TRIDIMENSIONNELLES PAR MOULAGE POUR L'INGÉNIERIE

TISSULAIRE Domaine technique

La présente invention se rapporte à un procédé de fabrication de microfibres dans des structures en trois dimensions, ainsi qu'à un substrat en alginate réticulé comprenant une microfibre ou une solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules à l'origine de la microfibre.

La présente invention se rapporte également à un kit pour la mise en œuvre du procédé de la présente invention, ainsi qu'à un substitut comprenant au moins deux microfibres.

Elle trouve des applications pour la réalisation de nouveaux modèles cellulaires d'étude in vitro en trois dimensions (3D), et dans le domaine médical, en particulier pour la médecine régénératrice par ingénierie tissulaire.

Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([ ]) renvoient à la liste des références présentée à la fin des exemples. Etat de la technique

Les deux principaux champs applicatifs du procédé, à savoir la modélisation cellulaire 3D et la médecine régénératrice, sont deux domaines en plein essor.

Le premier vise à combler le vide entre la boite de pétri (monoculture en deux dimensions (2D)) et le modèle animal pour l'étude et la compréhension des mécanismes de réponses cellulaires aux caractéristiques environnementales. Le modèle cellulaire d'étude in vitro 3D se présente comme une alternative plus prédictive et plus physiologique que la culture cellulaire 2D traditionnelle. Ces performances ont notamment été validées dans le domaine de la recherche en cancérologie. La médecine régénératrice quant à elle a pour but de fournir des substituts biologiques viables pour régénérer des tissus déficients ou créer des tissus fonctionnels implantables. Les principales avancées dans ce domaine se focalisent pour l'instant sur des tissus tels que la peau, le cartilage et la cornée.

Pour ces deux applications, les deux limitations majeures qui persistent sont la difficulté de vasculariser et/ou innerver les systèmes produits et la difficulté d'associer au sein d'un même système des types cellulaires variés. La vascularisation d'un système 3D est primordiale pour assurer la viabilité cellulaire au-delà de la limite de diffusion de 20Όμηη. Ainsi, la création d'une micro-vascularisation est cruciale pour assurer à chaque cellule l'apport nécessaire en oxygène et en nutriments ainsi que l'élimination des déchets. L'innervation des systèmes produits permettrait en outre d'obtenir des modèles et substituts plus évolués et mieux adaptés à la fonction recherchée. Par ailleurs, l'association et l'organisation de différents types cellulaires au sein d'un système sont impératives puisqu'elles conditionnent étroitement la capacité du système final à réaliser des fonctions spécifiques.

Deux types d'approches sont actuellement proposés :

- l'approche guidée où l'organisation cellulaire est physiquement orientée par divers processus (matrice de soutien ou scaffold, réutilisation de structures biologiques, bio-impression) ;

- l'approche spontanée où l'organisation cellulaire s'opère librement au sein de gels, de sphéroïdes, de patchs ou de feuillets.

Concernant la problématique de la vascularisation, les acteurs s'intéressent principalement à la fabrication de vaisseaux de gros diamètre (700-1 ΟΟΌμιτι de diamètre). Plusieurs méthodes ont ainsi été développées, par exemple sur la base d'auto-assemblage cellulaire ([1] Wystrychowskief al.) ou par culture in vitro de cellules formant un feuillet qui est ensuite enroulé de manière à former un vaisseau ([2] Bourget et a/.).Toutefois, ces techniques ne permettent pas de fabriquer des structures de diamètre plus faible, de type capillaire. Pour la fabrication de structures de type capillaire, les techniques actuelles reposent sur l'approche guidée via l'utilisation de fibres d'acide poly-(L-lactique)bio-fonctionnalisées recouvertes de cellules ([3] Weinandyef al.), de gels de collagène, ou de puces de polydimethylsoloxanes (PDMS) modifiées par lithographie ([4] Zheng et al.). Le micropatterning d'hydrogel biodégradable et de cellules ([5] Muraokaef al.), ou l'électrospinning qui permet de créer des fibres cellularisables à partir de polymères ([6] Stankusef al.) sont également utilisés.

Les principales limites des techniques existantes sont leurs coûts élevés, tant en termes de matériels que de matériaux. En outre, elles requièrent des compétences techniques spécifiques (stéréolithographie, electrospinning, etc.).

Concernant la problématique de l'assemblage et de l'organisation cellulaire, la technique la plus pointue est actuellement la bio-impression 3D, approche guidée qui mime la distribution spatiale des cellules constitutives de l'organe natif. Cette technique requiert une expertise aiguë et un équipement lourd et coûteux.

Perez et al. (Tissue Engineering Part A 2014, 20, p.103 [7]) décrivent l'utilisation de fibres de diamètre de 700 à 1000 microns ayant un cœur de collagène et une écorce d'alginate pour la libération de cellules souches dans le cadre de la régénération osseuse. Le procédé de préparation de ces fibres comprend l'utilisation d'une double canule concentrique pour produire la structure cœur-écorce des fibres. Cette canule doit être fabriquée spécifiquement, et permet uniquement la formation de fibres linéaires de diamètre supérieur à 700 microns. En outre, la structure de la gaine d'alginate est en un seul bloc.

En outre, pour une utilisation optimale dans les domaines identifiés ci-dessus, il serait important de pouvoir disposer de fibres de toute géométrie, c'est-à-dire de fibres qui ne sont pas nécessairement linéaires mais éventuellement coudées, ramifiées, à plusieurs « bras » de diamètres éventuellement différents. Aucune des techniques décrites pour fabriquer des fibres ne permet une telle flexibilité dans la structure des fibres obtenues.

Il n'existe pas à ce jour de méthodes faciles à mettre en œuvre, ne nécessitant pas de compétences techniques spécifiques et qui soient peu coûteuses pour répondre aux deux problématiques majeures mentionnées ci-dessus. En particulier, il n'existe pas de telles méthodes pour la fabrication de fibres, notamment de fibres de faible diamètre, comprenant des cellules, lesdites méthodes permettant d'obtenir des fibres de géométrie variée.

II existe donc un réel besoin de procédés palliant les défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, en particulier d'un procédé de production de microfibres comprenant des cellules, qui soit facile à mettre en œuvre, ne nécessitant pas de compétences techniques spécifiques, qui soit peu coûteux et permette de former des fibres de géométrie variée.

Exposé de l'invention

La présente invention répond précisément à ces besoins en fournissant un procédé de fabrication d'un substrat pour la production d'une microfibre, comprenant les étapes successives suivantes :

a. mise en contact d'un tube avec une solution de réticulation, b. mise en contact du tube avec une solution d'alginate, la solution d'alginate formant alors une gaine d'alginate réticulé à la surface externe du tube,

c. substitution du tube par une solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules, formant ainsi un substrat comprenant une gaine d'alginate réticulé traversée par un canal contenant une solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules.

