VERWENDUNG DESSELBEN

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Zusatzstoffes für den enzymatischen Abbau von Mykotoxinen, insbesondere Fumonisinen, einen Zusatzstoff zum enzymatischen Abbau von Mykotoxinen, insbesondere Fumonisinen, in einem pflanzlichen Rohstoff und Mi- schungen, die pflanzliche Rohstoffe enthalten, sowie eine Verwendung von Genen.

Mykotoxine treten auf landwirtschaftlichen, pflanzlichen Produkten sehr häufig auf und verursachen je nach Art der Mykotoxine schwere wirtschaftliche Schäden, insbesondere in den aus den landwirtschaftlichen Produkten hergestellten Nahrungsmitteln und auch bei mit derartigen Nahrungsmitteln ernährten Tieren und Menschen, wobei derartige Schäden äußerst vielfältig sind. Es wurden bereits zahlreiche Me- thoden entwickelt, mit welchen versucht wird, derartige Mykotoxine zu entgiften bzw. abzubauen oder unschädlich zu machen, um durch die Mykotoxine verursachte Schäden in den Bereichen von tierischer und menschlicher Ernährung, der Tierzucht, Verarbeitung von Futter- und Lebensmitteln und dgl. hintanzuhalten.

Unter den bekannten Mykotoxinen existiert eine Vielzahl von untereinander strukturell verwandten Mykotoxinen, wie beispielsweise die Fumonisine, von welchen Fumonisin Bl das am häufigsten vorkommende Toxin der Gruppe ist. Jedoch sind zahlreiche Derivate und verwandte Moleküle bekannt, welche ebenfalls giftige Wirkungen bei Menschen und Tieren aufweisen. So ist es bekannt, daß die Fumonisine den Sphingoli- pidstoffwechsel durch eine Wechselwirkung mit dem Enzym Ceramidsynthase behindern. Sphingolipide sind nicht nur Bestandteil von Zellmembranen, sondern spielen auch eine wichtige Rolle als Signal- und Botenmoleküle in vielen ele- mentaren, zellulären Prozessen, wie dem Zellwachstum, der Zellwanderung und Zellanbindung, bei entzündlichen Prozessen und intrazellulären Transportvorgängen. Aufgrund dieser Behinderung des Sphingolipidstoffwechsels werden Fumonisine für die giftige Wirkung auf unterschiedlichste Tierarten und auch für den Menschen verantwortlich gemacht. So konnte nachgewiesen werden, daß Fumonisine bei Nagetieren krebserregend wirken, und sie wurden durch epidemiologische Daten mit Speiseröhrenkrebs und dem Neuralrohrdefekt bei Menschen in Zusammenhang gebracht. Bei verschiedenen Tierarten, wie beispielsweise Schweinen, werden sie für die typische Toxikose durch Lungenödeme verantwortlich gemacht. Fumonisine sind in diesem Zusammenhang eine nahezu allgegenwärtige Kontamination auf verschiedensten Getreidearten und insbesondere auf Mais sowie auf Nüssen und Gemüse sind, ist die- ser stark negative Effekt in bezug auf die Gesundheit von Menschen und Tieren nicht vernachlässigbar.

Der mikrobielle Abbau von Fumonisinen wurde bereits in der EP-A 1 860 954 beschrieben, gemäß welcher Mikroorganismen zur Entgiftung von Fumonisinen und Fumonisinderivaten eingesetzt werden, bei welchen die detoxifizierenden Bakterien oder Hefen, gewählt aus genau definierten Stämmen zur Entgiftung von Fumonisinen, Futtermitteln zugesetzt werden.

Auch wurden bereits katabolische Stoffwechselwege für den biologischen Abbau von Fumonisinen und die hiefür verantwortlichen Gene und Enzyme beschrieben. So beschreibt beispielsweise die EP 0 988 383 Fumonisin entgiftende Zusam- mensetzungen und Verfahren, wobei die eingesetzten, Fumoni- sin abbauenden Enzyme in erster Linie in transgenen Pflanzen produziert werden, bei welchen die Entgiftung von Fumo- nisinen mit Hilfe einer Aminooxidase, welche für ihre enzy- matische Aktivität molekularen Sauerstoff benötigt, erfolgt.

Des weiteren beschreibt die WO 2004/085624 Transaminasen, Deaminasen und Aminomutasen und Zusammensetzungen und Ver- fahren zur enzymatischen Detoxifizierung, wobei insbesondere aminierte Toxine, beispielsweise Fumonisine, entgiftet werden. In diesem Zusammenhang werden Polypeptide, welche eine Deaminaseaktivität besitzen, zur Entgiftung eingesetzt .

Bisher bekannten Verfahren ist jedoch gemeinsam, daß sie für eine Detoxifizierung der Mykotoxine molekularen Sauerstoff für die beschriebenen, katabolischen Stoffwechselwege benötigen, wobei die insbesondere erforderlichen Aminooxi- dasen unter sauerstoffunabhängigen Bedingungen nicht arbeiten können. Ein Einsatz von derartigen Genen und Enzymen zur Detoxifizierung von Futtermitteln, beispielsweise im Verdauungstrakt von Tieren, ist aufgrund des im wesentlichen Sauerstofffreien Milieus in dem Verdauungstrakt von Tieren nicht möglich bzw. zeigen die bekannten Gene und Enzyme keinerlei Wirkung.

Die Erfindung zielt nun darauf ab, ein Verfahren zur Herstellung eines Zusatzstoffes für den enzymatischen Abbau von Mykotoxinen zur Verfügung zu stellen, mit welchem es gelingt, Mykotoxine und insbesondere Fumonisine sicher und zuverlässig zu toxikologisch unbedenklichen Substanzen abzubauen bzw. zu entgiften. Zur Lösung dieser Aufgaben ist das erfindungsgemäße Verfahren derart geführt, daß wenigstens eine Nukleinsäuresequenz von Genen entsprechend Sequenz ID-Nr. 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 und 24 vorgelegt wird, die wenigstens eine Nukleinsäuresequenz in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen exprimiert wird und wenigstens ein dadurch hergestelltes Enzym entsprechend Sequenz ID-Nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 und 25 oder wenig- stens ein kompletter, rekombinanter Wirtsorganismus sowie gegebenenfalls gemeinsam mit einem Cosubstrat in einem pflanzlichen Rohstoff eingesetzt werden. Dadurch, daß wenigstens eine Nukleinsäuresequenz von Genen entsprechend den nachfolgenden Sequenz ID-Nr. 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 und 24 vorgelegt wird, gelingt es, spezifische, Fumonisine bzw. Mykotoxine abbauende Gene zu klonie- ren und zu exprimieren, wobei beispielsweise die Expression in E. coli und Pichia pastoris unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt wird, bei welcher Expression Enzyme entsprechend den Sequenz ID-Nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13,

15, 17, 19, 21, 23 und 25 oder auch ein kompletter, rekombinanter Wirtsorganismus gewonnen werden können, wobei das wenigstens eine Enzym gegebenenfalls gemeinsam mit einem Cosubstrat auf einem zu behandelnden Rohmaterial eingesetzt wird. Mit einem nach einem derartigen Verfahren hergestellten Zusatzstoff gelingt es, einerseits beispielsweise Mykotoxine direkt auf dem Rohmaterial vollständig und zuverlässig abzubauen, wobei die spezifischen bei diesem Verfahren produzierten Enzyme den Abbau von Fumonisinen und von Zwi- schenprodukten des Abbauweges katalysieren, und andererseits Mykotoxine beispielsweise auch direkt bei der Bio- ethanolherstellung in der Maische für die Alkoholherstellung abzubauen oder auch bei der Herstellung von Nahrungs- mittein direkt in dem Herstellverfahren abzubauen bzw. unschädlich zu machen.

