La présente invention concerne un procédé de préparation du trans- resvératrol et des ses analogues, ainsi que les intermédiaires de synthèse utiles selon ce procédé.

Le trans-resvératrol est une molécule naturelle et non-toxique, présente notamment dans les fruits rouges dont le raisin ; ce stilbène trihydroxylé présente de nombreuses activités biologiques et thérapeutiques et fait donc l'objet d'un grand nombre de travaux de recherche. A ce sujet, on pourra se référer notamment à l'ouvrage :N. Latruffe, D. Delmas, G. Lizard, C. Tringali, C. Spatafora, D. Vervandier-Fasseur, P. Meunier, Resveratrol against major pathologies: from diet prévention to possible alternative chemotherapies with new structural analogues, in: Bioactive Compounds from Natural Sources, Second Edition: Natural Products as Lead Compounds in Drug Discovery, C. Tringali Ed., CRC Press/Taylor & Francis Group, Boca Raton. (2011, ISBN:978-l-4398-2229-6.

frans-resvératrol

Le /raiîs-resvératrol est commercialisé. Cependant son prix reste élevé. Le resvératrol peut être obtenu soit par extraction de différentes parties de la vigne ou d'une plante asiatique, le Polygonum Cuspidatum. Il peut être aussi synthétisé par au moins trois méthodes :

la méthode de Perkin, effectuée en trois étapes dont une étape de décarboxylation nécessitant des températures élevées (G. Solladié, Y. Pasturel-Jacopé, J. Maignan, Tetrahedron, 59, 3315-21, 2003),

la méthode de Heck, impliquant l'utilisation d'un catalyseur à base de palladium ; cette voie de synthèse a fait l'objet de plusieurs publications (M. Guiso, C. Marra, A. Farina, Tetrahedron Letters, 43, 597-8, 2002 ; T. Jeffery, B. Ferber, Tetrahedron Letters, 44, 193-7, 2003) et notamment d'une demande de brevet (US 2007/0197819), la méthode de Wittig qui consiste à condenser un aldéhyde aromatique et un bromure de phosphonium benzylique en milieu basique, nécessitant la protection préalable des groupes phénoliques soit par un groupement silyle très encombré (G. R. Pettit, M. P. Grealish, M. K. Jung, E. Hamel, R. K. Pettit, J. C. Chapuis, J. M. Schmidt, J. Med. Chem., 45, 2534-2543, 2002) soit par un groupe méthyle (Y-Q. Li, Z-L. Li, W-J. Zhao, -X. Wen, Q-W. Meng, Y. Zeng, Eur. J. Med. Chem., 41, 1084-9, 2006). Toutefois, dans les deux cas, la réaction de déprotection à l'issue de la synthèse est difficile, les rendements sont faibles et la synthèse est difficilement transposable à l'échelle industrielle. En outre, lors de la déprotection des groupements méthyles, le réactif BBr ₃ utilisé est explosif.

II a maintenant été mis au point un nouveau procédé de synthèse du /raHi'-resvératrol et de composés analogues de formule (I), basé sur la réaction de Wittig. Plus particulièrement, ce procédé simple, économique, facilement transposable à l'échelle industrielle permet d'accéder, en un nombre limité d'étapes, et avec de bons rendements, à un grand nombre de dérivés stilbènes ayant une activité biologique, ceci grâce à l'utilisation de groupements protecteurs r judicieusement choisis.

En outre, le trans-resvératrol peut être aisément préparé selon ce procédé à partir de composés commerciaux : l'alcool 3,5-dihydroxybenzylique (1) et le 4- hydroxybenzaldéhyde (2).

Avantageusement les groupements protecteurs Pr mis en œuvre selon le procédé de l'invention permettent une protection et une déprotection dans des conditions relativement douces, simples et avec des rendements satisfaisants. Par ailleurs, ils ne comprennent pas de protons acides susceptibles d'être arrachés par la base présente dans la réaction de Wittig à l'étape i).

