Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Formkörpern auf Basis von vernetzter Gelatine. Ferner betrifft die Erfindung Formkörper auf Basis von vernetzter Gelatine, insbesondere Flächenmaterialien und Hohlkörper. Weiter¬ hin betrifft die Erfindung Implantate, die unter Verwendung vorgenannten Formkörpern hergestellt sind.

Zur Behandlung von geschädigten Geweben und Organen können so genannte Gewebeimplantate zum Einsatz kommen, bei denen es sich um Konstrukte aus einem Trägermaterial und lebenden Zellen handelt (Tissue Engineering). Sol¬ che Implantate sind im Stand der Technik bekannt und werden unter anderem zur Regeneration von Haut oder Knorpel eingesetzt.

Das Trägermaterial soll dabei so beschaffen sein, dass es das Wachstum und die Proliferation der Zellen unterstützt. Darüber hinaus ist eine gewisse Festig¬ keit wünschenswert, um die Zellen während des Anwachsens im Körper vor mechanischer Beanspruchung zu schützen. Gleichzeitig sollte das Material aber flexibel genug sein, um sich der Form der zu behandelnden Körperstelle anzu¬ passen. Schließlich sollte das Trägermaterial vom Körper möglichst vollständig resorbiert werden können, nachdem die Zellen in ausreichendem Maße ange¬ wachsen sind und extrazelluläre Matrix synthetisiert haben. Die bisher verwendeten Materialien können diese vielfältigen Anforderungen nicht in gewünschtem Umfang erfüllen. Im Stand der Technik werden unter anderem Träger auf der Basis von Chitosan, Alginat, Agarose und Hyaluron- säure beschrieben. Die drei letztgenannten Materialien weisen dabei zum Teil erhebliche Mängel bei der rückstandsfreien Resorption auf.

Ein weiteres häufig verwendetes Trägermaterial ist Kollagen. Dieses ist jedoch nicht in einer wünschenswert reproduzierbaren Zusammensetzung und Rein¬ heit erhältlich. Zudem kann das aus tierischen Quellen gewonnene Kollagen immunogene Telopeptide enthalten, die Abwehrreaktionen des Körpers auslö¬ sen können.

Alle vorgenannten Materialien weisen darüber hinaus den Nachteil auf, dass die jeweilige Resorptionszeit, nach der das Material abgebaut ist, nicht indivi¬ duell eingestellt werden kann. Die optimale Zeitdauer kann je nach Art des zu behandelnden Gewebes und der Größe des Defekts unterschiedlich sein. So sind z.B. für die Regeneration von Knorpeldefekten aufgrund des langsamen Wachstums der Chondrozyten Abbauzeiten von 4 Wochen und mehr wün¬ schenswert.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht somit darin, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem Materialien erhalten werden können, die die oben beschriebenen Anforderungen erfüllen und bei denen zusätzlich die je¬ weilige Abbauzeit des Materials gezielt eingestellt werden kann.

Diese Aufgabe wird bei dem eingangs genannten Verfahren erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass es die folgenden Schritte umfasst: a) Herstellen einer wässrigen Gelatinelösung; b) partielles Vernetzen der gelösten Gelatine; c) Herstellen eines Formkörpers ausgehend von der Gelatinelösung mit der partiell vernetzten Gelatine; und d) Vernetzen der im Formkörper enthaltenen Gelatine.

Die Verwendung von vernetzter Gelatine als Ausgangsmaterial für Wundaufla¬ gen und Gewebeimplantate wurde im Stand der Technik an sich bereits be¬ schrieben. Im Gegensatz zu Kollagen handelt es sich bei Gelatine um ein Pro¬ dukt mit definierter Zusammensetzung, das auch in sehr hoher Reinheitsstufe hergestellt werden kann. Materialien aus Gelatine sind zudem optisch klar, wo- , hingegen Produkte aus Kollagen meist milchig trüb erscheinen. Letzteres kann bei einer lichtmikroskopischen Analyse des Zellwachstums von Nachteil sein.

Die bisher bekannten vernetzten Gelatine-Materialien weisen allerdings keine für Langzeitanwendungen erforderliche Stabilität auf. So ist beispielsweise eine bis zu 12-stündige Vernetzung mit 1,5-Pentandial, wie sie in der europäischen Patentschrift EP 1 053 757 beschrieben wird, nicht ausreichend, um ein für die Regeneration von Knorpeldefekten geeignetes Gelatine-Material zu erhalten. Auch Schwämme aus vernetzter Gelatine, wie sie zur Behandlung von Wunden und Blutungen bereits zum Einsatz kommen, sind ungeeignet, da sie in Ge¬ genwart von Proteasen zum Teil innerhalb weniger Minuten abgebaut werden.

Es wurde gefunden, dass ein höherer Vernetzungsgrad der Gelatine mit einer erhöhten Stabilität einhergeht.

Eine Erhöhung der Stabilität mittels höherer Konzentration an Vernetzungsmit¬ teln oder längerer Dauer der Vernetzungsreaktion ist dadurch limitiert, dass bei zu hoher Vernetzung einer Gelatinelösung diese nicht mehr verarbeitet und in Form gebracht werden kann.

Aber auch ein Vernetzen der Gelatine ausschließlich nach der Herstellung des Formkörpers führt nicht zu befriedigenden Ergebnissen, da hierbei die Gelatine an den von außen zugänglichen Grenzflächen stärker vernetzt als in den inne¬ ren Bereichen des Formkörpers. Dies kann z.B. bei Formkörpern mit einer Zell¬ struktur, auf die weiter unten noch ausführlich eingegangen wird, dazu führen, dass die Zellwände oder Stege zwischen den Poren im Inneren nur unzurei¬ chend vernetzt werden und sich beim späteren Einsatz der Formkörper zu schnell auflösen.

Erstaunlicherweise ermöglicht das oben beschriebene erfindungsgemäße Ver¬ fahren, das sich durch eine zweistufige Vernetzung der Gelatine-Materialien auszeichnet, nicht nur entsprechend langlebige und formstabile Materialien herzustellen, ohne die oben beschriebenen Vorteile von Gelatine aufgeben zu müssen. Das Verfahren erlaubt auch die gewünschte Resorptionszeit des Ma¬ terials individuell einzustellen.

Die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellten Formkörper sind da¬ bei selbsttragend, d.h. sie sind ausreichend stabil, um frei von einem Trägere¬ lement gehandhabt und eingesetzt werden zu können. Dies ist in der medizini¬ schen Anwendung von großem Vorteil, da hier möglichst einheitliche Materiali¬ en eingesetzt werden sollen.

Als Ausgangsmaterial für das Verfahren kann Gelatine verschiedener Herkunft und Qualität eingesetzt werden. Die Gelatinekonzentration in der Lösung (a) kann je nach Ausführungsform der Erfindung 5 bis 45 Gew.-%, vorzugsweise 10 bis 30 Gew.-% betragen. Der nach der ersten Vernetzung (b) gebildete Formkörper (c) wird vor der zweiten Vernetzung (d) bevorzugt zumindest teilweise getrocknet, vorzugswei¬ se bis zu einem Restfeuchtegehalt von weniger als 20 Gew.-%, insbesondere 15 Gew.-% oder weniger.