Ce procédé de fabrication est particulièrement simple à mettre en œuvre, tant au niveau des matériaux que des équipements qui se retrouvent dans la plupart des laboratoires. En outre, l'apprentissage de ce procédé est particulièrement simple, notamment par rapport à l'electrospinning ou le micropatterning.

La mise en contact des étapes a) et b), et éventuellement des étapes ultérieures détaillées ci-après, peut être indépendamment réalisée par toute technique adaptée connue dans l'art. De préférence, la mise en contact est réalisée par immersion du tube dans la solution. Il peut également s'agir d'aspersion.

Dans la présente, on entend par « solution de réticulation », une solution comprenant au moins un composé adapté pour réticuler l'alginate lorsqu'elle est mise en contact avec celui-ci.

Avantageusement, la réticulation de l'alginate est réalisée par mise en contact avec une entité chimique dans le présent procédé car elle permet une meilleure maîtrise de la structure de la gaine d'alginate réticulé obtenue. La solution de réticulation peut être par exemple une solution comprenant au moins un cation divalent. La solution de réticulation peut également être une solution comprenant un autre réticulant connu de l'alginate, ou un solvant, par exemple de l'eau ou un alcool, adapté pour permettre une réticulation de l'alginate par irradiation ou par toute autre technique connue dans l'art. De préférence, la solution de réticulation est une solution comprenant au moins un cation divalent.

Selon l'invention, le cation divalent peut être tout cation permettant de réticuler de l'alginate en solution. Il peut s'agir par exemple d'un cation divalent décrit dans les documents [8] Bhurhbalef a/.et [9] Kuoef al. Il peut s'agir par exemple d'un cation divalent choisi dans le groupe comprenantCa ²⁺ , Mg ²⁺ , Ba ²⁺ et Sr ²⁺ , ou d'un mélange d'au moins deux de ces cations divalents. Le cation divalent, par exemple le Ca ²⁺ , est généralement présent en solution associé à un contre-ion pour former par exemple des solutions de typeCaC ou CaCO3, bien connues de l'homme du métier.

La solution de réticulation peut également être une solution comprenant du CaCO3 couplé à du Glucono delta-lactone (GDL) formant une solution de CaCO ₃ -GDL. La solution de réticulation peut également être un mélange de CaCO3-CaSO ₄ -GDL. De préférence, la solution de réticulation est une solution de CaC^.

L'homme du métier est à même d'ajuster la nature du cation et/ou du contre-ion aux autres paramètres du procédé de la présente invention, notamment à la nature de l'alginate utilisé et à la vitesse et/ ou au degré de réticulation désiré(e).

Toute concentration de cation divalent dans la solution de réticulation peut être utilisée pour réticuler l'alginate lors de l'étape (b). L'homme du métier est à même de déterminer la concentration de cation divalent à utiliser en fonction du cation divalent choisi et éventuellement d'autres paramètres tels que la nature de l'alginate ou la température de mise en contact. Par exemple, la concentration de cation divalent dans la solution de réticulation peut être comprise entre 10 et 1000mM. Par exemple, si le cation divalent est sous forme de CaC , il peut être présent dans la solution de réticulation à une concentration comprise entre 10 et 1000mM, de préférence entre 20 et 500mM, de préférence entre 50 et 400mM, de préférence à 200mM.

La solution de réticulation peut comprendre d'autres constituants, bien connus de l'homme du métier, que ceux décrit ci-dessus afin d'améliorer la réticulation de la gaine d'alginate dans les conditions, notamment temps et/ou température, particulières.

Selon l'invention, l'alginate peut être tout alginate, notamment en termes de longueur de chaîne et de distribution des deux types de monomères le constituant. Par exemple, il peut s'agir d'un alginate décrit dans le document [10] Lee et al.. De préférence, l'alginate est de l'alginate de sodium 10-60.

Le choix de l'alginate peut dépendre notamment de l'application utilisée, de la rigidité désirée pour la gaine, et de la géométrie finale de la fibre désirée.

Toute concentration d'alginate dans la solution d'alginate, permettant la réticulation de l'alginate à la surface du tube après mise en contact avec une solution de réticulation, peut être utilisée. L'homme du métier est à même de déterminer la concentration d'alginate à utiliser en fonction notamment des caractéristiques physiques du tube, de la composition de la solution de réticulation et de la gaine que l'on cherche à obtenir. Par exemple, la concentration d'alginate peut être comprise entre 0,5 et 10% en poids par rapport au poids total de la solution d'alginate. De préférence, la concentration d'alginate est comprise entre 0,5 et 5%, de préférence elle est de 2% en poids par rapport au poids total de la solution d'alginate.

L'homme du métier est à même s'il le désire de remplacer l'alginate par tout autre polymère biocompatible équivalent permettant la survie cellulaire, adapté en particulier pour laisser passer les nutriments et l'oxygène nécessaires à la survie des cellules et qui peuvent être présents dans le milieu de culture. De préférence, ledit polymère limite l'adhésion cellulaire, afin de faciliter l'étape de séparation de la fibre et de la gaine de polymère.

L'agent formant un hydrogel peut être tout agent capable de former un hydrogel lorsqu'il est placé dans des conditions appropriées, notamment en termes de température, et qui est compatible avec la présence de cellules.

Selon l'invention, l'agent formant un hydrogel peut être choisi notamment parmi le collagène de type 1 à 19, modifié ou non, la gélatine, le matrigel (marque déposée) qui est un mélange de protéines sécrétées par des cellules de sarcome de souris, la fibrine, l'acide hyaluronique, le chitosan et le mélange d'au moins deux de ces agents formant un hydrogel. De préférence, l'agent formant un hydrogel est du collagène, de préférence du collagène de type I. D'autres agents formant un hydrogel, bien connu de l'homme du métier peuvent également être utilisés. Il s'agit par exemple des agents formant un hydrogel cités dans les documents

[11 ] Lee et al. , [12] Lee et al. ou [13] Druryef al..

L'agent formant un hydrogel à utiliser peut être fonction de l'application destinée de la microfibre et/ou du type de cellules utilisé. Par exemple, le collagène peut être utilisé comme agent formant un hydrogel lorsque la microfibre est destinée à la régénération tissulaire dans le domaine de la peau, des os et/ou dans le domaine vasculaire ([12] Lee et al.). L'acide hyaluronique peut être utilisé lorsque la microfibre est destinée à la régénération osseuse ([14] Patterson et al.) ou la régénération du cartilage ([15] Chungef al.). La gélatine peut être utilisée lorsque la microfibre est destinée à la régénération musculaire ([16] Ostrovidovef al.) ou osseuse. La fibrine peut être utilisée lorsque la microfibre est destinée à la vascularisation ([17] Barreto-Ortiz et al.).