Als pflanzliche Rohrstoffe werden hiebei Getreide bzw. Ge- treideprodukte, Gräser, Obst oder Gemüse sowie Zwischenprodukte des diese Stoffe zur Herstellung von Nahrungs- und Futtermittel enthalten, wie beispielsweise Silage, Obstmaische oder dgl. verstanden.

Als Zusatzstoffe werden vor allem Futtermittelzusätze, Nahrungsmittelzusätze sowie Zusätze zur Bioethanolherstellung verstanden.

Mit einem derartigen Verfahren gelingt es weiterhin, den SphingolipidstoffWechsel, der durch eine Wechselwirkung der Fumonisine mit dem Enzym Ceramidsynthase behindert wird, aufrecht zu erhalten und gleichzeitig die Fumonisine biologisch zu nicht toxischen Substanzen abzubauen. Schließlich können technologische Anwendungen der Detoxifizierung er- zielt werden, da dieses Verfahren auch im größeren technischen Maßstab anwendbar ist, so daß mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sicher und zuverlässig mykotoxinfreie Produkte hergestellt werden können.

Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Nuk- leinsäuresequenzen bzw. die mittels dieser Nukleinsäurese- quenzen in prokaryotischen und eukaryotisehen Wirtszellen exprimierten, in sauerstoffunabhängigem Milieu katalytisch wirkenden Enzyme sind nachfolgend aufgelistet. Nukleinsäuren Sequenzen:

>Seq ID 1 [fum (Fumonisinkatabolismus) Gencluster, 15.420 bp) TGTCGGCGATCRGTAAACTTCTACCGTGGTCCTCGTTCGCCCACAKCATACATCACAGAC RTCGGGATTTCCAACTGAAC GGGTCCCGGCCTGCCGGCCCACATTTCCCGGAACGCCATATGGGTGATTTCGACAATCCG GTTCCAGGCGAAGATGGGTG CGCCCCATTTAACCGCGGGTCGAAAGAGGTCGATCTGGTCTTGTCCCTGAAAGGTTTTTG GCGTGCAGGGATAAACGACA CCAAGTTGATGCTGGGACGTTATTGCGACGAAGGGAACCCCTTCGTGGCGTGCCGTCACG ACTCCAGGCAGAAGGTTTGC CGTACCGGGACCCGGATTCGTGACAATCGCGGCGACCTGTCCGGTGGTCTTGTAAATGCC CTCGGCCATATAGGCTGCGG CGGCCTCGTGCCGCACCGGGACGAACAATATCCCATTGTCTTCGAGCGCAGCCAGGAGCG GATCCACCTCCGGCGACATG AGGCCGAAGACATACCGGACGCCTTCGACGGCCAAACATCGTGCCAATAATTCTCCGCCC GTGAGGCGCATGACGATCTC CAGTACGAAAGGTGAGTGCCCAGGTTCCGGCACATTCGCTGTGGTTAGTTGATGCGCTGA TCGGCCAACCGACTGAGTGG AGTTGGATGGCCGCACCTTACCCTGTCGCGCATAACTCTCAGATCCGGAAACGGACCCCG ACATTAAAATAGCGGCCGAC CGGATCATAGGCAGAGCTGGTCGGGCTGGAAAAACTGCTGGGGTCGTTCGTCGCTATTGG CGGATCTCGGTCGAACAAAT TATTGACCGATAGAAACAGCTGCTGCTTCTGGCCAAAAGCCGCGATGTCGAAGGTCAATG TCGCGTCGGTGTACCAAACC

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GCGGGGCGTAGCACCGCGCCGAATGTAAGGACGTCCGCCTTTTCAGGGCGCAAATCC GCGTTGCCGGCGGTAAAGAACCG

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GCTCCCGGTCGCCCACCGAGCGTTGGAACTTGTCGATACGTCGCTGTTTGCGTCGCC CAATGTCCGGGAGTTCCGCTGGA CAGACATCACGATTGCCTGTGTACAGACCGCCGCCTTCCATGTTCTCCCGCGAGCTGCGC GCTTGTACATGGATCAAAAT

CATCAGCATTGAGAGCCTGTTGCCATCAAGCCTGCGGTTCGATGCGCTCCACGAGGA CCCGTTCGGCCTGGCATGCCACC GAAGCCATCCGCTGGCGTCGCTCGAGATCCTTGAATGGACGCAATTGAAAGGTGAAAGCC TGATCGCCGTTCACCGTGCG

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TCGAGGGCGTCGAGGGCGACGTCGAGACTTTTTTGGGAATACCCTTCGCGGCTCCGC CGGTCGGCGACCTGCGATGGCGG

GGGGGCTCCCCGTCATGATCTGGGTTTACGGCGGTGGGTTTAGCGGCGGTTCTGGCG CGGTGCCATATTATGACGGCTCT

GCGCTCGCGCAGAAGGGCGTGGTGGTCGTCACGTTCAACTATCGCGCCGGGATTCTG GGCTTTCTTGCCCATCCGGCGCT

TTCAAAGGAAAGTCCGAATGGCGTGTCGGGCAACTATGGTCTTCTCGACATGCTCGC GGCGTTCAAATGGGTTCAGAACA ACATAAGGGAGTTCGGCGGAGACCCGAACCGTGTCACGGTCTTTGGCGAGTCCGCCGGCG CGAGCGCGCTCGGACTGCTC

TTCTGAAAGCGAAGCGAATGGGCTGGAGCTGGGAGCCGATATTTCTGCTCTACGGCG TGCCGATGCGGGCGAATTGACGA AGATCGCGCAATCGCGAATACCCATGTCGCGCCAGTTCACCAAGCCGCGGCCGATGGGTC CGATTCTGGACGGCTATGTT

AGGCGGACGCATGGGAGCGTTGTTATCCCGCGAACTCCGACGCCGACGTCCCCGCCG CCGTTGCCCGTCTTTTTGGGGAT AGTCAGTTCAACAACGGGATCGAGCTGCTCTCGGCAGCCTTCGCGAAATGGCGAACGCCG CTTTGGAGATATCGCTTTAC GGGCATTCCAGGAGCCGGCCGTCGCCCCGCCACGCATGGAGACGAAATTCCCTATGTCTT CGCAAATCTGGGGCCGTCGT

GACTTTTGGTTCGCAGGTTGGCTCTGGGGAAGGTCTTGGAGTTTCGCCGAGCAAAGC CTGCCAACCCTCAAAATAGCGCC

CTACGACGTCGCGATAATTGGAGGTGGCAACGCTGCATTGACGGCAGCCGTGACGGC GCGTGAAGCGGGGGCCTCGGTTC CCCCTGTCGCCGTTGACCGGTGAATATTCGGCGGACGAATATTGGAATGATCTTGTCCGC GTCACGGGGGGGCGCACCGA CGAAGAACTCGCGCGGCTCGTTATCCGCAACACCACCGACGCTATTCCCTTCATGACGCG CTGCGGTGTGCGTTTCCAGC CCTCGCTGTCGGGCACGCTGAGTTTATCGCGAACCAACGCATTCTTCCTTGGCGGCGGGA AGGCGCTTGTAAACGCATAT

GGCACGGTGCTCAAGAACCTGTTGGAGCAAGGCGTCGCCTCGGTGGGAGATCCAACC CAATGCCATGCTGTCGCGATCGA TGGGCGAGCGCCCAAATACGACGGCGGCATCGTCACACGACTGGACTGCGTTCCCTTCTC GATCGTCGTCAACAAGGACG

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GATGATTGCCGTCGCGGCGACCACATTTCTTTATTCCGCGCTGGCGCTGGCGATCAG TCTCGTTCGCTTTTCGCGGACGA