En outre, lorsque le procédé comprend la mise en œuvre de composés ayant des fonctions alcool benzylique, par exemple l'alcool 3,5-dihydroxybenzylique, les groupements protecteurs Pr pennettent avantageusement de protéger sélectivement les fonctions phénoliques. Enfin, ces groupements protecteurs ne sont pas sensibles aux réactifs d'halogénation, notamment de bromation, susceptibles d'être mis en œuvre lors de la préparation des composés de formule (II) ou (III). Ainsi, selon un premier aspect, l'invention a pour objet un procédé de préparation d'un composé de formule (I :

(I)

dans laquelle :

Rj, R ₂ , représentent chacun indépendamment H, Br, Cl, F, un groupe alkyle en C _J -C _Ô , un groupe alcényle en C ₂ -C ₆ , un groupe alkoxyle en C]-C ₆ ou un groupe CH ₂ OR ₃ ;

R ₃ représente H, un groupe alkyle en C ₁ -C] _2s un groupe aryle en C ₆ -Cio, ou un groupe hétérocyclique ayant de 5 à 7 chaînons ;

m et n sont chacun indépendamment un nombre entier compris entre 0 et

5 ;

p, q sont chacun indépendamment un nombre entier compris entre 0 et 4 ; étant entendu que :

m + n > 1 ;

m + p < 5 ; et

n + q < 5 ;

Ledit procédé comprenant les étapes de :

i) Couplage d'un composé (II) avec un composé (III) en présence d'une base selon une réaction de Wittig, ce par quoi on obtient un composé de formule (IV)

(11) (I II) (iV)

Ri, R ₂ , m, n, p et q étant tels que définis ci-dessus,

Pr est un groupement protecteur de formule -C(=0)R4 ;

R4 est un groupe alkyle en C1-C12, un groupe aryle en C ₆ -Cio, un groupe (C6-Cio)aryl(C]-C ₄ )alkyle, ou un groupe hétérocyclyle, lesdits groupes aryles ou hétérocyclyles étant éventuellement substitués par au moins un groupe R ₅ ;

R ₅ est, à chaque occurrence, choisi indépendamment parmi un groupe alkyle en Ci-C ₆ , un groupe alkoxyle en Cj-Cg, un atome d'halogène, un groupe N0 ₂ ou C≡N ; X, Y représentent, chacun indépendamment, un groupe C(=0)H ou un groupe CH ₂ PPh ₃ Hal, étant entendu que l'un de X ou de Y est C(=0)H, l'autre étant CH ₂ PPh ₃ Hal ;

Hal est Cl, Br ou I,

et

ii) Déprotection du composé (IV) obtenu à l'étape i), ce par quoi on obtient le composé (I).

Etape i)

L'étape i) selon le procédé de l'invention consiste à coupler, selon une réaction de Wittig, les composés de formule (II) et (III), dans lesquelles l'un de X et de Y représente C(=0)H, l'autre étant CH ₂ PPh ₃ Hal.

La réaction de Wittig est une réaction bien connue de l'homme du métier. Pour plus d'informations concernant cette réaction et les conditions pouvant être mises en œuvre, on pourra se référer notamment aux publications suivantes : J. Med. Chem., 45, 2534 (2002) ; Carbohydr. Res. 301, 95 (1997) ; An. Quim. Ser. C, 81, 157 (1985) ; Bioorg. Med. Chem., 14, 3231 (2006) ; J Med. Chem., 34, 2579 (1991) ; Tetrahedron Letters, 37, 4225 (1996) ; J Med. Chem., 48, 287 (2005) ; J. Org. Chem., 63, 8125 (1998) ; Anti cancer Drug Design, 16, 185 (2001) ; Bioorg. Med. Chem. Letters, 14, 463 (2006).

Elle consiste en l'addition d'un ylure de phosphore sur un composé carbonylé, en l'occurrence un aldéhyde, pour former un composé éthylénique, notamment substitué. L'ylure de phosphore résulte de l'élimination de l'un des atomes d'hydrogène lié au carbone en alpha de l'atome de phosphore, grâce à la présence d'une base, qui peut être une base organique ou minérale.

A titre d'exemple, lorsque X est CH ₂ PPh ₃ Hal, la formation de l'ylure de phosphore (II _y ) peut être représentée de la façon suivante :

(II) (Hy) (liy) sel de phosphonium ylure de phosphore ylure de phosphore L'étape (i) du procédé peut être réalisée en présence d'une base très forte, notamment choisie parmi les bases lithiées (RLi), les hydrures de métal alcalin (H ^" ), ou les ions amidures (R^N ^" , ΝΗ ₂ ^' ).

