СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОГО ЭЛЕМЕНТА ИММУНОСЕНСОРА НА ОСНОВЕ ЯВЛЕНИЯ ПОВЕРХНОСТНОГО ПЛАЗМОННОГО РЕЗОНАНСА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО

РОГАТОГО СКОТА

Область техники

Предложенное изобретение относится к способам производства чувствительных элементов иммуносенсоров для диагностики состояния здоровья крупного рогатого скота. Известно, что возбудителем лейкоза крупного рогатого скота (ЛКРС) является вирус типа С семейства Retroviridae, подсемейства Oncoviridae [1], который имеет близкое генетическое и антигенное родство с вирусом Т-клеточного лейкоза человека типов 1 и 2 и Т- кпеточного лейкоза обезьян [2].

Предшествующий уровень техники

Вирус лейкоза, кроме ревертазы содержит 6 белков, из которых определяющими являются поверхностный (капсидный) гликопротеид др51 и внутренний белок р24. Эта болезнь может передаваться разными путями и за короткое время одно больное животное может стать угрозой для всего поголовья. Лечение больных лейкозом животных не проводят, их подвергают вынужденному забою [1 ,2].

Предложенное изобретение может быть использовано в ветеринарной медицине для неинвазивной экспрессной диагностики ЛКРС.

С целью диагностики инфекционных болезней широко применяется серологическая диагностика для определения антигенов и антител [3]. В частности, такой подход используется для диагностики ЛКРС [1 , 2] с использованием реакции иммунодиффузии в агаровом геле (РИД) и иммуноферментного анализа (ELISA).

Недостатком метода РИД является недостаточно высокая чувствительность (в пределах 5-50 мкг / см ³ ) и значительная продолжительность выполнения анализа (2-3 суток) в условиях стационарной лаборатории. Известны различные модификации метода ELISA [4]. Процедура диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом ELISA включает адсорбцию антигена на поверхности полистиролового планшета (чувствительного элемента для этого метода) из расчета 0,1 см ³ раствора антигена на лунку (раствор антигена готовят в 0,1 М фосфатном буфере с pH 7,8) в течение 1часа при температуре 37°С. Способ позволяет определить 1-10 нг / см ³ специфического белка.

Недостатками данного метода является высокая стоимость тест-систем, которые, к тому же, не производятся в Украине, и высокая трудоемкость. Поэтому метод ELISA имеет высокую стоимость анализа.

Известен также способ диагностики вируса лейкоза КРС, предусматривающий определение фрагмента env-гена вируса лейкоза (полимеразная цепная реакция, ПЦР) с использованием праймеров следующей последовательности: BIV1 5 '- GAA TGT GAA САС ТТА ACT GCA АТА-3' и BIV2 5 ААТ GTC GGA СТА CAG ТСТ ТСС - 3', характеризующихся 100% степенью гомологии [5]. Этот способ обеспечивает высокую чувствительность и специфичность детекции вируса КРС.

Недостатком этого метода является то, что он требует сложной предварительной подготовки образцов к анализу, дорогостоящих расходных материалов и оборудования для диагностики, что обусловливает высокую стоимость анализа.