TCGGTCTGGGAATTAAGGTTCTTTATCAGCACGTGCCGGTTCTTCGGGCGCTACGCG ATGCGGCGACTCTGCGATATCTC

GGCGGCAGCGACGGCGAGGGGTGTAACGACGCGGACGAGACATTTTCGACGACCCGG CGAAAATTTCATCACGCCCTTGC

CTATGGCTTCGGACTTTGTTTCGCGGCCACAGCCACGGGCACGATCTACGATCATAT GTTCGGCTGGCCGGCGCCCTATG CGCTTTTCAGCTTGCCGGTCGTCCTAGGGACCGTTGGGGGGATCGGAATGGTCGTGGGCG CGATCGGCCTACTCTGGCTC

AAGCTGGCCGGCGAAGACGCTCCTCGATCACCGGCACTGCTTGGGCCGGATGTTGCC CTGTTGGTGCTTCTGCTTGCCAT

TCTTGGCCTTCTTTTTGGTGATGCCATACAGCAAATTTGTCCACGGTATCTTCAGGC TCACGGCTCTCGTGCGCCATCAT

TCGCACCGGTTATCGTGCTCGTCGGGCGACTTTTGCAGGGTTTTTCCGCTGGAGCAG AGTCGGGTGGCGTCTCAGTGTAC TTGGCGGAAATTGCGTCGCCCAAATCGAGAGGCTTCTTCACCTCGTGGCAGTCTGCCAGC CAGCAGGTGGCCGTCATGAT

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GGCACCGACATTCGGAGCGCTTGCAGCTGTTCTGCTGACTTTCTCCGCATGCTTTGG ACTCTATAATGGGGCGCTCATCG

CGAGACTCACCGAGATTATGCCTCCCGCCATTAGAACCCTTGGCTTCTCGCTGGCGT TCAGTCTCGCGACCTCGCTGTTC

GGCGGCTTCACCCCATTGGTAAGTACGGCGCTAATCCACGCGACGGGCAGCAATTCC GCGCCTGCAATCTGGCTCTGTTT

TTTGCGATCATGCGCAGGCGTTTACGAACCTTGCATCGCGGGCGGGTATCGCCTCTA TGGAAGTTGATTTGTGTCGAGAC TGTGTGCTCGCTGCCGCTGGCGATCGGTCCGACCGGAGCGCGGACGATTGGCTACTCGGA TGAGTATCCCGGCGGGCTCG

GGTCGGGTTGGCAGTCGTCGCTGCCCTGAAACATAAGCAAGTTGCTCCGATTATTGC GTCGGATCCATCGCCCGATCGGC GTGC _T C _T TGCTCTGCGGATGGGCGCCGACGCCGTTGTCGATCCGCGCGAAGAATCACCCTT TCGCCAGGCCGAGAAGATC

GC _A CGCCCGGTCGGACAAGGTGGGGCCCTGTCCAGCTCATTGCTGTCAAAGTCTCAA ATGATATTCGAATGCGTAGGGGT GCCGGGCATGCTTCGGCATGCGATGGACGGCGCGTCCGACGGGTCCGAGATCATGGTCGT TGGCGCATGCATGCAGCCGG _A CGCGATCGAGCCCATGATCGGGATGTTTAAAGCGCTCACGATCAAATTCTCGCG AACTTACACGGGTGAGGAATTCGCC GTCCGCGTTTGAGGCTCTACGGAGTCCAGGCGCCCAAGCAAAAGTGATTGTGGACCCTTG GCGCTGAGCCTGAGGATGCC AAGGGTGCGACGTTGGGCATCGTCAAAGAAGGCGACGTTGACCCGGTATGTGAACATCCC CATATTCTTCCGCAGCTGAA GCAGTTGGTAAACATGCCAAAATATGAACTGTAGTATTGCGTCGGGGTTCTCATTGTGGG GTTTGCCATTGTCATCGCTC GCACCCGGCGACAAAGATTAGATGTACTTCCGATAATCCGTGCTCTCGACCTGGCCTTCC TTCATATATTTCAGGACCTC TCCGACCATGCGTGCGGCGCGGATCGGGATCGGCAGGCGTTGGTTCATCTGGGTCGAGTT CCAGTTGATCTTCGTAAGAG AGAACACCTCCTCGGCTAACTGCGCCGCGGTACTATCGCAGGATCGTCTCGAGCGTYCGC

GGCTTGCCGAGCGGCAGCGGGAGCCCTGGAAGGTCTTTCGCTCAGCGCGGCGATCCT GATCATGACTCATAATCGGCGGC

CGGCATTCGTTCAATTCTCGGGGGTCGGTGCCGCATGGAGCTATCTGGAGCGACTGG CTGCGCAGCACGGATTTTCGGGA

GAAACGATCGGTATCGCCATTTCCGGGAGTTTGCTTTGCCAGGTAGGCGGGGCTTGG CTGGCCGCTTGGATCGGTGGGCG CAAGCTGGTTTATTTCCGCTTCCTGTGCTTTCGGCCTGTTCTGGTTGGCGATGCAGCCCT TCCAAATCCGCTTCGCGATC

ATCTTTGCGCTTCTCTGTTTCAACCGCGCGGAAAGGTGATCGCTGAAACGGTGGACG TA >Seq ID 4 (fumB)

CGGGTGCCTCACCGTCGTCCGTCTATCATTTCTTTCCGACCAAGGAAGTGGCTCATC TCGCTCTGATGCGCCGCTATCTG - S -

GAAAGCTTGACGAGCGATACTCCGAGGAAATCGTGAGCTCCATGTATGGCAGATACA ACGGCATTTTCCATATGCCGCAA

TGAAATTACGTCGGATTTTCTTCGGGAGGGGCAAGCGGCTTGCATTGCCTATTGCCG ACACTATCTGCCCGAGCGAACGC CATCAGCGTGA

>Seq ID 6 (fumC)

TCGAGCGGACCAGTCGGTCGCTTGCCGAAACGGCGCTCGGCAAAGAGTTGCTCCCGG TCGCCCACCGAGCGTTGGAACTT GTCGATACGTCGCTGTTTGCGTCGCCCAATGTCCGGGAGTTCCGCTGGACAGACATCACG ATTGCCTGTGTACAGACCGC CGCCTTCCATGTTCTCCCGCGAGCTGCGCGCTTGTACATGGATCAAAATCCGAGGGTCCG ACTCCGCATCCTTGACGTGC

TTGGGTGTCGCTGTTATGCCCCGCATGGTTATGCCCCGCTCGGGTCGGTCGGAGGTC GTCTGGCGCCCCGTCGTCGCGCC

TCCGCGCGGCCTGGTCGTCCGCCAATCTGGGCGACATCGCGTCTCGCGAAGATGGGG CATCGTGA

>Seq ID 8 (fumD)

TCGTTCGTCATACCCAGTCGGGCGCCGTCGAGGGCGTCGAGGGCGACGTCGAGACTT TTTTGGGAATACCCTTCGCGGCT

TCTGGGCTTTCTTGCCCATCCGGCGCTTTCAAAGGAAAGTCCGAATGGCGTGTCGGG CAACTATGGTCTTCTCGACATGC TCGCGGCGTTCAAATGGGTTCAGAACAACATAAGGGAGTTCGGCGGAGACCCGAACCGTG TCACGGTCTTTGGCGAGTCC

GCCGGCGCGAGCGCGCTCGGACTGCTCCTGACCTCGCCGCTCAGTGAGAGCGCCTTC AATCAGGCGATACTGCAAAGTCC GGGTCTGGCCAGGCCGCTCGCCACGCTTTCTGAAAGCGAAGCGAATGGGCTGGAGCTGGG AGCCGATATTTCTGCTCTAC