Toutefois, lorsque le carbone en alpha du phosphore porte un cycle aromatique substitué par un groupe mésomère attracteur capable de stabiliser la délocalisation du doublet porté par le carbone, une base moins forte, choisie notamment parmi les aminés aliphatiques, notamment primaires, secondaires ou tertiaires, telles que la triéthylamine ou la pipéridine peut suffire.

Par « base très forte », on entend, au sens de la présente description, une base dont le pKa est supérieur à 20.

Par « base moins forte », on entend une base dont le pKa est inférieur à 20, notamment compris entre 9 et 19.

Comme exemples de bases lithiées, on peut citer notamment le butyl lithium (BuLi), le phényl lithium (PhLi).

Comme exemple d'amidures, on peut citer notamment l'amidure de sodium (NaNH ₂ ) ou le diisopropylamidure de lithium (LDA).

Comme exemples d'hydrures de métal alcalin, on peut citer notamment l'hydrure de sodium (NaH).

La quantité de base présente dans le milieu n'est pas critique. Elle peut varier entre 1 et 2 équivalents molaires par rapport au sel de phosphonium (i.e X ou Y = C¾P(Ph) ₃ Hal) et est de préférence comprise entre 1 et 1,4 équivalents.

La réaction peut avoir lieu dans une large gamme de températures, notamment entre 5 et 30°C. De préférence, la réaction est réalisée à une température comprise entre 10 et 25°C.

Le temps requis pour la réaction peut varier dans une large mesure, en fonction de nombreux facteurs, notamment en fonction de la température de réaction et de la nature des réactifs. Généralement, une durée comprise entre 2 et 5 heures est généralement suffisante.

L'étape i) est généralement réalisée dans un solvant qui peut être aisément choisi par l'homme du métier.

Par « solvant », on entend, au sens de la présente description, un liquide capable de dissoudre ou de diluer les réactifs mis en œuvre dans la réaction, sans les modifier et sans lui-même se modifier dans les conditions de température et de pression dans lesquelles est réalisée la réaction. Le solvant peut être un solvant organique, notamment aprotique polaire. A titre d'exemples, on peut citer notamment les éthers tels que l'éther diéthylique ou le tétrahydrofuranne, ou encore les autres solvants oxygénés tels que le diméthylformamide, ou encore les hydrocarbures halogénés tels que le dichlorométhane.

Le groupement protecteur Pr des fonctions phénoliques éventuellement présentes sur les composés de formule (II) et/ou (III) est avantageusement stable dans les conditions basiques mises en œuvre à l'étape i). En particulier, Pr ne présente pas d'atome d'hydrogène acide susceptible d'être éliminé lors de cette étape.

Selon un mode de réalisation, le groupe protecteur Pr de formule - C(=0)R est tel que R4 est un groupe aryle en C ₆ -Cio _, éventuellement substitué par au moins un groupe R5, par exemple un groupe alkyle en Ci -Ce.

Selon un mode préférentiel, ¾ est un groupe toluoyle C¾(C6H ₄ )-, de préférence un groupe jarotoluoyle.

Avantageusement, le composé (IV) obtenu à l'étape i) peut être directement déprotégé à l'issue de la réaction de Wittig, notamment par hydrolyse, sans qu'il soit nécessaire de l'isoler préalablement à l'étape ii). La réaction peut donc avantageusement être réalisée dans un seul réacteur (procédé dit « one pot » ou monotope).

Selon un mode de réalisation, le composé de formule (IV) obtenu est récupéré à l'issue de l'étape i), avant réalisation de l'étape ii).

Le composé (IV), de même que les intermédiaires de synthèse décrits ci- après, peuvent être récupérés à partir du mélange de la réaction par les moyens traditionnels. Par exemple, les composés peuvent être récupérés en distillant le solvant du mélange de la réaction ou si nécessaire après distillation du solvant du mélange de la solution, en versant le reste dans de l'eau suivi par une extraction avec un solvant organique immiscible dans l'eau, et en distillant le solvant de l'extrait.

