Verfahren zur Spaltung von Rutinosiden

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Spaltung von Rutinosiden unter Gewinnung von Rhamnose und/oder den entsprechenden Agiyconen.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden als Rutinoside solche Verbindungen bezeichnet, die einen zuckerfreien Bestandteil enthalten, an welchen ein Rest der Formel (I)

über eine glykosidische Bindung gebunden ist. Beispielsweise handelt es sich bei den Rutinosiden um Flavonoide mit der in Formel (I) dargestellten bisglykosidischen Einheit. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden aus den Rutinosiden Rhamnose und/oder die entsprechenden Glucopyra- noside gewonnen. Die Glucopyranoside leiten sich von den Rutinosiden dadurch ab, dass sie anstelle des Rests der Formel (I) einen Rest der Formel (I*)

an den zuckerfreien Bestandteil gebunden enthalten, aus dem Molekül also Rhamnose abgespalten ist.

Rhamnose ist ein Monosaccharid, welches in der natur weitverbreitet, allerdings zumeist nur in geringen Mengen, vorkommt. Eine wichtige Quelle für Rhamnose sind z.B. die glykosidischen Rest natürlicher Flavonoide wie Rutin, aus welchen die Rhamnose durch Glykosidspaltung gewonnen werden kann. Rhamnose spielt beispielsweise eine wichtige Rolle als Ausgangsstoff für die Darstellung von künstlichen Aromastoffen wie Furaneol.

Der zuckerfreie Bestandteil der Flavonoide ist das sogenannte Aglycon. Isoquercetin ist beispielsweise ein Glykoside des Aglycons Quercetin (2-(3,4- Dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4H-1 -benzopyranon-4-on), welches sich von Flavon durch das Vorhandensein von fünf Hydroxylgruppen unterscheidet. Im Isoquercetin ist der Kohlenhydratrest Glucose an die Hydroxylgruppe in Position 3 des Quercentins gebunden. Isoquercetin wird z.B. als Quercetin-3-O-ß-D-glucopyranosid oder 2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3-(ß-D- glucopyranosyloxy)-5,7-diyhdroxy-4H-1-benzopyran-4-on bezeichnet.

Ein Beispiel für ein natürlich vorkommendes Flavonoid mit bisglykosidischer Einheit ist Rutin, welches folgende Strukturformel (III) besitzt:

Rutin ist wie Isoquercetin ebenfalls ein Glykosid des Aglycons Quercetin wobei der Kohlenhydratrest Rutinose an die Hydroxylgruppe in Position 3 des Quercetins gebunden ist. Der Kohlenhydratrest im Rutin besteht aus einer in 1- und 6-Stellung verknüpften Glucose- und einer terminal gebun-

denen Rhamnose- bzw. 6-Deoxymannose-Einheit. Rutin wird z.B. als Quercetin-3-O-ß-D-rutinosid oder 2-83,4-Dihydroxyphenyl)-3-{[6-O-(6- deoxy-α-mannopyranosyl)-ß-D-glucoyransoly]oxy}-5,7-dihyrox y-4H-1-ben- zopyran-4-on bezeichnet. Es ist jedoch beispielsweise auch unter den Namen Sophorin, Birutan, Rutabion, Taurutin, Phytomelin, Melin oder Rutosid bekannt.

Rutin bildet mit drei Molekülen Kristallwasser blassgelbe bis grünliche Nadeln. Wasserfreies Rutin hat die Eigenschaft einer schwachen Säure, wird ei 125 ⁰ C braun und zersetzt sich bei 214-215 J. Rutin, das in vielen Pflanzenarten - häufig als Begleiter des Vitamin C - vorkommt, z.B. in Zitrus-Arten, in gelben Stiefmütterchen, Forsythien-, Akazienarten, verschiedenen Solanum- und Nicotiana-Arten, Kapern, Lindenblüten, Johanniskraut, Tee usw. wurde 1842 aus der Gartenraute (Ruta graveolens) isoliert. Rutin kann auch aus den Blättern des Buchweizens und der ost- asiatischen Färberdroge Wei-Fa (Sophora japonica, Fabaceae), die 13- 27 % Rutin enthält, gewonnen werden.

Aus den oben genannten Gründen ist es wünschenswert, sowohl Rhamnose als auch Aglycone von Flavonoiden aus natürlichen Rohstoffen, bei- spielsweise aus Flavonoiden mit einer bisglykosidischen Einheit, herzustellen. In diesem Zusammenhang ist z.B. die Spaltung von Rutinosiden zu Rhamnose und den entsprechenden Aglyconen interessant.