ATGGGTCCGATTCTGGACGGCTATGTTTTGCGCACCCTTGACGTCGATGCCTTCGCC AAGGGGGCCTTCCGCAAGATACC

GCCGCCGTTGCCCGTCTTTTTGGGGATAGTCAGTTCAACAACGGGATCGAGCTGCTC TCGGCAGCCTTCGCGAAATGGCG AACGCCGCTTTGGAGATATCGCTTTACGGGCATTCCAGGAGCCGGCCGTCGCCCCGCCAC GCATGGAGACGAAATTCCCT ATGTCTTCGCAAATCTGGGGCCGTCGTCCGTATCTATGTTTGGGTCGCTCGAAGGCGGCG CCGGGGCGTCGGACATCAAA CTTGCGACCGAAATGTCCGCGGCCTGGGTGAGCTTCGCGGTGCACGGGGTCCCCGATCAG GGCACGAAATCGCACTGGCC

GCGCTTCGAGCGGCGAGGGGAGATCATGACTTTTGGTTCGCAGGTTGGCTCTGGGGA AGGTCTTGGAGTTTCGCCGAGCA AAGCCTGCCAACCCTCAAAATAG

>Seq ID 10 {fumE) TTGGAGTTTCGCCGAGCAAAGCCTGCCAACCCTCAAAATAGCGCCCGGCCTGTGCGTGCÎ ªTCAGCACGCCGTCCCGCTTT GCGGGCGACGGGCTGTGCCCTCTGCCTAGAAGGAAGTAAGTTGCGCTACGACGTCGCGAT AATTGGAGGTGGCAACGCTG

GGCAACAGTCGTCACACACGCAATATGCGTACGATGCACGAACGTCCCCTGTCGCCG TTGACCGGTGAATATTCGGCGGA

CGAATATTGGAATGATCTTGTCCGCGTCACGGGGGGGCGCACCGACGAAGAACTCGC GCGGCTCGTTATCCGCAACACCA CCGACGCTATTCCCTTCATGACGCGCTGCGGTGTGCGTTTCCAGCCCTCGCTGTCGGGCA CGCTGAGTTTATCGCGAACC

CGAAGACCTCTTCATGCCGTCAGTGTTCCCCCCCGTGCAAGCGGACACGATCGCGGG TCTGGCCGAGAAACTCGGTCTGA

TCTCCGGCCCGGGATCACCTTCACCTATCTCGGCGTCAAGGTAGACAGCCGTGCGCG GGTCATCATGGAGACAGGTGAGC CGACAAAAAACCTGTTTGCTTCGGGGGAAATAATGGCGGGCAGCATTCTCGGCCAAGGTT ATCTCGCTGGATTTGGAATG GCGATTGGTACCGTATTCGGCCGCATCGCGGGTTGGGAGGCCGCACGTCATGCAGGATTT TGA >Seq ID 12 (funjF)

ATGCAGGATTTTGATCTCGTAAAAATGCTGTCTGACTTGCCGTCGGCGCCGGAGCTG GAAGCCAGGCGCGTTATGGAGGT GTGCAACGCGTGCCGCTATTGCGAAGGGTTCTGCGCGGTATTTCCTGCAATGACCTTGCA GCGTCATTTCGCCAGCGGCG ATCTCAGCCACCTCGCCAATCTCTGCCACTCGTGCCAAGGTTGCTATTACGCCTGCCAAT ACGCCCCTCCGCATGAGTTC GGAATAAACGTTCCAAAGGCGCTGTCGGAGTTGCGGCTCGAGAGCTACGAGCAGCATGCT TGGCCCCGGCCGGTCGCCGC TCTCTATCGCAAGAATGCGCTCATCATTTCCATCTTGTCGGCGGCATGCATAACCGGCGT CCTTCTGCTTGCCGCCATCT TCAACGGGGATGCACTTTTCGCGAAACACGCATCGGTGCCCGGCGGCGGGTTTTACAACG TTATTCCTTATCAGGCGATG ATTGCCGTCGCGGCGACCACATTTCTTTATTCCGCGCTGGCGCTGGCGATCAGTCTCGTT CGCTTTTCGCGGACGATCGG TCTGGGAATTAAGGTTCTTTATCAGCACGTGCCGGTTCTTCGGGCGCTACGCGATGCGGC GACTCTGCGATATCTCGGCG GCAGCGACGGCGAGGGGTGTAACGACGCGGACGAGACATTTTCGACGACCCGGCGAAAAT TTCATCACGCCCTTGCCTAT GGCTTCGGACTTTGTTTCGCGGCCACAGCCACGGGCACGATCTACGATCATATGTTCGGC TGGCCGGCGCCCTATGCGCT TTTCAGCTTGCCGGTCGTCCTAGGGACCGTTGGGGGGATCGGAATGGTCGTGGGCGCGAT CGGCCTACTCTGGCTCAAGC

GCAACGGGCCTCCTCCTTTTAGCGGTCCGCAGCACCGAAGTCATGGGCGTCGCGCTC GCCGTCCATCTCGGCGTCGTCTT

GGCCTTCTTTTTGGTGATGCCATACAGCAAATTTGTCCACGGTATCTTCAGGCT

ACCGCGAGGCAAGTAATGGCTTCGCCTCCAGCCCTCCCACGAAAAAGGGTTIiA

>Seq ID 14 (fumG)

ATGGAACATATGAAGTCCGTTCGCG2

ATATGATTTCTTCGTTTACGGCTTCTATGCGGCATATATTGCGAGAAGCTTTTTTCC GACCGGCGATAACGCGACATCGC

TCATGCTTTCATTGGCCACTTTTGGCGCTGGTTTCCTCATGAGGCCCTTGGGGGCGA TTTTTCTCGGGTCCTACATCGAT

CTATGAGGCAATTGGATTACTCGCACCGGTTATCGTGCTCGTCGGGCGACTTTTGCA GGGTTTTTCCGCTGGAGCAGAGT CAGCAGGTGGCCGTCATGATCGCCGCCGCGATCGGTCTTGCGCTGCAATCAACGCTTTCA CCGGAGCAAATGAACGACTG

TTGACGGGCATGGCGATGTCGATCCTCACGACGACCACCTTTTACATGATTACCGCC TATACGCCGACATTTGGCGAGAA

CTGATGAGCTGGCTCGTCGCGGCACCGACATTCGGAGCGCTTGCAGCTGTTCTGCTG ACTTTCTCCGCATGCTTTGGACT

CGAAGGCGCCAGATAG >Seq ID 16 (fumH)

ATGAGAGCAGTAGTTTACCGAAATGG CGTCAAGACCAGAGCATGCGGCATCTGCGGATCTGACCTTCATTTTTGCGATCATGCGCA GGCGTTTACGAACCTTGCAT

GAGTTCGGGCCCTCTGCGGATCGTCGCTTCAAACCCGGACAGCTTGTGTGCTCGCTG CCGCTGGCGATCGGTCCGACCGG AGCGCGGACGATTGGCTACTCGGATGAGTATCCCGGCGGGCTCGGCGAATATATGGTCCT CACGGAAGCGCTCTTGCTGC

CTGTTCCGAACGGCCTTCCGGCGACCTGCGCGGCGTTGACGGAGCCGATGGCGGTGG GATGGCATGCCGTCGAGATCGCG

AGCAAAAGTGATTGTGGACCCTTGGCGCTGA

>Seq ID 18 (fuml)

