7-ACA를 생산할수 있는 조건에서 배양하는 단계 ; 및 배지에서 7-ACA를 회수하는 단계를 포함하는 7-ACA의 생산방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은

서열번호 10 내지 14로 이루어진 군에서 선택된 염기서열로 이루어진 아크레 모니움 크리소제눔 균주에서의 단백질 고발현용 프로모터를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은

서열번호 15 내지 17로 이루어진 군에서 선택된 염기서열로 이루어진 아크레 모니움 크리소제눔 균주에서의 CPC 아실라제 고발현용 발현 백터를 제공하는 것이 다. 또한본 발명의 목적은

본 발명의 상기 균주를 7—ACA 생산에 사용하는 용도를 제공하는 것이다. 또한본 발명의 목적은

본 발명의 상기 균주를 배양하여 생산한 7-ACA를 항생제 제조에 사용하는 용 도를 제공하는 것이다. 또한본 발명와 목적은

본 발명의 상기 균주를 배양하여 생산된 7-ACA의 유효량을 개체에 투여하는 것을포함하는 세균 감염성 질환의 치료방법을 제공하는 것이다.

【기술적 해결방법】

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은

(a) CPC (cephalospor in C) 고생산성 아크레모니움 크리소제눔 (Acremonium chrysogenum) 균주를 제조하는 단계 ;

(b) 계 1프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 CPC 아실라제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 겨 U발현백터로 상기 (a) 단계의 균주를 형질전환 시 키는 단계; 및

(c) 게 2프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 상기 폴리뉴클레오티드를 포 함하는 제 2발현백터로 상기 (b) 단계의 균주를 형질전환 시키는 단계를 포함하며， 상기 (c) 단계는 반복적으로 수행되는 것을 특징으로 하는 7-ACA 고생산성 아크레모니움 크리소제눔 균주의 제조 방법을 제공한다.

또한본 발명의 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은

본 발명은 본 발명의 방법에 의해서 제조된 아크레모니움 크리소제눔 균주를 제공한다. 또한본 발명의 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 본 발명의 상기 균주를 7-ACA를 생산할수 있는 조건에서 배양하는 단계 ; ¾ 배지에서 7-ACA를 회수하는 단계를 포함하는 7-ACA의 생산방법을 제공한다. 또한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

서열번호 10 내지 14로 이루어진 군에서 선택된 염기서열로 이루어진 아크레 모니움크리소제눔 균주에서의 단백질 고발현용 프로모터를 제공한다. 또한본 발명의 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은

서열번호 15 내지 17로 이루어진 군에서 선택된 염기서열로 이루어진 아크레 모니움크리소제눔 균주에서의 CPC 아실라제 고발현용 발현 백터를 제공한다. 또한본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

본 발명의 상기 균주를 7-ACA 생산에 사용하는 용도를 제공한다. 또한본 발명의 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은

본 발명의 상기 균주를 배양하여 생산한 7-ACA를 항생제 제조에 사용하는 용 도를 제공한다. 또한본 발명의 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은

본 발명의 상기 균주를 배양하여 생산된 7-ACA의 유효량을 개체에 투여하는 것을포함하는 세균 감멈성 질환의 치료방법을 제공한다. 이하 본 발명을상세히 설명한다. 본 발명은 7-ACA 고생산성 아크레모니움 크리소제눔 균주의 제조 방법을 제 공한다.

또한 본 발명은 상기 방법에 의해서 제조된 아크레모니움 크리소제눔 균주를 제공한다.

또한본 발명은 7-ACA의 생산방법을 제공한다. 또한 본 발명은 아크레모니움 크리소제눔 균주에서의 단백질 고발현용 프로 모터를 제공한다. 또한 본 발명은아크레모니움 크리소제눔 균주에서의 CPC 아실라제 고발현용 발현 백터를 제공한다. 본 발명의 7-ACA고생산성 아크레모니움 크리소제눔 균주의 제조 방법은

(a) CPC 고생산성 아크레모니움 크리소제눔 (Acremon ira chrysogenum) 균주 를 제조하는 단계 ;

(b) 제 1프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 CPC 아실라제晕 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제 1발현백터로 상기 (a) 단계의 균주를 형질전환 시 키는 단계; 및

(c) 계 2프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 상기 폴리뉴클레오티 ^를 포 함하는 제 2발현백터로 상기 (b) 단계의 균주를 형질전환 시키는 단계를 포함하며, 상기 (c) 단계는 반복적으로 수행되는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 제조방법에 의해 제조되는 균주는 CPC 고생산성의 특징과 더불어 7-ACA 고생산성의 특징을 가진다. 본 발명의 균주에 의해서 생산되는 CPC는 형질전 환된 CPC 아실라제에 의해서 7-ACA로 전환되며， 그 전환효율은 매우 높은 특징을 가진다. 본 발명의 제조방법에 의해서 제조되는 7-ACA 고생산성 아크레모니움 크리 소제눔 균주의 7-ACA 생산능은 15g/L이상， 16g/L이상， 17g/L이상,， 18g/L이상， 19g/L이상， 20g/L이상， 21g/L이상， 22g/L이상， 23g/L이상， 24g/L이상， 25g/L이상, 26g/L이상， 27g/L이상, 28g/L이상, 29g/L이상， 30g/L이상， 31g/L이상， 32g/L이상， 33g/L이상일 수 있으며， 바람직하게는 20g/L이상， 가장 바람직하게 30g/L이상일 수 있다. 생산능의 상한값은 아크레모니움 크리소제눔의 생육조건， 배지 내 원료물 질의 양 등에 의해서 조절될 수 있으며， 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지 식을 가진 자라면 용이하게 설정할수 있다. 이하에서 본 발명의 균주의 제조방법을 각 단계별로 보다상세히 설명한다.

(a) 단계는 CPC 고생산성 아크레모니움 크리소제눔 (Acremonium chrysogenum) 균주를 제조하는 단계이다.

본 발명에서 "CPC 고생산성" 이란 적절한 배양 조건에서 20 , 21 , 22， 23 , 24, 25, 26, 27, 28 , 29, 30 , 31 , 32， 33 , 34 또는 35 g/L 이상， 바람직하게는 30， 31， 32， 33， 34 또는 35g/L 이상， 가장 바람직하게는 35g/L 이상의 CPC 생산능올 가지는 것을 나타낸다. 상기 "적절한 배양 조건" 이란 상기 CPC 생산능을 나타낼 수 있도록 CPC 고생산성 아크레모니움 크리소제눔 균주를 특정의 배지 조성， 배양 은도， 배양 시간， pH 환경 하에서 배양하는 것을 의미한다. "적절한 배양 조건" 은 다음의 기술에 따라서 당업자가 적절하게 설정할 수 있다.

형질전환된 숙주세포의 배양은 공지된 숙주세포 배양 방법 또는 이를 변형한 방법으로 행할 수 있다. 배양은 1 내지 5회의 종배양 및 본배양으로 나눌 수 있으 나 이에 국한되지는 않는다. 배지조성은 형질전환된 재조합 숙주세포가 효율적으로 이용할 수 있는 탄소원， 질소원， 무기염 둥을 포함하는 천연 배지 또는 합성 배지 를 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원은 글루코오스， 프럭토오스， 수크로오 스， 콩가루， 땅콩가루， 밀가루， 옥수수가루， 덱스트린， 콘밀， 과당 시럽과 같은 탄 수화물; 녹말, 녹말의 가수분해물; 아세트산 및 프로피온산과 같은 유기산; 에탄 올, 프로판올， 글리세를과 같은 알코을; 콩기름， 올리브기름， 카놀라유， 땅콩기름， 생선기름 등의 기름류 둥을 포함한다. 질소원은 암모니아; 염화암모늄， 암모늄설 페이트， 암모늄아세테이트 및 암모늄포스페이트와 같은 무기산 또는 유기산의 암모 늄염; 펩톤， 육추출물 (meat extract ) , 이스트추출물， 옥수수 침지액， 카제인 가수 분해물, 대두추출물, 대두가수분해물; 다양한 발효된 세포 및 이들의 분해물 등을 포함한다. 아미노산으로， 글루타민산나트륨， 메티오닌, 라이신， 루이신， 시스테 인， 발린 등을 포함한다. 무기염은 포타슴디하이드로젠 포스페이트, 다이포타 하 이드로젠 포스페이트， 마그네슴 포스페이트， 마그네슘 설페이트， 소디엄 클로라이 드， 망간 설페이트， 구리 설페이트， 칼슘 카보네이트 등을 포함한다.

