DESCRIPTION

Domaine technique

[001] La présente invention se rapporte à un procédé d'extraction de molécules organiques et/ou organominérales à partir d'un matériau calcaire, ainsi qu'aux extraits obtenus par ce procédé. [002] Les produits extraits sont des molécules organiques et/ou organominérales.

[003] Le procédé et les produits obtenus par ce procédé trouvent notamment des applications dans les domaines thérapeutiques et non thérapeutiques : notamment médicales, cosmétiques et agro-alimentaires, notamment, la nutraceutique, les compléments alimentaires et/ou les alicaments.

[004] Dans la description ci-dessous, les références entre parenthèses (ReT) renvoient à la liste des références présentées à la fin du texte.

Etat de la technique

[005] Des procédés d'extractions de molécules organiques à partir de différentes sources sont connus dans l'état de la technique. Il s'agit par exemple des procédés d'extraction de molécules organiques à partir d'extraits de végétaux, par exemple des extraits de Arachis hypogaea (Fabacée) et de Phaseolus vulgaris (Fabacée). Les molécules extraites avec ces procédés peuvent être utilisées dans différents domaines, par exemple en, pharmaceutique, cosmétique, dans le domaine agroalimentaire etc.. Des exemples de molécules organiques extraites dans l'état de la technique sont, par exemple les stérols, les terpènes, des esters de terpènes etc.. Ces molécules sont, par exemple, utilisées comme additifs alimentaires ou dans des produits cosmétiques pour notamment combler des carences et/ou pour traiter des pathologies de la peau ou autre.

[006] La diminution de la masse et de la densité osseuse est un problème important en santé publique, plus particulièrement chez les femmes après la ménopause, elle intervient aussi chez les hommes seniors et plus rarement chez les enfants.

[007] En effet, après la ménopause, la diminution du taux d'oestrogènes entraîne une perte de masse et de densité osseuse. [008] La diminution de la densité osseuse peut être également due à des traitements pharmacologiques, par exemple des traitements antiinflammatoires à base de corticoïdes qui peuvent entraîner une ostéopénie pouvant aller jusqu'à l'ostéoporose.

[009] La pathologie associée à une perte de masse et de densité osseuse est l'ostéoporose qui entraîne une fragilité excessive du squelette. [0010] L'ostéoporose peut être également due à l'acquisition d'un capital osseux insuffisant à la fin de la croissance, ou à une perte osseuse lors de la vie adulte due par exemple à des facteurs génétiques, nutritionnels et environnementaux. Un des moyens connus dans l'état de la technique, pour prévenir ou traiter la diminution de la masse et de la densité osseuse est en général l'administration de régimes enrichis en calcium. Différentes formes de calcium sont utilisées, il peut s'agir par exemple de CaCO ₃ (voir J. L Greger et al. « Minerai utilisation by rats fed various commercially available calcium suppléments or milk. » J Nutr; 117 :717-24 1987 (Ref 1) ; T. Chevalley et al. « Effect of calcium suppléments on fémoral bone minerai density and vertebrate fracture in Vitamin D repleted elderly patients », Osteoporosis Int 4 :245-52, 1984 (Ref 2)). Certains travaux ont étudié l'effet de l'assimilation de poudres à base de corail (Blumberg S. « Is coral calcium a safe and effective supplément ? » J Am Diet Assoc Sept ; 104(9) : 1335-6 (Ref 3)), de nacre, de coquilles fossiles ( T.Okano et al. « Bioavailability of calcium from oyster shell electrolysate and DL-Calcium lactate in vitamin D-replete or vitamin D-deficient rats. Journal of Bone and Minerai Metabolism 11 (2) : 23-32 1993 (Ref 4) ; T. Miura « Calcium bioavailability of a total bone extract (TBE) and diets effects on bone metabolism in rats » Biosci. Biotechnol. Biochem 62 : 1307-12, 1998 (Ref 5) ou encore de coquille d'œuf (Y Takada « bioavailabillity of various dietary calcium compound. 2 Examination in vivo of various dietary compound, Snow brand milk products Co, Ltd Sapporo: 75-84 (Ref 6); A Schaafsmal et al. « Eggshell powder, a comparable or better source of calcium than purified calcium carbonate: piglet studies JSci Food Agric 79: 1596-600, 1999 (Ref 7)). Ces différentes formes de calcium « naturel » ont semblé montrer une assimilation « améliorée ».

[0011] Cependant, ces solutions ne sont pas suffisantes dans la mesure où elles ne permettent pas de traiter complètement certaines pathologies osseuses, notamment l'ostéoporose. De plus, les procédés permettant l'extraction de ces molécules ou leur fabrication présentent de faibles rendements nécessitant donc l'utilisation d'une grande quantité de matières premières et donc des coûts d'exploitation importants. [0012] Un autre moyen connu dans l'état de la technique pour traiter les ostéopénies (ostéoporose) est l'administration d'anti-ostéoporotiques. Il s'agit par exemple de composés qui stimulent la formation osseuse et la fixation du calcium : la vitamine D, l'hormone parathyroïdienne (à très faible dose), les estrogènes et le strontium ; de composés qui freinent la résorption osseuse : les biphosphonates et la calcitonine. Un apport de calcium facilement biodisponible est toujours nécessaire lors de ces traitements. Il a été montré chez des rats que l'hormone parathyroïdienne à haute dose est cancérigène. Par ailleurs, la vitamine D a des effets sur l'immunité qui peuvent être délétères pour homme.

[0013] Ces produits ont en général des effets secondaires non négligeables et ne peuvent en conséquence êtres utilisés que sur de courtes périodes avec une complémentation en calcium. Ces produits ne permettent donc pas de s'affranchir de prises de calcium concomitantes. Une prise de calcium excessive peut être source de problèmes en raison de fixations ectopiques : calcul rénaux, calcification aortique, etc.. L'ostéoporose peut toucher également les animaux, par exemple les chiots entre 2 et 6 mois, les vieux chiens qui ne fixent pas le calcium, les chiens nourris exclusivement à base de viande, les chevaux, par exemple les chevaux restant longtemps à l'étable. [0014] Cependant, aucune des molécules connues ou utilisées dans l'état de la technique ne permettent de traiter de manière efficace la diminution de la densité osseuse chez les animaux. De plus, les problèmes et effets secondaires connus pour les hommes surviennent également chez les animaux. [0015] Les procédés connus dans l'état de la technique permettant d'extraire les molécules utilisées pour, par exemple, le traitement de l'ostéoporose, nécessitent des quantités importantes de matières premières, par exemple de plantes, et ont des rendements d'extraction faibles et donc des coûts de mise en œuvres très importants. [0016] Une étude réalisée par l'industrie pharmaceutique a montré que près de deux tiers des principes actifs utilisés dans les médicaments proviennent des plantes ou sont copiés de la nature par voie chimique. D'autres molécules sont donc activement recherchées et avec elles des procédés permettant leurs extractions. [0017] Par ailleurs, le calcium joue un rôle important dans les différentes fonctions de la jonction dermo-épidermique (JDE). Il assure un rôle structural associé aux macromolécules qui lient la couche basale au collagène du derme. C'est un élément important de la cohésion entre le derme et l'épiderme. La JDE a un rôle régulateur, un rôle de filtre dans les échanges entre le derme et l'épiderme ; l'épiderme n'est pas vascularisé, le calcium est un élément clé dans les mécanismes de communication et de régulation.

[0018] Par ailleurs, le calcium a également un rôle dans l'ensemble du métabolisme cutané. Il s'agit notamment de la différentiation terminale épidermique (DTE) où le calcium est impliqué dans la différenciation des kératinocytes. Le gradient de calcium augmente de la couche germinative où se forment les kératinocytes vers les couches extérieures de l'épiderme. Le calcium se lie à des phospholipides, nécessaires au processus de kératinisation.

[0019] Les produits connus dans l'état de la technique permettant de stimuler la kératinisation ont de nombreux effets secondaires, par exemple une hypersensibilisation de la peau aux ultraviolets.

[0020] De plus, le rôle probablement le plus important du calcium en physiologie humaine est celui du maintien de l'homéostasie calcique (calcémie) et de messager cellulaire. [0021] Dans le domaine de l'alimentation du bétail, le calcium est aussi un élément important. Il s'agit par exemple de l'alimentation des volatiles de ponte.

