VARAKSIN NIKOLAI ANATOL EVICH (RU)
RYABICHEVA TAT YANA GENNAD EVNA (RU)
RADAEVA IRINA FEDOROVNA (RU)
KOLESOVA MARINA EVGEN EVNA (RU)
KHRIPKO OL GA PAVLOVNA (RU)
SEREBROVA VARVARA SERGEEVNA (RU)
OBSHCHESTVO S OGRANICHENNOY OTVETSTVENNOST YU VEKTOR FORTIS (RU)
WO2011019619A1 | 2011-02-17 |
RU2125093C1 | 1999-01-20 | |||
RU2089611C1 | 1997-09-10 | |||
CN102233129A | 2011-11-09 | |||
RU2182830C1 | 2002-05-27 |
Формула изобретения 1. Способ получения субстанции рекомбинантного эритропоэтина человека, включающий культивирование в роллерных флаконах штамма клеток яичника китайского хомячка, трансформированного предварительным введением плазмиды, содержащей ген человеческого эритропоэтина, последовательно в ростовой и в накопительной питательных средах с последующим выделением целевого продукта последовательно методами микрофильтрации и хроматографии, отличающийся тем, что в качестве ростовой питательной среды используют ростовую среду, содержащую, масс.%: сыворотка крови крупного рогатого скота 5,0 питательная среда Игла MEM остальное до 100%, а в качестве накопительной питательной среды используют бессывороточную среду, содержащую следующие ингредиенты в 1 л: пролин, мг/л 49,0-80 глицин, мг/л 40,0-60,0 смесь равных долей сред DMEM и F-12 до 1 литра, а целевой продукт - субстанция рекомбинантного эритропоэтина человека имеет активность от 1000 до 10 000 МЕ/мл. 2. Способ по п.1 , отличающийся тем, что в качестве культивируемого штамма используют рекомбинантный штамм клеток яичника китайского хомяка JV ВСК (П) N 626Д. 3. Нанокапсулированная форма рекомбинантного эритропоэтина человека, включающая полиэлектролит в качестве которого выбран альгинат натрия, или хитозан, или пектин, или коллидон, или карбопол, стабилизатор - сахарозу, отвердитель - желатозу, жидкую субстанцию рекомбинантного эритропоэтина человека (ЭПО) и мочевину при следующем исходном составе компонентов до нанокапсулирования, мае. %: сахароза 2,5-6,0 желатоза 2,5-5,5 мочевина 0,1-3,0 альгинат натрия или хитозан, или пектин, или коллидон, или карбопол 0,001- 1 ,0 жидкая субстанция ЭПО с концентрацией эритропоэтина 1 000-10 000 МЕ/мл, полученная по п.1 формулы изобретения остальное до 100 %. |
Область техники
Изобретение относится к технологии получения субстанции рекомбинантного человеческого эритропоэтина и нанокапсулированной его формы и может быть использовано в медицине и биотехнологии,
Эритропоэтин (ЭПО) - гормон, продуцируемый интерстициальными клетками почек и регулирующий эритропоэз у млекопитающих. ЭПО применяется при лечении анемий, возникаюших вследствие трансплантации органов и тканей, терапии ВИЧ-инфекции, в пред- и послеоперационном периоде, а также анемий, возникающих при беременности, системных заболеваниях (ревматоидный артрит) и хронической почечной недостаточности (диализные и преддиализные пациенты). Особое место рекомбинантный человеческий ЭПО (рчЭПО) занимает в профилактике и лечении анемий, возникающих в результате интенсивной химио- и радиотерапии опухолевых заболеваний, улучшая качество жизни людей и ее продолжительность. Кроме того, ЭПО улучшает сердечную функцию и может выступать в роли кардио- и нейропротектора при инфарктах миокарда и инсультах.
Размеры нанокапсул обычно не превышают 100 нм, которые обладают высокой проникающей способностью и могут проходить даже в такие «закрытые» зоны организма, как головной мозг. Малый размер делает их невидимыми для клеток иммунной системы, что позволяет нанокапсул ам длительное время циркулировать в кровотоке. Использование нанокапсул исключает наработку аутоантител организмом, что повышает безопасность использования лекарственных препаратов.