ATGGCGAACGGAACAAGGCAGAft TCGACACGGTTGCTGCCGCCAGAATTCCCCCAGTTCTTCAGGCGCGCGCTGGGGGCACGA ATTTGGGACGCCGACGAG

GCCGGGATTCTCGCTTCCGATCGCGTGCATGTCGCATATTATACCTATAACGACGCC CAAAGCTTATCGGACGCGTTC

GGTTTCCGGGTGGCGCGCGATTGCAGCTGGACGCATTTGGGTATCGAACCCGATCTC AGTTGCTGGGGAAAATGCTTT GCGAΆTGGCTATCCGATCTCCGCCCTGCTGGGCTCGAACAAGGCGCGCGATGCGGCGCG GGATATATTTGTGACCGGC TCCTTCTGGTTCTCTGCGGTACCGATGGCGGCCGCGATCGAAACCCTCAGGATCATTCGA GAGACGCCTTATCTCGAA ACGCTGATCGCCAGCGGCGCCGCCCTGCGGGCAGGCCTGGAGGCACAGTCTCAGCGCCAT GGTCTTGAGTTGAAGCAG ACGGGCCCGGCGCAGATGCCGCAAATATTCTTTGCGGACGATCCCGATTTTCGGATCGGC TATGCGTGGGCCGCGGCG TGCCTGAAGGGCGGCGTCTATGTTCATCCCTATCACAATATGTTTCTCTCTGCGGCCCAT ACAGTTGACGATGTAACG GAGACCCTCGAGGCGACGGATCGCGCGTTCAGCGCGGTCCTCAGAGATTTTGCGTCTCTC CAGCCTCATCCCATTTTA ATGCAACTCGCCGGTGCTTGA >Seq ID 20 (fumJ)

ATGTATCGGAAGTTCAGAATCGAAAAGCCCGGCAAGGCAAATAGTTTGCTCGGCGCA GTAGCGCTCGGCACCCTCGCA TTTCCTGTCTCTGCCAGTGCTCAGGATAGCGATCCCGCATCGATAGGTCAGCCGGACGAA GCGGACACGGACCGGGGA ACGAGCGAAATCGTCGTGACCGGCAGCCGCCTCCAGAACGGCTTCAATTCGCCGACGCCG GTTACAGCCGTATCCAGC GAGCAGTTGAAGGAGGCATCTCCGACCÄACCTTGCCGACGCACTCAACCAGCTGCCCGT GTTCAACGACAGCTTGAAG CGGAACCTCGTCCTGCTGAACGGCAACCGTTTCGTCGCGACCAATTTCACAGGCTCGGTC GATATCAACGTGCTGCCG

TTCGTAATATCGCATGTCGGTGGCTCGAATAATTTCCGGATCTTCCGTGATAACGCC TTCCTTCCGGCTCCACTCGCG

ACCTTCTTCTGCGACCTCATAACGGAGAATCCGGACGGCACCATCACAGTGACGGGT CCCAATCTCAACCTGGCTGTC CAGAAAGCGGCGGGAATTGACTTCGAGGCCTATTACTCACGCCCCGTCGGCGGCGGCACG TTCAGTCTTCGTGCGCTG GCAACGCACCATACCTCTGCCTATCGCATCGCGACCGGCTCGGCGCCCATCCGTTCGCTC GGACAACCGGACACGCCA

TCGGTGTTCAATGCCGACAATGTGGAGGGCGTCGATACGAATTTGAACCACGCTCCG GCGGTTTGGTACACCGACGCG ACATTGACCTTCGACATCGCGGCTTTTGGCCAGAAGCAGCAGCTGTTTCTATCGGTCAAT AATTTGTTCGACCGAGAT CCGCCAATAGCGACGAACGACCCCAGCAGTTTTTCCAGCCCGACCAGCTCTGCCTATGAT CCGGTCGGCCGCTATTTT AATGTCGGGGTCCGTTTCCGGATCTGA

>Seq ID 22 (fumK) nicht vollständig

ATGCGCCTCACGGGCGGAGAATTATTGGCACGATGTTTGGCCGTCGAAGGCGTCCGG TATGTCTTCGGCCTCATGTCG CCGGAGGTGGATCCGCTCCTGGCTGCGCTCGAAGACAATGGGATATTGTTCGTCCCGGTG CGGCACGAGGCCGCCGCA GCCTATATGGCCGAGGGCATTTACAAGACCACCGGACAGGTCGCCGCGATTGTCACGAAT CCGGGTCCCGGTACGGCA AACCTTCTGCCTGGAGTCGTGACGGCACGCCACGAAGGGGTTCCCTTCGTCGCAATAACG TCCCAGCATCAACTTGGT GTCGTTTATCCCTGCACGCCAAAAACCTTTCAGGGACAAGACCAGATCGACCTCTTTCGA CCCGCGGTTAAATGGGGC GCACCCATCTTCGCCTGGAACCGGATTGTCGAAATCACCCATATGGCGTTCCGGGAAATG TGGGCCGGCAGGCCGGGA CCCGTTCAGTTGGAAATCCCGARGTCTGTGATGTATGKTGTGGGCGAACGAGGACCACGG TAGAAGTTTACRGATCGC

CGACA...

>Seq ID 24

ATGGAATTGAGCCGCCAACGAGACCAGGCCTTGAGGGAGCGCGCCCAAGCGGTGATC CCGGGCGGGATGTACGGTCAC

GAGTCGACCTATCTGATGCCCGAGGGCACGCCACAGTTCTTCAGTCGCGGCAAAGGC GCCCGACTTTGGGACGCCGAC

TTCGAGGCCCATCAGGACGACGTCGCGGCGATCTTCGCCACCCCTCACCGTCACGAG GTGTTCAGCGACCAGATCGAT

GGCTCGTTCTGGTTCTCGGCCACGCCCATGGCCGCAGCCGTCGAAACCCTGAAGCAA ATCCGCGAGACCGACTATCTC

GAATGCCTGAAGCGAGGGGTGTACTTCAGCCCCTACCATAACATGTTCCTGTCGGCG GCCCATAGCGAGGCGGACCTG

GCCAAGACCCTTGCGGCTACCGGCG

CTCCTCGCCCTGAGAGCGGCCTAA Enzyme Sequenzen:

>Seq ID 3 (FumA)

MRNVSDIKAPPHETLTVWAAMIVGTAALMVLGIQPILLGALVEEGRIPAEGLGSAAT VEI LAIAAGTCIGPVLMKTGYLRAKCAALCLMLAAINFGLTLPGFDLPIVACRAAAGALEGLS

LSAAILIMTHNRRPDRLSGIFLGAQTIPQVISAYLLPTEIIPRWGSAGGFTILGILA AIA

AIAALCLVDRVELDPTTVNDDLQWSPAAIVISMAAFVQFSGVGAAWSYLERLAAQHG FSG

ETIGIAISGSLLCQVGGAWLAAWIGGRVGYRFALIAGSLLQAGNVIALAVADQPSWF ISA

SCAFGLFWLAMQPFQIRFAIAIDWSRQLAVLLTPIALVGLSAGPLLLSRFAGATDLR WIF VGSSTLLLASALLYLCASLFQPRGKVIAETVDV

>Seq ID 5 (FuraB)

MTSQVKLRSAAKRPRSPKSERGLARYESLLDATDRLLVDLDPDQVGLYQIAEEAGAS PSS VYHFFPTKEVAHLALMRRYLEGLRNLDAMEVDIGQLESWQDLMKLDQIRARDYYNSHPPA LKLLFGGYGGVEARKLDERYSEEIVSSMYGRYNGIFHMPQMENEALMFTICFAILDAVWA VSFRRFGEITSDFLREGQAACIAYCRHYLPERTPSA

>Seq ID 7 (FumC)