[0022] II existe donc un réel besoin de trouver de nouvelles molécules palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, lesdites molécules pouvant être utilisées, par exemple, pour un traitement et/ou la prévention de la diminution de la masse et de la densité osseuse, pour la stimulation de l'activité et/ou la restructuration cutanée, la complémentation de l'alimentation avec en conséquence le maintien de l'homéostasie calcique. [0023] II existe également un réel besoin de trouver un procédé permettant l'extraction de ces molécules de la nature afin, par exemple de diminuer le coût d'extraction et de trouver de nouveaux principes actifs utilisables dans le domaine biomédical (médecine, pharmacie, parapharmacie, nutrition et autres) et/ou en cosmétique et/ou dans le domaine agroalimentaire. [0024] II y a un réel besoin de complémenter efficacement l'alimentation des animaux en découvrant de nouveaux actifs capables de favoriser l'assimilation du calcium et sa fixation, et de diminuer les coûts de production de ces molécules.

Description de l'invention [0025] La présente invention a précisément pour but de répondre à ces besoins et inconvénients de l'art antérieur en fournissant un procédé d'extraction de molécules organiques et/ou organominérales. [0026] Le procédé de l'invention est un procédé d'extraction de molécules organiques et/ou organominérales à partir d'un matériau calcaire, comprenant l'étape suivante : la mise en contact du matériau calcaire avec une solution, ladite solution comprenant : au moins un solvant organique, de l'eau et au moins un acide. [0027] Les inventeurs sont les premiers à avoir découvert que les matériaux calcaires contenant de nombreuses molécules organiques et/ou organominérales accumulées lors de la formation desdits matériaux présentaient des propriétés pharmaceutiques et/ou cosmétiques. Ils ont donc mis au point un procédé d'extraction de ces molécules afin de les extraire et de les utiliser. En outre, les inventeurs ont montré que les molécules extraites étaient capables de stimuler les mécanismes de formation et de minéralisation osseuse et/ou de stimuler l'activité des cellules épidermique et/ou dermiques.

[0028] Dans la présente invention par matériau calcaire, on entend tout matériau comprenant du calcaire. Il peut s'agir par exemple d'une roche calcaire.

[0029] De préférence, il peut s'agir de toutes les formes naturelles de roche calcaire comprenant au moins 50% de carbonate de calcium quel que soit la forme et le nom d'usage. Ces roches peuvent être, par exemple, de formes massives, friables, poudreuses ou autres. [0030] Selon l'invention, le matériau calcaire peut-être, par exemple une roche calcaire de France choisie dans le groupe comprenant une roche d'Orgon, France, de Pierre d'Euville, France, de Saint Germain, France, et de Pagny sur Meuse, France. [0031] De manière préférée, le matériau calcaire peut-être, par exemple une roche calcaire choisie dans le groupe comprenant la roche d'Orgon, F-13660, la Pierre d'Euville, F-5520, de Saint Germain, F-55140 ou de Pagny sur Meuse, F-55190 ou encore d'Héming, F-57830. La mention « F » indique l'origine France et le chiffre le code postal. [0032] Dans la présente, le matériau calcaire peut provenir, par exemple des carrières : de Fontvieille, F-13 990 ; de Salon de Provence, F- 13300 ; d'Orgon, F-13660 ; de Cassis, F-13260 ; de Maine de Boixe, F- 16230 ; de Biarge à Saint Fraigne, F-16140 ; de Gratte-Chat à Saint Sornin, F-17600 ; de Subdray, F-18570 ; de Sainte-Croix-De-Mareuil, F- 24340 ; du Pont-du-Gard à Remoulin F-30210 ; de Verfeuil, F-30630 ; des Conques à Brouzet-les-Ales, F-30055 ; de Val d'Epis, F-39160 ; Raymond Rabier, La Tieule F-48500 ; de Senonville, Valbois F-55300 ; de Pagny- sur-Meuse, F-55190 ; d'Euville, F-55200 ; de Saint Germain-sur-Meuse, F- 55140 ; d'Héming, F-57830 ; de Saint Maximin F-60740 ; d'Arancou, F- 64270 ; de Rébenacq, F-64260 ; de Roquemaure à Orange F-84100 ; des Chaux de la Tour à Coustellet F-84220 ; de Menerbes, F-84560 ; des Estaillades à Oppede, F-84580 ; de Saint Maurice La Clouère, F-86160 ; de Feriana, Tunisie.

[0033] Selon l'invention, la roche calcaire préférée a une teneur en carbone organique total (COT) mesurable, mais elle peut tout aussi bien être très faible, voire indétectable. Par exemple la teneur en COT peut être comprise entre 0,01 et 1 ,5% par exemple entre 0,02 et 0,8% ou par exemple entre 0,03 et 0,3%.

[0034] La mesure de la teneur en carbone organique total (COT) peut être effectuée par toute méthode connue de l'homme du métier . Il peut s'agir, par exemple l'analyse Leco (Marque enregistrée) du carbone organique des roches décarbonatées (par exemple Leco (Marque enregistrée) SC-444) ou encore une analyse élémentaire des matières organiques concentrées à l'aide d'un Kerogenatron (Vinci Technologies, France) ou encore une méthode pyrolytique connue sous le nom de pyrolyse Rock Eval qui a été utilisée ici, détournée de son utilisation habituelle que sont les huiles minérales ou les contaminations (Rock-Eval 6 turbo de Vinci Technologies, France ; voir E. Lafargue, F. Marquis, D. Pillot, « Rock-Eval 6 Applications in hydrocarbon exploration, production and soil contamination studies », OiI & Gas Science and Technology, 1998, 53(4), 421-37 (Réf. 8). Par exemple, pour des concentrations très faibles de matrice organique endogène, le critère retenu consiste à enregistrer l'apparition dans les calcaires d'un pic de craquage type-S2 qui n'existe pas dans un carbonate de précipitation purement chimique (e.g. tel que fourni par VWR International SA). L'analyse du COT comme l'utilisation de la pyrolyse Rock-Eval sont des méthodes indirectes qui ne déterminent en rien la nature chimique des molécules, ou leur activité. [0035] Selon l'invention, le matériau calcaire peut par exemple avoir une granulométrie moyenne comprise entre 0,5 et 1000 μm, de manière préférée entre 0,5 et 500 μm, de manière encore plus préférée inférieure à 200 μm.

[0036] Selon l'invention, par « molécules organiques et/ou organominérales » on entend, par exemple, des protéines, des peptides, des lipides ou des saccharides ou mélanges et/ou par exemple des molécules riches en hétéroéléments par exemple une protéine de liaison au calcium ( « calcium binding protein ») des sels, des ions, des minéraux, des particules colloïdales et/ou des combinaisons de ces composés. Les molécules organiques et/ou organominérales peuvent être, sous la forme complexe du mélange naturel ou séparées et purifiées. Il peut s'agir par exemple, des molécules anciennes dont l'âge correspond à l'âge du matériau calcaire ou par exemple des molécules liées à la diagenèse ou formées au cours du temps, ou dans les calcaires récents. [0037] Selon l'invention, on parle également d' « extrait » ou d' « extraits de roche » ou encore d' « extrait de roche calcaire » pour désigner de façon équivalente les molécules organiques et/ou organominérales telles que définies précédemment, par exemple, il peut s'agir de protéines, peptides, lipides, saccharides et/ ou mélange et/ou par exemple des sels, ions, minéraux, particules colloïdales et/ou des combinaisons de ces composés.

[0038] Selon l'invention, par « solvant organique » il est entendu, par exemple, un solvant ou un mélange de solvants choisi dans le groupe comprenant les alcools en C1 à C6, les éthers et les hydrocarbures. Par exemple, il peut s'agir d'un solvant choisi dans le groupe comprenant l'éthanol, l'éther diéthylique, le dichlorométhane, diméthylformamide (DMF) ₁ le diméthylsufoxyde (DMSO), l'acétonitrile, ou un mélange de ces solvants. Il peut également s'agir, par exemple, sans préjuger de leur nature, de tous fluides à l'état supercritique ou subcritique, ayant des caractéristiques équivalentes aux « solvants organiques », par exemple du CO ₂ supercritique ou encore de l'eau subcritique. [0039] Selon l'invention, par « mélange de solvants » il est entendu, par exemple, un mélange d'au moins deux solvants organiques, au moins trois solvants organiques, au moins quatre solvants organiques ou plus. Le mélange de solvants peut être, par exemple, un mélange d'alcools en C1 à C6, un mélange d'éthers, un mélange d'hydrocarbures et/ou un mélange de solvants choisis dans le groupe comprenant les alcools en C1 à C6, un mélange d'éthers et un mélange d'hydrocarbures organiques ou un mélange de ces solvants.

[0040] Selon l'invention, toute concentration de solvants appropriés peut être utilisée. La concentration volumique du solvant organique par rapport à la phase aqueuse est avantageusement comprise entre 1 et 99%.