Die zweite Vernetzung kann durch Einwirken einer wässrigen Lösung eines Vernetzungsmittels durchgeführt werden, bevorzugt ist jedoch das Einwirken eines gasförmigen Vernetzungsmittels.

Als Vernetzungsmittei können prinzipiell alle Verbindung eingesetzt werden, die eine chemische Vernetzung der Gelatine bewirken. Bevorzugt sind Aldehy¬ de, Dialdehyde, Isocyanate, Diisocyanate, Carbodiimide und Alkyldihalogenide, wobei für die beiden Vernetzungsschritte gleiche oder verschiedene Verbindun¬ gen eingesetzt werden können.

Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Formaldehyd, insbesondere für den zweiten Vernetzungsschritt in der Gasphase, da der Formkörper durch Formaidehyd gleichzeitig sterilisiert werden kann. Dabei kann das Einwirken des Formaldehyds auf den Formkörper von einer Wasserdampfatmosphäre unterstützt erfolgen.

Die Eigenschaften der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Formkörper können in Bezug auf ihre Stabilität noch weiter verbessert werden, wenn die Formkörper nach dem zweiten Vernetzungsschritt einer thermischen Nachbehandlung bei vermindertem Druck ausgesetzt werden. Diese Nachbe¬ handlung wird bevorzugt bei Temperaturen von 80 bis 160 0C durchgeführt, da unterhalb von 80 0C die beobachteten Effekte relativ schwach ausgeprägt sind und oberhalb von 160 0C eine unerwünschte Verfärbung der Gelatine auftreten kann. Am meisten bevorzugt sind Werte im Bereich von 90 bis 120 0C.

Unter vermindertem Druck sind dabei Drücke unterhalb des Atmosphären¬ drucks zu verstehen, wobei möglichst geringe Druckwerte, im Idealfall ein Va¬ kuum, bevorzugt sind.

Die thermische Nachbehandlung wirkt sich in zweierlei Hinsicht vorteilhaft aus. Zum einen erfolgt unter den oben genannten Temperatur- und Druckbedin¬ gungen eine weitere, dehydrothermale Vernetzung der Gelatine, indem ver¬ schiedene Aminosäureseitenketten unter Wasserabspaltung miteinander rea¬ gieren. Dies wird dadurch begünstigt, dass das abgespaltene Wasser durch . den geringen Druck aus dem Gleichgewicht entfernt wird. Durch die thermi¬ sche Nachbehandlung kann somit ein höherer Vernetzungsgrad bei gleicher Menge an Vernetzungsmitteln erzielt werden bzw. die Menge an Vernetzungs¬ mitteln kann bei vergleichbarem Vernetzungsgrad reduziert werden.

Der weitere Vorteil der thermischen Nachbehandlung besteht darin, dass der im Formkörper verbleibenden Restgehalt an nicht verbrauchtem Vernetzungs¬ mittel deutlich reduziert werden kann.

Um eine gute Bioverträglichkeit der Formkörper sicherzustellen, z.B. bei der Verwendung als Trägermaterial für Gewebeimplantate, wird bei dem erfin¬ dungsgemäßen Verfahren vorzugsweise überschüssiges, nicht reagiertes Ver¬ netzungsmittel aus dem Formkörper entfernt. Dies kann z.B. durch mehrtägi¬ ges Entgasen der Formkörper unter Normaldruck und/oder durch Waschen mit einem flüssigen Medium erfolgen, wobei letzteres je nach Konzentration des Vernetzungsmittels, Größe des Formkörpers usw. ebenfalls einen Zeitraum von einem Tag bis zu einer Woche erfordert. Da durch die oben beschriebene thermische Nachbehandlung einerseits die Menge an eingesetztem Vernetzungsmittel reduziert werden kann und darüber hinaus überschüssiges Vernetzungsmittel durch die erhöhte Tempera-tur und den verminderten Druck aus dem Formkörper entfernt wird, kann durch diesen zusätzlichen Verfahrensschritt eine deutliche Verringerung des Restgehaltes an Vernetzungsmittel bereits innerhalb von ca. 4 bis 10 Stunden erreicht werden.

Erfindungsgemäße Formkörper, die vorzugsweise im Wesentlichen frei von überschüssigem Vernetzungsmittel sind, können somit durch die thermische Nachbehandlung mit einem relativ geringen Zeitaufwand hergestellt werden. Bevorzugt weisen die erfindungsgemäßen Formkörper einen Gehalt an Vernet¬ zungsmittel von ca. 0,2 Gew.-% oder weniger auf, was z.B. im Falle des Ver¬ netzungsmittels Formaldehyd einen Grenzwert für die Bioverträglichkeit von Trägermaterialien darstellt. Durch ein reines Waschen mit flüssigem Medium kann dieser Wert in dem oben genannten Zeitraum von 4 bis 10 Stunden nicht erreicht werden.

Erstaunlicherweise führt eine thermische Behandlung bei vermindertem Druck tatsächlich nur dann zu einer verbesserten Stabilität der erfindungsgemäßen Formkörper, wenn diese, wie oben beschrieben, nach den beiden Vernetzungs¬ schritten durchgeführt wird. Eine Vorbehandlung der eingesetzten Gelatine unter den entsprechenden Temperatur- und Druckbedingungen führt zu keiner merklichen Erhöhung der Lebensdauer der Formkörper, obwohl die Gelatine auch in diesem Fall chemisch modifiziert wird, was sich in einer Erhöhung der Bloom-Stärke, der Viskosität und des mittleren Molekulargewichts nieder¬ schlägt. Eine thermische Vorbehandlung der eingesetzten Gelatine, die bevorzugt unter vergleichbaren Bedingungen durchgeführt wird wie die thermische Nachbe¬ handlung der Formkörper, bringt allerdings anderweitige Vorteile mit sich, die ja nach Anwendungsfall von Bedeutung sein können. Zum einen führt die thermische Vorbehandlung zu einer höheren Reißfestigkeit der erfindungsge¬ mäßen Formkörper in trockenem Zustand, insbesondere im Falle der weiter unten beschriebenen Folien. Des weiteren kann durch die höhere Viskosität der thermisch vorbehandelten Gelatine die Konzentration der einzusetzenden Gelatinelösung verringert werden, wodurch Formkörper mit einer niedrigeren Dichte und höheren Flexibilität erhältlich sind. Dies betrifft in erster Linie Formkörper mit einer Zellstruktur, die weiter unten im Detail beschrieben wer¬ den.

Bevorzugt wird für das erfindungsgemäße Verfahren eine Gelatine mit einer Viskosität von 8 mPas oder mehr eingesetzt, wobei sich dieser Wert auf die Viskosität einer 6,7 Gew.-%igen wässrigen Gelatinelösung bei 60 0C bezieht.

Die gewünschte Festigkeit, insbesondere Reißfestigkeit, und Stabilität bzw. Lebensdauer oder Abbauverhalten des hergestellten Materials können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren sehr einfach eingestellt werden, bevorzugt durch die gezielte Wahl der Herstellungsbedingungen. Z.B. können durch eine höhere Konzentration des Vernetzungsmittels oder durch die oben beschrie¬ bene thermische Nachbehandlung in der Regel sowohl Festigkeit als auch Le¬ bensdauer erhöht werden.