배양은 통상적으로 진탕배양 또는 회전기에 의한 회전에 의한 것과 같은 호 기성 조건하에서 행한다. 배양 은도는 바람직하게는 5 내지 30 ^° C의 범위에서 행하 고， 배양시간은 일반적으로 1일 내지 20일， 바람직하게는 3일 내지 12일간 행한다. 배지의 pH는 배양 중에서 바람직하게는 3.0 내지 9.0의 범위를 유지한다. 배지의 pH는 무기 또는 유기산, 알칼리 용액， 우레아， 칼슘 카보네이트， 암모니아 등으로 조절할 수 있다. 배양 중에는 필요한 경우 형질전환체의 선별 및 오염의 방지를 위해 하이그로마이신 B, 제네티신， 플레오마이신， 베노밀， 암피실린, 스트렙토마이 신， 클로람페니콜, 카나마이신 및 테트라사이클린과 같은 항생제를 첨가할 수 있 다.

바람직하게는 본 발명의 CPC고생산성 아크레모니움 크리소쎄눔 균주는 변이 에 의해서 CPC고생산성을 가지는 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 NTG (N-methyl-N ' -ni tro-N-ni trosoguanidine) 처리에 의해서 아크레모니움 크리소제눔 균주의 돌연변이를 유도하고, 이들 중 CPC 생산성이 높아진 균체를 선별하여 기탁하였다. 최종 선별된 E1 균주의 CPC 생산성 은 약 35 g/L로 평가되었다.

따라서， 바람직하게는 본 발명의 CPC 고생산성 아크레모니움 크리소제눔 균 주는 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2016년 8월 18일자로 기탁된 아크레모니 움 크리소제눔 E1 (기탁번호 KCTC13079BP)일 수 있다.

(b) 단계는 제 1프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 CPC 아실라제를 암호 화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제 1발현백터로 상기 (a) 단계의 균주를 형질 전환시키는 단계이다.

본 명세서에서 '제 1발현백터'란 CPC 아실라제를 암호화하는 폴리뉴클레오타 이드가 클로닝된 플라스미드， 바이러스 또는 기타 매개체, 바람직하게는 플라스미 드 발현백터를 의미한다. 본 발명에 따라 클로닝된 상기 폴리뉴클레오타이드 서열 은 적절한 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며 , 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절서열은 선택 마커 및 복제 개시점 (repl icat ion origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 백터 내에 포함될 수 있다. '작동가능 하게 연결 (operably l inked) ' 된다는 것은 상기 폴리뉴클레오타이드 서열이 발현 조절 서열에 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 것을 의미한다. 상기 ' 발현 조절 서열 (expression control sequence) '이란 특정한 숙주세포에서 작동 가 능하게 연결된 폴리뉴크레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그 러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터， 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열， 적합한 _m RNA 리포좀 결합 부위를 코딩하는 서열， 및 전사 및 해 독의 종결을 조절하는 서열 둥으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.

바람직하게는 본 발명의 제 1발현백터는 CPC 아실라제에 대한 유전자를 클로 닝된 pB-HCX (서열번호 9， 도 1)일 수 있으며， 제 1발현백터에 의한 아크레모니움 크 리소제눔 균주의 형질전환에 의한 결과는 종래의 CPC 아실라제 도입에 따른 7-ACA 의 생산능에 비해서 큰 장점을 나타내지는 않으나， 이후 (c) 단계의 반복된 형질전 환에 따른 생산능 증가의 기본 베이스가 되며， 이러한 점은 본 발명자들에 의해서 개발된 것이다. 본 발명에서 '프로모터' 란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵 산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며， '프로모터에 작동 가능하게 연 결된다 (operably l inked)' 는 것은 프로모터의 기능에 의해서 이후의 핵산 단편의 발현카세트가 암호화하는 단백질의 발현이 영향을 받는 것을 말한다. 상기 프로모 터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터 (const i tut ive promoter ) 또는 특정한 위치， 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하 는 프로모터 ( inducible promoter )를 사용할 수 있다. 바람직하게는 제 1발현백터에 포함된 '제 1프로모터' 는 아스퍼질러스 니둘란스의 gpdA 프로모터 (GenBank Z32698 염기서열의 1—2129 bp의 서열 또는 서열번호 9의 11410-13532 bp의 서열) 일 수 있다. 곰광이 발현에 일반적으로 사용하는 프로모터로서 널리 알려진 pdc 프 로모터， trpC 프로모터일수 있다. '발현 조절 서열' 중 터미네이터 서열은 trpC 터미네이터일 수 있다.

상기 발현 백터의 모백터로 사용되는 백터는 특별한 제한이 없으며， 이 발명 이 속하는 기술분야에서 숙주세포로 사용되는 미생물에서의 발현을 위하여 통상적 으로 사용되는 모든 플라스미드， 바이러스 또는 기타 매개체 둥이 사용 가능하다. 예컨대, 상기 플라스미드에는 대장균 유래 플라스미드 (pBR322 , pBR325, pUC118 및 PUC119, pET-22b(+)) , 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드 (pUBllO 및 pTP5) 및 효모 유래 플라스미드 (ΥΕρ13 , ΥΕρ24 및 YCp50) , pBluescr ipt 계열의 백터 둥이 있 으며， 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 'CPC 아실라제' 는 야생형 또는 변이형 아실라제를 모두 포함 하나， 바람직하게는 아미노산 서열의 경우 서열번호 19로 표시되는 아미노산서열 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 경우 서열번호 18로 이루어진 폴리 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일실시예에서는 pBluescr ipt I I SK+ 클로닝 백터에 항생제인 하이 그로마이신 B (hygromycin B)， 제네티신 (genet icin) 또는 플레오마이신 (phleomycin) 저항성을 갖는 마커유전자 카세트 (cassette) 및 다중 도입을 목적으 로 마커를 제거하기 위한 Flp 카세트를 도입한 것을 기본 프레임으로하여 CPC 아실 라제에 대한 유전자를 클로닝하여 pB-HCX (서열번호 9， 도 1)를 제작하고 이를 E1균 주에 형질전환하고， 그 중 생산성이 높은 균락을 E2 균주로 명명하여 선별하였다. E2 균주에 대한 7-ACA발효생산성은 7일째 최대치로서 약 2 g/L로 평가되었다/

(c) 단계는 제 2프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 상기 폴리뉴클레오티 드를 포함하는 제 2발현백터로 상기 (b) 단계의 균주를 형질전환 시키는 단계이며, (c) 단계는 반복적으로 수행되는 것을 특징으로 한다. (c) 단계에서의 발현백터, 즉 제 2발현백터는 7-ACA의 생산능을 높이기 위하 여 개량된 프로모터를 포함하며， 서열번호 15， 서열번호 16 또는 서열번호 17일 수 있다. 아울러， (c) 단계의 프로모터， 즉 제 2프로모터는 서열번호 10， 서열번호 11， 서열번호 12， 서열번호 13 또는 서열번호 14의 프로모터 서열일 수 있다. 바람직하 게는 제 2프로모터는 서열번호 12의 프로모터 서열일 수 있다. 본 발명에서 '형질전환' 은 본 발명의 제 1발현백터 또는 제 2발현백터를 숙 주 세포로 도입하는 것이며， 이를 위하여 통상적으로 사^되는 모든 수단에 의하여 수행될 수 있다. 예컨대， 상기 발현백터는 이에 제한되지는 않지만, 염화칼슘 (CaC12) 및 열쇼크 (heat shock) 방법， 입자 총 충격법 (part icle gun bombardment ) , 실리콘 ¾화물 위스커 (Si l icon carbide whi skers) , 초음파 처리 ( son i cat ion) , 전기천공법 (electroporat ion) , PEG (polyethylenglycol )에 의한 침 전법 등의 방법으로 숙주세포에 도입될 수 있다.