[0041] Dans la présente invention, par « acide » on entend, par exemple, un acide minéral et/ou un acide organique. Par exemple, l'acide peut être choisi dans le groupe comprenant l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, l'acide acétique, l'acide citrique, l'acide éthylène-diamine- tétraacétique.

[0042] De préférence, dans la présente invention, le pH de la solution du procédé de l'invention peut être inférieur à 7, de manière préférée compris entre 0 et 7, de manière encore plus préférée entre 0 et 5, de manière plus préférée entre 1 et 4, de manière plus préférée entre 1 et 3. [0043] Dans la présente invention, la mise en contact du matériau calcaire avec la solution peut-être effectuée, par exemple, par trempage, aspersion, mouillage, immersion partielle ou totale du matériau calcaire avec ladite solution.

[0044] De préférence, la mise en contact du matériau calcaire avec la solution est effectuée par immersion totale du matériau. [0045] Selon l'invention, la mise en contact du matériau calcaire avec la solution comprenant : au moins un solvant organique, de l'eau et au moins un acide, peut-être effectuée, par exemple, à une température comprise entre 5 et 90 ⁰ C, de manière préférée entre 8 et 75°C, de manière encore plus préférée entre 8 et 30 ⁰ C. Cette température peut être également choisi dans toute la gamme nécessaire aux états subcritiques ou supercritiques, si nécessaire. La température est généralement choisie de façon à ne pas dénaturer de manière irréversible les molécules extraites. [0046] Selon l'invention, la mise en contact du matériau calcaire avec la solution comprenant : au moins un solvant organique, de l'eau et au moins un acide, peut-être effectuée, par exemple, pendant un temps compris entre environ 1 minutes et 72 heures, de préférence entre environ 1 minutes et 48 heures, de manière encore plus préférée entre 1 minutes et 12 heures. [0047] Selon l'invention, avantageusement le procédé peut comprendre en outre une étape de broyage avant la mise en contact du matériau calcaire avec la solution.

[0048] Dans la présente par « broyage », on entend fractionnement de la roche via, par exemple, des moyens mécaniques industriels ou via n'importe quel type de broyage où la température est suffisamment basse de façon à ne pas dénaturer de manière irréversible les molécules extraites.

[0049] L'étape de broyage peut être réalisée par exemple en suivant les techniques connues de l'homme de l'art pour obtenir un matériau calcaire avec une granulométrie moyenne décrite précédemment. Il peut s'agir par exemple d'un broyage réalisé par une technique choisie dans le groupe comprenant le broyage à boulet, le broyage à rouleau, le broyage mortier/pillon, le broyage à marteaux, le broyage à marteaux à percussion, le broyage à disques oscillants, le vibro-broyage, le broyage à deux cylindres dentés et/ou le broyage à deux cylindres lisses. [0050] De préférence, le matériau calcaire a une granulométrie inférieure à 200 μm. En effet, cette granulométrie peut permettre d'optimiser le rendement d'extraction du procédé de l'invention. [0051] Selon l'invention, le procédé peut comprendre en outre une étape de récupération des molécules organiques et/ou organominérales. Il peut s'agir par exemple, d'une étape de filtration. Cette étape permet de séparer le matériau calcaire de la solution dans laquelle les molécules organiques ou organominérales sont extraites. Elle peut être réalisée, par exemple au moyen d'un filtre, par exemple ayant des pores d'un diamètre choisi en rapport avec la granulométrie sélectionnée, compris par exemple entre 0.2 et 500 μm, d'une filtration qui peut être, par exemple sous vide, voire d'une ultrafiltration, ou de chromatographie haute performance, ou toute autre technique choisie pour ne pas altérer les extraits. [0052] De manière préférée, l'étape de récupération des molécules organiques et/ou organominérales peut correspondre à une concentration des molécules par élimination de tout ou partie du liquide. Cette étape peut comprendre, par exemple une précipitation par un contre solvant, une évaporation à faible pression, une sublimation après congélation (lyophilisation) sans que cette liste soit limitative.

[0053] Le contre solvant peut être par exemple un solvant tel que décrit précédemment. [0054] Dans la présente, l'évaporation ou la sublimation à faible pression peut être réalisée par exemple à une pression comprise dans la gamme de 0,1 à 5000 Pa (50 à 0.001 hPa), de préférence entre 0,1 et 4000 Pa, de manière plus préférée entre 0,1 et 25 Pa, de manière encore plus préférée entre 0,1 et 20 Pa. [0055] La présente invention a également pour objet les molécules organiques et/ou organominérales susceptibles d'être obtenues par le procédé de l'invention. [0056] La présente invention a également pour objet l'utilisation des molécules organiques et/ou organominérales susceptibles d'être obtenues par le procédé de l'invention pour la fabrication d'une composition cosmétique. [0057] La présente invention a également pour objet un procédé de fabrication d'une composition cosmétique comprenant la mise en œuvre du procédé d'extraction de molécules organiques et/ou organominérales de la présente invention et le mélange des molécules organiques et/ou organominérales obtenues dans un support cosmétiquement acceptable. [0058] La présente invention a également pour objet une composition cosmétique comprenant au moins une molécule organique et/ou organominérale obtenue par le procédé de l'invention et un support cosmétiquement acceptable. [0059] Dans la présente par « composition cosmétique » on entend toute composition à visée cosmétique c'est à dire une composition pouvant être mise en contact avec les parties superficielles du corps humain, par exemple l'épiderme, les systèmes pileux et capillaires, les organes externes, les dents et les muqueuses. [0060] II peut s'agir par exemple d'une composition liquide, une émulsion, un onguent, une mousse, une pâte ou un gel.

[0061] Dans la présente par support cosmétiquement acceptable on entend tout composé connu de l'homme du métier permettant de fabriquer une composition cosmétique. [0062] La composition cosmétique selon l'invention peut comprendre en outre un ou plusieurs adjuvants cosmétiques choisis parmi des agents conditionneurs de type esters, des agents anti-mousse, des agents hydratants, des agents émollients, des plastifiants, des agents épaississants minéraux, des agents épaississants organiques, polymériques ou non, associatifs ou non, des filtres solaires hydrosolubles et liposolubles, siliconés ou non siliconés, des colorants permanents ou temporaires, des parfums, des conservateurs, des céramides, et pseudo- céramides, des vitamines et les provitamines, des protéines, des agents séquestrants, des agents solubilisants, des agents alcanisants, des agents anti-corrosion, des agents réducteurs ou anti-oxydants, des agents oxydants, des charges minérales.

[0063] Dans la présente, la composition cosmétique peut être, par exemple, une composition anti-âge, par exemple une composition cosmétique stimulant la densification du derme papillaire et stimulant la synthèse des protéines de la jonction dermo-épidermique. [0064] La présente invention a également pour objet un procédé de fabrication d'une composition pharmaceutique comprenant la mise en œuvre du procédé d'extraction de molécules organiques et/ou organominérales de la présente invention et le mélange des molécules organiques et/ou organominérales obtenues dans un support pharmaceutiquement acceptable. [0065] Selon l'invention pharmaceutiquement acceptable peut être par exemple un médicament destiné à augmenter la régénération des tissus osseux, cartilagineux ou cutané et/ou un médicament destiné au traitement de l'arthrose, la polyarthrite, l'ostéoporose, le vieillissement dégénératif. [0066] La présente invention a également pour objet l'utilisation molécules organiques et/ou organominérales susceptibles d'être obtenues par le procédé de l'invention pour la fabrication d'une composition pharmaceutique et/ou d'un médicament.

[0067] La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant au moins une molécule organique et/ou organominérale obtenue par le procédé de l'invention et un support pharmaceutiquement acceptable.

[0068] Dans la présente par « composition pharmaceutique » on entend une composition liquide, une émulsion, un onguent, une mousse, une pâte, un comprimé sécable, une gélule, un comprimé effervescent, un patch dermique ou un dispositif injectable, sans que la forme soit limitative. [0069] Dans la présente par « support pharmaceutiquement » acceptable on entend un agent diluent inerte, tel que du sorbitol, du sucre, du mannitol, de la cellulose microcristalline, de l'amidon, de chlorure de sodium, du phosphate de sodium, du carbonate de calcium, du phosphate de calcium, du sulfate de calcium, du lactose, par exemple du lactose monohydrate.

[0070] Dans la présente, le médicament peut être utilisé, par exemple, dans le traitement ou la prévention de maladies liées à une diminution de la densité et de la masse osseuse.