Предшествующий уровень техники
Известен способ получения инъекционной формы рчЭПО [Патент СССР JY O 1801 1 18, МПК C12N15/26, опубл. 07.03.1993 г.]. Способ состоит в том, что осуществляют получение геномного ДНК клона эритропоэтина человека гибридацией с зондами и его выделение, конструирование рекомбинантных плазмидных ДНК, кодирующих ЭПО человека, с последующей трансформацией полученными ДНК штаммов клеток млекопитающих (например, cos I), выделением и очисткой целевого продукта. Терапевтический эффект рчЭПО для парентерального применения широко известен и описан во многих работах.
Однако, известно побочное действие этого препарата, приводящее к различным осложнениям [Синюхин В.Н. и др. Фармакокинетика рекомбинантного человеческого эритропоэтина. Терапевтический архив, 1994, т. 66, JV° 8, с. 60-62].
Известен способ получения липосомальной формы ЭПО [Патент РФ J 22218914, МПК А61 9/127, опубл. 20.12.2003] путем разбрызгивания под давлением липидной фазы в спиртовом растворителе в водный буферный раствор, находящийся в высокоскоростном гомогенизаторе. Липидная фаза содержит заряженное липидное соединение и холестерин.
Недостатками этого способа является сложность технологии получения частиц и использование органических растворителей, способных инактивировать ЭПО. Кроме того, указанная липосомальная форма препарата предназначена только для инъекционного применения.
Известен способ получения таблетированной формы рчЭПО для перорального применения [Патент РФ Ν° 2152206, МПК А61К 9/20, опубл. 10.07.2000 г.]. Указанную форму получают путем смешивания ЭПО со стабилизирующими добавками и лиофилизации, лиофильно высушенный ЭПО смешивают с лактозой, стеаратом кальция и ванилином и прессуют в таблетки, которые затем покрывают кислотоустойчивой оболочкой.
Недостатком способа является использование в процессе получения кислотоустойчивой оболочки пожароопасного вещества ацетона, падение активности рчЭПО в процессе нанесения кислотоустойчивой оболочки, а также возможность разрушения оболочки в процессе хранения и, как следствие, падение активности рчЭПО.
Известен способ получения рчЭПО на основе штамма продуцента
СНОрЕ [Патент РФ М> 2070931, МПК C12N 15/12, опубл. 27.12.1996 г.]. Штамм СНОрЕ обеспечивает синтез и секрецию в культуральную жидкость рчЭПО с выходом до 4 мг/л при стационарном культивировании на смеси питательных сред Игла MEM (45 %) и 199 (45 %) с добавлением 10 % сыворотки крупного рогатого скота.
Недостатком этого способа является использование сыворотки крупного рогатого скота в составе среды культивирования. В процессе получения рчЭПО, собранную ЭПО-содержащую жидкость, необходимо очищать от балластных белков, что значительно усложняет процесс и влияет на конечную цену. Кроме того, сыворотка крупного рогатого скота - дорогостоящий компонент. Еще одним недостатком сыворотки является ее качественная изменчивость от партии к партии, возможность контаминации вирусами, прионами, микоплазмами, что также влияет на качество и количество целевого продукта.
Наиболее близким способом получения субстанции рекомбинантного человеческого эритропоэтина является способ получения рчЭПО [ Патент РФ JTs 2125093, МПК С12Р21/02, опубл. 20.01.2012 г. ], включающий получение субстанции рекомбинантного эритропоэтина человека путем культивированитя штамма клеток СНО- ЭПО-SPM в ростовой питательной среде, содержащей в 1 л смесь равных долей сред RPMI-1640 и DMEM, 200 мг глутамина, 0,04 мг гентамицина и 80-120 мл сыворотки крови плодов коровы, а затем в накопительной среде содержащей в 1 л глутамина 200 мг, Hepes 3,75 г, 10 мл Fetalclone II и смесь равных долей сред RPMI-1640 и DMEM с последующим выделением целевого продукта последовательно методами микрофильтрации и хроматографии.