Selon l'invention, l'agent formant un hydrogel peut être présent dans la solution comprenant l'agent formant un hydrogel et des cellules à toute concentration permettant la formation d'un hydrogel. L'homme du métier est à même de déterminer la concentration appropriée d'agent formant un hydrogel. Par exemple, l'agent formant un hydrogel peut être présent dans la solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules à une concentration comprise entre 0,5 et 10mg/nnl, de préférence à 5mg/ml.

Selon un mode de réalisation de la présente invention, la solution de réticulation est une solution de CaC et l'agent formant un hydrogel est du collagène, de préférence du collagène de type I.

Les cellules utilisées dans le cadre de la présente invention dépendent de l'application destinée de la microfibre qui sera produite à partir de ces cellules. L'homme du métier sait quelles cellules utiliser en fonction de la destination de la microfibre.

Les cellules utilisées peuvent être des cellules de mammifères et par exemple des cellules humaines. Selon l'invention, les cellules de la solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules peuvent être choisies dans le groupe constitué des cellules primaires, des cellules souches adultes, embryonnaires ou induites, des cellules souches mésenchymateuses, des cellules somatiques endothéliales, des cellules autologues, des cellules progénitrices de type vasculaire, glomérulaire, dentaire, chondroblastique, ostéoblastique ou nerveux, en particulier des cellules progénitrices de type vasculaire ou ostéoblastique, et du mélange d'au moins deux de ces types cellulaires. Parmi les cellules progénitrices de type vasculaire on peut citer notamment les cellules de type HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) et les cellules endothéliales dérivées de cellules souches et notamment de cellules souches mésenchymateuses. Parmi les cellules progénitrices de type ostéoblastique, on peut citer notamment les cellules souches mésenchymateuses (dont celles issues de moelle osseuse), les cellules souches dérivées de la pulpe dentaire et les ostéoblastes. Dans un mode de réalisation, les cellules sont choisies parmi les cellules souches de type SCAP (Stem Cells from Apical Papilla), les cellules de type HFF (Human Foreskin Fibroblasts), les cellules de type HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells), les cellules de type EC (Embryonal Carcinoma cells), les cellules progénitrices de type D1 , les podocytes rénaux et un mélange d'au moins deux de ces types de cellules.

De préférence, les cellules sont choisies parmi les cellules souches de type SCAP (Stem Cells from Apical Papilla), les cellules de type HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells), les cellules progénitrices de type D1 , les podocytes rénaux et un mélange d'au moins deux de ces types de cellules. De préférence encore, les cellules sont choisies parmi les cellules souches de type SCAP (Stem Cells from Apical Papilla), les cellules progénitrices de type D1 et leur mélange.

Les cellules peuvent être présentes dans la solution comprenant l'agent formant un hydrogel et les cellules à toute concentration permettant leur développement. L'homme du métier est à même de déterminer la concentration de cellules en fonction notamment des cellules utilisées. Par exemple, les cellules peuvent être présentes dans la solution contenant l'agent formant un hydrogel et les cellules à une concentration comprise entre 1 et 100M/ml, de préférence entre 30 et 60 M/ml, et préférentiellement à une concentration de 50M/ml.

La solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules peut comprendre en outre d'autres composés, notamment des facteurs utiles au développement des cellules. Ces composés peuvent être par exemple des composés adaptés pour induire la différenciation des cellules et/ou des facteurs de croissance et/ou des cytokines. L'utilisation de tels composés permet notamment d'améliorer la multiplication et la différenciation des cellules. L'homme du métier est à même de déterminer quels composés utiliser, sous quelle forme et à quelle concentration, en fonctions des cellules utilisées.

Les facteurs de croissance peuvent, par exemple, être choisis dans le groupe comprenant les Fibroblast Growth Factors (FGFs), les Transforming Growth Factors (TGFs), les Insulin Growth Factors I (IGFs), les Platelet Derived Growth Factors (PDGFs), les Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) et les Vascular Endothelial Growth Factors (VEGFs). Préférentiellement, le facteur de croissance est choisi dans le groupe constitué par BMPs, FGFs, TGF beta et VEGFs. En particulier, le facteur de croissance est un BMP.

Les cytokines peuvent, par exemple, être choisies dans le groupe comprenant l'interleukine 1 , l'interleukine 6, l'interleukine 4, le Tumor Necrosis Factor alpha, le Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor et le Macrophage Colony-Stimulating Factor.

Les composés adaptés pour induire la différenciation des cellules peuvent, par exemple, être de l'hydroxyapatite (ostéoinducteur) ou du corail.

La solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules peut également comprendre du strontium, de l'or, des nanoparticules, etc.

Selon l'invention, le tube peut être un tube plein ou un tube creux.

De préférence, le tube est un tube creux. Cela permet avantageusement lors de l'étape (c) de substitution d'utiliser le tube directement pour effectuer le dépôt de la solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules au sein de la gaine d'alginate réticulé. Ladite solution est ainsi déposée dans la gaine d'alginate réticulé au niveau de l'extrémité du tube creux au fur et à mesure que celui-ci est retiré, de sorte que le vide laissé par le tube est comblé par ladite solution (e.g. par injection en exerçant une légère pression au niveau du piston d'une seringue comprenant ladite solution) ; ce qui permet de mouler ladite solution au sein de la gaine d'alginate. Ceci permet notamment d'éviter d'appliquer une trop forte pression à la solution comprenant les cellules.

Selon l'invention, le tube peut être par exemple un capillaire ou une aiguille creuse. Par exemple, le capillaire peut être un capillaire de polycarbonate, de polyméthacrylate de méthyle (PMMA), de polystyrène, de polyéthylène téréphtalateglycolisé (PETG), de polyphénylsulfone (PPSU - Radel (marque déposée)), de polysulfone (PSU - Udel (marque déposée)), de polymère d'oléofine polycyclique (Zeonor (marque déposée), Zeonex (marque déposée)), de polytetrafluoroéthylène (PTFE) ou de polypropylène. De préférence, le capillaire est un polymère de polycarbonate, de polyméthacrylate de méthyle ou de polystyrène, de préférence de polycarbonate.

Selon l'invention, le tube peut être de toute forme appropriée pour former un canal dans la gaine d'alginate réticulé. Par exemple, le tube peut avoir une section de forme circulaire, carrée, ovale, en forme d'étoile. De préférence, le tube est un tube creux ayant une section de forme circulaire ou ovale, de préférence circulaire.

Quelle que soit la forme de la section du tube, le diamètre moyen externe peut être compris entre 50 et Ι ΟΟΟμηη, de préférence entre 100 et 500μηη, de préférence entre 200 et 400μηη.

