PROCEDE DE PRODUCTION DE JUS SUCRé à PARTIR DE BIOMASSE LIGNOCELLULOSIQUE AVEC RECYCLAGE AMéLIORé DES ENZYMES

Domaine de l'invention La présente invention s'inscrit dans la production de biocarburants dits de

"seconde génération". Il concerne un procédé de production de jus sucrés dans lequel l'hydrolyse enzymatique de substrats lignocellulosiques présente une amélioration de l'utilisation et du recyclage des enzymes mises en jeu. Les jus sucrés ainsi obtenus sont envoyés vers l'étape de fermentation alcoolique puis de distillation, en vue de la production d'un alcool ex-biomasse.

Etude de l'art antérieur

La ressource de biomasse lignocellulosique représente une source d'énergie renouvelable considérable et provient aussi bien des résidus agricoles et forestiers ou des sous-produits de transformation du bois que des cultures dédiées (plantes ligneuses ou herbacées). La matière lignocellulosique est constituée de trois éléments majeurs imbriqués dans un réseau complexe. Ces éléments sont la cellulose, les hémicelluloses et la lignine. Leurs proportions respectives varient selon l'origine exacte de la biomasse. La voie souvent préconisée pour obtenir des sucres fermentescibles à partir de cellulose est l'hydrolyse enzymatique. La dégradation de la cellulose en glucose nécessite l'action synergique de trois catégories d'enzymes, les cellulases, classées en fonction de leur activité :

- les endoglucanases coupent la cellulose aléatoirement au niveau des zones amorphes de la cellulose,

- les exoglucanases (ou cellobiohydrolases quand elles produisent du cellobiose) agissent de façon progressive sur les extrémités libres des chaînes de cellulose, libérant du glucose ou du cellobiose,

- les β-glucosidases (ou cellobiases) hydrolysent les cellodextrines solubles et le cellobiose en glucose.

Un des principaux verrous limitant actuellement le développement industriel de ce procédé est le coût élevé associé à la production des cellulases. Afin d'améliorer l'activité des cocktails enzymatiques commerciaux, une supplémentation

des cellulases avec des β-glucosidases est décrite dans la littérature, de façon à annihiler l'effet inhibiteur du cellobiose bien connu sur l'activité des endo- et exoglucanases.

Afin de réduire la quantité d'enzymes mises en oeuvre, différentes solutions ont été proposées pour pouvoir recycler ces enzymes. A la fin de l'hydrolyse enzymatique, les enzymes se retrouvent en partie sous forme libre dans l'hydrolysat et sous forme liée au résidu solide.

Dans le brevet FR-B-2 608 625 au nom de la Demanderesse, une méthode consistant à récupérer la majeure partie des enzymes est proposée : les enzymes libres sont récupérées par adsorption sur le substrat neuf à convertir, tandis que les enzymes liées sont réutilisées par recontactage du résidu solide avec le substrat neuf. Dans le cas où les cellulases sont supplémentées avec des β-glucosidases pour améliorer l'activité du cocktail enzymatique, la méthode proposée n'est toutefois pas satisfaisante : après recyclage, une perte d'activité importante est observée, associée à l'accumulation de cellobiose (Ramos et al, Applied Biochemistry and Biotechnology, 1994, 45 (6), 193-207). Cette méthode ne permet pas en effet de recycler efficacement les β-glucosidases libres qui n'ont que très peu d'affinité avec le substrat lignocellulosique.

La supplémentation des cellulases commerciales avec des β-glucosidases supportées est une méthode décrite par Woodward et al ("Use of immobilized beta- glucosidase in the hydrolysis of cellulose", 1993, ACS symposium séries, 533, 240- 250) qui permet de réutiliser plusieurs fois les β-glucosidases, sans perte d'activité ni diminution appréciable de la conversion de la cellulose en glucose. L'immobilisation des β-glucosidases permet d'améliorer notablement leur stabilité : Aguado et al. {Biotechnology and Applied Biochemistry, 1995, 17(1 ), 49-55) ont montré que l'immobilisation des β-glucosidases de Pénicillium funiculosum sur de la poudre de nylon permettait d'obtenir une activité stable pendant 1500 min à 50°C alors que ces mêmes enzymes à l'état libre se désactivent à partir de 40 ⁰ C. Les β-glucosidases d'Aspergillus niger sont quant à elles stables à l'état libre jusqu'à 45°C, tandis que sous la forme immobilisée sur Eupergit C, leur activité reste stable jusqu'à 65°C (Tu et al, 2006, Biotechnology Letters, 28 (3), 151-156). A ces températures, les cellulases sont en revanche peu stables, et se désactivent rapidement, ce qui impacte l'efficacité de l'hydrolyse.