발명의 형질전환의 대상이 되는 숙주세포는 아크레모니움 크리소제눔이 며， 상기 (b) 단계에서의 숙주세포는 (a) 단계의 아크레모니움 크리소제눔일 수 있 으며， (c) 단계에서의 숙주세포는 (b) 단계의 아크레모니움 크리소제눔 또는 n회차 의 형질전환인 경우 n-1회의 형질전환이 이루어진 아크레모니움 크리소제눔일 수 있다.

(c) 단계의 숙주세포로의 형질전환은 반복적으로 수행되는 것이 특징이다 _: 형질전환 횟수는 2회 내지 8회가 바람직하며， 더 바람직하게는 4회 내지 7회， 한층 더 바람직하게는 5회 내지 6회， 가장 바람직하게는 5회 반복적으로 수행될 수 있 다. 상기 형질전환 횟수가 2회 미만인 경우 충분한 수준의 7-ACA의 생산능을 가지 는 균주를 제조할 수 없으며, 8회 초과인 경우 더 이상 7-ACA의 생산능의 증가가 이루어지지 않기 때문에 비경제적이다.

바람직하게는 (c) 단계의 반복적인 형질전환은 서열번호 15로 이루어진 발현 백터， 서열번호 16으로 이루어진 발현백터， 서열번호 17로 이루어진 발현백터, 서 열번호 15로 이루어진 발현백터， 서열번호 16으로 이루어진 발현백터의 순으로 순 차적으로 이루어질 수 있으며, 이와 같은 순차적 /반복적 형질전환에 의해서 7-ACA 의 생산능을 충분히 포화 (saturat ion) 시킬 수 있다.

상기와 같은 5회의 형질전환에 추가적으로 1회 내지 3회의 형질전환을 더 수 행할 수도 있으며， 이 경우 서열번호 15로 이루어진 발현백터， 서열번호 16으로 이 루어진 발현백터 및 서열번호 17로 이루어진 발현백터로 이루어진 군에서 임의로 선택하여 추가로 형질전환할수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 (b) 단계의 형질전환을 거친 균주에서 발현하는 CPC 아실라제는 발현량이 높지 않아 프로모터 튜닝 (promoter tuning)을 실시하여 개량하고， 이 돌연변이 프로모터의 서열을 각각 서열번호 10 내지 14로 나타내었 다. 아울러， 이 돌연변이 프로모터를 가지며， CPC 아실라제를 발현하는 재조합 풀 라스미드 백터를 각각 제조하여 이를 서열번호 15 내지 17로 나타내었다. 본 발명 자들은 7-ACA의 생산성의 향상을 위해서 연구하던 중 반복형질전환이 7-ACA의 생산 성을 향상시킨다는 점을 알아내었고， 이에 CX 유전자의 발현을 증대시키기 위해서 균주에 반복적으로 형질전환을 하였고， 7-ACA 생산성이 향상된 균주를 제조하였다. 한편， 본 발명은 본 발명의 제조 방법에 의해서 제조된 아크레모니움 크리소 제눔 균주를 제공한다. 상기 균주는 발현능이 개선된 프로모터를 포함하는 발현 백 터로 5희 이상 반복적으로 형질전환된 균주인 특징이 있으며， 각 형질전환에 의해 서 7-ACA 생산능이 증가되어 최종적으로 25g/L이상의 7-ACA 생산능을 가지는 특징 이 있다. 바람직하게는 본 발명의 상기 균주의 7-ACA 생산능은 30g/L이상일 수 있 다. 한편， 본 발명은

(a) 본 발명의 방법에 의해서 제조된 균주를 그 ACA를 생산할 수 있는 조건에 서 배양하는 단계 ; 및

(b) 배지에서 7-ACA를 회수하는 단계를 포함하는 7-ACA의 생산방법을 제공한 다.

7-ACA 생산방법의 (a) 단계는 본 발명의 방법에 의해서 제조된 균주를 7-ACA 를 생산할 수 있는 조건에서 배양하는 단계이며， 7-ACA를 생산할 수 있는 조건은 CPC 생산에 있어서의 "적절한 배양 조건" 과 동일.또는 유사하게 할 수 있다. 이 때 그 ACA 생산방법에의 "적절한 배양 조건" 은 7-ACA의 생산능을 나타낼 수 있도 록 본 발명의 방법에 의해서 제조된 아크레모니움 크리소제눔 균주를 특정의 배지 조성， 배양 온도， 배양 시간， pH환경 하에서 배양하는 것을 의미한 .

7-ACA 생산방법의 (b) 단계는 배지에서 7-ACA를 회수하는 단계이며， 본 발명 의 균주에 의해서 생산된 7-ACA를 균주 또는 이의 배양 배지로부터 분리， 수확， 정 제 또는 수집시키는 것을 의미한다. 구체적으로， 7-ACA의 회수 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나， 원심분리, 여과, 추출， 분무， 건조， 증방， 침전， 결정화， 전기영 동， 분별용해 (예를 들면 암모늄 설페이트 침전) , 크로마토그래피 (예를 들면 이은 교환, 친화성， 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있으며 , 이는 당업자가 용이하게 구성할 수 있다. 한편， 본 발명은 아크레모니움 크리소제눔 균주에서의 단백질 고발현용 프로 모터를 제공하며， 상기 프로모터는 서열번호 10， 서열번호 11 , 서열번호 12， 서열 번호 13 또는 서열번호 14의 염기서열로 이루어질 수 있다. 한편， 본 발명은 아크레모니움 크리소제눔 균주에서의 CPC 아실라제 고발현 용 발현 백터를 제공하며， 상기 발현 백터는 서열번호 15， 서열번호 16 또는 서열 번호 17의 염기서열로 이루어질 수 있다. 한편, 본 발명은 본 발명의 아크레모니움 크리소제눔 균주를 7-ACA 생산에 사용하는용도를 제공한다. 또한， 본 발명은 본 발명의 상기 균주를 배양하여 생산한 7-ACA를 항생제 제 조에 사용하는용도를 제공한다. 또한， 본 발명은 상기 균주를 배양하여 생산된 7-ACA의 유효량을 개체에 투 여하는 것을포함하는 세균 감염성 질환의 치료방법을 제공한다. 본 발명의 상기 '유효량' 이란 개체에게 투여하였을 때, 감염성 ^' 질환， 특히 세균 감염성 질환 및 이로 인한 증상 또는 증후의 개선， 차료 또는 예방 효과를 나 타내는 양을 말하며, 상기 '개체' 란 동물, 바람직하게는 포유동물， 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으몌 동물에서 유래한 세포 조직， 기관 둥일 수도 있다. 상기 개체는 상기 효과가 필요한 환자 (pat ient ) 일 수 있다. 본 발명의 상기 '제제 ' 는 '약학적 조성물' 의 형태알수 있으며， 상기 ' 약학적 조성물' 은 제제시에 통상적으로 이용되는 약제학적으로 허용되는 담체로 서， 탄수화물류 화합물 (예: 락토스， 아밀로스, 텍스트로스， 수크로스， 솔비를, 만 니를, 전분， 샐를로스， 등)， 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트， ¾라틴, 규산 칼슴, 미세결정성 셀를로스， 폴리비닐피를리돈, 셀를로스, 물, 시럽， 염 용액， 알 코올， 아라비아 고무， 식물성 기름 (예: 옥수수 기름， 목화 종자유， 두유， 올리브 유， 코코넛유)， 폴리에틸렌 글리콜， 메틸 셀를로스, 메틸히드록시 벤조에이트， 프 로필히드록시 벤조에이트, 활석， 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 둥을 포함할 수 있고， 윤활제， 습윤제， 감미제， 향미제， 유화제, 현탁제， 보존제 등을 추가로 포함할 수 있으나， 이에 한정되는 것은 아니다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담 체 및 제제는 Remington ' s Pharmaceut ical Sciences (19th ed. , 1995)에 상세히 기 재되어 있다.