[0071] Dans la présente, le médicament peut être utilisé, par exemple, dans le traitement ou la prévention de maladies choisies dans le groupe comprenant l'ostéopénie y compris génétique, l'ostéoporose, le vieillissement dégénératif, les infections rhumatologiques dont l'arthrose, les polyarthrites, et l'ensemble des maladies qui affectent le squelette. [0072] Le médicament peut être également utilisé, par exemple, dans le traitement de maladies cutanées, par exemple des maladies dues à des origines génétiques, psychosomatiques, pathologiques, dues au vieillissement intrinsèque et extrinsèque ou à des agressions ou des stress environnementaux. Il peut s'agir par exemple d'une maladie liée au rayonnement solaire Ultraviolet (UV), aux Infra-Rouge (IR), à une atmosphère humide excessive, à l'air conditionné et/ou à la poussière. [0073] La présente invention a également pour objet l'utilisation des molécules organiques et/ou organominérales susceptibles d'être obtenues par le procédé de l'invention, pour la fabrication d'un médicament destiné à augmenter la régénération des tissus osseux, cartilagineux ou cutané. [0074] Dans la présente, par « augmenter la régénération des tissus osseux, cartilagineux ou cutané », il est entendu, par exemple, la reformation des tissus par stimulation de l'activité cellulaire induisant par exemple, une ostéogenèse, une restructuration de l'épiderme, une redensification du derme par production de matrice extracellulaire, de l'activité de la jonction épidermique, une régulation de l'activité de l'hypoderme, entre autres. Selon l'invention, l'augmentation de la régénération des tissus osseux, cartilagineux ou cutané peut être effectuée in vivo et/ou in vitro ou pour la culture de tissus, de cellules ou d'assemblages de cellules. [0075] Dans la présente, le médicament peut être administré par exemple, par voie topique, per-oesophagienne, sous cutanée ou intraveineuse ou tout autre mode d'administration approprié. Le médicament peut être formulé de toute manière connue par l'homme du métier selon l'administration.

[0076] La présente invention a également pour objet l'utilisation de molécules organiques et/ou organominérales susceptibles d'être obtenues par le procédé de l'invention, pour le traitement de maladies choisies dans le groupe comprenant l'ostéopénie, l'ostéoporose, le vieillissement dégénératif, les infections rhumatologiques dont arthrose, polyarthrite, les maladies orthopédiques et les maladies dermatologiques. [0077] La présente invention a également pour objet l'utilisation de molécules organiques et/ou organominérales susceptibles d'être obtenues par le procédé de l'invention pour l'application avec un implant ou sur un implant pour, par exemple augmenter la régénération des tissus par exemple osseux, cartilagineux ou cutanés, dans tous les types d'os et autres tissus. Par exemple au niveau du rachis, des membres (os compact, os spongieux), des os plats de la face et de la boite crânienne, du squelette thoracique ou autres. [0078] La présente invention a également pour objet l'utilisation de molécules organiques et/ou organominérales susceptibles d'être obtenues par le procédé de l'invention pour la fabrication des greffons osseux par stimulation d'ostéoblastes ou de fibroblastes (ostéoinduction). [0079] D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, données à titre illustratif.

Brève description des figures

La figure 1 représente des puits de cultures de cellules. Les cellules sont cultivées en présence ou en absence d'extrait (T) de roches calcaires obtenu par un procédé de l'art antérieur (IM, NAC, AGH) ou un des modes de réalisation du procédé de l'invention (AGA, AGB).

La figure 2 représente des coupes histologiques de cellules après 5 jours de culture. - La figure 2 A représente une coupe d'expiant témoin non traité maintenu en condition de survie.

La figure 2 B représente une coupe d'expiant cultivé dans des conditions identiques à celle du témoin ayant reçu un traitement d'extrait de roche calcaire. - La figure 3 A représente une coupe histologique d'un explant de peau humaine maintenu en survie 9 jours, non traité et constitue un témoin de coupe de la figure 3 B.

La figure 3 B représente une coupe histologique d'un même explant de peau humaine maintenu en survie dans les mêmes conditions que la figure 3 A, traité 9 Jours avec l'extrait organo- minéral d'Orgon obtenu par le procédé décrit dans l'exemple 1 , montrant la stimulation des GAGs neutres et acides (acide hyaluronique).

La figure 4 A représente une coupe histologique témoin d'un explant de peau maintenu en survie 9 jours, non traité, pour constituer un témoin de coupe histologique de la figure 4B..

La figure 4 B représente une coupe histologique d'un même explant de peau humaine maintenu en survie dans les mêmes conditions que pour la figure 4 A traité pendant 9 jours avec l'extrait organo-minéral d'Orgon et montre la stimulation des

GAGs neutres et acides (acide hyaluronique).

EXEMPLES

Exemple 1 : Extraction de molécules organiques et/ou organominérales

[0080] Une roche de carbonate de calcium, 50g de roche d'Orgon, a été mélangée dans un récipient à bouchon, en Nalgène de 1000 ml à une solution comprenant 238ml d'éthanol absolu GPR RECTAPUR (solvant organique) de la société VWR International SAS, 12 ml d'eau milliQ obtenue avec une chaîne complète de purification d'eau de la société Thermo Scientific Barnstead (osmoseur Diamond RO et polisseur Easypur II) et 1ml d'acide minéral (HCI 37% ou 12N) de la société Carlo Erba. Le pH de la solution ainsi obtenue a été mesuré avec un pH mètre de la société Hach-Lange (Titralab 854) et était pH = 1 ,58. [0081] La température de réalisation de cet exemple était de 23 ⁰ C. [0082] Le mélange a été effectué avec un éluteur rotateur de marque Heidolph à une vitesse de rotation de 10 tours par minutes.

[0083] Dans cette expérience, trois mélanges identiques ont été effectués. Différents temps d'extractions ont été testés. [0084] L'extraction des molécules a été obtenue après des temps croissants par centrifugation à 3000g (centrifugeur CR 3.12 Jouan, France) pendant 20 minutes, réfrigérée à 4°C. Le surnageant a été ensuite filtré à l'aide d'un porte filtre pour filtration sous vide sur membrane (Whatman) avec filtre Millipore : membrane de polyfluorure de vinylidène (PVDF) hydrophile Durapore seuil 0.22μm. Les solutés ont été ensuite évaporés sous vide à l'aide d'un évaporateur (Bϋchi Rotovapor R-200) de manière à éliminer le solvant organique. Ils ont été enfin lyophilisés à l'aide d'un lyophilisateur Christ LyoDisplay Alpha 2-4 équipé d'un piège à -85 ⁰ C. Une poudre a été obtenue.

[0085] Les molécules extraites ont été analysées par spectrométrie d'émission au plasma (ICP-OES, Ultima Jobin Yvon), par Chromatographie Liquide à Haute Performance (HPLC) analytique (Thermo, colonne BioBasic SEC-300 et détecteur UV 2000), PyroGC/MS (THERMOfinnigan) et par électrophorèse SDS-PAGE (Mini ProteanTetra CeII, Biorad). [0086] Le tableau 1 ci-dessous résume les caractéristiques des extraits obtenus.

Tableau 1 : caractéristiques des mélanges effectués, les quantités extraites et le rendement d'extraction

[0087] Tel que démontré dans cet exemple et dans le tableau ci- dessus, le rendement d'extraction obtenu avec un exemple de mise en œuvre du procédé de l'invention était constant à environ en moyenne de 1.3% d'extrait.

Exemple 2. Extraction avec un procédé de l'art antérieur.

[0088] Le protocole décrit dans le brevet européen EP 0869805 a été appliqué sur 8 échantillons de roche d'Orgon avec deux dilutions différentes et des temps d'extraction croissants. Les dispositifs et produits utilisés dans cet exemple sont identiques à ceux utilisés dans le brevet EP

0869805.

[0089] Différents temps d'extraction ont été testés. [0090] Résultats : le tableau 2 ci-dessous résume les conditions testées

Tableau 2 : résultats des expériences d'extraction de molécules organiques avec le procédé du brevet EP 0869805.

[0091] Les quantités d'extrait avec ce procédé étaient de l'ordre du milligramme. Le rendement massique d'extraction avec le procédé de l'art antérieur est de l'ordre de 0.0056%. [0092] Tel que démontré dans l'exemple 1 , le procédé de l'invention permet d'avoir un rendement de 1 ,3%, soit au moins plusieurs centaines de fois supérieurs (environ 232) au procédé de l'art antérieur.

Exemple 3 : Extraction de molécules organiques et/ou organominérales suivant différents temps d'extraction.

[0093] Les composés de cet exemple sont identiques à ceux de l'exemple 1. Lors de cet exemple, la proportion d'acide a été augmentée par rapport à l'exemple 1 et différents temps d'extraction ont été testés.

50g de roche d'Orgon ont été mélangés à une solution comprenant 238ml d'éthanol absolu (solvant organique), 12 ml d'eau absolue et 2ml d'acide minéral (HCI à 37%). Le pH de la solution était de pH = 1 ,2.