Также известен способ неинвазионной диагностики лейкоза крупного рогатого скота [6] с помощью иммуносенсорного анализа на основе поверхностного плазмонного резонанса (ППР). С помощью данного метода в сыворотке молока коров определяют наличие антител к белкам р24, рд51 вируса лейкоза КРС, присутствие которых указывает на наличие болезни у животного. Взаимодействие антигенов (белки р24 и др51 вируса лейкоза КРС) со специфическими к ним антителами, регистрируется по изменению резонансного угла отражения, обусловливает возможность мониторинга процесса связывания антигена с антителом в реальном времени. Авторы способа используют вариант конструкции ППР-сенсора, где физическим преобразователем оптического сенсора является тонкая золотая пленка, которая расположена между двумя средами с разным коэффициентом преломления - стеклом и исследуемым раствором. Слой золота толщиной 45 нм напыляют (термическое испарение в вакууме, 10-3 Па) на поверхность стеклянной пластинки, которая предварительно обработана в смеси перекиси водорода и серной кислоты в соотношении 1 : 3. Последняя сочетается с призмой ППР-сенсора с помощью иммерсионной жидкости (полифенилового эфира) с показателем преломления 1 ,61. Согласно этому способу, тестирования сывороток молока на наличие в них антител, специфичных к белкам др51 и р24 вируса, проводят следующим образом. Сначала регистрируют резонансный угол при введении в измерительную ячейку (объемом 10 мкл) буферного раствора. Затем ячейку наполняют раствором специфического антигена, выдерживают его там в течение 20 минут при температуре (20 ± 5)°С, промывают ячейку для удаления избытка антигена, который не адсорбировался на поверхности сенсора. Для предотвращения дальнейшего неспецифического связывания компонентов антигена, свободные места связывания на поверхности сенсора блокируют с помощью 1% раствора БСА (бычий сывороточный альбумин), который вносят в ячейку, выдерживают 10 минут при температуре (20 ± 5)°С , после чего ячейку промывают и регистрируют показания прибора.

Преимуществами этого метода является отсутствие процедуры подготовки образцов к анализу и невысокая стоимость анализа. Кроме того, метод ППР позволяет определять взаимодействие антиген-антитело в реальном времени.

Недостатком этого метода является неоднородность чувствительного слоя сенсора, что приводит к неполному взаимодействию по всей поверхности плоскости. Причиной неоднородности является, в первую очередь, неоднородность сформированного напылением испаряемого в вакууме золотого слоя. Поэтому неоднородность поверхностного чувствительного слоя сенсора изменяется от образца к образцу, снижает точность измерения.

Наиболее близким техническим решением, принятым за прототип является способ диагностики лейкоза КРС[7], по которому с помощью иммуносенсорного анализа на основе ППР в сыворотке молока коров определяют наличие антител к белкам р24, рд51 , присутствие которых указывает на наличие болезни у животного, при котором иммобилизацию указанных белков проводят приведением в контакт их раствора с поверхностью наноразмерной пленки золота чувствительного элемента, которая предварительно была отожженная при температуре 100-140°С в течение 10-40 мин и / или облученная ультрафиолетом с длиной волны 205-315 нм в течение 10-40 мин. Наноразмерная пленка золота на поверхности стеклянной подложки чувствительного элемента формируется так же, как и в способе [6] термическим испарением в вакууме (10 ³ Па).

Такой метод прост в реализации, не требует дорогостоящих исходных материалов и поэтому дешевле аналогов. Важным преимуществом предложенного метода является то, что его можно осуществлять на оборудовании, производимом в Украине (приборы серии "Плазмой", разработчик и производитель Институт физики полупроводников им. Лашкарёва НАН Украины).

Недостатком прототипа является то, что для каждого диагностирования болезни у животного необходимо готовить специальный раствор, который содержит белки р24, рд51 вируса лейкоза КРС, что замедляет процесс диагностирования и создает трудности при работе в полевых условиях в животноводческих хозяйствах. Кроме того, непосредственная иммобилизация белков на поверхность наноразмерной пленки золота приводит к снижению чувствительности иммуносенсорного анализа на основе ППР и уменьшению повторяемости полученных результатов из-за наличия неспецифического взаимодействия белков р24, рд51 вируса лейкоза с антителами к другим вирусам или органическими соединениями, присутствующими в сыворотке. Причина неспецифического взаимодействия: невозможность контакта активных центров белков вируса лейкоза с центрами антител из-за неправильного пространственного расположения на поверхности наноразмерной пленки. Поэтому эти белки являются специфически неактивными. Пространственное расположение белков вируса при непосредственной иммобилизации является хаотичным, поэтому площадь поверхности наноразмерной пленки золота с неактивными белками вируса варьируется для каждого образца чувствительного элемента, что дополнительно снижает повторяемость результатов диагностики.