En outre, le produit peut, si on le souhaite, être encore purifié par diverses techniques, telles que la recristallisation, la reprécipitation ou les diverses techniques de chromatographie, notamment la chromatographie sur colonne ou la chromatographie en couche mince préparative.

Etape ii)

L'étape ii) du procédé selon l'invention consiste à éliminer les groupements protecteurs Pr présents sur les fonctions phénoliques. Cette étape (ii) comprend généralement une hydrolyse en conditions basiques du composé (IV) puis une acidification du milieu obtenu.

Par « hydrolyse en conditions basiques », on entend, au sens de la présente description, la mise en contact du composé (IV) avec un excès de base minérale, en milieu organoaqueux.

L'étape ii) peut notamment être réalisée dans un mélange de solvant organique et d'eau, le solvant organique étant de préférence miscible avec l'eau. A titre d'exemple, cette étape peut être réalisée dans un mélange alcool/eau, en particulier méthanol/eau.

La base minérale utile pour réaliser cette étape de déprotection peut être notamment choisie parmi les hydroxydes de métal alcalin ou alcalino-terreux, tels que l'hydroxyde de potassium.

La quantité de base mise en œuvre dans cette étape peut varier de 2 à 10 équivalents molaires, notamment de 3 à 5 équivalents molaires.

La réaction peut avoir Heu dans une large gamme de températures, notamment à température comprise entre 25 °C et 50°C, en particulier à 30°C environ.

Après hydrolyse basique, le milieu obtenu est acidifié par addition d'une solution aqueuse acide, par exemple une solution d'acide chlorhydrique, dans une quantité suffisante pour amener le pH du milieu à une valeur comprise entre 1 et 2.

Une quantité suffisante d'une solution aqueuse basique, par exemple une solution de soude, peut être ensuite ajoutée au mélange ainsi acidifié, de manière à obtenir un pH compris entre 4 et 5.

Le composé de formule (I) obtenu peut être ensuite récupéré.

Etape iii)

Le procédé selon l'invention peut comprendre une étape iii) subséquente à l'étape ii) de séparation et de récupération des stéréoisomères cis et/ou trans du composé de formule (I) obtenu.

Ces stéréoisomères peuvent être séparés de leurs mélanges, par l'application ou l'adaptation de procédés connus, par exemple par chromato graphie ou recristallisation.

De préférence, le stéréoisomère trans est récupéré.

Selon un mode de réalisation, le composé de formule (I) est le resvératrol de formula (la) :

Selon un mode de réalisation particulier, l'isomère trans du resvératrol est récupéré.

Le composé de formule (la) peut être préparé selon une étape (i) comprenant le couplage d'un composé (Ha) et (Illa) :

(lia) (Illa) (IVa)

Les composés de formule générale (II) ou (III) , (Ha) ou (Illa), peuvent être préparés par application ou adaptation de toute méthode connue en soi de et/ou à la portée de l'homme du métier, notamment celles décrites par Larock dans Comprehensive Organic Transformations, VCH Pub., 1989, ou par application ou adaptation des procédés décrits ci-après ou dans les exemples qui suivent.

Le composé de formule (Ha) peut être préparé à partir d'un composé

(Va) :

(Va) (lia)

A titre d'exemple, cette étape peut être réalisée en faisant réagir un composé (Va) avec de la triphénylphosphine (PPh ₃ ) dans le toluène.

Le composé (Va) peut être préparé à partir d'un composé (Via) :

(Via) (Va)

A titre d'exemple, cette réaction peut être réalisée en faisant réagir un composé (Via) avec du N-bromosuccinimide (NBS) en présence de triphénylphosphine (PPI13) dans le dichlorométhane. La réaction peut être réalisée à température ambiante pendant 1 heure.

De façon avantageuse, les groupements protecteurs Pr, qui forment avec les fonctions phénoliques, des groupements esters carboxyliques ne sont pas sensibles aux réactifs de bromation, dans la mesure où ceux-ci ne contiennent pas d'acide bromhydrique.

Par ailleurs, alors que la forme non protégée du composé (Va) est instable, la présence des groupements protecteurs Pr permet d'obtenir un composé (Va) très stable.