Quels que soient la forme de la section du tube et son diamètre moyen externe, le tube peut être de toute longueur. Par exemple, le tube a une longueur comprise entre 2 et 10 cm, par exemple entre 5 et 7 cm.

Ainsi, le canal formé dans la gaine d'alginate réticulé à l'issue de l'étape (c) peut avoir un diamètre sensiblement identique voire identique à celui du tube, à savoir un diamètre compris entre 50 et Ι ΟΟΟμηη, de préférence entre 100 et 500μηη, de préférence entre 200 et 400μηη.

Quels que soient la forme de la section du tube, son diamètre moyen externe et sa longueur, le tube peut être linéaire, ramifié, droit, courbé, présenter des angles, et/ou comprendre différentes parties de directions et/ou de diamètres différents. L'homme du métier est à même de choisir les caractéristiques (forme, diamètre, longueur,...) du tube adaptées pour obtenir l'architecture de fibre désirée. En particulier, l'homme du métier sait adapter les diamètres des différentes parties du tube le cas échéant pour permettre la mise en œuvre de chacune des étapes du procédé, en particulier de l'étape (c).

Lors de l'étape (a), le tube peut être mis en contact totalement ou partiellement avec la solution de réticulation. De même, lors de l'étape (b), le tube peut être mis en contact totalement ou partiellement avec la solution d'alginate. L'homme du métier comprend que les parties de tube qui sont mises en contact respectivement avec la solution de réticulation et avec la solution d'alginate doivent comprendre au moins une partie commune. L'homme du métier est à même de déterminer la longueur du tube devant être mise en contact avec chaque solution en vue de la fabrication d'une microfibre et de l'application de cette dernière.

Selon l'invention, après avoir été mis en contact avec la solution de réticulation lors de l'étape (a), le tube peut être retiré de la solution de réticulation avant d'être mis en contact avec la solution d'alginate selon l'étape (b).

Par ailleurs, lors de l'étape (a), le tube peut être mis en contact avec la solution de réticulation pendant toute durée permettant de réticuler l'alginate à la surface externe du tube lors de l'étape (b). Par exemple, le tube peut être mis en contact avec la solution de réticulation pendant une durée comprise entre 1 et 5 secondes. De même, lors de l'étape (b), le tube peut être mis en contact avec la solution d'alginate pendant toute durée permettant de réticuler l'alginate à la surface externe du tube. Par exemple, le tube peut être mis en contact avec la solution d'alginate pendant une durée comprise entre 1 et 5 secondes, de préférence entre 1 et 3 secondes. L'homme du métier est à même de déterminer les durées de mise en contact lors des étapes (a) et (b) afin d'obtenir une gaine d'alginate réticulé ayant les propriétés désirées, notamment le diamètre désiré, à la surface externe du tube. Chacune de ces durées peut notamment être indépendamment adaptée en fonction du type d'alginate utilisé, de la nature de la solution de réticulation, du diamètre du tube creux, ou de tout autre paramètre susceptible d'influencer le dépôt de la gaine d'alginate réticulé à la surface externe du tube.

Selon l'invention, l'enchaînement des étapes (a) et (b) peut être réalisé successivement plusieurs fois avant l'étape (c) de substitution du tube par la solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules. Cette répétition successive des étapes (a) et (b) permet notamment d'ajuster la taille de la gaine d'alginate réticulé autour du tube. L'homme du métier est à même de déterminer le nombre de fois où ces étapes doivent être réalisées successivement. Par exemple, les étapes (a) et (b) peuvent être réalisées successivement entre 2 et 100 fois, par exemple entre 2 et 50 fois, par exemple entre 10 et 20 fois, par exemple entre 7 et 10 fois.

Lorsque les étapes (a) et (b) sont réalisées successivement plusieurs fois, la composition de la solution de réticulation n'est pas nécessairement identique pour chacune des étapes (a). Par exemple, lorsque les solutions de réticulation sont des solutions comprenant un cation divalent, les natures et/ou les concentrations de cation divalent dans les solutions de cation divalent peuvent être identiques ou différentes. Il en va de même pour le temps de mise en contact du tube avec la solution de réticulation. Il en va également de même pour la concentration d'alginate dans la solution d'alginate et la durée de mise en contact du tube avec la solution d'alginate. L'homme du métier est à même de déterminer les solutions de réticulation, les concentrations du composé adaptées pour réticuler l'alginate lorsqu'elle est mise en contact avec celui-ci, les solutions de réticulation et les concentrations des solutions d'alginate, ainsi que les temps de mise en contact du tube avec chacune de ces solutions, ainsi que le nombre de répétitions des étapes (a) et (b) pour obtenir une gaine d'alginate de diamètre désiré à la surface externe du tube. De préférence, dans le cadre de la présente invention, les étapes

(a) et (b) sont réalisées successivement, en une ou plusieurs fois, de manière à ce que la gaine d'alginate réticulé à la surface du tube ait un diamètre externe compris entre 3 et 7 mm, de préférence entre 5 et 7mm.

L'alternance des étapes (a) et (b) permet notamment d'obtenir une structure de la gaine d'alginate réticulé en « pelure d'oignon » (ou multicouches), dont la structure est mieux contrôlée qu'une structure monobloc.

Dans certains modes de réalisation, l'ordre des étapes (a) et (b) peut être inversé. L'homme du métier est à même d'ajuster l'ordre de ces étapes en fonction notamment de la solution de réticulation utilisée. Par exemple, dans le cas où la réticulation est réalisée par irradiation UV ou par choc thermique, l'étape (b) peut être mise en œuvre avant ou simultanément à l'étape (a) qui permet la réticulation de l'alginate.

Le procédé selon la présente invention, permet, à l'issue de l'étape

(b) , d'obtenir un tube recouvert d'une gaine d'alginate réticulé. Lorsque le tube est un tube creux, le tube creux recouvert d'une gaine d'alginate réticulé constitue un « moule » qui peut être utilisé pour injecter une solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules. Ce tube creux recouvert d'une gaine d'alginate réticulé peut être utilisé extemporanément pour faire la substitution, par exemple 1 heure après l'opération de réticulation alors qu'il est conservé à une température inférieure à 20°C, dans du PBS 1 X. Ainsi, la présente invention se rapporte également à un tube, de préférence un tube creux, recouvert d'une gaine d'alginate réticulé, obtenu de préférence à l'issue de l'étape (b) du procédé selon la présente invention. Le tube peut être n'importe quel tube décrit dans la présente.

Le procédé selon l'invention peut également comprendre, préalablement à l'étape (c), une étape (b1 ) de mise en contact du tube recouvert par la gaine d'alginate réticulé avec une solution tampon. Cette étape permet de d'échanger l'eau contenue par la gaine avec la solution tampon pour éviter notamment les chocs osmotiques lors de la mise en contact ultérieure avec les cellules. Aussi cette étape permet de stocker le tube creux recouvert par la gaine d'alginate réticulé le temps de la préparation du mélange collagène/cellules. Par exemple, la solution tampon peut être une solution saline de phosphate (Phosphate Buffer Saline solution, PBS) ou une solution saline de Hanks (Hank's Balance saline solution, HBSS).