Раскрытие изобретения

Задачей предлагаемого изобретения является создание удобного способа изготовления чувствительного элемента, который позволит повысить чувствительность иммуносенсорного анализа на основе ППР, удобство и производительность анализа.

Поставленная задача достигается тем, что предлагается способ изготовления чувствительного элемента иммуносенсора на основе явления поверхностного плазмонного резонанса для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, по которому на стеклянную пластину в вакууме наносят золотую пленку толщиной 50 ± 5 нм, отжигают при температуре 100 ... 140°С в течение 10 ... 40 мин. и / или облучают золотую пленку чувствительного элемента ультрафиолетом с длиной волны 205 ... 315 нм в течение 10 ... 40 мин, который отличается тем, что чувствительный элемент после отжига и / или облучения его золотой пленки погружают в герметичной емкости из политетрафторэтилена или стекла в смесь двух спиртовых растворов при соотношении спиртовых растворов, % об .:

первый спиртовой раствор 18-22

второй спиртовой раствор остальное со следующим соотношением компонент в каждом, мг/см ³ :

в первом спиртовом растворе:

11-меркаптоундекановая кислота 0, 7-1 ,1 абсолютный (100%об.) этиловый или метиловый спирт остальное во втором спиртовом растворе:

11-меркаптоундеканол 0,15-0,25 абсолютный (100%об.) этиловый или метиловый спирт остальное и выдерживают в смеси при температуре 40 ± 5°С в течение 6 ... 10 часов, промывают поверхность сначала абсолютным метиловым или этиловым спиртом, затем дистиллированной или деионизированной водой, затем погружают чувствительный элемент в смесь двух водных растворов при соотношении водных растворов, %об.:

первый водный раствор 45-55

второй водный раствор остальное со следующим соотношением компонент в каждом, мг/см ³ :

в первом водном растворе:

М-этила-М'-(диметиламинопропил)ка рбодиимида гидрохлорид 47-77 бидистилированная или деионизированная вода остальное во втором водном растворе: N-гидроксисуксинимид 9-14

бидистилированная или деионизированная вода остальное и выдерживают в этой смеси 10 ... 20 минут при температуре 25 ± 10°С, далее промывают погружением в физиологический раствор, после чего на влажную поверхность чувствительного элемента наносят 50 ... 150 микролитров физиологического раствора с инактивированным вирусом концентрацией 10 ... 100%, далее чувствительный элемент выдерживают при температуре 30 ± 15°С в течение 30 ... 80 минут, после чего операцию промывки повторяют погружением чувствительного элемента в бидистиллированную или деионизированную воду на 5 ... 10 минут с последующим его высушиванием в течение 30 ... 80 минут при комнатной температуре, после чего чувствительный элемент кладут на хранение при температуре 4 ± 3°С в холодильник.

Благодаря процедуре выдержки чувствительного элемента в растворе смеси меркаптанов 11-меркаптоундекановой кислоты и 11-меркаптоундеканола в абсолютном этиловом или метиловом спирте и затем в смеси водных растворов N-3tpp-N '- (диметиламинопропил) карбодиимида гидрохлорида и N- гидроксисуксинимида с последующей промывкой физиологическим раствором на поверхности наноразмерной золотой пленки образуется однородный слой активированных алкантиолов, на вирус иммобилизуется таким образом, что на поверхности чувствительного элемента площадью более 90% он является специфически активным. Это обеспечивает специфическое взаимодействие пары антиген-антитело и увеличение чувствительности и повторяемости результатов иммуносенсорного анализа по сравнению с прототипом. При концентрациях 11-меркаптоундекановой кислоты и 11-меркаптоундеканола меньше 0,7 мг / см ³ и 0,15 мг / см ³ , на поверхности наноразмерной золотой пленки образовывался неоднородной слой активированных алкантиолов, что вело к неспецифическому взаимодействию как в прототипе, что снижает чувствительность и повторяемость результатов иммуносенсорного анализа. При концентрациях, превышающих 1 ,1 мг / см ³ и 0,25 мг / см ³ , на поверхности наноразмерной золотой пленки образуется многослойное неоднородное покрытие из алкантиолов, которое активируется не по всей поверхности, что уменьшает процент иммобилизованных вирусов и как следствие, снижает чувствительность иммуносенсорного анализа.