Le recyclage des β-glucosidases supportées nécessitent de les extraire du mélange réactionnel contenant un résidu solide, ce qui ne peut pas être réalisé aisément lorsque les cellulases et les β-glucosidases sont utilisées dans le même réacteur. D'autre part, l'adsorption non productive des β-glucosidases sur la lignine est une source de limitation connue de l'hydrolyse enzymatique. Une des solutions connues pour limiter cette adsorption consiste à ajouter des surfactants et/ou des protéines tels que l'albumine de sérum bovin (ASB) (Yang et al., 2006, Biotechnology and Bioengineering, 94 (4), 611-617).

Ces principales limitations peuvent être levées en réalisant la mise en oeuvre du procédé de jus sucré selon la présente invention.

Résumé de l'invention Le procédé selon la présente invention consiste à produire des jus sucrés par hydrolyse enzymatique de substrats lignocellulosiques en réalisant la supplémentation des cellulases avec des β-glucosidases supportées, mises en oeuvre dans un réacteur séparé du réacteur d'hydrolyse enzymatique de la lignocellulose, l'hydrolysat H1 obtenu en sortie du réacteur (1 ) étant envoyé vers un moyen de séparation permettant d'extraire les cellulases avant d'être envoyé dans le réacteur (2).

La présente invention décrit également le dispositif dans lequel le procédé d'hydrolyse enzymatique est réalisé.

Description des figures

La Figure 1 représente un schéma du procédé selon la présente invention correspondant à la phase de conversion de la lignocellulose.

La Figure 2 représente un schéma du procédé selon la présente invention correspondant à la phase de production continue de jus sucrés. Les Figures 3 correspondent aux schémas du procédé de production de jus sucrés selon l'invention mis en oeuvre en mode discontinu, la Figure 3A correspondant à la phase de vidange des deux réacteurs et la Figure 3B à la phase de remplissage des réacteurs.

La Figure 4 représente un schéma du procédé selon la présente invention correspondant à la phase de vidange complète du réacteur d'hydrolyse enzymatique de lignocellulose.

Description détaillée de l'invention

La présente invention concerne un procédé de production de jus sucrés à partir de substrat lignocellulosique par hydrolyse enzymatique, dans lequel on réalise une supplémentation des cellulases avec des β-glucosidases supportées, dans un réacteur (2) séparé du réacteur (1 ) d'hydrolyse enzymatique de la lignocellulose, dans lequel ledit substrat, préalablement prétraité, est mis en contact avec une solution de cellulases, l'hydrolysat H1 obtenu en sortie du réacteur (1 ) étant envoyé vers un moyen de séparation permettant d'extraire les cellulases avant d'être envoyé dans le réacteur (2), ledit procédé comprenant une phase de conversion de la lignocellulose, une phase de production de jus sucrés et une phase de visange complète des réacteurs.

Le procédé selon l'invention permet notamment d'améliorer le recyclage des enzymes, en facilitant l'extraction des β-glucosidases du milieu réactionnel.

Un autre avantage du procédé selon la présente invention est de pouvoir dissocier les conditions de fonctionnement (température et éventuellement pH) des deux réacteurs et par conséquent de les optimiser dans le deuxième réacteur propre aux β-glucosidases. Les cellulases sont extraites en sortie de réacteur (1 ) et ne sont pas envoyés dans le deuxième réacteur.

De plus, dans le procédé de la présente invention, les β-glucosidases supportées ne sont pas en contact avec la lignine qui reste dans le réacteur dédié à l'hydrolyse enzymatique de la lignocellulose.

Le procédé selon la présente invention permet de produire un jus sucré, riche en glucose à partir de substrats lignocellulosiques.

Les substrats utilisés sont choisis parmi les pailles, le bois, les cultures forestières, les résidus de plantes alcooligènes, sucrières et céréalières, les résidus de l'industrie papetière et les produits de transformation des matériaux cellulosiques et lignocellulosiques.