Недостатком данного способа является использование в составе ростовой питательной среды дорогостоящей сыворотки крови плодов коровы, а также использование в составе накопительной питательной среды Fetalclone II. Fetalclone II создан на основе сыворотки крупного рогатого скота путём удаления из неё иммуноглобулинов и других нежелательных компонентов, а так же добавления химически очищенных витаминов, аминокислот микроэлементов и других низкомолекулярных факторов. Стоимость Fetalclone II превышает стоимость сыворотки в 1,5 - 2 раза и к тому же при получении целевого продукта собранную ЭПО-содержащую жидкость необходимо очищать от посторонних белков, что значительно усложняет получение целевого продукта и влияет на конечную цену. Кроме того, при недостаточной очистке субстанции ЭПО от посторонних белков и использовании ее для нанокапсулирования, часть нанокапсул будет содержать в ядре только посторонние молекулы белков, которые не будут обладать активностью эритропоэтина.
Наиболее близким аналогом нанокасулированной формы эритропоэтина является микрокапсулированная (в виде микросфер) форма эритропоэтина (патент Китая N?. CN102233129, МПК А61К9/16, опубл. 09.1 1.201 1 г.), включающая эритропоэтин, как активный компонент, декстран - защитный (стабилизирующий) агент для активного компонента, и производная полигликолиевой или молочной кислоты или поликапролактон, являющийся материалом оболочки микрокапсул (компонент покрытия). В экспериментах на животных показана пролонгированность действия эритропоэтина.
Однако заявленная микрокапсулированная форма эритропоэтина имеет сложную технологию получения микрокапсул. Кроме того, размер частиц микрокапсул составляет 5-10 микрон, а технология получения микрокапсул и компонентный состав препарата не позволяют изготавливать указанные микрокапсулы меньшего размера, что может вызвать наработку антител к эритропоэтину организмом и приведёт к усилению анемии.
Нанокапсулы обладают высокой проникающей способностью и могут проходить даже в такие «закрытые» зоны организма, как головной мозг. Малый размер делает их невидимыми для клеток иммунной системы, что позволяет нанокапсулам длительное время циркулировать в кровотоке.
Раскрытие изобретения
Техническим результатом предлагаемого изобретения является упрощение технологии получения субстанции ЭПО, свободной от посторонних белковых примесей и пригодной для нанокапсулирования, б а также упрощение технологии и возможность получения нанокапсулированной формы ЭПО с размером частиц от 15 до 500 нм.
Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения субстанции рекомбинантного эритропоэтина человека, включающем культивирование в роллерных флаконах штамма клеток яичника китайского хомячка, трансформированного предварительным введением плазмиды, содержащей ген человеческого эритропоэтина, последовательно в ростовой и в накопительной питательных средах с последующим выделением целевого продукта последовательно методами микрофильтрации и хроматографии, согласно изобретения, в качестве ростовой питательной среды используют ростовую среду, содержащую, масс.%:
сыворотка крови крупного рогатого скота 5,0
питательная среда Игла MEM остальное до 100%,
а в качестве накопительной питательной среды используют бессывороточную среду, содержащую следующие ингредиенты в 1 л: пролин, мг/л 49-80 глицин, мг/л 40-60 смесь равных долей сред DMEM и F-12 до 1 литра, а целевой продукт - субстанция рекомбинантного эритропоэтина человека имеет активность от 1000 до 10 000 МЕ/мл.
В качестве культивируемого штамма используют рекомбинантный штамм клеток яичника китайского хомяка N° ВСКК (П) N 626Д.
Полные прописи питательных сред Игла MEM, DMEM, RPMI- 1640, и F-12: приведены в книге: «Методы культивирования клеток: Сборник научных трудов. - Л.: Наука, 1988. - 313 с.»..
Указанный технический результат достигается также нанокапсулированной формой рекомбинантного эритропоэтина человека, включающей полиэлектролит в качестве которого выбран альгинат натрия, или хитозан, или пектин, или коллидон, или карбопол, стабилизатор - сахароза, отвердитель - желатоза, жидкую субстанцию рекомбинантного эритропоэтина человека (ЭПО) и мочевину при следующем исходном составе компонентов до нанокапсулирования, масс.%: сахароза 2,5-6,0; желатоза 2,5-5,5; мочевина 0,1-3,0; альгинат натрия или хитозан, или пектин, или коллидон, или карбопол 0,001-1,0 и жидкая субстанция ЭПО с концентрацией эритропоэтина 1 000-10 000 МЕ/мл, полученная по п.1 формулы изобретения - остальное до 100 %.
Следует отметить, что все соотношения между исходными компонентами полимеров выбраны, исходя из оптимального выхода коацервата с размером частиц в диапазоне 15-500 нм.