Enzymatisch katalysierte Darstellungen von Rhamnose sind in der Literatur beschrieben. Beispielsweise wird in der EP 0 317 033 ein Verfahren zur Hersteilung von L-Rhamnose beschrieben, wobei dir rhamnosidische Bindung von Glykosiden, die Rhamnose in terminaler Position gebunden enthalten, durch enzymatische Hydrolyse erreicht wird.

Weiterhin sind enzymatisch katalysierte Spaltungen von Rutin beispielsweise auch in der JP 01213293 beschrieben.

Die Verwendung immobilsierter Enzyme zur Spaltung von Rutin ist aus WO 01/59143 bekannt. Die Verwendung von Lösungsmittelgemischen aus WO 00/26400.

Demnach besteht Bedarf nach alternativen Verfahren zur Spaltung von Rutinosiden.

Es bestand daher die Aufgabe, ein Verfahren zur Spaltung von Rutinosiden unter Gewinnung von Rhamnose und/oder den entsprechenden Aglyconen zur Verfügung zu stellen.

Es wurde nun gefunden, dass diese Aufgabe gelöst wird, wenn das Verfahren zur Spaltung von Rutinosiden unter Gewinnung von Rhamnose und/oder den entsprechenden Aglyconen unter Verwendung von Hefe durchgeführt wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich insbesondere dadurch aus, dass die Spaltung von Rutinosiden zu Rhamnose und den entsprechenden Aglyconen mit hoher Selektivität erfolgt. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden vorzugsweise Rhamnose und die Aglycone durch geeignete Aufarbeitung gewonnen. Ferner können nach dem erfindungsgemäßen Verfahren aber auch entweder nur Rhamnose oder nur die Aglycone durch geeignete Aufarbeitung gewonnen werden.

Weiter handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren um ein einfach durchzuführendes und durch den Einsatz von Hefe, insbesondere auch billiges Verfahren zur Herstellung von Rhamnose und/oder den entsprechenden Aglyconen aus Rutinosiden. Durch die Möglichkeit in diesem Verfahren ausschließlich mit Naturprodukten zu arbeiten, ist das Verfahren darüber hinaus außerordentlich umweltverträglich.

Die vorliegende Erfindung stellt ein vorteilhaftes Verfahren zur enzymati- schen Spaltung von Rutinosiden unter Gewinnung von Rhamnose und/oder den entsprechenden Aglyconen zur Verfügung. Nach einem bevorzugten Verfahren wird das Rutinosid mit einer katalytischen Menge der Hefe in Wasser gespalten. Vorzugsweise wird die Reaktion unter guter Durchmischung, z.B. durch Rühren, durchgeführt.

Geeignete Rutinoside für das erfindungsgemäße Verfahren sind z.B. Rutinoside, die als zuckerfreien Bestandteil oder Aglycon einen 2-Phenyl- 4H-1-benzopyran-4-on-Grundkörper enthalten, der in Position 3 einen Rest der Formel (I) trägt und dessen Phenylgruppen abgesehen von der Position 3 auch ein- oder mehrfach durch -OH oder -0-(CKb) _n -H, wobei n aus dem Bereich von 1 bis 8 ausgewählt ist, wobei n vorzugsweise 1 bedeutet, substituiert sein können.

Die Substitution des 2-Phenyl-4H-1-benzopyran-4-on-Grundkörpers durch -OH und/oder -O-(CH ₂ ) _n -H tritt bevorzugt in den Positionen 5, 7, 3 ¹ und/oder 4' auf.

Besonders bevorzugte Rutinoside entsprechen der Formel (IV)

worin R H (Kämpferolrutinosid), OH (Rutin) oder OCH ₃ (Isorhamnetin- rutinosid) bedeutet. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können aus Kämpferolrutinosid Rhamnose und Kampferöl, aus Rutin Rhamnose und Quercetin und aus Isorhamnetinrutinosid Rhamnose und Isorhamnetin erhalten werden. Insbesondere bevorzugt wird das Rutinosid Rutin verwendet.

Das erfindungsgemäße Verfahren benötigt keine hochreinen Edukte. Beispielsweise können auch Gemische von Rutinosiden für das erfiπdungs-

gemäße Verfahren verwendet werden, die Reaktion gelingt z.B. auch dann, wenn das Edukt mit anderen Flavonoiden verunreinigt ist. Sie kann z.B. auch mit Mutterlaugenrückständen der Rutinproduktion durchgeführt werden.