Dans le procédé selon la présente invention, l'hydrolysat H1 obtenu en sortie de réacteur 1 est envoyé vers une membrane d'ultrafiltration (7) permettant d'extraire les cellulases.

Le procédé de production de jus sucré selon la présente invention comprend une phase de conversion de la lignocellulose, une phase de production proprement dite du jus sucré et une phase de vidange complète des réacteurs.

Pour mettre en oeuvre le procédé selon la présente invention, on met en contact dans le réacteur (1 ) un substrat lignocellulosique (S), préalablement prétraité, avec une solution de cellulases (E) dans des conditions de dilution, de température et de pH favorables à l'hydrolyse enzymatique de la lignocellulose. Le prétraitement réalisé selon les techniques connues par l'homme de l'art permet d'améliorer la susceptibilité du substrat pour l'hydrolyse enzymatique.

Lorsque le substrat commence à se liquéfier (Figure 1 ), la phase de conversion de la lignocellulose produit un hydrolysat extrait en continu du réacteur (1 ) dans un média filtrant (3) et dans un moyen de séparation (7) de façon à ce que la fraction solide (résidu solide de l'hydrolyse enzymatique) et les cellulases présentes dans le mélange réactionnel restent dans le réacteur (1 ). Après passage dans le média filtrant (3) et le moyen de séparation (7), l'hydrolysat (H1 ), contenant des oligomères solubles de glucose non fermentescibles, est injecté dans le réacteur

(2) où il est mis en contact avec des β-glucosidases supportées, dans des conditions de température favorables à l'hydrolyse des oligomères solubles de glucose

(cellobiose, cellotriose...) en glucose. Le temps de séjour du jus sucré (H1 ) dans le réacteur (2) est ajusté de façon à ce que la teneur en oligomères solubles résiduelles soit très faible (de préférence inférieure à 1 g/L) dans l'hydrolysat obtenu en sortie du réacteur (2).

La température dans le réacteur (1 ) est comprise préférentiellement entre 40 et 55°C et celle dans le réacteur (2) entre 40 et 70 ⁰ C.

Les conditions opératoires de température et/ou de pH des réacteurs (1 ) et (2) peuvent être différentes ou identiques.

De façon très préférée, les conditions opératoires des réacteurs (1) et (2) sont différentes. Très préférentiellement, la température dans le réacteur (1 ) est comprise

entre 45 et 55°C et la température dans le réacteur (2) est comprise entre 60 et 70 ⁰ C.

Le moyen de séparation (7) est préférentiellement une membrane d'ultrafiltration. En sortie de cette membrane, le perméat débarrassé des cellulases est envoyé dans le réacteur (2), alors que le rétentat est mélangé au flux (H2) sortant du réacteur (2). Ce mode de réalisation permet notamment de faire fonctionner le réacteur (2) par exemple à des températures plus élevées que celles couramment utilisées pour les cellulases.

L'hydrolysat pauvre en oligomères solubles (H2) est extrait en continu du réacteur (2) dans un média filtrant (4), de façon à ce que les β-glucosidases supportées présentes dans le mélange réactionnel restent dans le réacteur (2) : le choix du média filtrant (4) se fait en fonction de la granulométrie du support choisi pour immobiliser les enzymes supportées.

Lors de la phase de conversion, la majorité du flux (H2), et préférentiellement la totalité du flux (H2) produit est réinjecté dans le réacteur (1 ).

Lorsque la conversion est jugée suffisante, c'est-à-dire lorsque le dosage réalisé indique que l'on atteint la concentration souhaitée en sucres dans l'hydrolysat (H2), on démarre la phase de production proprement dite de jus sucrés, illustrée par les Figures 2 et 3. La phase de production du jus sucré peut se faire selon deux modes de réalisation : en mode continu ou en mode discontinu.

Selon le premier mode de réalisation, la phase de production est réalisée en mode continu. Le flux d'hydrolysat (H2) issu du réacteur (2) est séparé en au moins deux flux (H2a) et (H2b). Le flux (H2a) est introduit en continu dans un contacteur (5). Cet hydrolysat (H2a) est mis en contact dans l'équipement (5) avec du substrat lignocellulosique neuf (S) de façon à ce que les cellulases présentes dans l'hydrolysat (H2a) s'adsorbent sur le substrat neuf.