Мочевина в концентрации 0, 1-3,0 масс. % способствует дезагрегации ЭПО в процессе образования нанокапсул вследствие чего нанокапсулы формируются более однородными и с более равномерным количеством молекул рчЭПО в них.
Ниже приведена характеристика полимеров (полиэлектролитов), используемых для получения нанокапсулированной формы эритропоэтина:
- альгинат натрия фармакопейного качества производства фирмы Pronova Biomedical (Норвегия),
- карбопол 934 (карбомер) - высокомолекулярный полимер акриловой кислоты, поперечно сшитый полиалкильными эфирами Сахаров и полиспиртов, является слабой кислотой, выпускается фирмой Sigma (США), - оллидон 90F (повидон, поливинилпирролидон) - растворимый поливинилпирролидон, образует комплексные химические соединения с фармацевтическими субстанциям, выпускается фирмой BASF AG,
- пектин AU 701, AU 202 фирмы Sigma (США) - очищенный полисахарид, образованный остатками галактуроновой кислоты, получаемый экстракцией цитрусового, свекловичного или яблочного жома,
- хитозан (PROTASAN) фармакопейного качества производства фирмы Pronova Biomedical (Норвегия),
Создание нанокапсулированной формы рчЭПО для перорального применения позволяет исключить возможность заражения пациентов вирусами гепатитов, ВИЧ и др. инфекций, что возможно при парентеральном способе введения. Специально подобранный состав стабилизаторов, полимеров и наполнителей позволяет исключить побочные эффекты, вызываемые добавками и исключить наработку аутоантител в макроорганизме.
Предложенные способ получения субстанции рчЭПО и нанокапсулированная форма ркомбинантного эритропоэтина человека не известны из опубликованных источников информации, что позволяет сделать вывод о соответствии критериям «новизна» и «изобретательский уровень».
Вариант осуществления изобретения
Ниже приведены примеры конкретного выполнения способа получения нанокапсулированной формы рчЭПО:
Пример 1. Способ получения жидкой субстанции рчЭПО
Клетки СНОрЕ — продуцент ЭПО культивируют в ростовой питательной среде, состоящей из 95 % питательной среды Игла MEM и 5 % сыворотки крови крупного рогатого скота. Клетки высевают в роллерные бутыли, которые помещают в роллерную установку и вращают со скоростью 1,5 об/мин. Посевная концентрация составляет (1,5-2,0)х 10 6 клеток в 1 мл, кратность рассева 1 :3-1 :4, частота пассирования— 3-4 суток. Для пересева культур клеток в качестве диспергента применяют 0,25 %-ный раствор трипсина и 0,02 %-ный раствор версена в соотношении 1 :2. Культуры клеток инкубируют при температуре 37 °С в течение 2-х суток до получения клеточного монослоя. После образования монослоя его освобождают от балластных белков, отмывая раствором Хенкса, и заливают накопительной средой. В качестве накопительной среды используют бессывороточную среду, содержащую в своем составе 50 % питательной среды DMEM, 50 % питательной среды F-12 и аминокислоты пролин и глицин. Каждые 2-3 суток проводят сбор ЭПО- содержащей жидкости и замену на свежую порцию накопительной среды, цикл накопления повторяют 5-6 раз. ЭПО-содержащую жидкость сливают, полученные сливы объединяют и хранят при температуре 4 °С. Затем ЭПО-содержащую жидкость очищают, фильтруя через ацетат-целлюлозные мембраны с размерами пор 0,45 и 0,22 мкм, концентрируют, используя метод ультрафильтрации, определяют специфическую активность ЭПО в полученном концентрате методом ИФА.
В таблице 1 представлены данные специфической активности рчЭПО в ЭПО-содержащей жидкости на различных накопительных средах, полученные методом ИФА. В качестве опытной накопительной среды использована бессывороточная среда, состоящая из 50 % питательной среды DMEM, 50 % питательной среды F-12 с добавлением 5 мг/л, или 49 мг/л, или 80 мг/л пролина и 10 мг/л, или 40 мг/л, или 60 мг/л глицина. Контрольная накопительная среда содержит в своем составе 98 % питательной среды Игла MEM и 2 % Fetalclone II. Таким образом, в предложенном способе получения субстанции рчЭПО экспериментально установлена возможность использования в ростовой питательной среде сыворотка крови крупного рогатого скота в количестве 5,0 масс.%, что позволяет снизить количество балластных белков за счет чего упрощается процесс удаления последних.