VASKFNCELLDLRSFVAVYETRSFSHAARLLNQSQPALSRRIQRLESLVGGPLFERT SRS LAETALGKELLPVAHRALELVDTSLFASPNVREFRWTDITIACVQTAAFHVLPRAARLYM

DQNPRVRLRILDVPAVEAADLVASGEAEFGI S I ES LLPS SLRFDALHEDPFGLACHRSHP LASLEILEWTQLKGESLIAVHRASRNRTLLDAELARNNIALEWRYEVAHLTTALGLIDAQ LGVAVMPRMVMPRSGRSEWWRPWAPWQRTIGIVQRRTGSMHPAAQQLLARLRAΆWSS ANLGDIASREDGAS

>Seq ID 9 (FumD)

VKEHQCRGGRASPAAPATWLARISVSRGASAIAWTFMLGATAIPVAAQTDDPKLVRH TQS GAVEGVEGDVETFLGIPFAAPPVGDLRWRPPAPPRAWAGTRDGRRFAPDCIGNERLREGS RAAGTSEDCLYLNIWSPKQVGKGGLPVMIWVYGGGFSGGSGAVPYYDGSALAQKGVWVT FNYRAGILGFLAHPALSKESPNGVSGNYGLLDMLAAFKWVQNNIREFGGDPNRVTVFGES

AGASALGLLLTSPLSESAFNQAILQSPGLARPLATLSESEANGLELGADISALRRAD AGE LTKIAQSRIPMSRQFTKPRPMGPILDGYVLRTLDVDAFAKGAFRKIPVLVGGNADEGRAF TDRLPVKTVLEYRAYLTEQFGDEADAWERCYPANSDADVPAΆVARLFGDSQFNNGIELL S AAFAKWRTPLWRYRFTGIPGAGRRPATHGDEIPYVFANLGPSSVSMFGSLEGGAGASDIK LATEMSAAWVSFÄVHGVPDQGTKSHWPRFERRGEIMTFGSQVGSGEGLGVSPSKACQPS K

>Seq ID 11 (FuraE)

LEFRRAKPANPQNSARPVRASARRPALRATGCALCLEGSKLRYDVAIIGGGNAALTA AVT

AREAGASVLVIEHAPRAMRGGNSRHTRNMRTMHERPLSPLTGEYSADEYWNDLVRVT GGR TDEELARLVIRNTTDAIPFMTRCGVRFQPSLSGTLSLSRTNAFFLGGGKALVNAYYATAE

RLGVDILYDSEVTEINLQQGWQRLQLRSRGFPVEVEAKAAIASSGGFQANLDWLSSA WG PAAANFIVRGTPYATGTVLKNLLEQGVASVGDPTQCHAVAIDGRAPKYDGGIVTRLDCVP FS I WNKDALRFYDEGEDVWPKRYAI WGRLVAQQPDQIAFS I IDRQAEDLFMPS VFPPVQ ADTIAGLAEKLGLNPVTLERTVAEFNAACVPGEFGGQDLDDLHTEGIEPKKSNWARPIIV PPFSAYPLRPGITFTYLGVKVDSRARVIMETGEPTKNLFASGEIMAGSILGQGYLAGFGM

AIGTVFGRIAGWEAΆRHAGF

>Seq ID 13 (FumF) MQDFDLVKMLSDLPSAPELEARRVMEVCNACRYCEGFCAVFPAMTLQRHFASGDLSHLAN LCHSCQGCYYACQYAPPHEFGINVPKALSELRLESYEQHAWPRPVAALYRKNALIISILS

AACITGVLLLAAIFNGDALFAKHASVPGGGFYNVIPYQAMIAVAATTFLYSALALAI SLV RFSRTIGLGIKVLYQHVPVLRALRDAATLRYLGGSDGEGCNDADETFSTTRRKFHHALAY GFGLCFAATATGTIYDHMFGWPAPYALFSLPWLGTVGGIGMWGAIGLLWLKLAGEDAP RSPALLGPDVALLVLLIAIAATGLLLIAVRSTEVMGVALAVHLGVVLAFFLVMPYSKFVH GIFRLTALVRHHADREASNGFASSPPTKKG >Seg ID 15 (FumG)

MEHMKSVRDRSSVMQIVRVASGNCLEQYDFFVYGFYAAYIARSFFPTGDNATSLMLS IAT FGAGFLMRPLGAIFLGSYIDRVGRRKGLIVTLAIMAVGTLTIAMTPSYEAIGLLAPVIVL VGRLLQGFSAGAESGGVSVYLAEIASPKSRGFFTSWQSASQQVAVMIAAAIGLALQSTLS PEQMNDWGWRVPLLIGCLIIPVILWLRRSLPETKAYLHMEHKAHSIGESLRELQQSWGLI LTGMAMSILTTTTFYMITAYTPTFGEKALGLSPQDVLLVTIMVGVSNFLWLPIGGALSDR IGRTPILLWPVTVIAIAFPLMSWLVAAPTFGAIAAVLLTFSACFGLYNGALIARLTEIM PPAIRTLGFSLAFSIATSLFGGFTPLVSTALIHATGSNSAPAIWLCFAAFISFVGVAAST RLSRPIAEGAR >Seq ID 17 (FumH)

MRAWYRNGELVLGAYADPIPAAGQVLVKTRACGICGSDLHFCDHAQAFTNIASRAGI AS MEVDLCRDIVLGHEFCGEIMEFGPSADRRFKPGQLVCSLPIAIGPTGARTIGYSDEYPGG LGEYMVLTEALLLPVPNGLPATCAALTEPMAVGWHAVEIAQVQPHHIPWIGCGPVGIAV VAALKHKQVAPIIASDPSPDRRAIALRMGADAWDPREESPFRQAEKIARPVGQGGALSS SLLSKSQMIFECVGVPGMLRHAMDGASDGSEIMWGACMQPDAIEPMIGMFKALTIKFSR TYTGEEFAAVLHMIGEGALDVSPLVTDVIGLSDVPSAFEALRSPGAQAKVIVDPWR

>Seq ID 19 (FumI)

MANGTRQKDLRERAERVIPGGMYGHESTRLLPPEFPQFFRRALGARIWDADEQPYID YMC AYGPNLLGYRQSEIEAAADAQRLLGDTMTGPSEIMVNIAEAFVGMVRHADWAMFCKNGSD

ATSTAMVLARAHTGRKTILCAKGAYHGASPWNTPHTAGIIASDRVHVAYYTYNDAQS LSD AFKAHDGDIAAVFATPFRHEVFEDQAIAQLEFARTARKCCDETGALLWDDVRAGFRVAR DCSWTHLGIEPDLSCWGKCFANGYPISALLGSNKARDAARDIFVTGSFWFSAVPMAAAIE TLRIIRETPYLETLIASGAALRAGLEAQSQRHGLELKQTGPAQMPQIFFADDPDFRIGYA WAAACLKGGVYVHPYHNMFLSAAHTVDDVTETLEATDRAFSAVLRDFASLQPHPILMQIA

GA

>Seq ID 21 ( PumJ)

MYRKFRIEKPGKANSLLGAVALGTIAFPVSASAQDSDPASIGQPDEADTDRGTSEIW TG SRLQNGFNSPTPVTAVSSEQLKEASPTNLADALNQLPVFNDSLKTSNPGTTPGTGNSGQN

LLNMRGLGSNRNLVLLNGNRFVATNFTGSVDINVLPQALVKRVDWTGGASAAYGSDA VS GVINFVLDEDLEGIRAELQSGVSTRGDLPSYGGSIAFGTSFADDRLHLLGSFEYFRQDGI RADEATGRRWFDIAAGQYPVPGATTGVTWPDIRSSRGSYGGLVTSGPLKGIAFLPGGVL GTFDYGNFTSSSFQSGGDGPRVNIGFAPDQLRYNAFLRAAYDVSDTVQVYAEGTYAYSHT NLGAFVISHVGGSNNFRIFRDNAFLPAPLATLMDRNAQASIWGRFSSDFPLVEIENFAK