Le flux (H2b), pauvre en oligomères solubles, est réinjecté dans le réacteur (1 ) permettant ainsi d'améliorer les conditions de mélange dans le réacteur et de

favoriser l'activité des cellulases par l'effet diluant induit, les oligomères solubles, étant en effet connus comme produits inhibiteurs de l'activité des cellulases.

Le substrat neuf imprégné de cellulases (SE), issu du contacteur (5), est séparé de l'hydrolysat (H3) avant d'être envoyé dans le réacteur (1 ).

L'hydrolysat (H3) récupéré à la sortie du contacteur (5) correspond au flux de jus sucrés produit par le procédé.

Selon le deuxième mode de réalisation du procédé selon l'invention, la phase de production est réalisée en mode discontinu et se fait en deux étapes (Figures 3A et 3B), la première étape consistant en la vidange des réacteurs, et la deuxième au redémarrage.

On procède dans un premier temps à la vidange des réacteurs : le flux (H2) issu du réacteur (2) est envoyé dans le contacteur (5), où il est mis en contact avec du substrat lignocellulosique neuf (S) de façon à ce que les cellulases introduites dans l'hydrolysat (H2) en sortie du moyen de séparation (7) s'adsorbent sur le substrat neuf. L'hydrolysat (H3) obtenu en sortie du contacteur correspond au flux de jus sucré produit par le procédé.

à la fin de la phase de vidange des réacteurs, on procède au redémarrage de la phase de production en mode discontinu (Figure 3B), en introduisant le substrat neuf imprégné de cellulases (SE) dans le réacteur (1 ).

Lorsque la quantité de résidu solide accumulée dans le réacteur (1 ) devient trop importante, on procède à la vidange complète du réacteur (1 ) (Figure 4). Le mélange réactionnel récupéré est envoyé sur un média filtrant (6), de façon à séparer la fraction solide (résidu R), correspondant au résidu de l'hydrolyse enzymatique, puis vers le moyen de séparation (7) en sortie duquel on obtient une fraction liquide (H4).

Cette fraction liquide (H4) est un jus sucré. En vue d'optimiser la production en glucose, si cette fraction (H4) contient des oligomères solubles résiduels, il est possible de l'envoyer dans le réacteur (2) avant de l'extraire.

La fraction (H4), correspondant au flux produit par le procédé pendant la phase de vidange, peut éventuellement être en partie ou totalement réintroduite dans

le réacteur (1) lors de la phase de démarrage de l'hydrolyse enzymatique en réintroduisant des cellulases fraîches et du substrat neuf ou être utilisée pour imprégner du substrat neuf dans le contacteur (5).

La présente invention décrit également le dispositif dans lequel le procédé de production de jus sucré décrit précédemment est mis en oeuvre.

Ledit dispositif pour la production de jus sucré par hydrolyse enzymatique à partir de substrat lignocellulosique comporte :

- au moins un premier réacteur (1 ) d'hydrolyse enzymatique de la lignocellulose, ledit réacteur (1 ) étant muni d'au moins une conduite pour l'introduction de substrat et de la solution de cellulases, d'au moins une conduite pour soutirer le jus converti (H1 ) et l'envoyer vers au moins un média filtrant (3) placé en sortie du réacteur (1 ) et d'au moins un moyen de séparation (7), qui est préférentiellement une membrane d'ultrafiltration, pour extraire les cellulases de l'hydrolysat,

- éventuellement un échangeur thermique en sortie du premier réacteur (non représenté sur les figures),

- au moins un deuxième réacteur (2) comprenant les β-glucosidases supportées, relié audit moyen de séparation (7) par au moins une conduite, ledit réacteur (2) étant équipé en sortie d'au moins un média filtrant (4) et d'au moins une conduite pour l'extraction du flux (H2) constitué de l'hydrolysat pauvre en oligomères solubles, - au moins une conduite pour introduire au moins une partie du flux (H2) dans un contacteur (5) et au moins une conduite pour renvoyer au moins une partie du flux (H2) dans le réacteur (1 ),

- au moins un contacteur (5), muni d'au moins une conduite pour l'introduction du substrat neuf, d'au moins une conduite pour l'extraction du jus sucré produit (H3) et d'au moins une conduite pour la sortie du substrat neuf imprégné de cellulases et son introduction dans le réacteur (1 ).