Le composé de formule (Via) peut être préparé à partir d'un composé

(Vlla)

(Vlla) (Via)

A titre d'exemple, cette réaction peut être réalisée en faisant réagir un composé de formule (lia) avec un chlorure d'acide de formule C1C(=0)R4 dans l'acétone, en présence d'une base minérale telle qu'un carbonate de métal alcalin ou alcalino-terreux, par exemple K ₂ C0 ₃ .

De façon avantageuse, il y a lieu de noter que les groupements protecteurs Pr permettent de protéger sélectivement les fonctions phénols par rapport aux fonctions alcool benzylique.

Le composé (llla) peut être préparé à partir d'un composé (Villa) ;

(Vi l la) ( ^{l i!a} )

Cette réaction peut être réalisée dans des conditions analogues à celles décrites ci-dessus pour la préparation composé (Via).

Selon un deuxième aspect, l'invention concerne les composés de formule

(Ha) :

("a) dans laquelle Pr est tel que défini ci-dessus.

Selon un autre aspect, l'invention concerne les composés de formule

(Via)

■ (Via)

dans laquelle Pr est tel que défini ci-dessus.

Selon encore un autre aspect, l'invention concerne les composés de formula (Ma)

OHC— <\ /)—OPr

(Nia)

dans laquelle Pr est tel que défini ci-dessus.

Selon un autre aspect, l'invention concerne les composés de formule

(IVa)

(IVa)

dans laquelle Pr est tel que défini ci-dessus.

Selon un mode de réalisation préférentiel, l'invention concerne les composés de formules (Ha), (Illa), (IVa) ou (Via) ci-dessus, dans lesquelles Pr est un groupe -C(=0)Ph, où Ph est éventuellement substitué par un groupe alkyle en (Ci-C ₆ ), de préférence un groupe toluoyle, plus préférentiellement un groupe aratoluoyle.

Ces composés sont particulièrement utiles pour la préparation des composés de formule (I) en un nombre limité d'étapes et avec de bons rendements.

Selon un autre aspect, l'invention concerne les composés de formule

(A) :

(A) Dans laquelle R ₂ est -CH=CH ₂ ou Br, en particulier le stéréoisomère trans de ces composés.

De préférence, R ₂ est en position para.

Selon encore un autre aspect, l'invention a pour objet les compositions pharmaceutiques comprenant un composé de formule (A _£ ), et éventuellement un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

Dans laquelle R ₂ est -CH=C¾ ou Br. De préférence, R ₂ est en position para. Ces composés présentent avantageusement une activité très supérieure à celle du trans- resveratrol.

"Pharmaceutiquement acceptable" signifie, au sens de la présente description, que c'est, dans la portée d'un jugement médical valable, adapté pour une utilisation en contact avec les cellules des humains et des animaux inférieurs sans toxicité, irritation, réponse allergique indue et similaires, et sont proportionnés à un rapport avantage/risque raisonnable.

Selon un autre aspect, l'invention a pour objet un composé de formule (AE) pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention :

du cancer (M. Jang, L. Cai , G.O.Udeani , K.V. Slowing , CF. Thomas , C.W.W.

Beecher , H.S. Fong , N. R. Farnsworth , A .D. Kinghorn , R.G. Mehta , R.C. Moon,

J. M. Pezzuto , Science, 275, 218-20 (1997))

des maladies cardio-vasculaires (G. Stef, A. Csiszar, K. Lerea, G. Veress, J Card. Pharm., 48, 1-5 (2006)) ou

des maladies neurodégénératives (C. Rivière , T. Richard , L. Quentin , S. Krisa , J.- M. Mérillon , J.-P. Monti , Bioorg. Med. Chem., 15, 1160-7 (2007)).

Le composé de formule (A) peut être utilisé seul ou en combinaison avec un autre principe actif.

Selon un autre aspect, l'invention a pour objet une composition cosmétique comprenant un composé de formule (A _E ).

Définitions

Selon la présente description, les radicaux « alkyle » représentent des radicaux hydrocarbonés saturés, en chaîne droite ou ramifiée, de 1 à 12 atomes de carbone, notamment de 1 à 6 atomes de carbone, de préférence de 1 à 4 atomes de carbone. On peut notamment citer, lorsqu'ils sont linéaires, les radicaux méthyle, éthyle, propyle, butyle, pentyle, hexyle. On peut notamment citer, lorsqu'ils sont ramifiés ou substitués par un ou plusieurs radicaux alkyles, les radicaux isopropyle, tert-butyl, 2-méthylbutyle, 2- méthylpentyle, et le 1 -méthylpentyle.