Selon l'invention, l'étape (c) de substitution du tube par une solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules peut être réalisée par injection de la solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules de façon concomitante au retrait du tube de la gaine d'alginate réticulée.

Selon l'invention, l'injection réalisée à l'étape (c) peut être réalisée par un moyen d'injection comprenant une solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules, et sur lequel est adapté un tube creux.

Le tube creux peut être adapté directement sur le moyen d'injection, par exemple directement sur une seringue ou sur l'embout d'une aiguille d'une seringue. Le tube peut également être adapté sur le moyen d'injection par l'intermédiaire d'un septum qui est lui-même adapté ou adaptable au moyen d'injection. Les septums utilisés peuvent être ceux disponibles dans le commerce, ou par exemple des septums préparés à partir de silicone dentaire (Aquasil, DENSPLY) étalé en couche de 2 mm puis découpé à l'aide d'un emporte-pièce de 5 mm. L'homme du métier est à même d'adapter le tube creux au moyen d'injection de manière à ce que le contenu du moyen d'injection, à savoir la solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules, puisse être injecté dans la gaine d'alginate réticulé par l'intermédiaire du tube creux.

Par exemple, le moyen d'injection peut être une seringue. Les moyens d'injections et septums sont des matériels d'utilisation courante qui peuvent être obtenus par exemple auprès de Dutscher. Dans un mode de réalisation, le moyen d'injection est une seringue de 1 mL, par exemple une seringue vendue sous la référence 300013 par Dutscher. Le procédé selon la présente invention permet, à l'issue de l'étape (c), d'obtenir un substrat comprenant ou consistant en une gaine d'alginate réticulé traversée par un canal contenant une solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules. Ce substrat est biocompatible et présente l'avantage de pouvoir être manipulé facilement, tout en maintenant la viabilité cellulaire. La présente invention a ainsi également pour objet un substrat comprenant ou consistant en une gaine d'alginate réticulé traversée par un canal contenant une solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules.

Le procédé selon la présente invention peut comprendre en outre une étape (d) de mise en culture du substrat obtenu à l'issue de l'étape (c) permettant le développement des cellules dans le canal, produisant ainsi une microfibre à l'intérieur de la gaine d'alginate réticulé.

Cette étape permet de produire une microfibre à partir des cellules présentes dans la solution d'agent formant un hydrogel et des cellules qui se situent dans le canal traversant la gaine d'alginate réticulé.

La mise en culture peut être réalisée dans des conditions classiques de culture cellulaire, bien connues de l'homme du métier. Par exemple, le substrat obtenu à l'étape (c) peut être mis en culture à 37°C dans un milieu de culture, par exemple sous une atmosphère à 5% de CO2. Par exemple, le substrat peut être placé au sein d'un incubateur de culture cellulaire. Le milieu de culture peut dépendre des cellules utilisées dans le cadre du procédé de la présente invention, mais également de l'application recherchée. L'homme du métier est à même de déterminer le milieu de culture approprié. Il peut s'agir par exemple d'un milieu de culture spécifique à chaque type cellulaire, par exemple un milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Médium) pour les progéniteurs ostéoblastiques, de préférence complémenté avec du sérum de veau fœtal associé ou non à des antibiotiques et/ou des agents de différenciation comme de l'acide ascorbique, par exemple un milieu Gibco® MEM Alpha, GlutaMAX™ sans acide ascorbique, de préférence additionné de 10% SVF décomplémenté (GE Healthcare PAA, réf : A1 1 -102 100ml) associé à 1 % PenStrep (GIBCO Life Technology, réf : 15140-122 100ml), pour des microfibres comprenant des cellules osseuses (microfibre SCAPs), par exemple des milieux Endothelial Cell growth Médium pour la culture et Endothelial cell growth Medium2 pour la différenciation (PromoCell), de préférence additionnés de 10% SVF décomplémenté (GE Healthcare PAA, réf : A1 1 -102 100ml) associé à 1 % PenStrep (GIBCO Life Technology, réf 15140-122 100ml), pour des microfibres comprenant des cellules de type HUVEC (microfibre HUVECs). L'étape (d) de mise en culture peut être réalisée par exemple pendant une durée comprise entre 1 et 21 jours pour des cellules utilisées pour la vascularisation et/ou les tissus osseux.

Les conditions de culture en fonction des cellules utilisées sont bien connues de l'homme du métier (par exemple celles décrites dans [18] Weinandyef al. ; [19] Baranskief al. ;[20]Chenef al.).

Lors de l'étape (d), le milieu de culture peut diffuser au travers de la gaine d'alginate réticulé, permettant de fournir les nutriments nécessaires à la viabilité des cellules et à leur organisation au sein de la microfibre. Au cours de cette étape, les cellules de la solution contenant un agent formant un hydrogel et des cellules se disposent principalement en périphérie du canal, à la surface de la gaine d'alginate réticulé (voir Figure 6).

Les composés adaptés pour induire la différenciation des cellules et/ou les facteurs de croissance et/ou les cytokines définis dans la présente peuvent également être ajoutés dans le milieu de culture utilisé lors de l'étape (d). Ces composés peuvent être ajoutés dans la solution comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules comme décrit ci- avant, et/ou dans le milieu de culture utilisé lors de l'étape (d).

A l'issue de l'étape (d) du procédé selon la présente invention, on obtient un substrat comprenant ou consistant en une gaine d'alginate réticulé traversée par un canal contenant une microfibre. Ce substrat est biocompatible, c'est-à-dire qu'il peut être mis en contact avec des cellules sans affecter leur viabilité, et présente l'avantage de pouvoir être manipulé facilement et de permettre la viabilité cellulaire. Il présente également l'avantage de pouvoir être stérile pour une utilisation in vivo ultérieure de la microfibre.

La présente invention a ainsi également pour objet un substrat comprenant ou consistant en une gaine d'alginate réticulé traversée par un canal contenant une microfibre. Est également décrit dans la présente un substrat obtenu ou susceptible d'être obtenu à l'issue de l'étape (d) du procédé selon la présente invention.