Ledit dispositif comporte au moins un média filtrant (6) utilisé lors de la phase de vidange complète du réacteur (1 ), au moins une conduite pour l'extraction du résidu solide R, au moins une conduite pour l'extraction du flux (H4) de jus sucré produit et éventuellement au moins une conduite pour l'introduction du flux (H4) dans le réacteur (2).

Le réacteur (1 ) peut être une cuve mécaniquement agitée, ou non. L'agitation peut être également entièrement ou en partie assurée par la boucle de circulation du jus sucré autour du réacteur (1 ) (flux H2b ou flux H2), en utilisant des fortes vitesses d'injection.

Les médias filtrants (3) et (6) permettant d'extraire la fraction liquide du mélange réactionnel sont adaptés à la granulométrie du substrat lignocellulosique solide. Tout équipement connu de l'homme de l'art peut être utilisé pour réaliser ce fractionnement : système de filtration installé à l'intérieur ou à l'extérieur du réacteur incluant le système de rétro-lavage ou nettoyage associé (bougies filtrantes, grille mécaniquement raclée...), module de séparation externe avec réinjection de la fraction solide dans le réacteur (filtre-presse, centrifugeuse...). Le dimensionnement de ces équipements doit être adapté au volume à traiter.

Ces médias filtrants (3) et (6) peuvent éventuellement être confondus avec le moyen de séparation (7).

La mise en oeuvre des enzymes immobilisées dans le réacteur (2) peut être réalisée en lit fixe ou en lit mobile ou dans un réacteur de type slurry agité. Le média filtrant (4) a pour objet de maintenir les enzymes supportées dans le réacteur (2).

Dans le cas d'un lit fixe, qui est la mise en oeuvre préférée, ce média (4) peut être une grille ou un lit de garde installé dans le réacteur.

Pour les autres modes de réalisation (lit mobile ou réacteur de type slurry agité), les équipements décrits précédemment pour le média filtrant (3) peuvent convenir également au média filtrant (4).

Pour pallier la désactivation des β-glucosidases supportées, un appoint continu d'enzymes fraîches couplé à un soutirage d'enzymes désactivées peut être réalisé dans le cas des mises en oeuvre en lit mobile ou slurry. Dans le cas d'une mise en oeuvre en lit fixe, le remplacement des enzymes désactivées par des enzymes neuves se fait en mode discontinu lors de la phase de vidange des réacteurs (1 ) et (2) par exemple.

Le recyclage des cellulases effectué dans l'équipement (5) peut être réalisé par mise en contact de l'hydrolysat (H2a) ou (H4) avec du substrat lignocellulosique

frais prétraité, ledit contact se faisant par exemple par percolation ou par remise en suspension et séparation, de manière à récupérer les cellulases par adsorption, selon toute méthode connue par l'homme de l'art. L'équipement (5) peut donc être un équipement similaire à celui décrit pour l'ensemble réacteur (1 ) et média filtrant (3), dans lesquels on peut effectuer la remise en suspension et filtration du substrat.

L'équipement (5) peut également être tout type de technologie permettant de réaliser un contactage liquide-solide par percolation du liquide sur le solide en mode discontinu ou préférentiellement en mode continu. Dans le cas d'une mise en contact par percolation, l'équipement (5) pourra intégrer en outre un système de filtre presse permettant de réduire la quantité de jus sucré qui sera réintroduite dans le réacteur (1 ).

La préparation des β-glucosidases supportées ou immobilisées est réalisée à partir de β-glucosidases produites par des souches de champignons appartenant aux genres Trichoderma, Aspergillus, Pénicillium ou Schizophyllum, par exemple par

Aspergillus niger, Pénicillium funiculosum, ou par Trichoderma reesei. Ces souches peuvent avoir été génétiquement modifiées. Leur immobilisation est réalisée en utilisant tout type de support (solide ou gel) connu de l'homme de l'art (résines, Eupergit C, nanotubes de carbone activé, alumine recouverte d'une matrice polymère, poudre de nylon activée, alginate de calcium, chitosan...).