Au sens de la présente description, les radicaux « alcényles » désignent un groupe hydrocarboné aliphatique qui contient une double liaison carbone- carbone et qui peut être linéaire ou ramifié ayant de 2 à 6 atomes de carbone dans la chaîne, de préférence de 2 à 4 atomes de carbone dans la chaîne. Ramifié signifie qu'un ou plusieurs groupes alkyle inférieurs, tels que le méthyle, l'éthyle ou le propyle, sont liés à une chaîne alcényle linéaire. Comme exemples de groupes alcényles, on peut citer notamment l'éthényle, le propényle, le n-butényle, l'i-butényle, le 3-méthylbut-2-ényIe, ou le n-pentényle.

Au sens de la présente description, « alkoxy » désigne un groupe alkyl- O-, dans lequel le groupe alkyle est tel que décrit ci-dessus. Comme exemple de groupes alkoxy, on peut citer notamment le méthoxy, l'éthoxy, le n-propoxy, l'i-propoxy, le n- butoxy et l'heptoxy.

Au sens de la présente description, « aryle » désigne un système aromatique hydrocarboné, mono ou bicyclique de 6 à 10 atomes de carbone. Parmi les radicaux aryles, on peut notamment citer le radical phényle ou naphtyle.

Selon la présente description, les groupes « hétérocychques » ou « hétérocyclyles » désignent des systèmes mono- ou polycycliques, saturés, insaturés ou aromatiques comprenant au moins un hétéroatome choisi parmi O, N ou S, ayant de préférence de 5 à 10 chaînons, notamment de 5 à 7 chaînons. Les groupes hétérocycliques comprennent les groupes hétéroaryles et hétérocycloalkyles.

Selon la présente description, « hétérocycloalkyle » désigne un système cyclique saturé comprenant au moins un hétéroatome choisi parmi O, N ou S. Comme exemple de groupe hétérocycloalkyle, on peut notamment citer les groupes pyrrolidinyles, pyrrolinyles, imidazolidinyles, imidazolinyles, pirazolidinyles, pirazolinyles, pyrazalinyles, pipéridyles, ou pipérazinyles.

Selon la présente description, « hétéroaryle » désigne un système hydrocarboné aromatique, mono ou bicyclique comprenant de 5 à 10 chaînons, notamment de 5 à 7 chaînons.

Au sens de la présente description, « aliphatique » désigne un système hydrocarboné, cyclique ou acyclique, saturé ou instauré, mais non aromatique. Les exemples suivants illustrent l'invention, sans toutefois la limiter. Les produits de départs utilisés sont des produits connus, préparés selon des modes opératoires connus, ou commercialement disponibles.

EXEMPLES

Les spectres RMN ont été enregistrés sur un spectromètre BRUCKER 300 MHz Avance. Les fournisseurs du 4-hydroxybenzaldéhyde, du chlorure de paratoluoyle , et de l'alcool 3,5-dihydroxybenzylique sont respectivement ACROS, FLUKA et ALDRICH. Les réactifs n'ont pas été purifiés avant utilisation. -parirtoluoyloxybenzaldéhyde

Le mélange de 4-hydroxybenzaldéhyde (11 ,2 g ; 9,16 mmol) et de carbonate de potassium (12,8 g ; 9,16 mmol) dans 300 mL d'acétone a été refroidi à 0°C. On a additionné en 30 min le chlorure de paratoluoyle (12 mL ; 9,16 mmol) en solution dans 100 mL d'acétone. Après la fin de l'addition, on a porté à reflux pendant 5h30. Après refroidissement du mélange réactionnel, les sels minéraux ont été filtrés et rincés à l'acétone. Après évaporation du solvant, 22,6 g de produit soit un rendement brut de 94% ont été obtenus. Après chromatographie sur colonne (AcOEt/heptane de 10 à 30%), 15 g de 4-£><3r#toluoyIoxybenzaldéhyde soit un rendement global de 63% ont été isolés.