Осуществление изобретения Применяется именно такие соотношение спиртовых растворов 11- меркаптоундекановой кислоты и 11-меркаптоундеканола, так как именно при таком соотношении формируются алкантиолы. Отклонение от этого соотношения как в большую, так и в меньшую стороны вызывает резкое уменьшение объема сформированных алкантиолов при постоянном объеме исходных веществ, что снижает чувствительность иммуносенсорного анализа. Применение абсолютных спиртов (стопроцентных) и герметичной емкости из инертного материала обусловлено тем, что попадание влаги или продуктов химического взаимодействия абсолютных спиртов со стенками емкости при формировании алкантиолового покрытия вызывает разрушение этого покрытия, что снижает чувствительность и повторяемость результатов иммуносенсорного анализа. Применяются именно этиловый или метиловый спирты, поскольку высшие спирты, как пропиловый, бутиловый и т.д., не способны растворять меркаптаны к ионам, в результате чего на поверхности чувствительного элемента не проходит реакция образования алкантиолов, что снижает чувствительность иммуносенсорного анализа. При температуре меньше 35°С процесс формирования алкантиолового покрытия продолжается более 24 часов, что снижает производительность проведения анализа, а при температуре выше 45°С исходные вещества реагенты разрушаются и алкантиоловий слой не формируется, что снижает чувствительность иммуносенсорного анализа. Заявленная продолжительность выдержки чувствительного элемента в спиртовом растворе меркаптанов обусловлена необходимостью формирования однородного слоя. Так, при выдержке меньше 6 часов, на поверхности чувствительного элемента формируется неоднородный слой, что уменьшает чувствительность иммуносенсорного анализа, а выдержка более 10 часов уменьшает производительность анализа. При концентрациях растворов М-этил-N '- (диметиламинопропил) карбодиимида гидрохлорида и N-гидроксисуксинимида в дистиллированной воде меньших 47 мг / см ³ и соответственно 9 мг / см ³ , на поверхности наноразмерного слоя золота алкантиолы не активируются, что ведет к невозможности иммобилизации вируса. При концентрациях, превышающих 77 мг / см ³ и 14 мг / см ³ на поверхности алкантиолов наноразмерной золотой пленки остаются не связанные между собой ионы N-3tpp-N (диметиламинопропил) карбодиимида гидрохлорида и N-гидроксисуксинимида, что уменьшает процент иммобилизованных вирусов, снижает чувствительность иммуносенсорного анализа, как и в предыдущем случае с меркаптанами. Для активации поверхности необходимо выдерживать чувствительный элемент не менее 10 минут, поскольку за меньший промежуток времени поверхность чувствительного элемента полностью не активируется, что уменьшит чувствительность иммуносенсорного анализа. Выдержка более 20 минут уменьшает производительность анализа. Активацию выполняют при температуре 25 ± 10°С. При температуре ниже 15°С реакция между N-3tpp-N '- (диметиламинопропил) карбодиимида гидрохлорид и N-гидроксисуксинимидом не происходит, а при температуре выше 35°С N-QTHP-N'