Кроме того, использование бессывороточной питательной среды в составе накопительной среды с добавлением от 49 мг/л до 80 мг/л пролина и от 40 мг/л до 60 мг/л глицина, значительно увеличивает продукцию рчЭПО в ЭПО-содержащей жидкости.
Таблица 1.
Специфическая активность рчЭПО в ЭПО-содержащей жидкости на различных накопительных средах
Отсутствие сыворотки и ее компонентов при получении рчЭПО значительно упрощает процесс очистки препарата и делает технологию более экономичной. Пример 2. Исходные компонентные составы 1-5 препарата до нанокапсулирования, масс. %.
Состав 1.
Сахароза 2,5
Желатоза 2,5
мочевина 0, 1
альгинат натрия 0,001
жидкая субстанция ЭПО с концентрацией
эритропоэтина 1 000 МЕ/мл остальное до 100 %.
Состав 2.
Сахароза 3,0
Желатоза 3,0
мочевина 0,5
хитозан 0,01
жидкая субстанция ЭПО с концентрацией
эритропоэтина 3 000 МЕ/мл остальное до 100 %.
Состав 3.
сахароза 3,5
желатоза 3,5
мочевина 1,0
пектин 0, 1
жидкая субстанция ЭПО с концентрацией
эритропоэтина 5 000 МЕ/мл остальное до 100 %.
Состав 4.
сахароза 5,0
желатоза 4,5
мочевина 2,0
коллидон 1 ,0 жидкая субстанция ЭПО с концентрацией
эритропоэтина 8000 МЕ/мл остальное до 100
Состав 5.
Сахароза 6,0
Желатоза 5,5
Мочевина 3,0
Карбопол 0,005
жидкая субстанция ЭПО с концентрацией
эритропоэтина 10 000 МЕ/мл остальное до 100
Пример 3. Получение нанокапсулированной формы ЭПО на основе альгината натрия во флаконах (состав 1).
Стерильную ЭПО-содержащую жидкость получают как в примере 1. К стерильной ЭПО-содержащей жидкости с концентрацией ЭПО 1 000 МЕ/мл при непрерывном перемешивании добавляют стерильные водные растворы: 10 %-ной мочевины до конечной концентрации 0,1 % (по массе), 2 %-ного альгината натрия до конечной концентрации 0,001 % (по массе), 50 %-ной сахарозы до 2,5 % (по массе) и 25 %-ной желатозы до 2,5 % (по массе). Полученную смесь разливают во флаконы по 0,5-2 мл и замораживают при температуре минус (50-60) °С в течение 18 часов. Нанокапсулы получают в результате коацервации заряженного полиэлектролита и отвердителя с образованием комплекса путем замораживания раствора со скоростью (0,1-3,0) °С в минуту до температуры, ниже температуры стеклования аморфной фазы, оставшейся после кристаллизации льда.
При коацервации водорастворимого полимера, способного диссоциировать на ионы при рН, близких к физиологической, обеспечивается сохранность рчЭПО в процессе получения нанокапсул. Коацервация обусловлена понижением растворимости полимера при понижении температуры и первичной кристаллизации льда, вследствие чего концентрация полимера в маточном растворе (жидкой фазе, оставшейся после первичной кристаллизации льда) увеличивается. Полученный коацерват вместе с равновесной жидкостью подвергается дальнейшему замораживанию и лиофильному высушиванию. Концентрирование (понижение растворимости) полимера проводится за счет первичной кристаллизации льда, что не вызывает инактивации белкового препарата или его существенного разбавления (не более 1-50 %). Весь процесс нанокапсулирования заключается в сведении растворов полимеров с ЭПО-содержащей жидкостью (гормон- содержащая жидкость, стабилизированная частично гидролизованным желатином - желатозой и сахарозой), замораживании полученного раствора с определенной скоростью и лиофилизации. Мочевина способствует дезагрегации ЭПО в процессе образования микрокапсул вследствие чего нанокапсулы формируются более однородными и более равномерном количеством ЭПО в них. Необратимость процесса коацервации обусловлена взаимодействием между положительными и отрицательными зарядами различных молекул реакционной смеси и, возможно, усилением воздействия между ними, происходящем при кристаллизации льда. Продукт лиофильно высушивают в течение 48 часов в стерильных условиях. После окончания сушки флаконы заполняют инертным газом (аргоном), укупоривают резиновыми крышками, завальцовывают колпачками. ЭПО в сухом виде при хранении в течение года при температуре (2-8) °С не теряет свою активность.