Im erfindungsgemäßem Verfahren können dabei an sich alle Hefen eingesetzt werden. Unter dem Begriff Hefe im Sinne der vorliegenden Anmeldung fallen alle an sich bekannten Hefezellen, so zum Beispiel Zellen aus den Stämmen Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces delbrueckii, Saccharomyces rosei, Saccharomyces microellipsodes, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces bisporus, Saccharomyces fermentati, Saccharomyces rouxii, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces polysporus, Candida albicans, Candida cloacae, Candida tropicalis, Candida utilis, Hansenula wingei, Hansenula ami, Hansenula henricii, Hansenula americana, Hansenula canadiensis, Hansenula capsulata, Hansenula polymorpha, Pichia kluyveri, Pichia pastoris, Pichia polymorphe, Pichia rhodanensis, Pichia ohmeri, Torulopsis bovina, Torulospsis glabrata und insbesondere Bäckerhefe.

Entsprechend sind die Verwendung von Hefe zur Spaltung von Rutinosiden bzw. zur Herstellung von Rhamnose bzw. zur Herstellung von Rutinosid- Aglyconen, wie insbesondere Kampferöl, Quercetin und/oder Isorhamnetin weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung.

Geeignete Reaktionstemperaturen für das erfindungsgemäße Verfahren sind Temperaturen zwischen 15 und 80 ⁰ C. Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren bei Reaktionstemperaturen von 25 bis 50 ⁰ C durchgeführt, insbesondere bei Reaktionstemperaturen von 30 bis 45 ⁰ C.

Wenn die Reaktionstemperatur zu niedrig ist. läuft die Reaktion mit einer unangemessenen langsamen Reaktionsgeschwindigkeit ab. Wenn die Reaktionstemperatur dagegen zu hoch ist, werden die Hefen deaktiviert. Dementsprechend wird die Reaktionstemperatur vorzugsweise nahe der optischen Arbeitstemperatur der gewählten Hefe gewählt.

Geeignete pH-Werte für das erfindungsgemäße Verfahren sind pH-Werte zwischen 3 und 8. Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren bei pH-Werten von 4,5 bis 7 durchgeführt, insbesondere bei pH-Werten von 4,8 bis 6,8. Weiterhin bevorzugte pH-Werte können jedoch je nach verwendete Hefen innerhalb der gegebenen Grenzen variieren. Beispielsweise sind pH- Werte von 6,4 bis 6,8 ganz außerordentlich bevorzugt.

Vorzugsweise wird das Verfahren derart ausgeführt, dass der pH-Wert mit Hilfe eines Puffer-Systems eingestellt wird. Prinzipiell können alle gängigen Puffer-Systeme, die zur Einstellung der oben genannten pH-Werte geeignet sind, verwendet werden. Bevorzugt wird jedoch wässriger Zitrat-Puffer verwendet.

Vorzugsweise werden die bevorzugten Temperatur- und pH-Bereiche kombiniert, d.h. die Reaktion wird vorzugsweise bei einer Reaktionstem- peratur von 15 bis 80 ⁰ C und bei einem pH-Wert von 3 bis 8, besonders bevorzugt bei einer Raumtemperatur von 25 bis 50 ⁰ C und bei einem pH- Wert von 4,5 bis 7 und insbesondere bevorzugt bei einer Reaktionstemperatur von 30 bis 45 ⁰ C und bei einem pH-Wert von 4,8 bis 6,8 durchgeführt.

Geeignete Gewichtsverhältnisse Rutinosid : Wasser für das erfindungsgemäße Verfahren sind Verhältnisse von 0,001 : 99,999 bis 40 : 60. Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren mit Gewichtsverhältnissen Rutinosid : Wasser von 0,005 : 99,995 bis 25 : 75 durchgeführt, insbesondere mit Gewichtsverhältnissen von 9,5 : 99,5 bis 20 : 80.

Geeignete Gewichtsverhältnisse Hefe : Rutinosid für das erfindungsgemäße Verfahren sind Verhältnisse von 0,005 : 99,995 bis 50 : 50. Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren mit Gewichtsverhält- nissen Hefe : Rutinosid von 0,5 : 99,5 bis 30 : 70 durchgeführt, insbesondere mit Gewichtsverhältnissen von 2 : 98 bis 20 : 80.

Gegebenenfalls kann das Wachstum der Hefen mittels Nährsalzen und

Sauerstoffzufuhr gefördert werden.

Das Fortschreiten bzw. das Ende der Reaktion kann z.B. mittels Dünnschichtchromatographie (DC) kontrolliert werden.