(диметиламинопропил) карбодиимида гидрохлорид разрушается, поэтому в обоих случаях активация поверхности не происходит, что снижает чувствительность иммуносенсорного анализа. Применяют раствор инактивированного вируса лейкоза КРС в физиологическом растворе, чтобы уменьшить вязкость исходного вируса для более равномерного его растекания на поверхности чувствительного элемента после нанесения. Кроме того уменьшение вязкости позволяет уменьшить объем вирус-содержащей жидкости для нанесения. Концентрация раствора, меньше 10% существенно замедляет реакцию иммобилизации вируса, что уменьшает производительность анализа. Вирус-содержащую жидкость наносят в объеме 50 ... 150 микролитров, чтобы покрыть всю поверхность чувствительного элемента. При объеме, меньшем 50 мкл, поверхность будет покрыта не полностью, что уменьшит чувствительность иммуносенсорного анализа, а при объеме более 150 мкл жидкость попадет за пределы чувствительного элемента, что уменьшает удобство и производительность анализа. Чувствительный элемент с нанесенной вирус- содержащей жидкостью выдерживают в течение 30 ... 80 минут. При длительности выдержки менее 30 минут вирус иммобилизуется не по всей поверхности, что приводит в дальнейшем к неспецифическому взаимодействию. Выдержка более 80 минут нецелесообразна, поскольку не дает полезного эффекта и приводит к расходам исследовательских веществ и времени. Следующей операцией является промывание чувствительного элемента путем погружения в дистиллированную воду в течение 5 ... 10 минут. Промывка продолжительностью менее пяти минут не очищает поверхность от излишков вируса, а более 10 минут не улучшает результат промывки, а только увеличивает затраты времени. Процедуры промывания выполняют погружением чувствительного элемента в соответствующий буферный раствор (физиологический раствор или дистиллированную воду), а не смывом, так как смывание может повредить органические слои на поверхности наноразмерной золотой пленки из-за давления промывающего раствора. Промывку перед высушиванием выполняют именно дистиллированной водой, а не физиологическим раствором, так как при высушивании физиологического раствора на поверхности чувствительного элемента остаются кристаллы хлорида натрия, что уменьшает площадь поверхности взаимодействия антиген- антитело. Высушивание выполняют в ламинарном шкафу при комнатной температуре в течение 30 ... 80 минут. При продолжительности менее 30 минут, поверхность чувствительного элемента с иммобилизованным вирусом не успевает высушиться и при последующем хранении в холодильнике оставшаяся вода, будет разрушать поверхность чувствительного элемента, что уменьшит чувствительность иммуносенсорного анализа, а высушивание продолжительностью более 80 минут уменьшает производительность анализа. После высушивания чувствительный элемент с иммобилизованным вирусом кладут на хранение в холодильник при температуре 4 ± 3°С. При температуре выше 7°С, вирус на поверхности чувствительного элемента теряет активность, а при температуре ниже 1 °С, начинает разрушаться наноразмерный слой золота вследствие замерзания конденсированной влаги, что в обоих случаях снижает чувствительность. Охлаждение после высушивания до комнатной температуры нужно для того, чтобы при размещении его в холодильнике на поверхности наноразмерной золотой пленки образовалась как можно меньше конденсата вследствие резкого перепада температур. (Примечание: Приведенные числовые показатели и параметры были получены при экспериментальных исследованиях).