So können überraschenderweise Formkörper erhalten werden, die einerseits unter physiologischen Bedingungen gezielt beispielsweise länger als eine Wo¬ che, länger als zwei Wochen oder länger als vier Wochen stabil bleiben, und andererseits den Anforderungen bezüglich Zellverträglichkeit und Resorbier- barkeit genügen.

Der Begriff der Stabilität ist hier dahingehend zu verstehen, dass das Material seine ursprüngliche Form sowohl bei der Lagerung in trockenem Zustand als auch während der angegebenen Zeitdauer bei physiologischen Standardbe¬ dingungen im Wesentlichen erhält und erst anschließend in erheblichem Um¬ fang resorbiert wird.

Physiologische Standardbedingungen, denen das Material bei seiner Verwen¬ dung zur Herstellung von Implantaten ausgesetzt ist, sind in erster Linie durch Temperatur, pH-Wert und Ionen-Stärke gekennzeichnet. Entsprechende Be¬ dingungen können in vitro durch eine Inkubation des Materials in PBS-Puffer (pH 7,2, 0,09 Gew.-% NaCI) bei 37 0C definiert werden, um verschiedene Materialien im Hinblick auf ihr zeitabhängiges Stabilitätsverhalten zu testen und zu vergleichen.

Die Resistenz der Formkörper gegenüber Proteasen, die hauptsächlich für den Abbau des Materials verantwortlich sind, kann ebenfalls bereits in vitro durch Zugabe einer Protease, z.B. Pepsin, oder bei der Besiedlung mit Protease-pro- duzierenden Zellen, z.B. Fibroblasten, sehr gut abgeschätzt werden. Quantita¬ tive Angaben hierzu können aus den unten angeführten Ausführungsbeispielen entnommen werden.

Trotz des zum Teil sehr hohen Vernetzungsgrades, der mit dem beschriebenen Verfahren erreicht werden kann, können die hergestellten Formkörper den¬ noch eine ausreichende Flexibilität aufweisen, die den Anforderungen bei der Verwendung als Gewebeimplantat, wie z.B. Geschmeidigkeit und Vernähbar- keit, genügt. Die gewünschte Flexibilität kann vorzugsweise durch einen Zusatz von Weich¬ machern im Verlauf des Herstellungsverfahrens eingestellt werden. Dabei führt eine Erhöhung der Weichmacher-Konzentration in der Regel zu flexibleren Formkörpern. Als Weichmacher sind z.B. Glycerin, Oligoglycerine, Oligoglycole und Sorbit geeignet.

Bei der Herstellung der Formkörper aus der vernetzten Gelatinelösung können verschiedene Verfahren zum Einsatz kommen, wie beispielsweise Gießen oder Extrudieren, gegebenenfalls kombiniert mit einem Aufschäumen, wenn zellulä¬ re Materialien angestrebt werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren Formkörper aus vernetzter Ge¬ latine, bei denen der Vernetzungsgrad so gewählt ist, dass die Formkörper un¬ ter physiologischen Bedingungen für eine vorgegebene Zeit, z.B. mindestens eine, zwei oder vier Wochen, stabil bleiben. Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung solcher Formkörper ist das oben beschriebene.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die Formkörper als Flächenmate¬ rialien ausgebildet. Flächenmaterialien sind als Träger für Gewebeimplantate vielfach anwendbar, z.B. bei der Regeneration von Haut. Das Flächenmaterial kann zellulär sein, d.h. eine Zellstruktur aufweisen, oder als (nicht zelluläre) Folie ausgestaltet sein.

Zellstrukturen, wie z.B. Schwämme oder Schäume, können durch Aufschäu¬ men der Gelatinelösung mit einem Gas, insbesondere Luft, erhalten werden. Bevorzugte Zellstrukturen sind offenporig, um bei einer Verwendung für Ge¬ webeimplantate ein Einwachsen von Zellen und die Ausbildung einer dreidi¬ mensionalen Gewebestruktur zu ermöglichen. Die Dichte der Formkörper mit Zellstruktur und die Porenweite können in ei¬ nem weiten Bereich, bevorzugt durch die Intensität des Aufschäumens, einge¬ stellt werden. Darüber hinaus kann die Dichte durch Verwendung einer ther¬ misch vorbehandelten Gelatine bzw. einer Gelatine mit hoher Viskosität, wie oben beschrieben, gesenkt werden.

Die Eigenschaften eines erfindungsgemäßen Formkörpers mit Zellstruktur kön¬ nen auch dadurch beeinflusst werden, dass die Zellstruktur durch mechanische Einwirkung auf den Formkörper modifiziert wird. Mechanisches Einwirken um- fasst z.B. ein Pressen oder Walzen des Formkörpers in einem Ausmaß, dass ein Teil der Zellwände oder Stege zwischen den Poren der Zellstruktur gebro¬ chen werden.

Vorzugsweise wird durch die mechanische Einwirkung die Dichte des Formkör¬ pers um einen Faktor von 2 bis 10 erhöht.

Durch die mechanische Einwirkung kann die Flexibilität der Formkörper in trok- kenem Zustand erhöht werden, ohne dass das zeitliche Stabilitätsverhalten merklich beeinflusst wird. Dies ist vorteilhaft, da insbesondere flexible Flä¬ chenmaterialien bei einer Verwendung als Gewebeimplat besser an die Gege¬ benheiten des Körpers angepasst werden können.

Die Poren der Zellstruktur weisen vorzugsweise einen mittleren Durchmesser von weniger als 300 μm auf. Bei größeren mittleren Porendurchmessern wird beim Einbringen von Zellen in die Zellstruktur oft ein zu geringer Rückhalte¬ grad beobachtet. Die bevorzugte Untergrenze der Porenweite richtet sich in den meisten Fällen nach der Größe der verwendeten Zellen, die in allen drei Dimensionen in die Zellstruktur hineinwachsen sollen. Für die Hersteilung von Formkörpern mit Zellstruktur kann eine Gelatinelösung mit einer Konzentration von 5 bis 25 Gew.-%, vorzugsweise von 10 bis 20 Gew.-%, eingesetzt werden. Dabei führt eine höhere Gelatine-Konzentra¬ tion im Allgemeinen zu einer höheren Bruchfestigkeit der Formkörper. Dies gelingt überraschenderweise weitgehend unabhängig vom Vernetzungsgrad, über den die Lebensdauer des Materials eingestellt werden kann.

Bevorzugte Formkörper mit Zellstruktur sind reversibel komprimierbar. Dies gilt insbesondere in hydratisiertem Zustand, wobei das Ausmaß der Kompres¬ sibilität dabei u.a. von der eingesetzten Gelatinekonzentration und der Poren¬ weite abhängig ist.

Unter dem Begriff "Folien" sind dünne Flächenmaterialien ohne Zellstruktur zu verstehen. Sie können durch Gießen aus einer bevorzugt im Wesentlichen ent¬ gasten Gelatinelösung hergestellt werden.