Пример 4. Получение нанокапсулированной формы ЭПО на основе хитозана в таблетках (состав 2). Стерильную ЭПО-содержащую жидкость жидкость получают как в примере 1. К стерильной ЭПО-содержащей жидкости с концентрацией ЭПО 3000 МЕ/мл при непрерывном перемешивании добавляют стерильные водные растворы 50 %-ной сахарозы до 3 % (по массе), 25 %-ной желатозы до 3 % (по массе), 10 % мочевины до 0,5 % (по массе) и 2%-ного хит озана до конечной концентрации 0,01 % (по массе). Полученную субстанцию рчЭПО разливают в эмалированные поддоны и замораживают при температуре минус (50-60) °С в течение 18 часов. Процесс образования нанокапсул описан в примере 3. Продукт лиофильно высушивают в течение 48 часов в стерильных условиях. Сухой полуфабрикат ЭПО смешивают с лактозой (до 25-37 % по массе), добавляют стеарат кальция до 2 %, из полученной массы прессуют таблетки двояковыпуклой формы. Полученная форма ЭПО обладает специфической активностью, при хранении в течение года при температуре (2-8) °С не теряет свою активность.
Пример 5. Получение нанокапсулированной формы ЭПО на основе пектина во флаконах (состав 3)
Стерильную ЭПО-содержащую жидкость получают как в примере 1. К стерильной ЭПО-содержащей жидкости с концентрацией ЭПО 5000 МЕ/мл при непрерывном перемешивании добавляют стерильные водные растворы 50 %-ной сахарозы до 3,5 % (по массе), 25 %-ной желатозы до 3,5 % (по массе), 10 % мочевины до 1 % (по массе) и 2 %- ного пектина до конечной концентрации 0, 1 %. Полученную субстанцию рчЭПО разливают во флаконы по 0,5-2 мл и замораживают при температуре минус (50-60) °С в течение 18 часов. Процесс образования нанокапсул описан в примере 3. Продукт лиофильно высушивают в течение 48 часов в стерильных условиях. После окончания сушки флаконы заполняют инертным газом (аргоном), укупоривают резиновыми крышками, завальцовывают колпачками. ЭПО в сухом виде при хранении в течение года при температуре (2-8) °С не теряет свою активность.
Пример 6. Получение нанокапсулированной формы ЭПО на основе коллидона в желатиновых капсулах (состав 4).
Стерильную ЭПО-содержащую жидкость получают как в примере 1. К стерильной ЭПО-содержащей жидкости с концентрацией ЭПО 8000 МЕ/мл при непрерывном перемешивании добавляют стерильные водные растворы 50 %-ной сахарозы до 5 % (по массе), 25 %-ной желатозы до 4,5 % (по массе), 10 % мочевины до 2 % (по массе) и 2%- ного коллидона до конечной концентрации 1 ,0 % (по массе). Полученную субстанцию рчЭПО разливают в эмалированные поддоны и замораживают при температуре минус (50-60) °С в течение 18 часов. Процесс образования нанокапсул описан в примере 3. Продукт лиофильно высушивают в течение 48 часов в стерильных условиях. Сухой полуфабрикат ЭПО фасуют в желатиновые капсулы в дозе 1 000-10 000 ME. Полученная форма ЭПО обладает специфической активностью, при хранении в течение года при температуре (2-8) °С не теряет свою активность.
Пример 7. Получение нанокапсулированной формы ЭПО на основе сополимера карбопола в таблетках (состав 5).
Стерильную ЭПО-содержащую жидкость жидкость получают как в примере 1. К стерильной ЭПО-содержащей жидкости с концентрацией ЭПО 10 000 МЕ/мл при непрерывном перемешивании добавляют стерильные водные растворы 50 %-ной сахарозы до 6 % (по массе), 25 %-ной желатозы до 5,5% (по массе), 10 % мочевины до 3 % (по массе) и 0,3 %-ный водный раствор карбопола до конечной концентрации 0,005% (по массе). Полученную субстанцию рчЭПО разливают в эмалированные поддоны и замораживают при температуре минус (50- 60) °С в течение 18 часов. Процесс образования нанокапсул описан в примере 3. Продукт лиофильно высушивают в течение 48 часов в стерильных условиях. Сухой полуфабрикат ЭПО смешивают с лактозой (до 25-37 % по массе), добавляют стеарат кальция до 2 %, из полученной массы прессуют таблетки двояковыпуклой формы. Полученная форма ЭПО обладает специфической активностью, при хранении в течение года при температуре (2-8) °С не теряет свою активность.