Принципы детектирования и определения концентрации адсорбированных молекул на основе явления поверхностного плазмонного резонанса (ППР), то есть возбуждения колебаний электронов проводимости (поверхностных плазмонов, поверхностных поляритонов или поверхностных плазмон-поляритонов) в тонкой электропроводной пленке с помощью электромагнитной (световой) волны рассматриваются в статье [8]. Для возбуждения поверхностных плазмонов авторами этой работы в качестве оптически более плотной среды использовалось стеклянная призма полного внутреннего отражения с нанесенной на ее основание металлической пленкой определенной толщины (в случае золотой, серебряной или медной пленки эта толщина должна быть порядка 40 нм). Поверхность пленки находилась в контакте с менее плотной внешней средой (воздух, вода), содержащей в себе примеси определяемого вещества. В результате этого контакта определяемое вещество, адсорбировалось на поверхности металлической пленки, создавая молекулярный слой. Возбуждение поверхностных плазмонов осуществлялось лучом света, падающим со стороны призмы на поверхность металлической пленки. Угол падения света мог меняться путем поворота призмы. Экспериментально измерялось уменьшение интенсивности отраженного излучения за счет поглощения падающего излучения как следствие преобразования энергии электромагнитной волны в энергию поверхностных плазмонов. Зависимость интенсивности отраженного излучения от угла падения электромагнитной волны на поверхность пленки (кривая плазмонного резонанса), имеет минимум при определенном угле падения (угол плазмонного резонанса). Форма кривой плазмонного резонанса и, в частности, положение минимума, зависят от показателя преломления призмы, оптических постоянных и толщины электропроводящей пленки, оптических постоянных внешней среды, которая находится с противоположной стороны по отношению к падающему и отраженному излучению, и от оптических параметров и толщины слоя молекул, которые находятся на/или вблизи внешней поверхности пленки.

Иммуносенсорный анализ при контроле заболевания крупного рогатого скота лейкозом предусматривает использование уже предварительно изготовленных чувствительных элементов по заявляемому способу и включает только операцию определения антител в сыворотке крови. Зато иммуносенсорный анализ, согласно прототипу, дополнительно включает иммобилизацию белков р24, рд51 вируса лейкоза крупного рогатого скота, приведением в контакт вирус-содержащего раствора с поверхностью наноразмерной пленки золота. Таким образом, предложенный способ позволяет проводить иммуносенсорный анализ с меньшим количеством операций, повышает удобство и производительность труда при контроле заболевания крупного рогатого скота лейкозом. Результаты проведенного иммуносенсорного анализа по определению антител к вирусу лейкоза в сыворотке молока коров с применением чувствительных элементов, изготовленных по предложенному способу и по способу, указанному в прототипе, показали, что применение чувствительного элемента, изготовленного по предложенному способу в 8 ... 10 раз повышает чувствительность иммуносенсорного анализа.

Предложенные операции и оборудование не являются дорогостоящими.

Общий положительный эффект предложенного технического решения заключается в повышении чувствительности иммуносенсорного анализа в 8 ... 11 раз (в зависимости от концентрации антител в сыворотке), удобстве и производительности анализа.

Новизна предложенного изобретения обусловлена совокупностью известных и впервые предложенных составляющих и признаков этого технического решения.

Промышленная применимость

Пример реализации.