VYRGAAGFRADIGNGWKLDGSASFGLTDLELRENNLTINRNLYAAVDAVRDPAGNIV CRS TLAGLDQDCVPLNLFGTGSPSASAIDYVTADGVAQLRLEQYVAGLTISGDLGDSLSFGAG PVSVAAGIEYRKEKARQETDAISQATTSITGIRGAPAAQAGRPGGFNLYNPLPFSGSYDI KEGFVEIGVPILKDSALGRSLNLNGAVRYADYSQSGGVTTWKLGGEYEPIDGLRFRATRS RDIRGPSLVELFDPGRQATLNSIYGGQAVQTRFFTAGNADLRPEKADVLTFGAVLRPAFV PGFQFSVDRYWKVKGAIDFLLPQQEIDACDAGNTFFCDLITENPDGTITVTGPNLNLAV QKAAGIDFEAYYSRPVGGGTFSLRALATHHTSAYRIATGSAPIRSLGQPDTPKWSANFQA RYSTDDWALLVQQRFIAASVFNADNVEGVDTNLNHAPAVWYTDATLTFDIAAFGQKQQLF LSVNNLFDRDPPIATNDPSSFSSPTSSAYDPVGRYFNVGVRFRI

>Seq ID 23 (FumK) nicht vollständig

MRLTGGELIARCLAVEGVRYVFGLMSPEVDPLIAALEDNGILFVPVRHEAAAAYMAE GIY

KTTGQVAAIVTNPGPGTANLLPGWTARHEGVPFVAITSQHQLGWYPCTPKTFQGQDQ I DLFRPAVKWGAPIFAWNRIVEITHMAFREMWAGRPGPVQLEIPXSVMYWGERGPR-KFX DRR . . . .

>Seq ID 25 MELSRQRDQALRERAQAVIPGGMYGHESTYLMPEGTPQFFSRGKGARLWDADGNEYVDYM CAYGPNLLGYGFEPVEAAAAAQQARGDTLTGPSEVMVQ]-AEDFVAQISHADWAMFCKNG T

DATSMAMVIARAHTGRKTILCAKGAYHGAAPWCTPILAGTLPEDRAFWYYDYNDAQS LV DAFEAHQDDVAAIFATPHRHEVFSDQIDPDPEYAASVRALCDKSGALLWDEVRAGFRIA RDCSWAKIGVAPDLSTWGKCFANGYPISAVLGGEKVRSAAKAVYVTGSFWFSATPMAAΆ V ETLKQIRETDYLERINAAGTRLREGLQQQAAHNGFTLRQTGPVSMPQVLFEEDPDFRVGY GWVRECLKRGVYFSPYHNMFLSAAHSEADLAKTLAATGDAFVELRAKLPSLEIHQPLLAL

RAA-

Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung wird das erfindungs- gemäße Verfahren so geführt, daß die Mykotoxine, insbesondere Fumonisine, sauerstoffunabhängig bzw. anaerob abgebaut werden. Dadurch, daß die Mykotoxine, insbesondere Fumonisine sauerstoffunabhängig abgebaut werden, gelingt es, das erfindungsgemäße Verfahren so weiterzubilden, daß die Nuk- leinsäuresequenzen von Genen bzw. Enzyme ohne Zusatz von molekularem Sauerstoff sicher und zuverlässig die Abbaureaktionen durchführen, wodurch der so hergestellte Zusatzstoff in sämtlichen sauerstoffunabhängigen bzw. anaeroben Medien, wo Mykotoxine möglicherweise abgebaut werden müs- sen, zum Einsatz gelangen kann, wie beispielsweise in Nahrungsmitteln für Menschen und Tiere, der Bioethanolherstel- lung, aber auch zur Herstellung bzw. Produktion von gentechnisch veränderten, landwirtschaftlichen Nutzpflanzen.

Gemäß einer Weiterbildung wird das erfindungsgemäße Verfahren so geführt, daß vor Einsatz der Enzyme in dem pflanzlichen Ausgangsmaterial diese mittels molekulargenetischer Methoden, Mutagenese oder molekularer Evolution verändert werden. Indem das Verfahren so geführt wird, daß die Enzyme vor ihrem Einsatz in dem pflanzlichen Ausgangsmaterial mittels molekulargenetischer Methoden, Mutagenese oder molekularer Evolution verändert werden, gelingt es, die Enzyme in noch stabilerer und an den späteren Einsatzzweck angepaßter Form herzustellen, wodurch der sauerstoffunabhängige Abbau von Mykotoxinen, insbesondere Fumonisinen, noch weiter verbessert bzw. vervollständigt werden kann.

Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung wird das Verfahren so geführt, daß die Enzyme isoliert werden. Durch eine derartige Verfahrensführung können insbesondere Fumonisine vollständig und sauerstoffunabhängig abgebaut werden.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Weiterbildung der Erfindung wird das Verfahren so geführt, daß die Enzyme in einer Schutzhülle verkapselt werden. Durch Verkapseln der Enzyme in einer Schutzhülle gelingt es, die Enzyme ohne Verände- rung, insbesondere ohne Abbau und Schädigung an ihren Einsatzort, insbesondere beispielsweise in den Verdauungs- trakt, zu transportieren, so daß erst nach Auflösung der Schutzhülle, beispielsweise im Magen-Darm-Trakt von Menschen oder Tieren, die Enzyme zu wirken beginnen, wodurch ein noch gezielterer, rascherer und vollständiger Abbau der

Mykotoxine im sauerstoffunabhängigen Milieu des Magen-Darm- Trakts erzielt werden kann, und gleichzeitig Mykotoxine, insbesondere Fumonisine, daran gehindert werden können, ihre schädliche Wirkung auf diejenigen Lebewesen auszuüben, welche diese mit der Nahrung aufgenommen haben.

Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung wird das erfindungs- gemäße Verfahren so geführt, daß die Enzyme aus Permease ID-Nr. 3, Carboxylesterase ID-Nr. 9, Tricarballylat-Dehy- drogenase ID-Nr. 11, Citratverwertungsprotein ID Nr. 13,

Alkohol-Dehydrogenase ID-Nr. 17, Aminotransferase ID-Nr. 19 und/oder Acetolactat-Synthase ID-Nr. 23 gewählt werden. Durch eine derartige Verfahrensführung können insbesondere Fumonisine glatt und vollständig im sauerstoffunabhängigen Milieu abgebaut werden. In diesem Fall wird bei den aus dem Gencluster der Nukleinsäuresequenz mit der ID-Nr. 1, welche aus einem prokaryotischen Stamm mit der Hinterlegungsnummer DSM 16254 stammt, isolierten Fum-Genclustern die Transkription der offenen Leserahmen durch einen bidirektionalen Promotor gesteuert bzw. geregelt, der zwischen FumA und FumI, wie dies der nachfolgenden Tabelle 1 entnehmbar ist, angeordnet ist. Die Cluster codieren für Proteine, welche in der Regulierung der Genexpression, wie beispielsweise FumB und FumC, bei der Substratabtastung und dem Transport, wie beispielsweise FumA, FumJ, FumG und in dem Substratka- tabolismus, wie beispielsweise FumD, FumE, FumF, FumH, FumI, FumK involviert sind. Aus diesen Nukleinsäuresequen- zen, welche für spezielle Gene bzw. Enzyme codieren, wurden gemäß einer bevorzugten Weiterbildung des Verfahrens gemäß der Erfindung die Gene ausgewählt, welche für den Substrat- katabolismus verantwortlich sind, wodurch die entsprechenden gebildeten Enzyme das Substrat, nämlich Fumonisine vollständig katabolisieren können.