또한 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고， 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입， 피하주입 근육 주입， 피부 도포 등으로 투여할 수 있으며， 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있 는 방법에 따라， 약제학적으로 허용되는 담체 및 /또는 부형제를 이용하여 제제화함 으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있 다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액， 현탁액 또는 유화액 형태이거나 액스제, 분말제， 과립제， 정제 또는 캅샐제 형태일 수도 있으며， 분산제 또는 안정 화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 '감염성 질환' 은 특히 '세균 감염성 질환' 을 지칭하며， 세팔로스포린계 항생물질 또는 7-ACA가 개선， 예방 또는 치료효과를 보이는 세균 감염성 질환을 포함한다. 예를 들에 살모넬라증 (salmonel losi s) , 식중독， 장티푸 스， 파라티푸스， 패혈증 ( _se p _S i _s ) , 패혈성 쇼크 (sept ic shock) , 전신성 염증반웅 증 후군 (systemic inf lammatory response syndrome, SIRS) , 다장기 기능장애 증후군 (mult iple organ dysfunct ion syndrome, MODS) , 폐렴， 폐결핵， 결핵 , 감기， 인플루 엔자, 기도 감염， 비염， 비인두염， 중이염， 기관지염, 임파선염， 이하선염， 림프절 ^' 염, 구순염, 구내염， 관절염， 근육염， 피부염， 혈관염， 치은염, 치근막염， 각막염， 결막염， 창상 감염， 복막염， 간염， 골수염, 봉소염, 수막염， 뇌염， 뇌농양， 뇌척수 염， 뇌막염， 골수염， 신장염， 심장염， 심내막염， 장염， 위염ᅳ， 식도염， 십이지장염， 대장염， 요로염， 방광염， 질염， 자궁경부염, 난관염， 감염성 홍반， 세균성 이질， 농양 및 궤양， 균혈증, 설 이질， 위장염， 위장관염， 비뇨생식기 농양, 개방성 창상 또는 상처의 감염， 화농성 염증， 농양， 종기， 농피증 농가진， 모낭염， 봉소 염, 수술 후 상처 감염， 피부열상증후군， 피부화상증후군， 혈전성 혈소판 감소증， 용혈성 요독 증후군， 신부전증, 신우신염， 사구체신염, 신경계 농양, 중이염， 부비 동염， 인두염， 편도선염, 유양돌기염， 연조직염， 치성 감염， 누낭염， 늑막염, 복부 농양, 간농양， 담낭염， 비장 농양， 심낭염, 심근염， 태반염ᅳ 양수염， 유방염， 유선 염， 산욕열， 독소성 쇼크증후군 (toxic shock syndrome) , 라임 ( lyme)병， 가스 회저, 아테롬성 동맥경화증， 마이코박테리움 아비움 증후군 (MAC) , 장출혈성 대장균 (EHEC) 감염증， 장병원성 대장균 (EPEC) 감염증， 장침습성 대장균 감염증 (EIEC) , 메치실린 내성 황색포도상구균 (MRSA) 감염증， 반코마이신 내성 황색포도상구균 (VRSA) 감염증 및 리즈테리아증 ( l isterosis)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 질환일 수 있 으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 용어 '〜을 포함하는 (compr ising)' 이란 '함유하는' 또는 '특장 으로 하는' 과 동일하게 사용되며， 조성물 또는 방법에 있어서， 언급되지 않은 추 가적인 성분 요소 또는 방법 단계 등을 배제하지 않는다. 용어 '〜로 구성되는 (consi st ing of ) ' 이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소, 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 '필수적으로 구성되는 (essent ial ly consi st ing of ) ' 이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서， 기재된 성분 요소 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 성분 요소 또는 단계 둥을 포함하는 것을 의미한다.

[유리한 효과】

본 발명은 CPC 생산성이 높아지도록 돌연변이를 유발한 아크레모니움 크리소 제눔을 제조하고， 강하게 발현하도록 조절한 프로모터와 CPC 아실라제를 포함하는 발현 백터를 반복적으로 형질전환하여 7-ACA를 고농도로 생산할 수 있는 균주를 제 조하는 방법 등을 제공한다. 본 뇰명의 방법에 의하면 재조합 아크레모니움 크리소 제눔 균주를 제조하여 이의 발효를 통하여 7-ACA를 고농도로 제조할수 있다.

【도면의 간단한 설명】

도 1은 항생제 카세트， Flp 카세트 및 CX 카세트를 가진 재조합 플라스미드 백터 pB-HCX의 구조이다.

도 2는 변이된 프로모터를 도입한 재조합 균주의 발효에 의한 7-ACA 생산성 으로 발효 7일째의 결과를 나타낸다.

도 3은 야생형 gpdA 프로모터 (A) 및 error prone PCR에 의해 변이된 프로모 터의 1 ~ -283 부위에 대한 염기서열 분석 결과이다. (B) EP1 해당부위 (서열번호 10) , (C) EP2 부위 (서열번호 11)， (D) EP3 부위 (서열번호 12)， (E) EP4 부위 (서열 번호 13)， (F) EP5 부위 (서열번호 14) . TSP는 전사 시작부위 (transcript ion start point)를 나타낸다. 一.

도 4는 반복적인 형질전환으로 7-ACA 생산성이 향상된 균주의 발효결과이다. E4: 2회 형질전환， E5: 3회 형질전환, E6: 4희 형질전환， E7: 5회 형질전환.

【발명의 실시를 위한 형태】

이하본 발명을 상세히 설명한다.

단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.

<실험방법>

효^ 및 키^

클로닝방법으로서， PCR법에 의한 유전자의 증폭은 특별한 경우가 아닌 이상 DNA 폴리머라제 구입 시에 동봉된 메뉴얼에 따랐다. 일반적인 PCR일 경우 DNA 폴리 머라제는 Pfu-X 폴리머라제 (Solgent , Korea) , error prone PCR일 경우 Taq 폴리머 라제 (Solgent , Korea)를 사용하였다. 제한효소， T4 DNA 리가제， Klenow fragment 는 NEB (USA)로부터 구입하여 해당 효소의 메뉴얼에 따라 사용하였다. PCR 및 플라 스미드 DNA의 정제， 아가로스 젤로부터의 추출 등 일련의 클로닝방법을 위해 QIAprep Spin Miniprep Kit , QIAquick PCR Pur if icat ion Kit , QIAquick Gel Extract ion Kit (Qiagen, 독일)를 사용하였다.

형질전환

클로닝을 위한 대장균 DH5alpha의 형질전환은 염화칼슴으로 세척 후 열충격 을 주는 방식으로 하였으며， 상세하게는， 대장균을 LB에 접종하여 0D0.6까지 배양 하고 원심분리 (4^， 4000 rpm)로 균체를 회수하여， 얼음으로 넁각한 0.1 M 염화칼 슘용액으로 4회 세척하여 competent cel l을 제조하였다. 준비한 100 내지 500 ng의 plasmid DNA를 100 의 competent cel l과 섞은 후 얼음에서 30분간 방치하고， 42 ^° C에서 30 초간 열층격을 주고 다시 얼음에서 2분간 방치 한 후 1 mL의 LB를 넣어 37 ^° C 1시간 배양후 항생제를 갖는 LB 평판배지에 도말하였다.