La taille de la microfibre dépend de la longueur du tube d'une part, mais également de son diamètre externe. La longueur de la microfibre est sensiblement la même que la longueur du canal traversant la gaine d'alginate réticulé et dépendant donc de la longueur du tube qui a été mise en contact avec les solutions de réticulation et d'alginate lors des étapes (a) et (b) du procédé de la présente invention. Le diamètre externe moyen de la microfibre peut être sensiblement inférieur à celui du tube. Par exemple, le diamètre moyen externe de la microfibre peut être de 1 ,1 à 2 fois plus petit que le diamètre moyen externe du tube. Les microfibres obtenues ou susceptibles d'être obtenues à l'issue de l'étape (d) ou de l'étape (e) du procédé selon la présente invention peuvent ainsi avoir tout diamètre, en fonction du diamètre moyen externe du tube. Par exemple, le diamètre moyen externe des microfibres selon l'invention peut être compris entre 50 et 500 μιτι, par exemple entre 100 et 300μηη. Jamais des microfibres de si petite taille n'ont été obtenues à ce jour par un procédé facile à mettre en œuvre et peu coûteux. Par ailleurs, la section de la microfibre peut avoir une forme différente en fonction de la forme de la section du tube utilisé.

Le procédé selon la présente invention peut comprendre en outre une étape (e) de séparation de la microfibre obtenue à l'étape (d) de la gaine d'alginate. Par exemple, l'étape (e) peut être réalisée par voie enzymatique à l'aide d'une alginate lyase, ou bien mécaniquement en tirant la gaine d'alginate et la microfibre dans des sens opposés. Un autre objet de la présente invention est une microfibre obtenue ou susceptible d'être obtenue à l'issue de l'étape (d) ou de l'étape (e) du procédé selon la présente invention.

L'étape (e) du procédé de la présente invention permet d'obtenir une microfibre prête à être utilisée. Cette microfibre peut être utilisée dans le domaine de la modélisation cellulaire 3D in vitro ou dans le domaine médical, notamment en médecine régénératrice que ce soit en orthopédie, chirurgie maxillo-faciale, ou tout autre domaine de médecine régénératrice. Par exemple, les microfibres peuvent être utilisées pour :

- la micro-vascularisation ou l'innervation des tissus issus de l'ingénierie tissulaire,

le patterning de cellules, par exemple de cellules nerveuses ou de cellules souches, pour la régénération tissulaire,

le développement de modèles d'études in vitro,

- des applications favorisant la perfusion de modèle tridimensionnel de culture cellulaire in vitro,

le transport de cellules, matériaux d'intérêt biologique, de molécules à intérêt thérapeutique, etc. Chacune des étapes du procédé de la présente invention peut être réalisée à toute température adaptée à la réticulation de l'alginate et/ou la substitution du tube creux par la solution content un agent formant un hydrogel et des cellules et/ou la mise en culture et/ou de séparation de la microfibre de la gaine d'alginate. L'homme du métier est à même de déterminer la température appropriée pour chacune de ces étapes. Par exemple, la température est généralement comprise entre 15 et 25 °C, de préférence entre 18 et 22 °C, préférentiel lement de 20°C, à l'exception des étapes de préparation du collagène qui se font à une température de 4°C ou sur de la glace. Les microfibres peuvent être associées entre elles. L'association peut avoir lieu entre des microfibres contenant le même type cellulaire ou des types cellulaires différents.

La présente invention a également pour objet un substitut comprenant le mélange d'au moins deux microfibres. Par exemple, chacune des microfibres peut comprendre un agent formant un hydrogel, identique ou différent, et des cellules identiques ou différentes. De préférence, les cellules des deux microfibres sont différentes. Par exemple, le substitut peut comprendre un mélange d'au moins deux microfibres, chacune des microfibres comprenant un agent formant un hydrogel et des cellules, les cellules de chacune des microfibres étant différentes d'une microfibre à l'autre. De préférence, les microfibres du substitut ont un diamètre compris entre 50 et 500 μιτι, en particulier compris entre 100 et 300 μιτι, plus particulièrement de 200 μιτι. De façon préférée, au moins une des microfibres du substitut a une structure ramifiée, c'est-à-dire qu'elle comprend plusieurs parties (bras), de diamètres identiques ou différents. Les microfibres comprises dans le substitut peuvent notamment être obtenues par un procédé selon l'invention. De préférence, le substitut comprenant au moins deux microfibres comprend au moins une microfibre comprenant des cellules osseuses (microfibre de SCAPs) et au moins une microfibre comprenant des cellules vasculaires (microfibre d'HUVEC). Par exemple, ladite au moins une microfibre comprenant des cellules osseuses et ladite au moins une microfibre comprenant des cellules vasculaires sont présentes en un ratio compris entre 1 :3 et 1 :5. Dans ce cas particulier, le substitut selon l'invention peut être un substitut osseux vascularisé.

Cette approche est une approche modulaire où chaque module, présenté sous la forme d'une microfibre correspond à un type cellulaire, à une organisation spécifique et ainsi à une fonction définie. La présente invention a également pour objet un kit pour la fabrication de microfibre ou d'un substrat pour la fabrication de microfibre. Ce kit peut permettre de mettre en œuvre le procédé de la présente invention.

Selon l'invention, le kit comprend

une solution de réticulation,

- un alginate, éventuellement en solution,

un moyen d'injection,

au moins un tube, de préférence un tube creux, adaptable sur l'embout du moyen d'injection de manière à pouvoir injecter un contenu du moyen d'injection.

Le contenu du moyen d'injection peut être par exemple une solution contenant un agent formant un hydrogel et des cellules.

Selon l'invention, le kit peut comprendre en outre :

une solution d'agent formant un hydrogel pour la mise en culture de cellules, et/ou

- un septum adapté ou adaptable au moyen d'injection et au tube creux.

La solution de réticulation, l'alginate, l'agent formant un hydrogel, le moyen d'injection, le tube creux et le septum peuvent être ceux définis dans la présente.

Le kit selon la présente invention peut également comprendre une notice d'utilisation.

D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif et non limitatif.

Brève description des figures

- La figure 1 représente un schéma de dispositif de maintien d'un capillaire. Ce dispositif comprend un capillaire (« Cap »), un septum (« Sep ») et un embout d'aiguille adaptable sur une seringue (« Emb »).

- La figure 2 représente un schéma de mise en œuvre des étapes (a) et (b) du procédé de la présente invention. Le capillaire est immergé successivement dans des solutions de chlorure de calcium (CaC ) et d'alginate de sodium (« Alg / Na »). A l'issue de ces étapes, une gaine d'alginate réticulé (« Alg / Ca ») est formée à la surface externe du capillaire.

- La figure 3 représente un schéma de dispositif de maintien d'un capillaire dont la surface est recouverte d'une gaine d'alginate réticulé et dont l'extrémité est coupée. Le fait de couper l'extrémité de la gaine permet de libérer l'extrémité creuse du capillaire.

- La figure 4 représente un schéma de remplissage d'une seringue à l'aide d'une micropipette contenant une solution constituée d'un agent formant un hydrogel et des cellules.