Nach beendeter Reaktion besteht das Reaktionsgemisch hauptsächlich aus Wasser, gegebenenfalls Puffer (z.B. Natriumzitrat), Hefe, gegebenenfalls geringen Mengen an nicht umgesetztem Rutinosid, Rhamnose, Aglycon des

Rutinosids und gegebenenfalls geringen Mengen an Glucopyranosid. Ebenfalls bei der Umsetzung entstehende Glucose wird von der Hefe verstoffwechselt. Die Isolierung der gewünschten Reaktionsprodukte Rhamnose und Aglycon erfolgt nach gängigen Methoden. Unter „üblicher Aufarbeitung" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorzugsweise folgendes Verstanden:

Das als Feststoff ausgefallene Aglycon wird vom restlichen Reaktionsgemisch abgetrennt, beispielsweise durch Absaugen bzw. Filtration unter vermindertem Druck oder durch Abschleudern der ausgefallenen Kristalle. Anschließend wird der Feststoff gewaschen, vorzugsweise mit Wasser, und danach getrocknet. Die Reinheit des erhaltenen Aglycons bei Einsatz von reinem Rutinosid ist üblicherweise größer als 94 %. Zur weiteren Reinigung kann es beispielsweise aus geeigneten Lösungsmitteln umkristallisiert werden, z.B. aus Wasser oder aus Lösungsmittelgemischen bestehend aus Toluol und Methanol oder bestehend aus Wasser und Essigsäuremethylester.

Im Filtrat verbleiben Wasser, gegebenenfalls Puffer, Hefe, gegebenenfalls geringe Mengen Rutinosid sowie das gewünschte Reaktionsprodukt Rhamnose.

Die Isolierung der im Filtrat verbliebenen Rhamnose kann durch bekannte Verfahren erreicht werden, beispielsweise durch Ultrafiltration, durch überleiten des Filtrats über Kationen- und/oder Anionenaustauscher, durch Kristallisation und durch mechanische Abtrennung wie z.B. Filtration oder Ausfällung mit Alkoholen.

Die in den Aufarbeitungsschritten angefallenen Substanzen können rezirkuliert und somit für weitere Umsetzungen verwendet werden.

Die Analyse der Reaktionsprodukte kann durch HPLC erfolgen, z.B. unter Verwendung von Standard-HPLC-Geräten und Säulen enthaltend Reversed-Phase-Materialien mit C-is-Alkyl-Belegung.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung verdeutlichen. Sie sind jedoch keinesfalls als limitierend zu betrachten.

Beispiele

Die Reaktionskontrolle erfolgt mittels Dünnschichtchromatographie (DC) und die Analyse der Reaktionsprodukte mittels HPLC.

DC-Bedinqunqen:

DC-Fertigplatten: Kieselgel 60 (Merck KGaA, Artikel-Nr. 105719)

Eluent: Gemisch aus Essigsäureethylester : Ethylmetyl- keton : Ameisensäure : Wasser : 1-Butanol im Volumenverhältnis 50 : 30 : 10 : 10 : 5 Sprühreagenz: lodschwefelsäure

Detektion: UV-Licht (254 nm)

R _f -Werte: Rutin: 0,38

Isoquercetin: 0,61 Quercetin: 0,96.

HPLC-Bedingunqen bei Verwendung einer Standard-HPLC-Anlage:

Kartusche: LiChroCART ^® 250/4 mit

Säule: LiChroSORB ^® RP 18 (Reversed-Phase-Material mit

C ₁₈ -Alkyl-Belegung und einer Körngröße von 5 μm (Merck KGaA, Artikel-Nr. 151355))

Eluent: Gemisch aus Acetonitril und Wasser im Volumenverhältnis 20 : 80 (pH 2; gepuffert mit NaH ₂ PO ₄ • H ₂ O/H ₃ PO ₄ )

Fluss: 1 ml/min

Wellenlänge: 260 nm

Temperatur: 3O ⁰ C

Probenvolument: 10 μl

Probenvorbereitung: 5 mg der Probe in 3 ml Methanol lösen und mit dem Eluent auf 10 ml auffüllen

Retentionszeiten: Rutin: 7-7,5 min

Isoquercetin: 8,5-9 min

Quercetin: 40-43 min.

HersteSIbeϊspϊel

200 mg Rutin werden in 200 ml Wasser mit Bäckerhefe (10,5g) versetzt und mehrere Tage bei 40 ⁰ C an Luft stehen gelassen. Nach 4 Tagen wird eine HPLC-Analyse der Reaktionslösung durchgeführt. Rutin ist nicht mehr nachweisbar. Der Feststoffanteil wird über einen Faltenfilter abfiltriert und HPLC-analytisch untersucht. Er besteht aus 95 % Quercetin.