RMN 1H (CDCI ₃ , 300 MHz, 298 K) : δ (ppm) 10,03 (s, 1H), 8,07 (d, 2H) ₅ 7,96 (d, 2H), 7,39 (d, 2H), 7,32 (s, 2H) ₅ 2,46 (s, 3H)

Exemple 2 : Synthèse de l'alcool 3,5-diparatoluoyloxybenzylique

Le mélange d'alcool 3,5-dihydroxybenzylique (9,6 g ; 68,57 mmol) et de carbonate de potassium (18,9 g ; 137,14 mmol) dans 360 mL d'acétone a été refoidi à 0°C. On a additionné en 45 min le chlorure de paratoluoyle (18 mL ; 137,14 mmol) en solution dans 240 mL d'acétone. Après la fin de l'addition, on a porté à reflux pendant 4h. Après refroidissement du mélange réactionnel, les sels minéraux ont été filtrés et rincés à l'acétone. Après évaporation du solvant, 25,70 g de produit soit un rendement brut de 100% ont été obtenus. Après chromatographie sur colonne (AcOEt/heptane 1/4), 18 g d'alcool 3,5-dïj?arartoluoyloxybenzylique soit un rendement global de 70% ont été isolés.

RMN 1H (CDC1 , 300 MHz, 298 K) : δ (ppm) 8,1 1 (d, 4H), 7,33 (d, 4H), 7,22 (d, 2H), 7,13 (t, 1H), 4,53 (s, 2H), 2,47 (s, 6H)

L'alcool benzylique diprotégé (14 g ; 37,7 mmol) et la triphénylphosphine (14,9 g ; 56,53 mmol) ont été solubilisés dans 150 mL de CH2CI2. On a ajouté à température ambiante et au goutte à goutte une solution de N-bromosuccinimide (10 g; 56,53 mmol) dans 100 mL de CH2CI2. Le mélange a été agité à la même température pendant 1 heure. On a transvasé le mélange dans une ampoule à décanter afin d'effectuer des lavages à l'eau de la phase organique ; après séchage sur MgS0 ₄ et évaporation du solvant, le produit a été recristallisé dans Péthanol. 10,6 g de bromure de 3,5- diparotoluoyloxybenzyle purifié soit un rendement de 64% ont été isolés. RMN Ή (CDC1 ₃ , 300 MHz, 298 K) : δ (ppm) 8,05 (d, 4H), 7,29 (d, 4H), 7,20 (d, 2H), 7,13 (s, 1H), 4,50 (s, 2H), 2,45 (s, 6H)

Une solution dans le toluène (100 mL) de bromure de 3,5- di _j wzratoluoyloxybenzyle (5g ; 11,38 mmol) et de triphénylphosphine (3,57 g ; 13,65 mmol) a été portée à reflux pendant 4 heures. Après refroidissement, on a filtré le bromure de phosphonium insoluble dans le toluène. Les eau -mères ont été portées à reflux 12 heures supplémentaires et on a filtré à nouveau le précipité. Le produit n'a pas nécessité de purification. Après séchage au dessicateur, 6,9 g de bromure de 3,5- diparirtoluoyloxybenzyltriphénylphosphonium soit un rendement de 86% ont été obtenus.

RMN Ή (CDC1 ₃ , 300 MHz, 298 K) : δ (ppm) 7,90 (d ₅ 4H), 7,56-7,77 (m, 15H), 7,17 (d, 4H), 6,99 (s, 1H), 6,81 (t, 2H), 5,44 (d, 2H, ³ J = 12,3 Hz)

RMN ^JJ P (CDCI3, 121,47 MHz, 298 K) : 8 (ppm) 24,17 (s, 1P) ', 5-tri^amtoluoyloxystilbène