- La figure 5 représente un schéma de mise en œuvre de l'étape (c) du procédé de la présente invention. L'injection de la solution se fait de manière concomitante au retrait du capillaire de la gaine d'alginate réticulé.

- La figure 6 représente une microfibre composée de cellules

(« Cel ») à l'intérieur d'une gaine d'alginate réticulé (« Alg / Ca »). « Col » représente du collagène à l'intérieur de la microfibre.

- La figure 7 représente des vues au microscope à contraste de phase d'une gaine d'alginate (« Alg / Ca ») traversée par un canal contenant des cellules (« Cel ») et du collagène le jour (J0) et le lendemain (J1 ) de la substitution du capillaire par la solution de cellules et de collagène.

- La figure 8 représente des vues au microscope à contraste de phase d'une gaine d'alginate (« Alg / Ca ») traversée par un canal contenant des cellules (« Cel ») et du collagène le jour (J0) de la substitution du capillaire par la solution de cellules et de collagène et à J1 , J2, J3, J4, J7, J9 et J14. La microfibre se rétracte au cours du temps pendant l'étape (d) de mise en culture du substrat

- La figure 9 représente des vues au microscope à contraste de phase de la microfibre dans la gaine d'alginate réticulé 15 jours après la substitution du capillaire par la solution de cellules et de collagène (Figure 9A), de la microfibre 1 et 3 jours après avoir été séparée de la gaine d'alginate réticulé et disposée sur un support en plastique contenant un milieu de culture (Figure 9B et 9C respectivement).

- La figure 10 représente des vues au microscope confocal d'une microfibre séparée de la gaine d'alginate réticulé le jour 1 après la substitution du capillaire par la solution de cellules et de collagène. La figure 10A correspond à une vue transversale, la figure 10B à une vue du dessus et la figure 10C à une vue longitudinale de la microfibre. Le marquage réalisé (Marquage Dapi des noyaux des cellules, Marquage FITC du collagène) permet de visualiser la position des cellules (« Cel ») et du collagène (« Col »).

- La figure 1 1 représente une vue au microscope confocal d'une microfibre séparée de la gaine d'alginate 7 jours après la substitution du capillaire par la solution de cellules et de collagène. Le marquage réalisé (Marquage Dapi des noyaux des cellules) permet de visualiser la position des cellules (« Cel ») et l'alignement des cellules dans le sens longitudinal de la microfibre.

- La figure 12 représente une vue au microscope optique d'une microfibre entière obtenue à partir de cellules humaines de type SCAPs.

- La figure 13 représente une vue au microscope optique de microfibres obtenues à partir de cellules humaines de type SCAPs à J1 et

J7 de la substitution du capillaire par la solution de cellules et de collagène.

- La figure 14 représente une vue au microscope optique de microfibres obtenues à partir de cellules endothéliales humaines de type HUVECs à J1 et J7 de la substitution du capillaire par la solution de cellules et de collagène.

- La figure 15 représente une vue au microscope optique de l'assemblage issu de la co-culture de microfibres (sans leur gaine) obtenues à partir de cellules humaines de type SCAPs et de cellules endothéliales humaines de type HUVECs, à J0 et J2 après la mise en co- culture. EXEMPLES

Sauf indication contraire, l'ensemble des protocoles présenté dans les exemples ci-dessous a été réalisé en conditions stériles et à température ambiante (environ 20°C).

Exemple 1 : Protocole de mise en œuvre du procédé de la présente invention

Un capillaire (ParadigmOptics, Vancouver, USA) de 6cm de longueur et dont la coupe à une forme circulaire et un diamètre moyen externe de 200 ou 300μηη a été introduit dans un septum (Sigma-AIdrich, Saint Quentin Fallavier, France) préalablement adapté sur l'embout d'une aiguille 18 G (Dutscher, Brumath, France) (Figure 1 ). Ce dispositif a été adapté sur une seringue de 1 ml.

Une solution d'alginate a été préparée en mélangeant 2% poids/poids de d'alginate de sodium Profanai LF-10/60 (FMC Biopolymer, Drammen, Norway) dans de l'eau désionisée ou du PBS 1 X.

Une solution de réticulation a été préparée en ajoutant du chlorure de calcium (Sigma Aldrich) dans de l'eau désionisée de manière à obtenir une concentration de chlorure de calcium de 200mM.

Le capillaire a été plongé 2 secondes dans la solution de chlorure de calcium puis 2 secondes dans la solution d'alginate de sodium (Figure 2). Cette opération a été réalisée successivement 10 à 15 fois. Une gaine d'alginate de 5 à 7 mm de diamètre a ainsi été obtenue à la surface externe du capillaire.

Le capillaire et la gaine d'alginate ont ensuite été immergés dans du Phosphate buffer saline (PBS) 0.1 M (Sigma-AIdrich, Saint Quentin Fallavier, France) en attendant son utilisation (environ 20°C).

L'extrémité du capillaire gainé par l'alginate réticulé a été coupée afin d'éviter l'obstruction du capillaire (Figure 3).

Des cellules D1 de la lignée cellulaire murine D1 , ATCC (LGC Standards, Molsheim, France) ont été cultivées sur plastique dans du milieu DMEM à faible concentration de glucose (Gibco, Life Technologies) complémenté avec 10% de sérum de veau fœtal (Lonza), sous atmosphère contrôlée (5% de CO ₂ , 100% d'humidité, 37 ° C).

Une solution d'hydrogel a été préparée à partir de collagène de type I issu de queue de rat (BD Biosciences, Le Pont de Claix, France) selon le protocole du fournisseur, c'est-à-dire en ramenant le pH à 7 et en tamponnant au PBS 1 X.

Des cellules D1 et de la solution d'hydrogel ont été mélangées de manière à obtenir 30 μΙ de solution « hydrogel/cellules » par fibre fabriquée, dont la concentration cellulaire est de 50.10 ⁶ cellules/ml et la concentration de collagène est de 5mg/ml.

La quantité de solution « hydrogel/cellules » préparée dépend du nombre de cellules disponibles. Quel que soit le volume final de solution « hydrogel/cellules » préparé, la concentration cellulaire est de l'ordre de 50.10 ⁶ cellules/ml et la concentration de collagène est de l'ordre de 5mg/ml.

Le dispositif de maintien du capillaire a été retiré et 30 μΙ de cette solution « hydrogel/cellules » ont été prélevés à l'aide d'une micropipette afin de remplir l'extrémité de la seringue (Figure 4). Cette étape a été réalisée de cette manière afin de minimiser les pertes.

Le dispositif de maintien du capillaire a été adapté à nouveau sur la seringue.

Ensuite, le capillaire a été retiré de la gaine d'alginate réticulé tout en effectuant une pression sur le piston de la seringue afin de substituer la solution « hydrogel/cellules » au capillaire (Figure 5).

Une gaine d'alginate réticulé remplie de la solution « hydrogel/cellules » a ainsi été obtenue.