Контроль состояния здоровья крупного рогатого скота и выявление заболевания лейкозом осуществляли неинвазивным способом с использованием, в качестве биологического материала сыворотки молока, как и в прототипе. Эксперименты проводили, используя два чувствительных элемента с наноразмерным слоем золота толщиной 50 ± 2 нм, которые отжигали при температуре 120 ± 5°С в течение 30 минут в атмосфере воздуха с последующим охлаждением до комнатной температуры в соответствии с прототипом. Затем готовили чувствительный элемент по заявляемому способу. Для этого его однократно погружали в смесь растворов 11- меркаптоундекановой кислоты (0,88 ± 0,01 мг / см ³ ) в абсолютном метиловом спирте (20% об.) И 11-меркаптоундеканолу (0,22 ± 0,01 мг / см ³ ) в абсолютном метиловом спирте (60% об.) и выдерживали в герметичной емкости из стекла при температуре 40 ± 1°С в течение 6-ти часов. После выдержки чувствительный элемент промывали сначала абсолютным метиловым спиртом, а затем дистиллированной водой, погружая в соответствующие жидкости в чашке Петри и выдерживая в течение 15 минут в каждой. Далее влажный чувствительный элемент погружали в чашку Петри со смесью водных растворов N-3mn-N '- (диметиламинопропил) карбодиимида гидрохлорида (62 ± 0,01 мг / см3) и N-гидроксисуксинимида (11 ,5 ± 0,01 мг / см3) в соотношении объемов растворов 1 : 1 , и выдерживали в этой смеси 15 минут при температуре 20 ± 1 °С. Далее промывали физиологическим раствором (9 мг / см ³ NaCI в дистиллированной воде), после чего на влажную поверхность чувствительного элемента площадью 20 ^c 20 мм наносили микропипеткой 100 ± 2 мкл физиологического раствора с инактивированным вирусом лейкоза крупного рогатого скота концентрацией 10% и выдерживали для иммобилизации вируса в закрытой чашке Петри в течение 60 минут при температуре 20 ± 1 °С. После этой операции выполняли, погружением в дистиллированную воду на 5 минут, промывку чувствительного элемента с иммобилизованным вирусом. Далее промытый чувствительный элемент высушивали в ламинарном шкафу в течение 60 минут при комнатной температуре и клали для хранения в холодильник при температуре 4 ± 3°С. Далее готовили чувствительный элемент по способу прототипа. Для этого в измерительную ячейку прибора «Плазмой» сначала устанавливали отожженный чувствительный элемент, а затем ячейку наполняли вирус-содержащей жидкостью, выдерживали чувствительный элемент в ячейке в течение 20 минут при температуре 20 ± 5°С, промывали ячейку фосфатным буфером для удаления избытка антигена, который не адсорбировался на поверхности наноразмерного слоя золота чувствительного элемента. Для предотвращения дальнейшего неспецифического связывания, свободные места на поверхности чувствительного элемента, не покрытые антигеном, блокировали с помощью 1 % -го водного раствора БСА (бычий сывороточный альбумин), который вносили в ячейку прибора, выдерживали его там 10 минут при температуре 20 ± 5°С.

Далее чувствительные элементы, изготовленные по предложенному способу и по способу прототипа, поочередно тестировали на приборе «Плазмой» для исследования взаимодействия антиген-антитело. Сначала тестировали чувствительный элемент, изготовленный заявляемым способом. Для этого регистрировали резонансный угол при введении в измерительную ячейку прибора «Плазмой» физиологического раствора (объемом 10 мкл). Затем в измерительной ячейке проводили контакт 10% об. раствора сыворотки молока в физиологическом растворе с иммобилизованными белками вируса на поверхности чувствительного элемента. Далее тестировали чувствительный элемент, изготовленный по способу прототипа. Для этого так же, сначала регистрировали резонансный угол при введении в измерительную ячейку прибора «Плазмой» (объемом Ю м п) физиологического раствора, а затем проводили контакт 10% об. раствора сыворотки молока в физиологическом растворе с поверхностью чувствительного элемента. В обоих случаях растворы сывороток выдерживали в измерительной ячейке в течение двух часов для связывания антител сыворотки с белками вируса на поверхности чувствительного элемента. После чего измерительные ячейки промывали и регистрировали показания прибора. Промывку выполняли для уменьшения влияния на результат измерения неспецифического взаимодействия и не связанных антител сыворотки молока, чувствительные элементы дополнительно промывали физиологическим раствором. Затем определяли изменение угла поверхностного плазмонного резонанса DQ1 при взаимодействии антиген-антитело на поверхности чувствительного элемента, изготовленного способом, который заявляется (фиг.1 , предложенный способ), и изменение угла поверхностного плазмонного резонанса DQ2 при взаимодействии антиген-антитело на поверхности чувствительного элемента, изготовленного способом прототипа (фиг.1 , прототип). Изменение угла определялась как разница между показаниями прибора до связывания вируса с антителом и показаниями после связывания. Результаты тестирования показали, что при применении чувствительного элемента, изготовленного по предложенному способу, смещение минимума угла ППР было в 8 раз больше, чем в случае применения чувствительного элемента, изготовленного по способу, описанному в прототипе, а именно: 1454 ± 6 угл.сек. для изобретения и 187 ± 6 угл.сек. для прототипа.