Les exemples suivants illustrent la présente invention sans en limiter la portée.

Exemple 1 : Hydrolyse enzymatique de paille de blé avec recyclage d'enzymes, selon l'enseignement du brevet FR-B-2 608 625 (β-glucosidases non supportées)

Un échantillon de paille de blé a été prétraité par explosion à la vapeur d'eau en présence d'acide sulfurique de façon à améliorer sa digestibilité, c'est-à-dire sa réactivité vis-à-vis de l'hydrolyse enzymatique. La composition de cet échantillon prétraité et lavé est la suivante : 56,5% de cellulose, 14,6% d'hemicellulose, 25,6% de lignine et composés extractibles (en % matière sèche). L'hydrolyse enzymatique de cet échantillon a été réalisée en présence de cellulases commerciales de SAF-

ISIS (référence XL-E508) complémentées avec des β-glucosidases commercialisées par Novozyme (référence SP-188). La quantité de cellulases utilisées dans les essais est exprimée en unités internationales "papier filtre" (uPF), celles des β- glucosidases en unités internationales "Ul" (1 Ul= 1 μmol de glucose produite par min à partir de cellobiose).

Une première série d'essais (A1 , B1 , C1 correspondant respectivement aux essais A, B et C réalisés dans les conditions 1 ) a été réalisée dans 3 réacteurs agités contenant chacun 100 g de substrat (exprimé en matière sèche), 480 uFP (cellulases), 1000 ul (β-glucosidases) dans un volume final de 1 litre. Le pH a été ajusté à 4,8 et la température à 50 ⁰ C. Après 72 heures de temps d'hydrolyse, les résidus solides ont été séparés par centrifugation et les sucres formés dans l'hydrolysat ont été dosés par chromatographie liquide à haute performance (HPLC). Une deuxième série d'essais (A2, B2, C2) a été réalisée dans des conditions identiques à celles de la première série d'essais, sauf en ce qui concerne les points suivants :

- l'essai B2 a été conduit sans ajout d'enzymes fraîches mais les enzymes solubles ont été recyclées par recontactage de l'hydrolysat obtenu à la fin de l'essai B1 avec le substrat neuf et 100% du résidu solide obtenu à la fin de l'essais B1 a été recyclé, - l'essai C2 a été conduit à l'identique de l'essai B2, en ajoutant 1000 ul de β- glucosidases fraîches.

Une troisième et dernière série d'essais (A3, B3, C3) a été réalisée dans des conditions rigoureusement identiques à celles de la deuxième série d'essais.

Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1. Les sucres produits après chaque série d'essais sont mesurés à partir du dosage des sucres présents dans l'hydrolysat final. Pour les séries B et C, la quantification des sucres produits au cours des 2 ^eme et 3 ^eme séries d'essais est réalisée en décomptant les sucres présents au démarrage de l'hydrolyse enzymatique (sucres contenus dans le résidu solide).

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Recyclage enzymes Recyclage enzymes

Cas de référence sans complémentation avec complémentation sans recyclage d'enzymes béta-glucosidase béta-glucosidase

Tableau 1 : Hydrolyse enzymatique de paille de blé avec ou sans recyclage d'enzymes

Les résultats de la série d'essais B, correspondant à la méthode décrite dans le brevet FR-B-2 608 625; montrent que les performances obtenues au cours des opérations 2 et 3 sont nettement dégradées : la production de glucose à l'issu des 3 opérations d'hydrolyse ne représente que 58% du cas de référence. Un ajout de β- glucosidases neuves au cours des opérations 2 et 3, réalisé pour la série d'essais C 0 permet d'améliorer les performances : la production de glucose à l'issu des 3 opérations d'hydrolyse représente 77% du cas de référence (essai A).

Exemple 2: Hydrolyse enzymatique de paille de blé avec recyclage d'enzymes et 5 utilisation de β-glucosidases supportées dans un réacteur séparé selon le procédé décrit dans la présente invention

Une série d'essais d'hydrolyse a été réalisée avec la même paille de blé que dans l'Exemple 1.