Eine bevorzugte Ausführungsform betrifft flexible Folien, deren Flexibilität z.B. durch einen Zusatz von Weichmachern eingestellt werden kann. Als Weichma¬ cher können die bereits im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Ver¬ fahren beschriebenen Verbindungen zum Einsatz kommen. Die Stabilität der Folien bei physiologischen Standardbedingungen bleibt durch den Einsatz der Weichmacher im Wesentlichen unbeeinflusst.

Bevorzugt sind Folien mit einer Dicke von 20 bis 500 μm, am meisten bevor¬ zugt von 50 bis 100 μm. Für die Herstellung der Folien werden bevorzugt Gelatinelösungen mit einer Konzentration von 5 bis 45 Gew.-%, weiter bevorzugt ungefähr von 10 bis 30 Gew.-%, verwendet.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft ein mehrlagi¬ ges Material, das eine Folie und ein Flächenmaterial mit Zellstruktur umfasst. Dabei können die beiden Schichten unmittelbar miteinander verbunden sein, was z.B. dadurch bewirkt werden kann, dass das Flächenmaterial mit Zell¬ struktur vor dem Trocknen der Folie mit dieser in Kontakt gebracht, gegebe¬ nenfalls in diese eingedrückt wird.

Alternativ können die Schichten mit einem Kleber miteinander verbunden wer¬ den, wobei als Kleber vorzugsweise ein Gelatine basierender Kleber verwendet werden kann.

Bei dem erfindungsgemäßen mehrlagigen Flächenmaterial werden die Folie und das Flächenmaterial mit Zellstruktur vorzugsweise flächig, insbesondere vollflächig miteinander verbunden.

Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform können die Formkörper auch als Hohlkörper, insbesondere als Hohlprofil, ausgebildet sein. Solche Hohlpro¬ file können beispielsweise durch Extrusion der Gelatinelösung erhalten werden. Alternativ können durch gleichzeitiges Extrudieren und Aufschäumen Hohlpro¬ file mit einer oben beschriebenen Zellstruktur hergestellt werden.

Hohlprofile können aber auch aus zuvor hergestellten Flächenmaterialien, ins¬ besondere Folien, gebildet werden, beispielsweise durch Aufrollen. Eine bevorzugte Ausführungsform betrifft zylindrische Hohlprofile, beispiels¬ weise kleine Röhrchen. Auch diese können u.a. durch Aufrollen der oben be¬ schriebenen Flächenmaterialien hergestellt werden.

Neben den vorstehend beschriebenen Materialien können die erfindungsgemä¬ ßen Formkörper auch eine beliebige andere Form oder Struktur aufweisen. Insbesondere können für die Verwendung als Gewebeimplantat Formkörper zum Einsatz kommen, die dem zu behandelnden Gewebedefekt räumlich an- gepasst sind.

Die Erfindung betrifft des Weiteren die Verwendung der beschriebenen Form¬ körper für den Einsatz im human- und veterinärmedizinischen Bereich und für die Herstellung von Implantaten.

Eine erfindungsgemäße Verwendung betrifft die Herstellung von Wundauflagen aus den vorstehend beschriebenen Materialien. Diese können bei der Behand¬ lung von Wunden oder von inneren oder äußeren Blutungen, z.B. bei Opera¬ tionen, eingesetzt werden. Die Resorption des Materials erfolgt dabei nach ei¬ ner individuell einstellbaren Zeit, bevorzugt durch die Wahl der Herstellungs¬ bedingung.

Es hat sich gezeigt, dass die erfindungsgemäßen Formkörper hervorragend für die Besiedlung mit Säugetierzellen, d.h. mit menschlichen oder tierischen Zel¬ len, geeignet sind. Dabei kann ein Formkörper mit einem geeigneten Nährme¬ dium behandelt und anschließend die Zellen, z.B. Fibroblasten oder Chondro- zyten, darauf ausgesät werden. Aufgrund der Stabilität des Materials können die Zellen in vitro mehrere Wochen wachsen und proliferieren. Die Erfindung betrifft weiterhin Implantate, insbesondere Gewebeimplantate, die einen erfindungsgemäßen Formkörper und hierauf kultivierten Zellen, wie oben beschrieben, umfassen.

Die erfindungsgemäßen Implantate werden für die Behandlung von Gewebe¬ defekten, beispielsweise Haut- oder Knorpeldefekten, verwendet, wobei die ausgesäten Zellen z.B. zuvor dem Patienten entnommen werden können. Während der Wachstumsphase der Zellen vermittelt der Formkörper dem sich bildenden Gewebe Schutz vor mechanischer Beanspruchung, und die Ausbil¬ dung der zelleigenen extrazellulären Matrix wird ermöglicht. Die erfindungs¬ gemäß einstellbare Resorptionszeit erweist sich dabei als besonderer Vorteil. Mit Hilfe langlebiger erfindungsgemäßer Materialien, die eine Resorptionszeit von mehr als vier Wochen aufweisen, können auch großflächige Defekte oder Defekte in Gewebetypen mit langsamem Zellwachstum behandelt werden.

Besonders bevorzugt für die Verwendung in Implantaten sind Formkörper mit einer Zellstruktur, da sich hier durch Einwachsen der Zellen in den Formkörper ein dreidimensionaler Gewebeverband entwickeln kann. Durch eine reversible Kompression des Formkörpers kann eine Zellsuspension aufgesaugt und die Zellen homogen im Formkörper verteilt werden.

Je nach Anwendungsgebiet kann ein Flächenmaterial mit Zellstruktur zur An¬ wendung kommen, wie z.B. zur Behandlung von großflächigen Verletzungen oder Verbrennungen der Haut. Aber auch jede andere Form kann vorteilhaft sein, z.B. individuelle, dreidimensionale Formkörper zur Behandlung von Knor¬ peldefekten.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Implantat ein oben beschriebenes mehrlagiges Flächenmaterial. Bei einem sol- chen Implantat dient das Flächenmaterial mit Zellstruktur als Träger für die Zellen, während die Folie zusätzlichen mechanischen Schutz bietet.

Ein solches Konstrukt kann beispielsweise bei der Regeneration von sehr lang¬ sam wachsendem Knorpelgewebe von Vorteil sein.

Ferner betrifft die Erfindung Nervenleitschienen. Die Implantation von Ner- venleitschienen dient der Regeneration durchtrennter Nervenstränge. Dabei sollte die Schiene so dimensioniert sein, dass eine einzelne Nervenzelle darin wachsen kann. Dies wird bei einem bevorzugten Innendurchmesser von 1 mm gewährleistet. Die Nervenleitschiene sollte zudem so beschaffen sein, dass sie seitlich von Blutgefäßen durchdrungen werden kann um die Versorgung der Nervenzelle mit Nährstoffen zu ermöglichen.

Nervenleitschienen, die diese Anforderung erfüllen, können mit dem erfin¬ dungsgemäßen Verfahren hergestellt werden.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die Nervenleitschiene durch Auf¬ rollen eines oben beschriebenen erfindungsgemäßen Flächenmaterials, insbe¬ sondere einer Folie, hergestellt.