균주의 발효

E1 균주를 비롯한 균주의 발효는 1차 종배양， 2차 종배양， 본배양의 단계로 진행하였다. 1차 종배양은 균락의 크기에 따라 4 내지 6 균락올 1차종배양 배지 ( 콩가루 28.5 g/L, 옥수수침지액 25 mL/L, sucrose 35 g/L, 포도당 5 g/L, 탄산칼슘 5 g/L, 소포제 0.8 mL/L)에 접종 후 30 ^° C , 200rpm에서 4 내지 5일 배양하였다. 2차 종배양은 1차 종배양액을 2차 종배양 배지 ( 1차 종배양 배지와 동일하나 콩기름을 5 mL/L 추가함)가 담긴 발효조에 모두 접종 하고， 30 ^° C , 35% DO, 400 rpm, 공기 1.0 wm의 조건을 시작으로 균체 성장에 따라 6% 포도당을 feeding하고 교반속도를 단 계적으로 올리면서 4 내지 5일 배양하였다. 본배양은 2차 종배양액 200 mL을 본 배 양 배지 (땅콩가루 23 g/L, 옥수수침지액 50 mL/L, 메티오닌 1.5 g/L, 텍스트린 70 g/L, 콘밀 35 g/L, 황산칼슘 13 g/L, 콩기름 60 mL/L, 황산암모늄 13 g/L, 과당 시 럽 9 g/L, 탄산칼슘 10 g/L, 소포제 0.5 mL/L)가 담긴 발효조에 접종하고 28°C , 35% DO, 400 rpm, 공기 1.0 m의 조건을 시작으로 배양하였고, pH는 암모니아수를 이용하여 5.4 내지 5.7로 조절하였으며， 균체 성장에 따라 교반속도를 단계적으로 올리면서 배양하였다. 배양 2일 후에 배양온도를 28 ^° C에서 25 ^° C로 낮춘 후, 균체성 장에 따라 5% 내지 10%의 콩기름을 단계적으로 공급하면서 5일 내지 7일 째 발효를 완료하였다.

균주의 CPC 생산성의 평가

균주의 CPC 또는 7-ACA의 생산성은 발효된 균주에 대해서 다음과 같이 HPLC 를 통하여 평가하였다.

HPLC 분석을 위해 배양액을 원심분리하여 상둥액 25 를 취한 뒤 3차증 류수 975 ii L와 섞어서 40배 회석하였다. 회석한 배양액은 0.2 u m 필터로 여과한 후 Shimadzu LClOAvp로 분석하였다. 분석조건은 Z0RBAX Ecl ipse Plus C18(Analyt ical 4.6 隱 X 250 隱， 5-Micron) 칼럼， 이동상 20 mM 암모늄 아세테이 트:아세토니트릴 (95 : 5)， pH 7.0， 유속은 0.8 mL/분， 칼럼온도 40 ^° C， UV 검출기 220 nra를 이용하였다.

<실시예 1>

NTG처리에 의한 CPC (cephalosporin C) 생산능이 향상된 아.ᄏ레?니움 .ᄏ리 소제눔 균추의 제^

NTG (N-methyl-N ' -ni tro-N-ni trosoguanidine) 용액은 아세톤에 NTG 10 mg/mL 농도로 녹여 stock solut ion을 만들었고, 이를 70 ^° C에 저장하면서 사용하기 직전에 ci trate buf fer (22.32 g/L sodium ci trate, 4.63 g/L ci tr ic acid, pH 5.5) 로 회석하여 사용하였다. 아크레모니움 크리소제눔 (Acremonium chrysogenum) 균체 한 균락 (colony) 을 LB배지 (10 g/L tryptone , 5 g/L yeast extract , 10 g/L NaCl )에 접종하여 3 내 지 7일 동안 3(rC , 200 rpm 조건에서 진탕배양하고 원심분리를 통해 회수한 후 ci trate buffer로 2회 세척하고 NTG 용액을 첨가하여 30 ^° C에서 30분 방치하였다. 이를 얼음에 위치하여 냉각시킨 후 원심분리하여 NTG 용액을 버리고， potassium phosphate buf fer ( 107. 13 g/L K ₂ HP0 ₄ , 52.39 g/L KH ₂ P0 ₄ )로 2회 세척한 후 동일 buffer를 이용하여 다양한 농도로 재현탁하였다. 이를 LB 평판배지 (2¾> agar)에 도 말하여 30 ^° C에서 정치배양하면서 10일 내지 30일 후 나타난 균락을 계수하였다. NTG의 처리 농도는 NTG를 처리하지 않은 대조군과 비교하여 사멸율이 90% 내지 97% 가되는농도로사용하였다.

NTG 처리 후 생장한 균체에서 단일 균락 (colony)을 취하여 CPM 배지 (60 g/L sucrose , 60 g/L soy tone , 10 g/L D,L-메티오닌， 2 g/L CaC0 ₃ , 0.05 mL/L 소포제， pH 7.0)에 접종하였다. 균락의 접종은 LB 평판배지 상에 있는 균락을 메스를 이용 하여 가로와 세로 5 내지 7 隱가 되게 자른 후 4 내지 6개를 취하여 접종하였다. 접종한 균체는 3일 내지 7일 동안 30 ^° C , 200 rpm 조건에서 진탕배양하고 배양 상층 액을 회수하여 생산된 CPC를 HPLC로 분석하였다. 이러한 방법으로 CPC 생산성이 높 아진 균체를 선별한 후 상기한 방법을 다시 적용하여 반복하면서 CPC 생산성이 높 아지는 균체를 지속적으로 선별하였다. 최종적으로 선발된 돌연변이 아크레모니움 크리소제눔 균주를 E1으로 명명하였고， 이를 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2016년 8월 8일자로 기탁하였다 (기탁번호 KCTC13079BP) . 최종 선별된 E1 균주의 CPC 생산성은 약 35 g/L로 평가되었다 (결과미도시) .

<실시예 2>

E1. 균주에 CPC 아실라제 ？입에 의한 7-ACA 생산

<2-1> CPC아실라제 발현 백터의 디자인

본 단계에서 CPC (cephalospor in C)에서 7-ACA ( 7-am i nocepha 1 ospor an i c acid)로의 전환능을 갖는 유전자는 대한민국특허출원 제 10-2013— 0006483호에서 명 시한 CPC 아실라제에 대한 유전자 (서열번호 18)를 사용하였다. 당 유전자를 발현 시키기 위한 프로모터는 통상적으로 널리 알려진 아스퍼질러스 니둘란스의 gpdA 프 로모터 및 trpC 터미네이터를 사용하였다 (Punt PJ et al . , Gene . 1990 Sep 1；93( 1)： 101-109 , Funct ional elements in the promoter region of the Aspergi l lus nidulans gpdA gene encoding glycer aldehydeᅳ 3ᅳ phosphate dehydrogenase) .

CPC 아실라제 유전자를 도입하기 위한 플라스미드 백터는 pBluescript II S + 클로닝 백터에 항생제인 hygromycin B, genetic in, phleomycin 저항성을 갖는 마커유전자 카세트 (cassette) 및 다중 도입을 목적으로 마커를 제거하기 위한 Flp 카세트를 도입한 것을 기본 프레임으로 하였다.