Пример 8. Определение специфической активности нанокапсулированной формы рч ЭПО in vitro. Специфическую активность рч ЭПО в нанокапсулированных препаратах определяют методом иммуноферментного анализа (ИФА). В основе метода ИФА лежит твердофазный (гетерогенный) вариант иммуноанализа, основанный на принципе «сэндвича». В качестве твердой фазы используют полистироловые 96-луночные стрипированные планшеты с иммобилизованными на их поверхности моноклональными антителами (МКАТ) к ЭПО. Анализ проводят в две стадии. На первой стадии калибровочные образцы с известной концентрацией, стандартный образец рч ЭПО (соЭПО) и исследуемые образцы рчЭПО, восстановленные в фосфатно-солевом буфере, наносят на планшет. Планшет помещают в термошейкер и инкубируют в течение 1 часа при температуре 37 °С и 700 об/мин. В ходе инкубации иммуносорбента с анализируемыми образцами происходит образование иммунных комплексов «МКАТ-ЭПО». На второй стадии, после удаления несвязавшегося материала, следует инкубация полученных комплексов с мечеными пероксидазой хрена МКАТ к ЭПО (конъюгатом) в течение 1 часа при 37 °С и 700 об/мин. В результате на поверхности носителя происходит присоединение к имеющимся комплексам «МКАТ-ЭПО» антител, меченых пероксидазой хрена. После удаления избытка конъюгата образовавшиеся иммунные комплексы «иммобилизованные МКАТ-ЭПО-конъюгат» выявляют цветной реакцией фермента с раствором перекиси водорода и тетраметилбензидина. Реакцию останавливают через 30 минут добавлением раствора серной кислоты. Результаты анализа регистрируют с помощью спектрофотометра, измеряя оптическую плотность в лунках в двухволновом режиме: основной фильтр - 450 нм, референс-фильтр - 620 нм. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации ЭПО в анализируемом образце. По результатам измерения строят калибровочный график зависимости оптической плотности от концентрации ЭПО в калибровочных образцах. Содержание ЭПО в анализируемых пробах определяют по калибровочному графику. Активность рчЭПО в образцах составляет 1 000- 10 000 ME, считая на одну дозу препарата без потери активности (составы 1-5).
Пример 9. Определение стабильности нано апсулированной формы рч ЭПО in vitro. Исследование стабильности нанокапсулированных препаратов рчЭПО в условиях желудочно- кишечного тракта проводят в соответствии с рекомендациями Государственной фармакопеи XI издания [ГФ XI, т.2, М., Медицина, 1989, с. 154-160]. Эксперимент состоит из двух этапов. На первом этапе для создания условий прохождения капсулами кислой среды желудка препараты ЭПО выдерживают 1 час в 0, 1 N соляной кислоте (рН=2). После чего, имитируя среду кишечника, рН раствора доводят 0,1 N гидроксидом натрия до 7,5-8,0 и выдерживают в течение 30 минут. Определение содержания ЭПО в препаратах до и после имитации условий желудочно-кишечного тракта проводят методом ИФА (см. пример N° 7). Потери при прохождении кислой и щелочной среды составляют 1,2-25,5 % в зависимости от полимера, использованного для образования капсул, и его концентрации. Наибольшей устойчивостью обладают препараты ЭПО, содержащие в своем составе альгинат натрия, карбопол 934 и пектин AU202.