Diese und weitere Vorteile der Erfindung werden durch die nachstehend auf¬ geführten Beispiele und Figuren näher erläutert. Es zeigen im Einzelnen:

Fig. 1 : Zug-Dehnungs-Diagramm erfindungsgemäßer Folien; Fig. 2: Zug-Dehnungs-Diagramm weiterer erfindungsgemäßer Folien; Fig. 3: Zeitliches Abbauverhalten erfindungsgemäßer Formkörper mit Zellstruktur; Fig. 4: Mikroskopaufnahmen erfindungsgemäßer Formkörpem mit Zellstruktur; Fig. 5: Bruchfestigkeits-Diagramm erfindungsgemäßer Formkörper mit Zellstruktur; Fig. 6: Protease-Resistenz erfindungsgemäßer Formkörpern mit Zellstruktur; Fig. 7: Zeitliches Abbauverhalten weiterer erfindungsgemäßer Formkör¬ per mit Zellstruktur; Fig. 8: Zug-Dehnungs-Diagramm weiterer erfindungsgemäßer Folien; Fig. 9: Zellverteilung von Chondrozyten in erfindungsgemäßen Formkörpern; und Fig. 10: Photographische Darstellung der Besiedlung einer erfindungsge¬ mäßen Folie mit Fibroblasten.

Beispiele

Beispiel 1: Herstellung und Eigenschaften von Folien auf Basis von vernetzter Gelatine

Schweineschwartengelatine (Bloom-Stärke 300) wurde in vier verschiedenen Ansätzen in einer Mischung aus Wasser und Glycerin entsprechend den Men¬ genangaben in Tabelle 1 bei 60 0C gelöst. Nach dem Entgasen der Lösungen durch Ultraschall wurde die in Tabelle 1 bezeichnete Menge einer wässrigen Formaldehyd-Lösung (1,0 Gew.-%ig, Raumtemperatur) zugegeben, die Mi¬ schung homogenisiert und bei ca. 60 0C in einer Dicke von 1 mm auf eine Po- lyethylen-Unterlage geräkelt. Tabelle 1

Nach Trocknen bei 30 0C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 50% für etwa einen Tag wurden die Folien von der PE-Unterlage abgezogen und ca. 12 h unter denselben Bedingungen nachgetrocknet.

Die getrockneten Folien wiesen eine Dicke von weniger als 100 μm auf und wurden für den zweiten Vernetzungs-Schritt zwei Stunden in einem Exsikkator dem Gleichgewichtsdampfdruck einer 17%igen wässrigen Formaldehyd-Lösung bei Raumtemperatur ausgesetzt. Für die gemäß Ansatz 1-1 hergestellte Folie war der zweite Vemetzungsschritt der einzige.

Die mechanischen Eigenschaften der verschiedenen Folien (im trockenen Zu¬ stand) sind in der Figur 1 dargestellt: Während die Folie 1-2 durch die zwei¬ stufige Vernetzung im Vergleich zur Folie 1-1 eine höhere Reißfestigkeit bei geringerer Bruchdehnung aufweist, ist die Folie 1-3 durch die Erhöhung der Glycerin-Konzentration wesentlich dehnbarer (flexibler). Durch die höhere Vernetzungsmittel-Konzentration bei der Folie 1-4 im Vergleich zur Folie 1-3 kann wiederum eine etwas höhere Festigkeit bei geringerer Bruchdehnung er¬ zielt werden.

Es wurden auch Folien gemäß den Ansätzen 1-1 und 1-2 hergestellt, die an¬ schließend aber keiner Vernetzung in der Gasphase unterzogen wurden (Folien 1-1', unvernetzt und 1-2', einfach vernetzt). Die Bruchdehnungskurven dieser Folien enden bei etwa 140 % / 10 N/nm2 (l-l1) bzw. 115 % / 15 N/nm2 (1-21) und sind aus Gründen der Übersichtlichkeit in der Figur 1 nicht dargestellt.

Es versteht sich von selbst, dass die jeweiligen Kurvenverläufe bei Herstellung im Labormaßstab nicht exakt reproduzierbar sind. Charakteristisch ist jedoch das Verhältnis der Kurven verschiedener Folien zueinander.

Das Beispiel zeigt daher, dass bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Fle¬ xibilität der hergestellten Folien über einen weiten Bereich angepasst werden kann, indem sowohl der Vernetzungsgrad als auch der Anteil des Weichma¬ chers entsprechend variiert werden.

Dabei zeichnen sich die zweifach vernetzten Folien dadurch aus, dass sie unter physiologischen Standardbedingungen wesentlich länger stabil bleiben:

Das Abbauverhalten der Folien wurde durch Einlegen von 2 x 3 cm großen Fo¬ lienstücken in je 500 ml PBS-Puffer (pH 7,2, 0,09 Gew.-% NaCI) und photome¬ trische Konzentrationsbestimmung der im Puffer gelösten Gelatine bei einer Wellenlänge von 214 nm gemessen. Während die nicht- bzw. einfach vernetz¬ ten Folien bereits nach 15 min vollständig aufgelöst waren, war an den zwei¬ fach vernetzten Folien nach einer Stunde noch keine Veränderung festzustel¬ len. Beispiel 2: Herstellung und Eigenschaften von Folien auf Basis von vernetzter Gelatine

Es wurden acht Ansätze einer 30 Gew.-%igen Lösung von Schweineschwar¬ tengelatine (Bloom-Stärke 300) in Wasser/G Iy cerin entsprechenden den Anga¬ ben in Tabelle 2 durch Lösen der Gelatine bei 60 0C hergestellt. Nach dem Ent¬ gasen der Lösungen durch Ultraschall wurden die entsprechenden Mengen ei¬ ner wässrigen Formaldehyd-Lösung (1,0 Gew.-%ig, Raumtemperatur) zugege¬ ben, so dass die Endkonzentration an Formaldehyd jeweils dem in Tabelle 2 angegebenen Wert entsprach. Aus den Mischungen wurden, wie im übrigen in Beispiel 1 beschrieben, Folien hergestellt, getrocknet und gegebenenfalls ver¬ netzt (vgl. Tabelle 2).

Tabelle 2

In der Figur 2 ist das Zug-Dehnungs-Verhalten der acht Folien dargestellt.

Die Kurven 2-1 bis 2-8 beziehen sich auf die entsprechenden trockenen Folien, die Kurven 2-2A bis 2-8A auf die hydratisierten Folien, die für vier Stunden in PBS-Puffer eingelegt wurden (die unvernetzte Folie 2-1 löst sich unter diesen Bedingungen soweit auf, dass keine Untersuchung des Zug-Dehnungs-Verhal¬ tens möglich ist). Die senkrechten Markierungen kennzeichnen die Endpunkte der jeweiligen Kurven.

Auch in diesem Beispiel wird deutlich, dass sich die Reißfestigkeit bzw. Flexibi¬ lität der Folien mittels der unterschiedlichen Herstellungsbedingungen über ei¬ nen weiten Bereich variieren lässt.

Darüber hinaus zeigt sich, dass auch Folien, die in trockenem Zustand relativ steif sind (was bei der Verarbeitung einen Vorteil darstellen kann), nach ihrer Hydratisierung unter physiologischen Bedingungen z. T. sehr flexibel werden können: Die Folien 2-7 und 2-8, die in trockenem Zustand nahezu identische Eigenschaften aufweisen, ergeben nach ihrer Hydratisierung im einen Fall ein extrem flexibles Material (2-7A), wie es z.B. für den Einsatz im Gelenkbereich benötigt wird, im anderen Fall ein steiferes Material mit höherer Reißfestigkeit (2-8A), das z.B. im Knochenbereich zum Einsatz kommen kann.