마커유전자 카세트에서는 gpdA프로모터와 trpC 터미네이터를사용하였다. 마커 제거를 위한 FRT-Flp 재조합법은 플립파제 (flippase)를 이용해 인접한 FRT 사이의 유전자를 제거하기 위한 방법으로 대장균의 유전자 다중 결손에 널리 쓰이고 있으며， 진균류에도 적용할 수 .있다는 보고가 다수 있었다 (Datsenko KA, Wanner BL, Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Jun 6 ;97 (12) :6640-5, One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia col i -12 using PCR products; Yamada Y, Maeda M, Alshahni MM, Monod , Staib P, Yamada T. , Microbiology. 2014 0ct;l60(Pt 10) :2122-35， Flippase (FLP) recombinase- mediated marker recycling in the dermatophyte Arthroderma vanbreuseghemi i； Bloemendal S, LD, Terfehr D, Kopke K, Kluge J, Tei chert I , U, J Biotechnol . 2014 Jan; 169 :51ᅳ 62.， Tools for advanced and targeted genetic manipulation of the β -lactam antibiotic producer Acrerao ium chrysogenum； Blatzer M, Gsal ler F, Abt B, Schrettl M, Specht T, Haas H. , J Biotechnol. 2014 Jan; 169:82-6. doi: 10.1016/ j . j bi ot ec .2013.11.003. Epub 2013 Nov 15, An endogenous promoter for conditional gene expression in Acreraonium chrysogenum： the xylan and xylose inducible promoter xyll) .

본 발명자는 마커유전자 카세트를 두 FRT부위의 사이에 위치시키고， 플립파 제의 발현을 위해 아크레모니움 크리소제눔에 내재하면서 자일로스에 의해 유도되 는 자일라제 유전자인 Xyll의 프로모터 부위 (Pxyl)로서 상위 약 2,100 bp의 부위 를 PCR로 증폭하여 도입하였고， 마커 제거 시에 자일로스가 존재하는 배지를 이용 해 마커유전자 카세트가 효과적으로 제거될 수 있도록 구성하였다. 플립파제 유전 자는 Barry Wanner 방법에서 사용했던 Πρ유전자의 아미노산 서열을 토대로 아크레 모니움크리소제눔의 코돈에 맞게 최적화하여 사용하였다.

<2-2> CPC아실라제 발현백터의 클로닝

프라이머 5 ' -GCAAAGCTTCCTTGTATCTCTACACACAGGC-3 ' (서열번호 20) 및 5' - GCTATCGATTACGTATTMTTMTCGAGT^AGATGTOAGTGG-3' (서열번호 21)를 이용하여 pAN7-l(GenBank Z32698)로 부터 프로모터와 터미네이터를 포함하는 hygromycin B 저항성 유전자 카세트를 증폭하였다. 증폭한 유전자는 pBluescript II SK+(Stratagene, USA)를 Sacl과 Kpnl으로 절단하고 Klenow를 처리하여 Blunt 말단 을 만든 부위로 삽입하여 pB-Hcast를 제작하였고 또한 각각의 프라이머에 FRT를 포함하여 5 '-

ACACAGGC-3' (서열번호 22) 및 5 '- GCGCTCTGAAG TCCTATACmCTAGAGAATAGGAACTTCGMCTG^

' (서열번호 23)를 이용하여 pAN7-l로부터 상기와 동일 부위를 증폭하여 동일한 방법으로 pBluescript I I SK+에 '삽입하여 카세트 말단에 FRT 부위를 갖는 pB- HcastF (서열번호 1)를 제작하였다.

npt l l 및 ble 유전자로 명명된 genet icin 및 phleomycin 저항성 유전자는 5 ' 말단 부위에는 gpdA프로모터의 3' 부위에 있는 Sai l을 시작으로 하고， 3' 말단 부위에 BamHI 제한부위를 넣어 유전자 합성하였다. npt l l와 ble에 대한 합성유전자 를 Sai l과 BamHI으로 절단하고 pB-HcastF의 동일부위로 삽입하여， 각각 pB-GcastF( 서열번호 2) 및 pB-PcastF (서열번호 3)를 구성하여 FRT를 사이에 위치한 항생제 마 커 카세트를 완성하였다.

Flp 유전자의 발현을 위하여 Xy 11유전자의 프로모터 Pxyll (GenBank KF575626)을 아크레모니움 크리소제눔의 염색체 DNA로부터 프라이머 5 '- CGAAAGCTTGAGGCCGGACAAATTCAGCC-3 ' (서열번호 24) 및 5 '-

GGTGTCAGGGTGTTGAAGATGGG-3 ' (서열번호 25)를 이용하여 증폭하였다. Flp유전자는 5' 부위에 Xyl 프로모터의 3 '방향으로 20 bp가 겹치도록 구성하여 유전자합성을 통해 확보하였다. Xyl 프로모터와 Flp 유전자는 over lapping PCR을 통하여 연결하 였고， 이를 Hindi II와 BamHI으로 처리한 후 pB-Hcast의 동일부위로 삽입하여 Flp카 세트인 pB-Fcast (서열번호 4)를 완성하였다.

pB-Fcast로부터 Pmel , Smal , SnaBI 제한부위를 가진 프라이머 5 '- GTTTAAACCCCGGGTACGTAAATTAACCCTCACTAAAGGG-3 ' (서열번호 26) 및 T7 프라이머. (5 ' -TAATACGACTCACTATAGGGC-3 ' , 서열번호 27)를 이용하여 Flp 카세트를 증폭하고 이 를 각각 pB-HcastF, pB-GcastF, pB-PcastF의 Hindl l l를 blunt말단 처리를 한 부위 에 삽입하예 각각 pB-HF (서열번호 5) , pB— GF (서열번호 6)， pB-PF (서열번호 7)을 제작하였으며， 이들 각각의 다른 항생제를 가진 프레임을 바탕으로 CPC 아실라제를 도입하기 위한플라스미드 백터로 이용하였다. CPC 아실라제의 염기서열은 대한민국특허출원 제 10-2013-0006483호에 나타나 있으며， CX로 명명하기로 하였다. CX 유전자는 gpdA 프로모터의 3' 부위에 있는 Sail을 시작으로 하고, 3' 말단 부위에 Bglll 제한부위를 가진 유전자를 합성하여 ρΒ-Hcast의 Sail과 BamHI 부위로 삽입하여 CX카세트를 완성하였다 (pB-CXcast, 서 열번호 8).

CX 카세트는 hygromycin B 항생제를 이용하기 위하여， pB— HF에 삽입하였다. pB-CXcast (서열번호 8)로부터 T3 (5' -AATTAACCCTCACTAAAGGG-3 ' ， 서열번호 28)와 T7 프라이머를 이용하여 CX카세트를 증폭하고 이를 pB-HF의 SnaBI부위로 삽입하여 pB-HCX (서열번호 9， 도 1)를 제작하고 이를 E1균주에 형질전환하였다.