Le même mode opératoire a été mis en œuvre avec des cellules souches de type SCAP et des cellules endothéliales et des microfibres ont été obtenues. La figure 12 montre l'image en microscopie optique (grossissement 2,5x) d'une microfibre entière de 3,2cm de longueur préparée à partir de cellules souche de type SCAP (50M/ml) dans du collagène (5mg/ml).

La figure 13 montre l'image en microscopie optique (grossissements 2,5x et x10) de microfibres obtenues à partir de cellules souches humaines (SCAPs, 50M/ml) dans du collagène (5mg/ml), à J1 et J7 de la substitution du capillaire par la solution de cellules et de collagène.

La figure 14 montre l'image en microscopie optique (grossissement 2,5x et x10) de microfibres obtenues à partir de cellules endothéliales humaines (HUVECs, 50M/ml) dans du collagène (5mg/ml), à J1 et J7 de la substitution du capillaire par la solution de cellules et de collagène.

Exemple 2 : Maturation des cellules présentes dans la solution « hydrogel/cellules » au cœur de la gaine d'alginate réticulé

Une gaine d'alginate réticulé obtenue à l'issue de l'exemple 1 a été placée dans un milieu de culture DMEM (Gibco, Life Technologies) en boite de culture 6 puits.

La boite a ensuite été placée dans un incubateur à CO2 Thermo Scientific HERAcell (marque déposée) pendant 15 jours.

Au bout de ces 15 jours une microfibre de 100 μιτι de diamètre a été obtenue au cœur de la gaine d'alginate réticulé (Figure 6).

La microfibre a été séparée de la gaine d'alginate réticulé à l'aide d'une pince et d'une lame de scalpel. II a été observé que la microfibre s'est compactée dans la gaine d'alginate au cours de l'étape de maturation. Ce phénomène de compaction a été mis en évidence par des vues en microscopie à contraste de phase (Figure 7). Une cinétique de compaction a été réalisée de manière à déterminer la vitesse de compaction de la gaine d'alginate réticulé en fonction du temps de maturation. Les résultats présentés en

Figure 8 montrent que le diamètre moyen externe de la microfibre a été divisé par deux en quelques jours. Exemple 3 : Viabilité cellulaire

La viabilité cellulaire a été vérifiée en disposant la microfibre séparée de la gaine d'alginate réticulé dans un puits de culture en plastique (NUNC (marque déposée)) contenant un milieu de culture DMEM.

Il a été observé que les cellules de la microfibre étaient capables de coloniser le fond du puits dès le premier jour après la séparation de la microfibre de la gaine d'alginate réticulé. La colonisation s'est poursuivie également 3 jours après la séparation (Figure 9).

Exemple 4 : Co-culture de microfibres

Le même mode opératoire qu'à l'exemple 1 a été mis en œuvre avec des cellules souches de type SCAPs et des cellules endothéliales de type HUVECs et des microfibres ont été obtenues.

Pour la co-culture, environ 10cm de fibres au total ont été utilisés selon un ratio 1 :3 ; à savoir 1 SCAPs pour 3 HUVECs.

L'assemblage des différents types de microfibres, dépourvues de leur gaine comme précédemment décrit par voie mécanique, a été réalisé après 1 jour de culture de chaque type de microfibre dans leur gaine.

La figure 15 montre le résultat de l'assemblage observé, à J0 et J2 après la mise en co-culture.

Liste des références

[I] Wystrychowski et al. First human use of an allogeneic tissue- engineered vascular graft for hemodialysis access. J Vase Surg. 2013

[2] Bourget et al. Human fibroblast derived ECM as a scaffold for vascular tissue engineering. Biomaterials. 20 12 Dec;33(36):9205-13

[3] Weinandy et al. Biofunctionalised microfibre-assisted formation of intrinsic three-dimensional (3-D) capillary- like structures. Tissue Eng Part A. 2014

[4] Zheng et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proc Natl Acad Sei US A. 2012 Jun 12 ;1 09(24):9342-7 [5] Muraoka et al. Control of the formation of vascular networks in 3D tissue engineered constructs. Biomaterials. 2013 Jan;34(3):696- 703

[6] Stankus et al. Fabrication of cell micro integrated blood vessel constructs through electro hydrodynamic atomization. Biomaterials.

2007 Jun;28(17):2738-46

[7] Perez et al. Utilizing Core-Shell Fibrous Collagen-Alginate Hydrogel

Cell Delivery System for Bone Tissue Engineering, Tissue

Engineering Part A. January 2014, 20(1 -2): 103-1 14.

[8] Bhujbal et al. Factors influencing the mechanical stability of alginate beads applicable for immuno isolation of mammalian cells. J of mechanical behavior of biomédical materials 37 (2014) 196-208

[9] Kuoef al. lonically crosslinked alginate hydrogels as scaffolds for tissue engineering: Part 1 . Structure, gelation rate and mechanical properties, Biomaterials 22 (2001 ) 51 1 - 521

[10] Lee et al. Alginate: properties and biomédical applications ProgPolym

Sci. 2012 Jan;37(1 ):106-126

[I I] Lee et al. Hydrogels for Tissue Engineering, Chemicla Review, Volume 101 , Number 7 July 2001

[12] Lee et al. Biomédical applications of collagen, International Journal of Pharmaceutics 221 (2001 ) 1-22 [13] Drury et al. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications, Biomaterials 24 (2003) 4337-4351

[14] Patterson, Hyaluronic acid hydrogels with controlled dégradation properties for oriented bone régénération, Biomaterials 31 (2010) 6772-6781

[15] Chung et al. Influence of 3D Hyaluronic Acid Microenvironments on

Mesenchymal Stem Cell Chondrogenesis, Tissue Eng Part A. 2009

February ; 15(2): 243-254

[16] Ostrovidov et al. Myotube formation on gelatin nanofibers e Multi- walled carbon nanotubes hybrid scaffolds, Biomaterials xxx (2014) 1 -

10

[17] Barreto-Ortiz et al. A Novel In Vitro Model for Microvasculature

Reveals Régulation of Circumferential ECM Organization by

Curvature, 2013, P/os One, Volume 8 Issue 1 1

[18] Weinandy et a/.Biofunctionalised microfibre-assisted formation of intrinsic three-dimensional (3-D) capillary-like structures. Tissue Eng

Part A. 2014 Jan 23

[19] Baranskief al. Géométrie control of vascular networks to enhance engineered tissue intégration and function. Proc Natl Acad Sci U S A.

2013 May 7;1 10(19):7586-91

[20] Chen et al. Rapid anastomosis of endothelial progenitor cell-derived vessels with host vasculature is promoted by a high density of cotransplanted fibroblasts. Tissue Eng Part A. 2010 Feb;16(2):585-94