Beispiel 3: Herstellung und Eigenschaften von Formkörpern mit Zellstruktur auf Basis von vernetzter Gelatine

Es wurden fünf Ansätze einer 12 Gew.-%igen Lösung von Schweineschwarten¬ gelatine (Bloom-Stärke 300) in Wasser durch Lösen der Gelatine bei 60 0C hergestellt, mittels Ultraschall entgast, und jeweils mit der entsprechenden Menge einer wässrigen Formaldehydlösung (1,0 Gew.-%ig, Raumtemperatur) versetzt, so dass 1500 ppm Formaldehyd (bezogen auf die Gelatine) vorlagen. Bei einer entsprechend hergestellten Referenzprobe erfolgte keine Zugabe von Formaldehyd.

Die homogenisierten Mischungen wurden nach einer Reaktionszeit von 10 min auf 45 0C temperiert und maschinell mit Luft aufgeschäumt. Der ca. 30minüti- ge Aufschäumvorgang wurde für die fünf Ansätze mit einem unterschiedlichen Verhältnis von Luft zu Gelatinelösung durchgeführt, wodurch Zellstrukturen mit unterschiedlichen Nassdichten und Porengrößen gemäß Tabelle 3 erhalten wurden.

Die aufgeschäumten Gelatinelösungen, die eine Temperatur von 26,5 0C auf¬ wiesen, wurden in Formen mit einer Abmessung von 40 x 20 x 6 cm gegossen und ca. vier Tage bei 26 0C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 10% ge¬ trocknet.

Die getrockneten Formkörper mit einer schwammartigen Zellstruktur (im Fol¬ genden als Schwämme bezeichnet), wurden in 2 mm dicke Schichten ge¬ schnitten und für den zweiten Vernetzungsschritt 17 Stunden in einem Exsik- kator dem Gleichgewichtsdampfdruck einer 17%igen wässrigen Formaldehyd- Lösung bei Raumtemperatur ausgesetzt. Um eine gleichmäßige Begasung des gesamten Volumens der Formkörper zu erreichen, wurde der Exsikkator dabei jeweils zwei- bis dreimal evakuiert und wieder belüftet.

Die Porenstruktur der Schwämme wurde lichtmikroskopisch ermittelt und konnte durch Rasterelektronenmikroskopie bestätigt werden. Tabelle 3

Um die Stabilität der Schwämme zu bestimmen, wurden 30 x 30 x 2 mm gro¬ ße Stücke eingewogen, in je 75 ml PBS-Puffer gelegt und bei 37 0C gelagert. Nach der jeweiligen Lagerzeit wurden die Stücke 30 min in Wasser gewaschen, getrocknet und ausgewogen.

Die Figur 3 zeigt das Auflösungsverhalten der Schwämme 3-1 bis 3-5 sowie der einfach vernetzten Referenzprobe (die Abfolge der dargestellten Balken ist jeweils: Referenz, 3-1, 3-2, 3-3, 3-4, 3-5).

Während die Referenz nach drei Tagen bereits vollständig aufgelöst ist, sind alle erfindungsgemäß hergestellten Schwämme auch nach 14 Tagen noch zu über 80 % erhalten. Es zeigen sich jedoch erhebliche Unterschiede im weiteren Abbauverhalten, die auf die unterschiedlichen Aufschäumdichten der Materiali¬ en zurückzuführen sind. So ist der Schwamm 3-1 nach 21 Tagen und der Schwamm 3-2 nach 28 vollständig aufgelöst, während die Schwämme 3-4 und 3-5 auch nach 35 Tagen noch weitgehend erhalten sind. Daraus ergibt sich die Möglichkeit das Abbauverhalten der Zellstrukturmaterialien unabhängig von anderen Parametern gezielt zu beeinflussen.

Die Eigenschaften der Zellstrukturmaterialien können aber auch über eine Än¬ derung der Gelatinekonzentration in der Ausgangslösung deutlich modifiziert werden.

Die Figur 4 zeigt lichtmikroskopische Aufnahmen der Zellstruktur zweier Form¬ körper in Dünnschnitten von 150 μm, die ausgehend von einer 12 Gew.-%igen (Bild A) bzw. 18 Gew.-%igen (Bild B) Gelatinelösung, unter ansonsten identi¬ schen Bedingungen, hergestellt wurden. Die höhere Gelatinekonzentration . führt zu breiteren (dickeren) Zellwänden oder Stegen zwischen den einzelnen Poren, was sich in einer erhöhten Bruchfestigkeit der entsprechenden Schwämme niederschlägt.

Quantitativ ist dies in der Figur 5 dargestellt. Die drei Kurven A, B und C re¬ präsentieren jeweils Schwämme mit drei unterschiedlichen Vernetzungsgra¬ den. Die Bruchfestigkeit nimmt mit Erhöhung der Gelatinekonzentration der Ausgangslösung von 10 auf 18 Gew.-% stetig zu, wobei ein weiter Bereich von ca. 500 bis fast 2000 Newton abgedeckt wird. Gleichzeitig ändert sich die Ver¬ formung bis zum Bruch nur geringfügig. Überraschenderweise ist die Korrela¬ tion zwischen Bruchkraft und Gelatinekonzentration dabei weitgehend unab¬ hängig vom Vernetzungsgrad.

Über den Vernetzungsgrad, d.h. durch die Wahl der Konzentration des Vernet¬ zungsmittels, kann hingegen die Stabilität der Formkörper, insbesondere im Hinblick auf proteolytischen Abbau, beeinflusst werden. In der Figur 6 ist die Resistenz verschiedener Zellstrukturmaterialien (Schwämme) gegen Pepsin in Abhängigkeit von der im ersten Vernetzungs¬ schritt verwendeten Formaldehydmenge(Gew.-% bezogen auf Gelatine) dar¬ gestellt.

Der Abbau wurde bei 37 0C in einer 1,0 Gew.-%igen Pepsin-Lösung in PBS- Puffer durchgeführt, dessen pH-Wert mit HCl auf 1 eingestellt wurde. Mit Er¬ höhung der Formaldehydkonzentration von 500 über 1500 auf 3000 ppm steigt die Abbauzeit der Schwämme von weniger als 5 min über 30 min auf 75 min. Die Trockendichte der Materialien ist dabei vom Vernetzungsgrad im Wesentlichen unabhängig. Die hier gewählten sehr drastischen Abbaubedin¬ gungen sind mit den wesentlich milderen physiologischen Bedingungen nicht vergleichbar, so dass unter letzteren Bedingungen erheblich längere Abbau¬ zeiten gelten.

Beispiel 4: Herstellung und Eigenschaften von Formkörpern mit Zellstruktur auf Basis von vemetzter Gelatine mit thermischer Nachbehandlung

Eine 12 Gew.-%ige Lösung von Schweineschwartengelatine (Bloom-Stärke 300) wurde wie in Beispiel 3 hergestellt, mittels Ultraschall entgast, und mit der entsprechenden Menge einer wässrigen Formaldehydlösung (1,0 Gew.- %ig, Raumtemperatur) versetzt, sodass 1500 ppm Formaldehyd (bezogen auf die Gelatine) vorlagen.