[0094] Différents temps d'extraction ont été testés dans cet exemple.

Le pH de la solution était inférieur à celui de la solution de l'exemple 1.

[0095] Le tableau 3 ci-dessous résume les conditions et la quantité de molécules organiques et/ou organominérales obtenues.

Tableau 3 : résultats d'extraction

[0096] Dans cette expérience, il a été montré que la diminution du pH a permis une augmentation du rendement d'extraction qui était alors compris entre 2.4% et 3.3%.

[0097] Tel que démontré dans cet exemple, une diminution du pH du mélange a permis d'augmenter le rendement d'extraction. Dans cet exemple, les quantités extraites sont 600 à 800 fois supérieures aux quantités extraites avec le procédé de l'état de la technique présenté dans l'exemple 2.

[0098] Cet exemple démontre donc clairement que le procédé de l'invention permet d'augmenter de façon très importante les quantités d'extraits de roches calcaires et permet ainsi d'optimiser le procédé et de diminuer les coûts.

Exemple 4. Exemple de réalisation du procédé de l'invention avec des volumes de solvants aqueux et organiques supérieurs

[0099] Les réactifs et conditions de réalisation de cet exemple sont identiques à celle de l'exemple 1.

[00100] Dans cet exemple, 50g de roche d'Orgon ont été mélangés à une solution comprenant 476ml d'éthanol absolu (solvant organique), 24 ml d'eau absolue et 2ml d'acide minéral (HCI à 37%). Le pH de la solution était de pH = 1,51. [00101] Les résultats et le temps d'extraction sont indiqués dans le tableau 4 ci-dessous.

Tableau 4 : résultats de l'extraction

[00102] Tel que démontré dans cet exemple, la proportion roche/solvant dans le procédé ne change pas le rendement à quantité d'acide constant.

Exemple 5 : Exemple de réalisation du procédé d'extraction en fonction du pH [00103] Les composés et les conditions de réalisation sont identiques à ceux des exemples précédents. 50g de roche d'Orgon a été mélangé à une solution comprenant 250ml d'éthanol absolu, la fraction aqueuse a été minimisée en mettant uniquement l'acide minéral, d'abord 1ml puis 2ml avec un pH environ égal à 0. [00104] Différents temps ont été testés. Tel que présenté dans le tableau 5, le rendement augmente avec la quantité d'acide uniquement :

1 ,2% puis 3,2%.

[00105] Par ailleurs, différentes quantités de solvants ont été testées.

[00106] Le tableau 5 ci-dessous résume les conditions et résultats obtenus.

Tableau 5 : résultats d'extraction en fonction de différentes quantités de solvant.

[00107] Tel que présenté dans le tableau 5, si la quantité de solvant organique est augmentée, le rendement reste inchangé à quantité d'acide constante, par exemple pour 500ml de solvant organique le rendement d'extraction est resté égal à environ 3%.

Exemple 6 : Extraction à partir de granulométries variables

[00108] Les conditions de réalisation sont identiques à ceux de l'exemple 1.

[00109] Les échantillons de la roche d'Orgon ont été préalablement broyés par le fournisseur (Omya SAS). Une colonne de tamisage a été utilisée pour caractériser le produit tel que reçu du fournisseur. La colonne de tamisage comprend les différents étages : 500 μm, 200 μm, 100 μm et 50 μm (fourni par OSI Inox). Le Tableau 6 donne le pourcentage de chaque fraction. Une série d'échantillons a été broyée à partir de bloc de roches. Les blocs ont été broyés en utilisant un broyeur de laboratoire (IKA-WERKE AUbasic). Le broyât est ensuite tamisé dans la même colonne de tamisage. 50 g de chacune des fractions ont été produits en broyant de plus en plus fin.

[00110] Les broyats ont ensuite été mélangés à une solution comprenant 238ml d'éthanol absolu, 12 ml d'eau absolue et 2 ml d'acide minéral (HCI à 37%). Le tableau 6 ci-dessous résume les quantités d'extraits obtenus en fonction de la taille du broyât.

Tableau 6 : caractérisation de la granulométrie de la poudre d'Orgon

[00111] La quantité d'extraits obtenue avec les différentes granulométries sont présentés dans le tableau 7 ci-dessous.

Tableau 7 : rendement d'extraction de la roche calcaire d'Orgon en fonction de la granulométrie

[00112] Tel que démontré dans cet exemple, l'extraction existe quelle que soit la granulométrie. Plus particulièrement, le rendement augmente quand la granulométrie diminue et reste constant lorsque la granulométrie est inférieure à 200μm.

Exemple 7 : étude de l'effet des extraits sur la minéralisation osseuse

[00113] Les différentes étapes de la différenciation osseuse peuvent être étudiées in vitro sur des cultures cellulaires. La capacité des extraits à stimuler les mécanismes de minéralisation osseuse a été testée selon le protocole décrit dans Bellows et al., 1991, 1992 (Refs 8, 9).

[00114] Dans cet exemple, les extraits de roches ont été obtenus à partir du calcaire du gisement d'Orgon, en suivant les trois conditions d'extraction décrites dans le tableau 8. [00115] L'extraction a été effectuée pendant 15 heures suivant le protocole décrit précédemment. Le solvant a été ensuite mis à évaporation et le culot lyophilisé.

Tableau 8 : conditions d'obtention des extraits et rendement des procédés utilisé.

- : pas présent dans la solution

[00116] L'extrait obtenu selon le procédé de l'invention correspond à la condition AGA. La condition AGB est obtenue suivant le procédé mais sans être optimisée. [00117] La condition AGH correspond à l'extrait obtenu selon le protocole du brevet européen précité.

[00118] Après avoir lyophilisé les 3 extraits, leur activité a été testée en utilisant des cultures cellulaires in vitro de cellules MC3T3-E1 de souris (ATCC, USA). Il s'agit d'une lignée ostéoblastique de cellules pré- différenciées, engagées dans la voie ostéoblastique, capables de minéraliser après avoir atteint un stade de maturation. [00119] Les cellules MC3T3 ont été cultivées pendant 25 jours à 37°C sous 5 % de CO ₂ dans un milieu alpha Minimum Essentiel (α-MEM médium) (alpha-modification, Sigma M4526) contenant 50 U/mL de pénicilline et 50 μg/mL de streptomycine (Gibco-lnvitrogen), 10 % de sérum de veau fœtal (HyClone-Perbio) et 2 mM L-glutamine (GibcoBRL). Les extraits AGA, AGB, AGH, ont été additionnés à ce milieu de culture, à savoir 200 μg d'extrait sec par ml de milieu nutritif. Ces tests ont été comparés au témoin sans apport (T) ₁ ainsi qu'à un milieu nutritif connu à l'acide ascorbique et au bétaglycérophosphate (IM).

[00120] Les résultats de cette expérience, Figure 1 , ont montré une stimulation très nette du développement des cellules lorsque le milieu nutritif comprend des extraits de roches calcaires suivant les conditions AGA, et AGB. [00121] Les extraits obtenus avec les conditions AGA et AGB de roches stimulent la minéralisation dès 21 jours comme pour les extraits de nacre fraîche (NAC). Le milieu nutritif de référence a atteint le même stade au bout de 26 à 29 jours. Par contre l'extrait AGH de roche obtenu avec le protocole de l'état de la technique n'a pas stimulé la minéralisation. L'extrait de nacre (NAC) obtenu selon le procédé de l'art antérieur permet une stimulation de la minéralisation comme attendue et confirme la réactivité des cellules. [00122] Tel que démontré dans cet exemple, lorsque les cellules préostéoblastiques sont exposées aux extraits obtenus par le procédé de l'invention, elles déclenchent le mécanisme de minéralisation osseuse dès la 3 ^ème semaine, alors que les inducteurs spécifiques ne produisent le même effet qu'à la fin de la 4 ^ème semaine de culture.

[00123] Les extraits du matériau calcaire obtenus selon le procédé de l'invention permettent donc la stimulation de la minéralisation au contraire de l'extrait de matériau calcaire obtenu par le procédé du brevet EP 0869805 de l'art antérieur. Les extraits de la roche selon le procédé de l'invention possèdent donc bien une activité sur les tissus biologiques.

Exemple 8 : Effet des extraits de roches sur des explants de peau humaine.

[00124] Dans cet exemple, les applications cosmétiques ont été démontrées sur des explants de peau humaine maintenus en condition de survie. Les explants provenaient d'une plastie abdominale d'une femme âgée de 38 ans. 21 explants de peau entière ont été mis en survie en milieu BEM selon le procédé Bio-EC, France.