Après avoir introduit le sel de phosphonium (3,08 g ; 4,4 mmol) dans un bicol, le montage a été purgé et placé sous argon. On a ajouté 20 mL de THF distillé. La température de la solution a été abaissée à -78°C puis une solution de BuLi 1 ,6M dans le THF (2,75 mL ; 4,4 mmol) a été additionnée à la seringue. Après la fin de l'addition, le mélange a été maintenu à -78°C et l'aldéhyde (1,06 g ; 4,4 mmol) en solution dans 20 mL de THF distillé a été lentement ajouté dans les mêmes conditions que précédemment. On a laissé revenir à température ambiante et le mélange a été agité pendant 3 heures. Le mélange réactionnel a alors été hydrolysé par ajout de 20 mL d'eau. La phase aqueuse a été extraite par de l'acétate d'éthyle, et la phase organique a été lavée par 5 mL d'acide chlorhydrique 6N, puis par 2x20 mL d'eau et 20 mL d'eau saturée en NaCl. La phase organique a ensuite été séchée, évaporée et le produit a été purifié sur colonne de gel de silice (Acétate d'éthyle / Heptane 3 :7). 1,28 g de produit pur soit, un rendement de 50% ont été isolés. MN 1H (CDC1 ₃ , 300 MHz, 298 ) : δ (ppm) 8,08 (d, 6H), 7,51 (d, 2H), 7,29 (d ₅ 6H) ₅ 7,19 (d, 2H), 7,05 (d, 1H, ³ J = 16,6 Hz), 7,00 (d, 1H, ³ J = 16,6 Hz), 6,88 (d, 2H), 6,64 (s, 1H), 2,46 (s, 9H) -resvératrol

Cette étape peut être effectuée avant la purification du 3, 4', 5- tri aratoluoyloxystilbène sur colonne.

Le 3, 4', 5-tnparatol oylox stilbèïiQ (1,00 g ; 1 ,71 mmol) a été solubilisé dans 35 mL de méthanol. On a ajouté sous agitation l'hydroxyde de potassium (0,28 g g ; 5,5 mmol) en pastilles. On a alors chauffé à 30°C pendant lh puis on a ajouté 30 mL d'eau et laissé à 30°C pendant 4 heures. On a ajouté 1,5 mL d'acide chlroydrique 6M jusqu'à pH = 2 puis on a traité par une solution de soude à 10% pour obtenir un pH = 4-5. La phase aqueuse a été extraite par 2x20 mL d'acétate d'éthyle. La phase organique a été séchée et le solvant évaporé et on a obtenu finalement 350 mg de resvératrol soit un rendement de 90%.

RMN 1H (C ₄ H _g O (THF deutéré), 300 MHz, 298 K) : δ (ppm) 8,45 (s, 1H), 8,08 (s, 2H), 7,28 (d, 2H), 6,88 (d, 1H, ³ J = 16 Hz), 6,78 (d, 1H, ³ J = 16 Hz), 6,70 (d, 2H), 6,35 (d, 2H), 6,06 (s, 1H) Exemple 7 : Tests biologiques

Les dérivés du resvératrol ont été testés sur des cellules tumorales colorectales SW480 et pour certains d'entre eux sur des cellules hépathiques HepG2. La cytotoxicité a été déterminée par la méthode du cristal violet et les valeurs des IC50 ont été déterminées après régression paramétrique et en comparaison des pourcentages de viabilité des contrôles. Le resvératrol est utilisé comme contrôle positif dans ces séries de tests.

Protocole pour les tests de cytotoxicité par la méthode du cristal violet :

Les tests ont été effectués sur des plaques 96 puits en triplicate et chaque expérience a été effectuée 3 fois.

Les cellules colorectales adenocarcinoma SW 480 ou les cellules hépathiques HepG2 ont été mises en culture dans un milieu RPMI avec 10% de sérum de veau fœtal et 1 % d'antibiotique pénicilline streptomycine. Après 24 h d'incubation à 37°C, les cellules ont été traitées avec un milieu contenant 1% de DMSO et la molécule à tester à différentes concentrations allant de 0,78 à 100 μΜ.

Contrôle - : 3 puits ont été traités par 1% de DMSO uniquement

Contrôle + : 3 puits ont été traités par 1 % de DMSO et Resvératrol à 30 μΜ.

Après 48 heures, le milieu a été retiré et les puits lavés par une solution saline (PBS) et le

C- Violet a été ajoute. On a laissé agir 20 min puis plusieurs lavages à l'eau ont été effectués jusqu'à disparition de la coloration des eaux de lavage. Les puits ont été séchés et dans chacun d'entre eux, les cellules ont été dissoutes dans une solution de citrate avant lecture de la densité optique par un spectrophotomètre DYNEX.