Die homogenisierte Mischung wurde nach einer Reaktionszeit von 5 min auf 45 0C temperiert und während ca. 30 min maschinell mit Luft aufgeschäumt. Die aufgeschäumte Gelatinelösung wurde in Formen gegossen und getrocknet wie in Beispiel 3 beschrieben, wobei ein Formkörper mit einer schwammartigen Zellstruktur (Schwamm) mit einer Nassdichte von 121 mg/cm3, einer Trocken- dichte von 18 mg/cm3 und einer mittleren Porengröße von 250 μrn erhalten wurde.

Der Formkörper war nach dem ersten Vernetzungsschritt bereits schnittfest.

Von dem Schwamm wurden vier Proben mit den Abmessungen 30 x 30 x 2 mm geschnitten, welche jeweils einem zweiten Vernetzungsschritt in der Gas¬ phase über dem Gleichgewichtsdampfdruck einer 10%igen wässrigen Formal- dehydlösung analog dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren unterworfen wurden. Im Unterschied zu Beispiel 3 war jedoch die Einwirkzeit des Form¬ aldehyds in diesem Fall deutlich kürzer, nämlich 2 Stunden im Falle der Proben 4-1 und 4-3 sowie 5 Stunden um Falle der Proben 4-2 und 4-4.

Alle vier Proben wurden nach dem zweiten Vernetzungsschritt vakuumentgast, anschließend wurden die Proben 4-3 und 4-4 einer thermischen Nachbehand¬ lung unterzogen. Dabei wurden die betreffenden Schwämme mit Hilfe eines Rotationsverdampfers für 6 Stunden bei 105 0C unter einem Vakuum von ca. 14 mbar gehalten.

Die Stabilität der verschiedenen Proben in PBS-Puffer wurde wie in Beispiel 3 beschrieben ermittelt. Die Figur 7 zeigt das Auflösungsverhalten der Proben 4- 1 bis 4-4 (die Abfolge der dargestellten Balken ist jeweils: 4-1, 4-2, 4-3, 4-4).

Es wird deutlich, dass durch die thermische Nachbehandlung die Lebensdauer der Schwämme unter physiologischen Bedingungen signifikant verlängert wer¬ den kann. Während die nicht nachbehandelte Probe 4-1 nach 14 Tagen bereits vollständig abgebaut ist, ist die thermisch nachbehandelte Probe 4-3 zu die¬ sem Zeitpunkt noch zu fast 50 % erhalten. Ein entsprechender Unterschied zeigt sich auch zwischen den Proben 4-2 (nicht nachbehandelt) und 4-4 (thermisch nachbehandelt), die jeweils 5 Stunden in der Gasphase vernetzt wurden. Nach 35 Tagen ist die Probe 4-2 vollständig aufgelöst und die Probe 4-4 noch zu über 70 % erhalten.

Neben der Erhöhung des Vernetzungsgrades und der Stabilität der Schwämme hat die thermische Nachbehandlung unter Vakuum auch den Vorteil, dass die in dem Formkörper verbleibende Restmenge an Vernetzungsmittel effektiv re¬ duziert werden kann, wodurch ein langwieriges Waschen vor der Verwendung vermieden oder zumindest verkürzt werden kann. Dies gilt insbesondere für mechanisch relativ feste Schwämme, die ausgehend von hohen Gelatinekon¬ zentrationen hergestellt wurden.

Für die Messung dieses Effekts wurden zwei Ansätze einer 18 Gew.-%igen Lö¬ sung von Schweineschwartengelatine (Bloom-Stärke 300) in Wasser durch Lö¬ sen der Gelatine bei 60 0C hergestellt, mittels Ultraschall entgast, und jeweils mit der ensprechenden Menge einer wässrigen Formaldehydlösung (1,0 Gew.- %ig, Raumtemperatur) versetzt, sodass 2000 ppm Formaldehyd (bezogen auf die Gelatine) vorlagen.

Die homogenisierten Mischungen wurden nach einer Reaktionszeit von 5 min auf 45 0C temperiert und maschinell mit Luft aufgeschäumt. Durch ein unter¬ schiedliches Verhältnis von Luft zu Gelatinelösung bei den zwei Ansätzen wur¬ den Zellstrukturen mit unterschiedlichen Dichten und Porengrößen gemäß Ta¬ belle 4 erhalten.

Das Gießen und Trocknen der aufgeschäumten Gelatinelösung erfolgten wie oben beschrieben, ebenso das Schneiden in Scheiben von 2 mm Dicke und der zweite Vernetzungsschritt unter Einwirkung von Formaldehyd-Dampf. Die Ver¬ netzungszeit betrug 17 Stunden. Tabelle 4

Nach der Bestimmung des Gehalts an überschüssigem Formaldehyd in den Schwämmen wurden die Proben einer thermischen Nachbehandlung bei 105 0C und einem Vakuum von ca. 14 mbar für eine Dauer von 4 Stunden (Probe 4-5) bzw. 10 Stunden (Probe 4-6) unterworfen. Danach wurde erneut der Restgehalt an freiem Formaldehyd ermittelt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 5 dargestellt.

Tabelle 5

Bei dem Schwamm 4-5 konnte der Formaldehydgehalt bereits nach 4 Stunden der thermischen Nachbehandlung um ca. 30 % gesenkt werden. Bei dem we¬ sentlich dichteren Schwamm 4-6 führte eine 10-stündige Nachbehandlung zu einer Senkung des Restgehaltes um ca. 40 %. Ein Restgehalt von ca. 0,2 Gew.-% stellt bei vielen medizinischen Anwendun¬ gen die physiologische Obergrenze für Formaldehyd dar. Es zeigt sich, dass dieser Wert durch die thermische Nachbehandlung in vielen Fällen erreicht werden kann, sodass die für das Waschen der Schwämme aufzuwendende Zeit erheblich verkürzt werden kann.

Beispiel 5: Herstellung von Formkörpern aus thermisch vorbehandelter Gelatine

Zum Vergleich wurde die Schweineschwartengelatine (Bloom-Stärke 300), welche zur Herstellung der Formkörper in den Beispielen 1 bis 4 eingesetzt worden war, einer thermischen Vorbehandlung analog der thermischen Nach¬ behandlung der Formkörper in Beispiel 4 unterzogen.

Dabei wurde die Gelatine für einen Zeitraum von 6 Stunden bei 105 0C unter einem Vakuum von ca. 14 mbar gehalten. Hierdurch erhöhte sich die Bloom- Stärke von 300 auf 310, die Viskosität stieg von 5,92 mPas auf 9,04 mPas (gemessen in einer 6,7 Gew.-%igen Lösung bei 60 0C) und das mittlere Mole¬ kulargewicht von 172 kDa auf 189 kDa.