Дополнительно было проведено тестирование для 1% об. раствора сыворотки молока в физиологическом растворе. В этом случае, при применении чувствительного элемента, изготовленного по предложенному способу, смещение минимума угла ППР было в 11 раз больше, чем в случае применения чувствительного элемента, изготовленного по способу, описанному в прототипе, а именно: 155 ± 6 угл.сек. для изобретения и 14 ± 6 угл.сек. для прототипа. Причем, для прототипа уровень сигнала был почти на уровне абсолютной погрешности. Чувствительность определяется как отношение изменения выходного параметра сенсора (угла минимума ППР) к изменению входного параметра (изменение концентрации антител в сыворотке). В обоих случаях чувствительность пропорциональна смещению минимума угла ППР, поскольку применяли одинаковые концентрации антител в сыворотке крови. Это означает, что чувствительность заявляемого изобретения, в 8 и 11 раз больше, чем у прототипа (в зависимости от концентрации антител в сыворотке). Преимуществом заявляемого способа является отсутствие дополнительных операции при выполнении иммуносенсорного анализа (как в прототипе), на которые тратится дополнительное время (не менее 30 минут), что повышает удобство и производительность анализа.

Таким образом, эксперименты показали, что применение чувствительного элемента, изготовленного по предложенному способу, повышает чувствительность, удобство и производительность иммуносенсорного анализа. При необходимости чувствительный элемент, изготовленный по предложенному способу, может быть использован как для анализа других биологических жидкостей в организме животных (неинвазивный контроль образцов крови, слюны и т.д.), так и для выявления в них антител к другим вирусам. Приведенный пример реализации подтвердил возможность решения поставленной задачи и полезность предложенного способа.

Источники информации:

1. OIE (2008). Enzootic bovine leukosis. In Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, - Peris, France. - ch. 2.4.11. - pp. 729-738: World Organisation for Animal Health.

2. 1нструкц1я з профтактики та оздоровления велико ^' 1 рогато! ^' худоби вщ лейкозу: Наказ Державного комтету ветеринарно! ^' медицини Укра ^' ши 21.12.2007 Ns 21. - Зареестровано в М ютерств! юстицп Укра ^' ши 11 смня 2008 р. за Ns 12/14703. - 8 с.

3. О. Ouchterlony. Acta Path. Microbiol. Scand., 32 (1953), p. 231

4. Абрамова Л. О., Собко Ю. А., Собко I. О., Прискока В. А. Сучасний метод лабораторно! ^' дюгностики лейкозу велико! ^' рогато! ^' худоби // Ветеринарна медицина Укра ^' ши. - 2003. - Ns 5. - С. 39-41.

5. С. В. HqBίkqB, О. I. Доброскок, А. Ю. Волянський, О. Ю. Лиманська, Н. П.

Волянська, В. А. Манолов, О. П. Лиманський Cnoci6 детекцм Bipycy 1мунодефщиту велико! ^' рогато! ^' худоби // патент Укра ^' ши на винахщ Ns 66291 А, опуб. 15.04.2004, бюл. Ns 4. 6. Пирогова Л. В., Стародуб М.Ф. Cnoci6 не вазмно! ^' д1агностики лейкозу велико! ^' рогато! ^' худоби шляхом визначення антитт до Bipycy у молоц| korΪB 1муносенсором поверхневого плазмонного резонансу // патент Украши на винахщ Ns 81045 А, опуб. 26.1 1.2007

7. Венгер Q.F., Маслов В.П., Ушенш Ю.В., Самойлов А.В., Громовой Ю.С. ,

Дорожинський Г.В., Клестова З.С., Бабюн М.В., Годовський О. В. Cnoci6 д|агностики лейкозу велико! ^' рогато! ^' худоби, Патент Украши на винахщ Ns 1 11270 вщ 11.04.2016, бюл. Ns7.

8. Claes Nylander, Во Liedberg, Tommy Lind, Gas detection by means of surface plasmon resonance, Sensors and Actuators, Volume 3, 1982, Pages 79-88.