<2-3> CPC아실라제 발현백터 pB-HCX의 E1 균주에의 형질전환

형질전환 방법은 일반적으로 알려진 진균류의 원형질체 (protoplast)를 이용 하는 방법을 본 발명에 맞게 변형하였다. E1 균주를 LB 평판배지에 도말하여 28 ^° C 에서 6 내지 8일 배양하여 균락을 얻은 후 이를 100 mL TB배지 (12 g/L 트립톤， 24 g/L 효모추출물, 9.4 g/L K2HP04, 2.2 g/L KH2P04, 4 g/L 글리세롤)를 넣고, LB 평 판배지에서 균락을 취하여 쩝종하였다. 균락의 접종은 LB 평판배지 상에 있는 균락 을 메스를 이용하여 한 변이 5 내지 7 mm가 되게 정사각형으로 자른 후 균락의 크 기에 따라 4 내지 6개를 취하여 접종하고 28 ^° C, 150 rpm 조건에서 3 내지 4일 배양 하였다. 성장이 완료된 배양액을 4 ^° C, 4,000 rpm에서 원심분리한 후 상둥액을 버리 고 0.6 M MgS0 ₄ 용액으로 1회 세척하였다. 원형질체 제작을 위해 균체 무게의 약 4배의 2%의 lysing enzyme (Sigma L1412)을 처리하여 30 ^° C, 100 rpm에서 3시간 반웅시켰다. 이 후 반웅액에 동량의 separation buffer A(0.6 M sorbitol, 100 mM Tris-Cl , pH 7.0)를 overlay한 뒤， 1,800 g, 4 ^° C 조건으로 10분간 원심분리하였다. 상등액 및 경계면을 새 원심분리관 에 옮겨 동량의 separation buffer B(1.2 M sorbitol, 100 mM Tris-Cl, pH 7.5)를 넣고 1，800 g, 4 ^° C 조건으로 10분간 원심분리하였다. 상등액을 버리고 침전물을 다 시 MSC(1 M sorbitol, 10 mM MOPS, pH 6.5, 10 mM CaCl ₂ )로 세척하였다. 현미경으로 관찰하여 형성된 원형질체를 계수한 후 형질전환을 위해 1X10 ⁷ 개의 원형질체에 1 내지 5 ug DNA, 50 의 60% PEG용액 (MSC에 polyethyleneglycol 6000을 60%농도 로 만듦)을 섞은 후， 얼음에서 20분 방치하였다. 다시 500 iiL의 60% PEG 용액을 넣고 섞은 뒤 상온에서 20분 방치한 후， 항생제를 함유한 LB-sucrose 평판배지 (0.8 M sucrose, 2% agar, 100 mg/L Hygromycin B, 또는 200 mg/L Geneticin, 또는 20 mg/L Phleomycin)에 도말하였다. 평판배지는 28 ^° C에서 10일 내지 30일 동안 균락이 형성될 때까지 배양하였다.

자라나온 균락은 항생제를 함유한 LB 평판배지에 옮기고 28 ^° C에서 7일 내지 10일 간 계대 배양하여 실제 성장 유무를 재확인하였다. 항생제 함유배지에서 잘 자라는 균락을 선별하여 배양하였고， 각 균락에 대한 7-ACA 생산성을 평가하였다. 각 균락마다 생산성 차이가 상이하였으며 , 가장 생산성이 높은 균락을 E2 균주로 명명하여 선별하였다. E2 균주에 대한 7-ACA 발효생산성은 7일째 최대치로서 약 2 g/L로 평가되었다 (결과미도시).

<실시예 3>

반복 형질전환에 의한 7-ACA 생산성 향상

<3-1>프로모터 류닝 및 7-ACA생산성 향상

E2 균주의 CPC 아실라제는 gpdA 프로모터로 발현되며， 발현량이 높지 않아 프로모터 튜닝 (promoter tuning)을 실시하여 프로모터의 강도를 향상시키고자 하 였다.

프로모터 튜닝은 다양한 방법으로 프로모터의 작동부위를 무작위 돌연변이 시켜 프로모터 강도 향상을 모색하는 방법으로， 최근 합성생물학의 등장으로 활발 히 연구되고 있는 기술이다 (Alper H, Fischer C, Nevoigt E, Stephanopoulos G. , Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Sep 6； 102(36)： 12678-83. Epub 2005 Aug 25， Tuning genetic control through promoter engineering; Santos CN, Stephanopoulos G. , Curr Opin Chem Biol . 2008 Apr； 12(2)： 168-76. , Combinatorial engineering of microbes for opt imizing cellular phenotype, ； Dehl i T, Sol em C, Jensen PR. , Subcell Biochem. 2012;64:181-201. Tunable promoters in synthetic and systems biology). 본 발명자는 에러 유발 PCR (error prone PCR) 방법으로 프로모터의 전사시작부위로부터 상위 283 bp 부위를 증폭하여 다양하게 돌연변이 된 부위를 포함하도록 프로모터 라이브러리를 구성하고 이를 E1 균주에 도입하여 생산성을 평가하였다.

gpdA 프로모터의 전사시작부위 (transcription start site)로부터 상위 100 bp 부위와 상위 250 bp 부위의 gpd box 부위 (Peter Jan Punt., Molecular Signals in PI ant -Microbe Communications, D. P. S. Verma. ed, CRC Pre, Boca Raton, Florida, 1992, pp. 29-48 , Functional elements in the promoter region of the glycer aldehyde一 3ᅳ phosphate dehydrogenase gene of Aspergi l lus nidulans)를 포함 하는 상위 283 bp 부위를 유력한 돌연변이 부위로 정하고 제한부위 EcoRI 및 Ndel 을 도입한 프라이머 5 '-GCTGAATTCCCATCCGGCATCTGTAGGGCG-3' (서열번호 29) 및 5 '-CGTCATATGGGAAGATGAATATACTGAAGATG-3' (서열번호 30)와 pB-CXcast (서열번호 8) 플라스미드 백터를 주형으로 하여 error prone PCR을 수행하였다. Error prone PCR 조건은 다음과 같이 하였다. PCR 반웅액 총 부피를 Ιθ 로 하였고 1 ng 주형 DNA, 10 mM Tr is-Cl (pH 8.3)， 50 mM KC1 , 3.5 mM MgCl ₂ , 0.05 ~ 0.075 mM MnCl ₂ ,

0.2 mM dATP, 0.2 raM dGTP, 1.0 mM dCTP, 1.0 mM dTTP, 0.3 μ Μ의 각 프라이머， 5U 의 Taq 폴리머라제를 사용하였다. PCR 반응 조건은 94 ^° C 5분, 9 ^° C 30초， 55 ^° C 30 초, 72°C 30초, 72°C 10분 후 4 ^° C 넁각으로서 증폭 회수는 15 내지 20 회로 하였 다. PCR 반웅산물을 0.8% agarose gel에 전기영동하여 344 bp 부위를 추출 및 정제 하여 에러가 유도된 DNA 단편의 po이을 제작하였다. 이때 대조구로서는 동일한 프 라이머와 동일한 주형으로부터 일반조건의 PCR을 수행하여 상기와 같이 제조하였 다.

이 DNA po 과 대조구 DNA단편을 도입하고자 하는 백터는 상기 DNA 단편의 범위를 제외하는 나머지 부분의 pB— CXcast (서열번호 8)로서 제한 부위 에러가 유 도된 DNA 단편을 도입하기 위하여 Ndel과 EcoRI 제한부위를 포함하는 프라이머 5 ' -CGTCATATGCATCCAAGAACCTTTATTTCC-3 ' (서열번호 31) 및 5 '-

GClXiAATTCGCCAATTAGGGAGCTTACGC-3' (서열번호 32)를 이용하여 pB-CXcast (서열번 호 8) 플라스미드 백터를 주형으로 증폭한 7 , 717 bp의 DNA 단편을 사용하였다. 각 각 증폭한 에러 유발 DNA 단편의 po 과 백터를 EcoRI과 Ndel을 이용하여 절단 및 연결하여 프로모터에 에러가 유발된 재조합 플라스미드 백터를 완성하였다.

이 재조합 플라스미드 백터의 po 을 대장균 DH5alpha에 형질전환하여 약 10 ,000개 대장균 균락의 라이브러리를 얻었다. 대장균 라이브러리 균락이 도말된 LB 평판배지에 100 y g/mL의 Ampici l l in을 함유하는 LB 액체배지 1 mL을 넣어 균락 을 모아 대장균 라이브러리 po 을 만든 후 총 플라스미드를 추출하여 재조합 풀라 스미드 라이브러리 pool을 제작하였다. 이 재조합 플라스미드 라이브러리 pool을 주형으로 T3와 T7 프라이머를 이용하여 돌연변이가 유발된 gpdA프로모터를 갖는 CX 카세트를 증폭하였고, 이를 실시예 2에서와 동일한 방법으로 pB-HF에 삽입하였다. 이렇게 만들어진 돌연변이가 유도된 프로모터를 갖는 라이브러리를 실시예 2에서와 동일한 방법으로 E1 균주에 도입하여 그 ACA 생산성을 평가에 이용하였다.