Aus der unbehandelten bzw. der thermischen vorbehandelten Gelatine wurden vier verschiedene Folien analog dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt. Die Mengenangaben für die verschiedenen Ansätze ergeben sich aus der Tabelle 6. Abweichend von Beispiel 1 wurde für den ersten Vernet¬ zungschritt eine 2,0 Gew.-%ige wässrige Formaldehydlösung eingesetzt und der zweite Vernetzungsschritt erfolgte 2 Stunden über dem Gleichgewichts¬ dampfdruck einer 10 %igen wässrigen Formaldehydlösung. Tabelle 6

Die mechanischen Eigenschaften der Folien 5-1 bis 5-4 in trockenem Zustand sind in der Figur 8 dargestellt. Es zeigt sich, dass die Reißfestigkeit der aus der thermisch vorbehandelten Gelatine hergestellten Folien 5-2 und 5-4 gegenüber den entsprechenden, aus der unbehandelten Gelatine hergestellten. Folien 5-1 bzw. 5-3 deutlich erhöht ist. Hierdurch wird die Handhabbarkeit der Folien im Rahmen einer medizinischen Anwendung verbessert. Alternativ ist es möglich, aus der thermisch vorbehandelten Gelatine dünnere Folien mit vergleichbarer Reißfestigkeit herzustellen.

Bezüglich ihrer Langzeitstabilität unter physiologischen Bedingungen weisen die aus vorbehandelter Gelatine hergestellten Folien dieselben vorteilhaften Eigenschaften auf wie die Folien aus unbehandelter Gelatine.

Die thermisch vorbehandelte Gelatine eignet sich auch zur Herstellung von Formkörpern mit Zellstruktur analog dem Beispiel 3. Auch in diesem Fall wer¬ den vergleichbare Langzeitstabilitäten beobachtet wie bei der Verwendung der unbehandelten Gelatine. Durch die höhere Viskosität der vorbehandelten Gela¬ tine (in diesem Fall 9,04 mPas gegenüber 5,92 mPas) ist es möglich, die Gela¬ tinekonzentration der für die Herstellung der Schwämme eingesetzten Lösun¬ gen deutlich herabzusetzen. Da die Viskosität einer Gelatinelösung linear bis quadratisch mit der Konzentration steigt, kann an Stelle einer 12 Gew.-%igen Lösung von unbehandelter Gelatine eine 5-8 Gew.-%ige Lösung der thermisch vorbehandelten Gelatine eingesetzt werden. Die auf diese Weise hergestellten Formkörper mit Zellstruktur zeichnen sich durch dünnere Stege zwischen den Poren und eine niedrigere Dichte aus, wodurch wiederum die Flexibilität der Schwämme erhöht wird. Eine geringere Dichte bedeutet zudem, dass bei der Verwendung als Trägermaterial für Gewebeimplantate insgesamt eine gerin¬ gere Menge an Gelatine eingesetzt werden muss.

Beispiel 6: Herstellung von mehrlagigen Flächenmaterialien

Aus 33 g Schweineschwartengelatine (Bloom-Stärke 300), 53,25 g Wasser, 15,5 g Glycerin und 8,25 g einer 2,0 Gew.-%igen Formaldehydlösung wurde gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren eine Folie hergestellt, wobei die gerakelte Folie vor dem Trocknen 2 h bei 40 0C gehalten wurde.

Ein 2 bis 3 mm dicker Schwamm wurde entsprechend Beispiel 3, Ansatz 3-2 hergestellt.

Vor der zweiten Vernetzung wurden die beiden Flächenmaterialien mittels ei¬ ner Lösung aus Knochengelatine (Bloom-Stärke 160) miteinander verklebt. Das mehrlagige Flächenmaterial wurde anschließend, wie in Beispiel 2 be¬ schrieben, durch Einwirken von Formaldehyd-Dampf vernetzt. Alternativ zum hier beschriebenen Verfahren können die Folie und der Schwamm auch vor dem Zusammenfügen jeweils separat dem zweiten Ver¬ netzungsschritt unterworfen werden.

Statt der Verwendung einer Gelatinelösung als Kleber kann die Verbindung zwischen den beiden Flächenmaterialien auch so hergestellt werden, dass der getrocknete Schwamm in die gerakelte, noch nicht getrocknete Folie partiell eingedrückt wird. Bei beiden alternativen Vorgehensweisen wird ein bevorzugt vollflächiger Verbund der Flächenmaterialien erhalten.

Beispiel 7: Besiedlung von Schwämmen mit Chondrozyten

Für die Besiedlung mit Chondrozyten wurden die entsprechend den Ansätzen 3-1 bis 3-3 hergestellten Schwämme sowie die einfach vernetzte Referenzpro¬ be aus Beispiel 3, jeweils als Flächenmaterial mit einer Dicke von 2 mm, ein¬ gesetzt. Als Kulturmedium wurde DMEM/10%FCS/Glutamin/Pen/Strep ver¬ wendet, welches ein Standardmedium für die Kultivierung von Säugetierzellen ist.

Vor der Besiedlung muss überschüssiges Formaldehyd aus den Schwämmen entfernt werden, z.B. durch Waschen der Schwämme mit Kulturmedium oder Ethanol.

Auf die Flächenmaterialien wurden pro cm2 eine Million Schweine-Chondrozy- ten, suspendiert in 150 μl Kulturmedium, ausgesät.

Die nach einer Stunde vorgefundene Verteilung der Zellen innerhalb der Schwämme ist in der Figur 9 dargestellt. Die Percentile gibt den Anteil aller Zellen in Prozent an, die bis zur jeweiligen Besiedlungstiefe im Material verteilt sind. Die Zellverteilung ist auf Grund der offenporigen Struktur über die gesamte Dicke der Schwämme weitgehend gleichmäßig und wird durch den höheren Vernetzungsgrad der Schwämme 3-1 bis 3-3 gegenüber der Referenzprobe R nicht beeinträchtigt.

Beispiel 8: Kultivierung von Fibroblasten auf Folien

Für die Besiedlung mit Fibroblasten wurden die entsprechend den Ansätzen 2- 3 bis 2-6 hergestellten Folien eingesetzt. Als Kulturmedium wurde wieder DMEM/KP/oFCS/Glutamin/Pen/Strep verwendet.

Auch die Folien müssen vor der Besiedlung mit Zellen zur Entfernung von rest¬ lichem Formaldehyd gewaschen werden.

Auf die Folien wurden humane Vorhaut-Fibroblasten (0,5 Mio. Zellen / cm2) ausgesät und 6 Wochen im Medium bei 37 0C kultiviert.

Die Vitalität der Zellen wurde zweimal wöchentlich mikroskopisch untersucht. Dabei zeigte sich, dass die Fibroblasten auf allen Folien mindestens vier Wo¬ chen lebensfähig waren.

Weiterhin war nach vier Wochen trotz Protease-Produktion der Zellen noch keine der Folien abgebaut. Die stärker vernetzen Folien 2-5 und 2-6 waren sogar bis zu sechs Wochen stabil. Die Figur 10 zeigt eine lichtmikroskopisch Aufnahme der Fibroblasten auf der Folie 2-5 nach einer Kultivierungszeit von 14 Tagen. Da noch keine Auflösung des Materials eingesetzt hat, ist der Rand der Folie deutlich erkennbar.

Obwohl bei allen vorstehenden Beispielen Schweineschwartengelatine (Bloom 300) verwendet wurde, versteht es sich von selbst, dass vergleichbare Ergeb¬ nisse problemlos mit anderen Gelatinetypen und - Qualitäten erzielbar sind.