Une première opération d'hydrolyse D1 a été réalisée dans un réacteur agité contenant 100g de substrat (exprimé en matière sèche) et 480 uFP (cellulases) dans un volume final de 1 litre. Le pH a été ajusté à 4,8 et la température à 50 ⁰ C. Après 6 heures de temps d'hydrolyse, la fraction liquide du mélange réactionnel est extraite en continu à travers un média filtrant, type membrane d'ultrafiltration à un débit de 10 ml/min pour introduire en continu l'hydrolysat sans cellulases à l'aide d'une pompe dans un deuxième réacteur rempli d'un lit fixe de βf-glucosidases supportées sur Eupergit C, préparé selon le protocole décrit par Tu et al contenant 1000 ul (activité β-glucosidases). La température du deuxième réacteur est maintenue à 60 ⁰ C. L'intégralité du flux sortant de ce deuxième réacteur est réinjectée dans le premier réacteur d'hydrolyse enzymatique. Après 66 heures d'opération, on vidange les deux réacteurs. Le résidu solide est séparé par centrifugation et les sucres formés dans l'hydrolysat ont été dosés par HPLC. Une deuxième opération D2 a été réalisée dans des conditions identiques à celles de D1 , sauf en ce qui concerne les points suivants :

- l'essai D2 a été conduit sans ajout d'enzymes fraîches mais les enzymes solubles ont été recyclées par recontactage de l'hydrolysat obtenu à la fin de l'essai D1 avec le substrat neuf et 100% du résidu solide obtenu à la fin de l'essai D1 a été recyclé. Une troisième opération D3 a été réalisée dans des conditions rigoureusement identiques à celle de l'essai D2.

Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 2.

Cas de référence sans recyclage d'enzymes

Selon invention

Tableau 2 : Hydrolyse enzymatique de la paille de blé selon l'invention

L'utilisation de β-glucosidases supportées mise en oeuvre dans un réacteur séparé permet d'améliorer nettement les performances : la production de glucose à l'issu des 3 opérations d'hydrolyse représente 88% du cas de référence (essai A).

Exemple 3 : Hydrolyse enzymatique de pâte à papier avec recyclage d'enzymes, selon l'enseignement du brevet FR-B-2 608 625 (β-glucosidases non supportées)

Les séries d'essais décrites dans l'Exemple 1 ont été reconduites avec un échantillon de pâte à papier non blanchi. La composition de cet échantillon est la suivante : 70,3% de cellulose, 15,9% d'hemicellulose, 7,6% de lignine et composés extractibles (en % matière sèche). Les résultats obtenus, après 48 heures de temps d'hydrolyse, sont présentés dans le tableau 3.

Recyclage enzymes Recyclage enzymes

Cas de référence sans complémentation avec complémentation sans recyclage d'enzymes béta-glucosidase béta-glucosidase

Tableau 3 : Hydrolyse enzymatique de pâte à papier avec ou sans recyclage d'enzymes

Les résultats de la série d'essais B, correspondant à la méthode décrite dans le brevet FR-B-2,608,625, montrent que les performances obtenues au cours des opérations 2 et 3 sont nettement dégradées : la production de glucose à l'issu des 3 opérations d'hydrolyse ne représente que 70,1 % du cas de référence. Un ajout de β-glucosidases neuves au cours des opérations 2 et 3, réalisé pour la série d'essais C permet d'améliorer les performances : la production de glucose à l'issu des 3 opérations d'hydrolyse représente 77,3% du cas de référence (essai A).

Exemple 4: Hydrolyse enzymatique de pâte à papier avec recyclage d'enzymes et utilisation de β-glucosidases supportées dans un réacteur séparé selon le procédé décrit dans la présente invention

Une série d'essais d'hydrolyse enzymatique a été réalisée avec la même pâte à papier que dans l'Exemple 3 et dans des conditions de mises en oeuvre strictement identiques à celles décrites dans l'Exemple 2, avec un temps d'hydrolyse

limité à 48 heures et des quantités d'enzymes ajustées pour le nouveau substrat choisi (1400 uPF de cellulases et 5000 Ul de β-glucosidases immobilisées).

Tableau 4: Hydrolyse enzymatique de pâte à papier selon invention

L'utilisation de β-glucosidases supportées mise en oeuvre dans un réacteur séparé permet là encore d'améliorer nettement les performances : la production de glucose à l'issu des 3 opérations d'hydrolyse représente 92,5% du cas de référence (essai A).