이렇게 평가된 재조합 균주 중 가장 높은 7-ACA 생산성을 보인 균주를 E3로 명명하였다. E3를 얻기 위한 후보로서 약 1 ,200의 균락을 시험관으로 배양하였으 며， 이 중 그 ACA 생산성으로 상위 78개의 균락을 삼각플라스크에 배양하였다. 삼 각플라스크 배양 결과로서 가장 7-ACA 생산성이 높았던 5 균락을 선별하여 발효 배 양하였으며， 그 결과를 도 2에 나타내었다.

7-ACA 생산성 향상에 영향을 미친 변이된 프로모터의 서열을 확인하기 위해 다음과 같이 실시하였다. 5개 균주의 각 한 균락씩을 평판배지로부터 잘라내어 멸 균된 3차 증류수로 4회 세척하고, 0.5 mL의 멸균 증류수에 재현탁하여 20분간 끓는 물에서 중탕하였다. 실은으로 넁각 후에 13 , 000 rpm에서 20분간 원심분리 후 상층 액을 주형으로 프라이머 5 '-TAGCATGCCATTAACCTAGG— 3' (서열번호 33) 및 5 '- GGGTAGCTGTTAGTCAAGC-3 ' (서열번호 34)를 이용하여 증폭한 후 T— Blunt Vector (Sol gent , 한국)에 동봉된 메뉴얼에 따라 도입하여 대장균 DH5alpha에 형질전환하 고 LB배지에 배양 및 플라스미드를 추출하여 염기서열 분석을 하였다. 염기서열 분 석은 마크로젠 (한국)에 의뢰하여 수행하였다. 상위 5개 균락에 대한 염기서열 분여 결과는 도 3과 같으며， (B) 내지 (F)의 돌연변이 프로모터의 서열을 각각 서열번호 10 내지 14로 나타내었다 ( (A)는 야생형 프로모터) .

도 3의 (D)에서 나타낸 서열의 변이 프로모터 부위를 가지며 해당 균주에 도 입되었던 재조합 플라스미드 백터는 pB-HCXEP3 (서열번호 15)라 명명하였고, 이를 도입하여 7-ACA발효생산성이 15 g/L를 나타낸 균주를 E3로 명명하였다 _:

<3-2> 반복 형질전환에 의한 7-ACA 생산성의 향상

본 발명자들은 7-ACA의 생산성의 향상을 위해서 연구하던 중 반복형질전환이 7-ACA의 생산성을 향상시킨다는 점을 알아내었다. 이에 CX 유전자의 발현을 증대시 키기 위해서 E3 균주에 재 형질전환을 시도하였다. 도입되었던 EP3부위로 변이된 프로모터로 작동하는 CX 카세트를 앞서 제작했던 pB-GF(genet icin) 및 pB- PF(phleomycin)에 도입하여 항생제가다른 두 재조합플라스미드를 제작하였다. 상기 도 3에서 보여지는 염기서열 분석을 위해 EP3를 도입하여 제작했던 재 조합 T-Bhmt vector를 EcoRI과 Ndel으로 절단하여 약 330 bp의 DNA단편을 추출하 였고， 이를 실시예 3에서 이용했던 pB-CXcast (서열번호 8) 플라스미드 백터를 주 형으로 증폭한 7, 717 bp의 DNA 단편을 동일한 제한효소로 절단하여 연결하여 EP3 염기서열을 갖는 CX 카세트를 포함하는 플라스미드 백터를 제조하였다. 이로부터 T3와 T7 프라이머를 이용하여 CX 카세트를 증폭한 후 이를 pB-GF 및 pB-PF의 SnaBI 부위에 도입하여 각각 pB-GCXEP3 (서열번호 16) 및 pB-PCXEP3(서열번호 17)를 제작 하였다.

PB-HCXEP3가 도입된 E3균주에 pB-GCXEP3를 형질전환한 균주를 E4라 명명하였 고， E4균주에 pB-PCXEP3를 형질전환한균주를 E5라 명명하였다.

E5균주의 경우 본 발명자가보유한 세 종류의 항생제마커유전자를 모두 갖고 있으므로， 형질전환을 반복하기 위해서 마커유전자 카세트를 제거할 필요가 있었 다. 이를 위해 E5균주를 2% 자일로스를 함유하고 항생제 LB 평판배지에 계대배양하 여 7일 내지 30일 후 나온 균락으로부터 총 DNA를 추출하여 PCR을 통해 마커유전자 카세트의 결손 여부를 확인하였다. 이상의 단계를 반복하여 세 가지 항생제마커 유 전자카세트가 모두 손실된 형질전환체를 선별한 후 pB-HCXEP3 , pB-GCXEP3 , pB- PCXEP3의 형질전환을 순차적으로 반복하였다. 반복적인 형질전환으로 그ACA 생산성 이 향상된 균주는 순차적으로 E6(4회 형질전환체) , E7(5회 형질전환체) , E8(6회 형 질전환체)로 명명하였다. E7의 경우 E6에 비해 7-ACA 생산성이 증가하였으나 그 정 도가 높지 않아 재도입의 효율이 낮았고， 또한 E8의 경우 7-ACA 생산성이 증가된 형질전환체가 선별되지 않았으므로 (유사한 수준의 생산성을 보임) E7 균주를 CPC 아실라제 도입에 대한 최종 균주로 선발하였다. E4 내지 E7의 7-ACA 발효 생산성을 도 4에 나타내었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기슬은 단지 바람직한 구현예일 뿐이 며， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서， 본 발명 의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 둥가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

【산업상 이용가능성】

이상 살펴본 바와 같이， 본 발명은 CPC 생산성이 높아지도록 돌연변이를 유 발한 아크레모니움 크리소제눔을 제조하고， 강하게 발현하도톡 조절한 프로모터와 CPC 아실라제를 포함하는 발현 백터를 반복적으로 형질전환하여 7-ACA를 고농도로 생산할 수 있는 균주를 제조하는 방법 둥을 제공한다. 본 발명의 방법에 의하면 재 조합 아크레모니움 크리소제눔 균주를 제조하여 이의 발효를 통하여 7-ACA를 고농 도로 제조할수 있어 산업상 이용가능성이 매우 우수하다.

【수탁번흐】

기탁기관명 ： 한국생명공학연구원 생물자원센터

수탁번호 : KCTC13079BP 수탁일자 ： 20160818

국 제 양 식 특허출원을 위한부다페스트 국제 조약 하의 미생물 수탁 증명 국제기탁기관에 의해 규칙 7.1에 따라 발행된 원기탁에 대한수탁증 수신: 아미코젠 주식회사

(52621) 대한민국 경상남도 진주시 진성면 동부로 1259번길 64

I . 미생물의 표시

기탁자가첨부한미생물식별에 대한표시: 국제 기탁기관이 부여한수탁번호: Acremoni删 chrysogeniim El KCTC 13079BP

II . 과학적 성질의 설명 및 /또는분류학상의 위치

항목 I에 표시된 미생물에 대하여 다음사항이 포함되어 있다:

[ ] 과학적 성질의 설명

[ ] 제안된분류학상의 위치

(적용시 X표시 )

III . 기탁및 수탁 본국제기탁기관은 2016년 08월 18일에 기탁된항목 I에 표시된미생물을수탁하였다.

IV. 이관청구의 수령

본 국제기탁기관은 에 항목 I에 표시된 미생물을 수탁하였으며 에 원기탁의 부다페스트조약하의 기탁으로의 이관청구를수령하였다.

V. 국제기탁기관 국제기탁기관을 대표하는 권한을 ： 명칭: Korean Col lection for Type Cultures

또는권한을부여받은공무원서명:

주소: (56212) 대한민국 전라북도 정읍시 입

신길 181 한국생명공학연구원 (KRIBB) 김차영 센터장

서명일: 2016.08.25

BP/4형식 (KCTG Form 17) 단일 페이자

(원문과상위 없음을확인함) 대리인 : 변리사

변리사