[00125] 3 groupes de 6 explants et 1 groupe de 3 explants ont été formés tel que présenté ci-dessous:

Témoin TO 3 explants lot non traité T 6 explants gel de CMC E 6 explants produit P1 P1 6 explants

[00126] Le groupe témoin TO correspondait aux 3 explants qui ont été prélevés à JO (jour zéro).

[00127] Le groupe T, non traité correspondait au groupe de 6 explants qui ont été maintenus en condition de survie à l'aide du milieu de culture BEM.

[00128] Le groupe E, gel de CMC (carboxyméthylcellulose) correspondait au groupe de 6 explants qui ont été maintenus en condition de survie et sur lesquels ont été appliqués l'excipient à savoir le gel CMC, sans actifs.

[00129] Le groupe produit P1 correspondait au groupe de 6 explants maintenus en condition de survie et sur lesquels ont été appliqués le gel CMC contenant le mélange d'extrait de roche suivant l'invention concentré à 2%.

[00130] Le traitement a été réalisé par application topique de 2 mg de produit à tester par explant. Ce traitement a été réalisé tous les jours. Les milieux de culture ont été renouvelés pour moitié à J2, J5 et J7, c'est à dire 2 jours après, 5 jours après et 7 jours après le début de l'expérience.

[00131] A JO, les 3 explants du groupe TO ont été prélevés et coupés en deux. Une partie a été fixée au formol tamponné pour l'observation de la morphologie générale. L'autre a été congelée et conservée à -80 ⁰ C. A J5 et à J9, 3 explants de chaque groupe ont été prélevés et traités de la même manière.

[00132] Des préparations histologiques ont été réalisées suivant les protocoles classiquement utilisés : coupes en paraffine après coloration au trichrome de Masson, variante de Goldner selon le mode opératoire MO-H- 157. Les observations de la morphologie générale présentée ici ont été réalisées en microscopie optique, à l'aide d'un microscope Leica type DMLB, à l'objectif x 40. Les prises de vue ont été réalisées avec une caméra tri CCD Sony DXC 390P et stockées à l'aide du logiciel d'archivage de données Leica IM 1000. [00133] Comparés aux explants témoins non traités, après 5 jours les explants qui ont subi l'application des extraits de roche montrent que le stratum corneum est modérément épais et feuilleté, légèrement kératinisé en surface et très nettement à sa base (Figure 2 B). La parakératose est légère. L'épiderme présente 6 à 7 assises cellulaires avec une bonne morphologie. Les coupes témoins (Figure 2 A) comme le groupe de départ n'en présente que 4 à 5. Le relief de la jonction dermo-épidermique est très net. Le derme papillaire présente des fibres de collagène assez épaisses formant un réseau dense. Il est bien cellularisé. [00134] Après 9 jours de traitement, il a été noté une nette augmentation de l'épaisseur du stratum corneum (signe d'un important renouvellement cellulaire et d'une assez bonne différenciation terminale) avec une augmentation de l'épaisseur épidermique (Figure 2 B). Le réseau de collagène, dans le derme papillaire, était également plus dense.

[00135] Tel que présenté dans cet exemple, une étude de la morphologie générale sur explants de peau humaine a été conduite dans des conditions standard non optimisées. Elle a montré une très nette activité stimulante épidermique et dermique avec l'extrait de roche dès 5 jours d'application et renforcée après 9 jours (non illustré) : meilleur ancrage avec une restructuration de la stratification cellulaire épidermique, une restauration du relief de la jonction dermo-épidermique ainsi qu'un réseau de collagène plus dense dans le derme papillaire. [00136] Cet exemple démontre donc clairement que l'extrait obtenu par la présente invention permet, en plus de stimuler la formation, la minéralisation et la régulation de la masse osseuse, d'avoir un effet restructurant et régulateur de l'ensemble de l'activité cutanée.

Exemple 9 : Exemple de caractéristiques de roche calcaire [00137] Les roches calcaires qui peuvent être utilisées dans le procédé de l'invention peuvent être choisies, par exemple sur la base de leur teneur en carbone organique total (COT), même si la technique n'est qu'indicative et généralement pas très sensible et que seule l'extraction suivant le brevet compte. [00138] Une méthode pyrolytique connue sous le nom de pyrolyse Rock Eval a été utilisée dans cet exemple, détournée de son utilisation habituelle que sont les huiles minérales ou les contaminations. Le tableau ci-dessous montre qu'il est possible de détecter un pic lié au craquage sous atmosphère neutre de constituants organiques, grâce au détecteur FID (Ionisation de Flamme) (Ref 8) (mg d'hydrocarbures formés par craquage en fonction de la température et par la température de son maximum). Ce pic même très faible, sur les roches calcaires sélectionnées chez un certain nombre de producteurs, n'apparaît pas sur le carbonate de calcium précipité (CCP) vendu par VWR International.

Tableau 9 : exemples de caractéristiques de roches calcaires

- : non testé [00139] Tel que démontré dans le tableau ci-dessus, les différentes roches testées présentent toutes un pic de pyrolyse comparable à celui de la roche d'Orgon.

[00140] Ces roches sont des carbonates de calcium (calcite) qui peuvent être utilisées dans le procédé de l'invention.

Exemple 9 Composition cosmétique

[00141] Une crème de redensification dermique cosmétique est préparée à partir des extraits obtenus dans l'exemple 1. Il s'agit d'une émulsion huile-dans-eau stable où la phase huileuse est dispersée dans une phase aqueuse avec un émulsionnant à base d'ester d'acide gras : palmitate de glucose et du palmito-stérate de saccharose (5%). La phase huileuse est réalisée avec de l'huile de tournesol (13%) et de l'huile de jojoba (5%). La phase aqueuse contient des substances bactériostatiques. Une concentration de 2% d'actif a été utilisée et ajoutée dans la phase aqueuse.

[00142] La préparation obtenue est testée par application topique sur des explants de peau dans les conditions décrites dans l'exemple 8. Les coupes d'expiants à 9 jours montrent avec l'excipient seul une structure épidermique en bon état de survie comparable à la morphologie des explants témoin à au début de l'expérimentation (JO). L'application de la crème cosmétique induit une nette augmentation de l'épaisseur épidermique (7/8 assises cellulaires) et dans le derme papillaire, un réseau de collagène plus dense. La structure de la jonction dermo-épidermique est nettement remodelée avec un ancrage prononcé dans le derme.

Exemple 10 : Composition pharmaceutique :

[00143] Une " composition pharmaceutique de renouvellement et restructuration de la barrière hydro lipidique cutanée a été préparée pour une application topique sur la peau, destinée à réaliser un peeling naturel sans aucune abrasion physique et donc sans fragilisation de la protection épidermique. L'excipient utilisé est une base classique décrite dans le tableau ci-dessous.

Tableau 10 : base de la composition pharmaceutique

[00144] Les actifs ont été additionnés à hauteur de 2% sur la base des extraits obtenus au cours de l'exemple 3.

[00145] La composition pharmaceutique obtenue est testée par application topique sur des explants de peau dans les conditions décrites dans l'exemple 8. Après 9 jours une vérification a été effectuée afin de vérifier que les explants traités avec l'excipient seul conservent une structure épidermique en bon état de survie comparable à la morphologie des explants témoins au début de l'expérimentation (JO). Les coupes d'expiants traitées avec la composition pharmaceutique montrent après 9 jours un important renouvellement cellulaire et une bonne différenciation terminale, avec une augmentation modérée de l'épaisseur épidermique (6/7 assises cellulaires). En 9 jours un peeling est observé suivi d'un renouvellement de la barrière hydrolipidique cutanée.