Пример 10. Изучение специфической активности нанокапсулированной формы рч ЭПО in vivo
Специфическую активность нанокапсулированной формы ЭПО проверяют на белых мышах популяции ICR по изменению содержания ретикулоцитов, предшественников эритроцитов, в периферической крови. Самок мышей разделяют на группы по 6 животных и перорально вводят один из препаратов в дозе 40 МЕ/мышь в сутки в течение 4 дней (суммарная доза на мышь— 160 ME), на 5 день забирают кровь для исследования. В качестве отрицательного контроля используют группу мышей, получавших физиологический раствор, в качестве положительного контроля— мыши, получавшие не капсулированный препарат ЭПО. Пробы крови берут из орбитальной вены и делают мазки на предметном стекле, после чего окрашивают их по методу Паппенгейма-Крюкова. · Подсчет количества ретикулоцитов осуществляют под микроскопом, используя иммерсионный объектив. Количество ретикулоцитов обозначают в процентах по отношению к общему числу эритроцитов. Для вычисления этого процента в мазке крови подсчитывают подряд 1000 эритроцитов, отмечая среди них число ретикулоцитов, и найденное количество делили на 10.
Проверка специфической активности нанокапсулированной формы рчЭПО на мышах указывает увеличение содержания ретикулоцитов (на 1000 эритроцитов) в крови животных после перорального введения препаратов: исходное - 4,56%, на 5-й день для не капсулированного препарата ЭПО - 5,34 %, а для капсулированных препаратов от 6,19 % до 8,78 %, в зависимости от полимера и его концентрации.
Пример 11. Исследование нанокапсулированных препаратов рч
ЭПО методом атомно-силовой микроскопии
Структуру нанокапсулированных препаратов рчЭПО исследуют с помощью силовой атомной микроскопии. Сухой препарат из ампулы растворяют в дистиллированной воде в соотношении 1 : 100 по массе, после чего 10 мкл этого раствора смешивают с 90 мкл дистиллированной воды (рН=5) или с 90 мкл дистиллированной воды, подкисленной НС1 (рН=2). Каплю полученного раствора наносят на чистый свежий скол слюды площадью примерно 25 мм , высушивают при комнатной температуре, после чего снимают поверхность на атомно-силовом микроскопе Solver Р47 Bio в полуконтактном режиме.
В препарате не капсулированного рчЭПО как при рН 2, так и при рН 5 не наблюдается крупных частиц. Средний размер обнаруживаемых структур равен 10-15 нм, что сравнимо с размерами молекулы ЭПО. В препаратах рчЭПО с Carbopol 934 (0,005 %) средний размер частиц препарата в кислой среде (рН 2) составляет 20- 25 нм. Распределение по размеру было неравномерным, некоторые частицы достигали 70 нм. При снижении кислотности среды (рН 5) препарат образовывает на подложке фрактальные узоры, напоминающие лист папоротника. Средний размер капсул составляет 40-50 нм, более крупные образования достигают 70-80 нм. В препаратах рчЭПО с Kollidon 90F (0,05 %) образуются крупные круглые частицы размером порядка 100 нм, выстраивающиеся в цепочки и образующие фрактальные узоры. В препаратах рчЭПО с альгинатом натрия (0,005 %) образуются равномерные овальные капсулы со средним размером частиц в кислой среде (рН 2, рН 5) 15-20 нм.
Пример 12. Определение стабильности нанокапсулированной формы рч ЭПО методом режимного хранения
Стабильность нанокапсулированных препаратов рчЭПО определяют методом ИФА (см. пример N2 7) до и после 1 года хранения при температуре (2-8) °С. Изменение содержания рчЭПО в полимерных капсулах после хранения варьирует в пределах от 0,06 % до 10,34 % в зависимости от полимера. Поскольку для иммунобиологических препаратов допускается падение активности до 10 % можно утверждать, что нанокапсулированные препараты ЭПО стабильны в течение 1 года хранения при температуре плюс (2-8) °С.
Таким образом, из выше изложенного видно, что в предлагаемом изобретении достигается заявленный технический результат: упрощение технологии получения субстанции ЭПО, свободной от посторонних белковых примесей и пригодной для нанокапсулирования, а также упрощения технологии получения нанокапсулированной формы с размером частиц от 15 до 500 нм.
Промышленная применимость. В предлагаемом изобретении, пригодном для использования в медицине, по сравнению с известными аналогами обеспечивается получение субстанции ЭПО, свободной от посторонних белковых примесей и пригодной для нанокапсулирования, а также упрощается технология и возможность получения нанокапсулированной формы ЭПО с размером частиц от 15 до 500 нм, что подтверждается выше приведенными примерами 1-12.
Next Patent: CORROSION RESISTANT PRESSURE MODULE FOR PROCESS FLUID PRESSURE TRANSMITTER