Exemple 10 : Exemple comparatif : extraction avec un procédé de l'art antérieur décrit dans le document FR 2 919 186 [00146] Le protocole décrit dans le document FR 2 919 186 a été appliqué sur un échantillon de roche d'Orgon et un échantillon de Falun de Touraine tel que décrit dans le document FR 2 919 186. [00147] Les dispositifs et produits utilisés dans cet exemple sont identiques à ceux utilisés dans le document FR 2 919 186. Les deux matériaux ont été broyés de manière à obtenir une granulométrie moyenne inférieure à 1 μm. Chacune des poudres a été introduite dans de l'eau déminéralisée contenant un mélange de conservateurs : sorbate de potassium à 0,3% en poids, benzoate de Sodium à 0,4% en poids, déhydroacétate de sodium à 0,1% en poids et alcool benzylique à 0,6% en poids, dans une cuve munie d'un agitateur et maintenue à température ambiante, c'est-à-dire à 22°C dans une proportion de 20% en poids, comme indiqué dans le document FR 2 919 186. Le pH de la solution a été vérifié afin de confirmer que celui-ci était bien neutre, comme décrit dans le document précité, c'est-à-dire pH= 7,1. L'agitation a été maintenue pendant 48 heures à une température de 22°C comme indiqué dans le document FR 2 919 186. Le mélange a été ensuite filtré afin de séparer la suspension minérale résiduelle du liquide. [00148] Une analyse des minéraux en solution a été ensuite réalisée sur le liquide par ICP/AES (Jobin Yvon Ultima 2 (marque déposée)) pour évaluer le rendement d'extraction avec le procédé du document FR 2 919 186. Dans l'échantillon de falun, les inventeurs ont mesuré une valeur de 205 mg de Ca par litre et 23,5 mg de Si par litre de solution (1396 mg de résidu après lyophilisation). Ils ont trouvé une valeur de 245 mg de Ca pour la roche d'Orgon et une valeur de Si indétectable. Le rendement massique par rapport à la masse de roche d'Orgon est de 0,0012% par ce procédé de l'art antérieur décrit dans le document FR 2 919 186. Le rendement massique obtenu pour le falun de Touraine par le même procédé de l'art antérieur est de 0,007%. [00149] Ainsi comme démontré dans cet exemple, le rendement d'extraction du procédé de l'invention permet d'obtenir un rendement plus de 1000 fois supérieur aux procédés décrits dans l'art antérieur. Exemple 11 : Activités cosmétiques des extraits obtenus par le procédé de l'invention suivant la provenance du matériau calcaire

[00150] Cet exemple est réalisé dans les mêmes conditions que l'exemple 8, ci-dessus.

[00151] Une plastie abdominale d'une femme âgée de 53 ans a été utilisée. Plusieurs lots d'expiants ont été obtenus. Dans cet exemple, tous les extraits ont été appliqués, suivant le protocole décrit dans l'exemple 8 ci-dessus: application topique, tous les jours, de 2 mg de gel CMC contenant l'extrait de roche suivant l'invention, concentré à 1%.

[00152] L'extrait de roche d'Orgon tel qu'obtenu dans l'exemple 1 , a été utilisé pour tester un lot d'expiants référencé CA2.

[00153] Un extrait de roche de Saint Germain tel qu'obtenu suivant le même procédé a été utilisé pour tester un lot d'expiants référencé CB6. [00154] Après traitement pendant 5, 9 ou 10 jours sur les explants, des coupes histologiques ont été réalisées par fixation des explants 24 heures dans du formol tamponné, déshydratation et imprégnation en paraffine à l'aide d'un automate de déshydratation (Leica 1020) et mise en bloc (station d'enrobage (Leica EG 1160)). Les coupes de 5 μm ont été ensuite réalisées au microtome (Minot, Leica RM2125) et collées sur des lames de verre histologiques silanisées superfrost (marque déposée). Les colorations et les marquages immunochimiques ont été réalisés sur les coupes dans les conditions suivantes. :

- La visualisation des glycosaminoglycanes (GAGs) est effectuée par coloration au bleu alcian-P.A.S. sur les coupes précédemment décrites (également connu de l'homme de l'art par coloration de Mowry).

- Le collagène I a été marqué sur coupes congelées avec un anticorps polyclonal anti-collagène I, fait sur lapin, (Monosan, ref : PS 047), au 1/500 ^ème pendant 1h à température ambiante avec un système amplificateur biotin/streptavidin, révélé en FITC. Les noyaux ont été contre colorés à l'iodure de propidium. - Le collagène III a été marqué sur coupes congelées avec un anticorps polyclonal anti- collagène III, fait sur chèvre (SBA ref : 1330-01), au 1/320 ^ème pendant 2 h à température ambiante avec un système amplificateur biotin/streptavidin, révélé en DAB. Les noyaux ont été contre colorés à l'hémalun de Masson.

- Le collagène IV a été marqué sur coupes congelées avec un anticorps polyclonal anti- collagène IV, fait sur chèvre (SBA ref : 1340-01), au 1/60 ^ème pendant 2 h à température ambiante avec d'un système amplificateur biotin/streptavidin, révélé en fluorescéine isothiocyanate (FITC). Les noyaux ont été contre colorés à l'iodure de propidium.

- La laminine-5 a été marquée sur coupes congelées avec un anticorps monoclonal anti-laminine-5, clone P3E4 (SBA ref : 1340- 01), fait sur chèvre, au 1/320 ^ème pendant 1h30 à température ambiante avec un système amplificateur biotin/streptavidin, révélé en FITC. Les noyaux ont été contre colorés à l'iodure de propidium.

[00155] Les résultats sont évalués par comparaison avec des témoins réalisés sur des lots d'expiants traités avec l'excipient uniquement. [00156] Le lot CA2 traité pendant 10 jours avec l'actif organo-minéral d'Orgon obtenu dans l'exemple 1 a montré de façon inattendue, une surexpression nette des GAGs acides (GAGsA) du derme papillaire tel que représenté sur la figure 3 B. Ces GAGs sont connus pour être essentiellement des acides hyaluroniques, facteur hydratant très recherché en dermopharmaceutique et cosmétique.

[00157] II a été également observé une surexpression modérée des GAGs neutres (GAGsN) (réserve de facteur de croissance), du collagène de type I (CoII I) et III (CoII III) (collagène juvénile). Ces effets peuvent avantageusement produire une stimulation de la densification du derme papillaire, un effet anti-ride recherché en cosmétique (voir Tableau 11).

[00158] Le lot CB6 traité pendant 10 jours avec l'extrait organo-minéral obtenu à partir du matériau calcaire de la carrière de Saint Germain a montré par rapport au lot témoin, une surexpression nette du collagène IV (CoII IV) (collagène des tissus de soutien), de la laminine 5 (Lam 5) et du collagène de type III ou collagène juvénile (voir le tableau 11).

Tableau 11 : résultats obtenus avec les extraits obtenus par le procédé de l'invention par rapport à des témoins

Diminution légère: ^ ; modérée : ^^ ; assez nette :^^^ ; nette :^^v

Augmentation : légère :/ ⁷¹ ; modérée \PP ; assez nette : PPP \ nette :

PPPP ou Inchangé :*» [00159] Tel que démontré dans cet exemple, les extraits obtenus par le procédé de la présente invention ont donc un effet, par exemple au niveau des protéines impliquées dans le derme et la jonction dermo-épidermique en stimulant leurs activités.

[00160] Aussi, cet exemple démontre clairement que les extraits obtenus par le procédé de l'invention peuvent être utilisés, par exemple, dans le domaine cosmétique, par exemple pour un effet anti-âge par restructuration du relief de la jonction dermo-épidermique et stimulation de son activité.

[00161] Cet exemple démontre que dans des conditions non optimisées des extraits tels qu'obtenus par le procédé à partir de différents matériaux calcaires ont une activité ciblée à divers niveaux dermo-épidermique.

Exemple 12 : Activités dermatologiques des extraits obtenues par le procédé avec différents matériaux calcaires [00162] Les tests d'activité de cet exemple sont réalisés sur des explants de peau humaine maintenue en survie dans les mêmes conditions que ceux de l'exemple 11 précédent. [00163] Des colorations et des marquages sont obtenus comme décrit dans l'exemple 11 précédents sur les GAGs, les collagènes de types I, III et IV, sur la laminine-5. D'autres activités sont évaluées comme suit. [00164] Les cellules en mitose ont été marquées avec un anti-corps monoclonal, anti-Ki67 (clone 7B11 de chez Zymed, IgGI sur souris) avec un système amplificateur biotin/streptavidine (Vectastain RTU Universal Vector) et une révélation en VIP.

[00165] La G6PDH a été marquée sur coupes paraffine fixée au Bouin avec un anti-corps polyclonal anti-G6PDH (Rockland ref : 200-1153), fait sur souris, au 1/150 ^ème pendant 24h à température ambiante (20 ⁰ C) avec un système amplificateur biotine/streptavidine révélé en Fluorescéine isothiocyanate (FITC). Les noyaux ont été contre colorés à l'hémalun de Masson. [00166] La loricrine a été marquée sur coupes congelées avec un anti- corps polyclonal anti-loricrine (Covance ref PRB-145) fait sur lapin au 1/4000 ^ème pendant 1 nuit à 4°C avec un système amplificateur biotine/streptavidine et révélé en FITC. Les noyaux ont été contre colorés à l'iodure de propidium. [00167] Les LEKTI sont des inhibiteurs de protéases à serine (lympho epithelial kazal type inhibitor). Ils ont été marqués à l'aide d'un anti-corps monoclonal de souris anti-LEKTI (Santa Cruz, ref sc-32330), au 1/800 ^ème pendant 1 nuit à 4°C avec un système amplificateur Vectastain RTU Universal VECTOR avidine/biotine et révélé en FITC. Les noyaux ont été contre colorés à l'iodure de propidium. [00168] Le lot DA2 traité pendant 9 jours avec l'extrait organo-minéral d'Orgon obtenu dans l'exemple 1 , a montré de façon inattendue, une régulation du turnover complet de stratification épidermique en 9 jours avec conservation d'une excellente morphologie de l'épiderme, tel que représenté sur la figure 4 B. Une nouvelle peau a donc été reconstituée en 9 jours par simple application topique de l'extrait organo-minéral d'Orgon, la peau se renouvelle naturellement trois fois plus lentement, en 28 jours. [00169] Les extraits obtenus par le procédé de l'invention peuvent donc d'être utilisé dans le cas de brûlures de peau, de stimulation d'expiants humains en croissance, stimulation de tissus de synthèse in vitro, etc

[00170] Le lot DB6 a été traité pendant 10 jours avec l'actif organo- minéral extrait de la pierre d'Euville obtenu suivant l'exemple 1. Il a été observé avec intérêt, une stimulation de la prolifération cellulaire dans l'épiderme par une surexpression du marquage Ki67 des cellules en mitose et une stimulation des LEKTI dans la couche granulaire (voir le tableau 12).

[00171] Le lot DB2 a été traité pendant 10 jours avec l'extrait obtenu à partir de la nacre de Pinctada margaritifera suivant l'exemple 1. Il a été observé une surexpression des collagènes de type I (voir le tableau 12). Tableau 12 : résultats obtenus avec les extraits obtenus par le procédé de l'invention par rapport à des témoins

Diminution légère: ^ ; modérée : ^^ ; assez nette ^^^ ; nette ^^v Augmentation : légère :/ ⁷¹ ; modérée : ss ^> ; assez nette : s ¹ /*/* ; nette : s>/*?s ^ι ou Inchangé :**

[00172] Cet exemple démontre que les extraits obtenus par le procédé de l'invention à partir de différents matériaux calcaires de provenances variées ont des effets spécifiques de stimulation de la peau humaine. Il montre que l'âge du matériau peut, en outre, produire des effets bénéfiques : le calcaire d'Orgon (110 millions d'années) stimule, en outre, la production d'acide hyaluronique (GAGsA).

Exemple 13 : Activité sur la peau des extraits optimisés par fractionnement [00173] Différents extraits fractionnés ont été testés sur des explants de peau humaine ex-vivo, dans les mêmes conditions que l'exemple 11 et 12 précédents.

[00174] Dans cet exemple l'extrait de la roche d'Orgon a été obtenu en utilisant le procédé dans les proportions suivantes : 50 g du calcaire d'Orgon broyés sont mis en contact avec une solution de 500ml d'eau MiIIi- Q, 10 ml de dichlorométhane et 2ml d'acide chlorhydrique. [00175] L'extrait brut est utilisé tel quel pour traiter pendant 9 jours les explants du lot référencé FA1. Le traitement des explants par l'extrait est effectué dans les mêmes conditions que celui décrit dans les exemples 11 et 12 précédents.

[00176] Le même extrait a été déminéralisé et utilisé pendant 10 jours pour tester un lot d'expiants référencé FB3. La déminéralisation de l'extrait a été réalisée en reconstituant une solution à partir de la poudre lyophilisée avec de l'eau MiIIi-Q, en utilisant des sacs de dialyse (Spectrum, Spectra/Por avec une coupure à 0,5 kDa). L'extrait mis en solution est dialyse contre un tampon d'eau MiIIi-Q (<1 μS/cm) renouvelée et maintenu à température ambiante sous agitation jusqu'à ce que la conductivité soit inférieure à 1 μS/cm (2 micro siemens par centimètre correspondent à environ 1 milligramme de sel dissous par litre).

[00177] Le même procédé d'extraction a été utilisé avec le matériau calcaire CCP fourni par la société VWR International SA. L'extrait total est utilisé pour traiter pendant 10 jours un lot d'expiants référencé FB5. [00178] Une série de colorations et de marquages immunochimiques est réalisée sur les coupes d'expiants de peau après traitements des trois lots : FA1 , FB3 et FB5, dans les conditions décrites dans les exemples 11 et 12 précédents.

[00179] Le lot FA1 traité pendant 10 jours avec l'extrait organo-minéral d'Orgon obtenu dans cet exemple, a montré par rapport au lot témoin, une surexpression modérée des GAGs neutres et du collagène de type IV. Ceci s'interprète comme une stimulation de l'activité de la jonction dermo- épidermique dans la mesure où les GAGs neutres sont connus pour constituer le réservoir des facteurs de croissance au niveau de la jonction dermo-épidermique (voir le tableau 13 ci-dessous). Ces effets sont recherchés en cosmétique.

[00180] Le lot FB3 a été traité avec la fraction organique de l'actif concentré au cours de la dialyse par élimination des oligo-éléments solubles. Dans le lot FB3, il a été montré une surexpression des GAGs neutres, de la laminine 5 et des collagènes de type IV, III et de façon plus nette du collagène de type I. La fraction organique concentrée, testée sur le lot FB3 explique bien la stimulation de la jonction dermo-épidermique découverte avec l'extrait brut obtenu dans cet exemple par le procédé de l'invention. Il a également été constaté, une surexpression du collagène I ₁ composante importante de la matrice extracellulaire du derme papillaire (voir le tableau 13 ci-dessous).

[00181] Le lot FB5 a été traité avec l'extrait obtenu dans cet exemple mais à partir d'un matériau calcaire, CCP (carbonate de calcium précipité) fourni par la société VWR International SA. Il a été montré de façon surprenante après 10 jours de traitement une stimulation les GAGs neutres, du collagène IV et de la laminine 5, tous constituant la jonction dermo-épidermique (voir le tableau 13 ci-dessous).

Tableau 13 : résultats obtenus avec les extraits obtenus par le procédé de l'invention par rapport à des témoins

Tableau 13 (suite) : résultats obtenus avec les extraits obtenus par le procédé de l'invention par rapport à des témoins

Diminution légère: ^ ; modérée : ^ ; assez nette :^^ ; nette :^wv Augmentation : légère :/ ⁷¹ ; modérée :/ ⁷¹ ' ⁷¹ ; assez nette : ??P \ nette : / ⁷¹ T ¹ /"/ ¹ ou Inchangé :«*

[00182] Cet exemple démontre que le fractionnement des extraits obtenus avec le procédé de l'invention, peut permettre d'obtenir des effets amplifiés et/ou des effets ciblés sur un compartiment précis ou une fonction précise des cellules et/ou des processus physiologiques de la peau.

Listes des références

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(Réf 2) T. Chevalley et al. « Effect of calcium suppléments on fémoral bone minerai density and vertebrate fracture in Vitamin D depleted elderly patients », Osteoporosis IntΛ :245-52, 1984

(Réf 3) Blumberg S. « Is coral calcium a safe and effective supplément? » JAm DietAssoc Sept ; 104(9) : 1335-6

(Réf 4) T.Okano et al. « Bioavailability of calcium from oyster shell electrolysate and DL-Calcium lactate in vitamin D-replete or vitamin D-deficient rats. Journal of Bone and Minerai Metabolism 11 (2) : 23-32 1993

(Réf 5) T. Miura « Calcium bioavailability of a total bone extract (TBE) and diets effects on bone metabolism in rats » Biosci. Biotechnol. Biochem 62 : 1307-12, 1998

(Réf 6) Y Takada « bioavailabillity of various dietary calcium compound. 2 Examination in vivo of various dietary compound », Snow brand milk products Co, Ltd sapporo : 75- 84

(Réf 7) A Schaafsmal et al. « Eggshell powder, a comparable or better source of calcium than purified calcium carbonate: piglet studies », JSci Food Agric 79: 1596-600, 1999

(Réf 8) E. Lafargue, F. Marquis, D. Pillot, « Rock-Eval 6 Applications in hydrocarbon exploration, production and soil contamination studies », OiI & Gas Science and Technology, 1998, 53(4), 421-37

(Réf 9) Bellows CG, Heersche JN, Aubin JE. Bone Miner. Inorganic phosphate added exogenously or released from beta- glycerophosphate initiâtes mineralization of osteoid nodules in vitro. Apr; 17(1): 15-29, 1992

(Réf 10) Bellows CG, Aubin JE, Heersche JN. Initiation and progression of mineralization of bone nodules formed in vitro: the rôle of alkaline phosphatase and organic phosphate Bone Miner. Jul;14(1):27-40, 1991

REVENDICATIONS