In diesem Fall werden beispielsweise aus dem Gencluster der Nukleinsäuresequenz mit der ID-Nr. 1 ausgewählte, offene Leserahmen in prokaryotischen oder eukaryotisehen Wirtszel- len zur Expression gebracht. Im bakteriellen Stamm mit der Hinterlegungsnummer DSM 16254 erfolgt die Transkription der im Gencluster mit der ID-Nr. 1 enthaltenen, offenen Leserahmen, gesteuert bzw. geregelt durch einen bidirektionalen Promotor, der zwischen fumA und fuml, wie dies der nachfol- genden Fig. 1 entnehmbar ist, angeordnet ist. Die Gene codieren für Proteine, welche in der Regulierung der Genexpression, wie beispielsweise FumB und FumC, bei der Substraterkennung und dem Transport, wie beispielsweise FumA, FumJ, FumG, und im Substratkatabolismus, wie beispielsweise FumD, FumE, FumF, FumH, FumI und FumK, involviert sind.

In der nachfolgenden Tabelle 1 ist die Bezeichnung der Gene des fumonisinkatabolischen Genclusters aufgeführt, wobei O die Orientierung, nämlich f forward und r reverse, bedeuten.

Tabelle 1

Indem das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt so geführt wird, daß ein Enzym eingesetzt wird, welches wenigstens 90 % Sequenzidentität mit wenigstens einem der Enzyme ID-Nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 oder 25 aufweist, kann ein noch vollständigerer Abbau der Fumonisine sichergestellt werden, wobei gleichzeitig nicht nur Fumonisine, sondern auch verwandte bzw. strukturell ähnliche Mykotoxine vollständig insbesondere im anaeroben bzw. sauerstoffunabhängigen Milieu entgiftet werden können, wie zum Beispiel das AAL Toxin.

Indem das Verfahren bevorzugt so geführt wird, daß bei Einsatz von Aminotransferase ID-Nr. 19 als Cosubstrat ein Ke- ton, insbesondere eine α-Ketosäure, eingesetzt wird, kann insbesondere beim Abbau der Aminogruppe von Fumonisin und gleichzeitigem Einsatz von einer α-Ketosäure, wie bei- spielsweise Brenztraubensäure, die Aminogruppe an dem Fumo- nisinmolekül durch eine Ketogruppe ersetzt werden, wobei als Nebenprodukt dieser Reaktion Alanin entsteht, welches vollständig unschädlich ist, so daß ein vollständiger Abbau von Fumonisinen zu unschädlichen Substanzen sichergestellt ist.

Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung kann das erfindungs- gemäße Verfahren auch so geführt werden, daß bei Einsatz von Carboxylesterase ID-Nr. 9 zusätzlich wenigstens ein Ad- Sorbens, insbesondere gewählt aus Tonmineralien, eingesetzt wird. Indem bei Einsatz von Carboxylesterase ID-Nr. 9 zusätzlich wenigstens ein Adsorbens, insbesondere gewählt aus Tonmineralien, eingesetzt wird, kann auch ohne Zusatz von weiteren Enzymen ein vollständiges Unschädlichmachen der Mykotoxine, insbesondere Fumonisine erzielt werden, indem in einem ersten Schritt durch die Carboxylesterase aus dem Fumonisinmolekül die zwei Tricarballylsäure-Seitenketten abgespalten werden und sogenanntes hydrolysiertes Fumonisin gebildet wird. Hydrolysiertes Fumonisin, welches ein im we- sentlichen kettenförmiges Molekül ist, kann in weiterer Folge beispielsweise an Tonerdemineralien adsorbiert werden, so daß auch in einem einstufigen, enzymatischen Abbau- verfahren ein vollständiges Unschädlichmachen der Mykotoxine, insbesondere Fumonisine, erzielt werden kann.

Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung wird das erfindungsg- emäße Verfahren so geführt, daß der damit hergestellte Zusatzstoff in einem zu vergärenden, pflanzlichen Ausgangsmaterial bzw. in einer Maische zur Bioethanolherstellung eingesetzt wird. Indem der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Zusatzstoff in einem zu vergärenden, pflanzli- chen Ausgangsmaterial bzw. in einer Maische zur Bioethanolherstellung eingesetzt wird, gelingt es, daß bei der Etha- nolherstellung anfallende Coprodukte, nämlich den Trester, d.h. die getrockneten Körnerreste und unlösliche Bestandteile oder die Trockenschlempe (Dried Distiller's Grains with Solubles - DDGS) , von Fumonisinen bzw. Mykotoxinen insbesondere in einem sauerstoffunabhängigen Milieu zu befreien.

Die Erfindung zielt weiterhin auf einen Zusatzstoff zum en- zymatischen Abbau von Mykotoxinen, insbesondere Fumonisinen, ab, mit welchem es sicher und zuverlässig gelingt, derartige Mykotoxine insbesondere sauerstoffunabhängig abzubauen bzw. zu detoxifizieren.

Zur Lösung dieser Aufgaben ist ein derartiger Zusatzstoff dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein Enzym der Sequenz ID-Nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 und 25 oder wenigstens ein kompletter, rekombinanter Wirtsorganismus zur Expression der entsprechenden Gene sowie gegebenen- falls zusätzlich wenigstens ein Cosubstrat für wenigstens eines bzw. einige der eingesetzten Enzyme und ein inerter Träger enthalten sind. Ein derartiger Zusatzstoff, in dem wenigstens ein Enzym oder ein kompletter, rekombinanter Wirtsorganismus zur Expression dieses Enzyms sowie gegebenenfalls zusätzlich wenigstens ein Cosubstrat für wenigstens eines bzw. einige der eingesetzten Enzyme und ein inerter Träger enthalten sind, zeichnet sich dadurch aus, daß er zielgerichtet Mykotoxine, insbesondere Fumonisine, abbaut und somit detoxifi- ziert. Durch den Einsatz eines erfindungsgemäßen Zusatzstoffes, welcher im wesentlichen aus isolierten Enzymen so- wie gegebenenfalls deren Cosubstraten und Trägern besteht, ergibt sich der Vorteil, daß diese ihre katalytische Aktivität in einer Umgebung und unter Bedingungen beibehalten, in welchem beispielsweise komplette Mikroorganismen nicht oder nur wenig aktiv wären, wobei gleichzeitig eine bedeu- tend höhere, spezifische Aktivität erzielt werden kann, sowie definierte Reaktionen unter Vermeidung von unerwünschten Nebenreaktionen katalysiert werden können.

Darüber hinaus können Probleme, welche gemäß dem Stand der Technik durch den Einsatz vermehrungsfähiger Keime auf landwirtschaftlichen Rohprodukten entstanden sind, mit Sicherheit hintangehalten werden und überdies weisen Zusatzstoffe, welche nur isolierte Enzyme enthalten, sowohl eine bessere Eignung zur Formulierung für eine gezielte und kontrollierte Aktivierung, d.h. beispielsweise an einer bestimmten Stelle des Verdauungstrakts, als auch die Vermeidung von unerwünschtem, erhöhtem Substratverbrauch auf. Um die Spezifität noch weiter zu erhöhen, ist der Zusatzstoff gemäß der vorliegenden Erfindung dahingehend bevorzugt wei- tergebildet, daß durch molekulargenetische Methoden, Muta- genese oder molekulare Evolution veränderte Enzyme eingesetzt sind. Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung ist der Zusatzstoff so ausgebildet, daß ein Enzym eingesetzt ist, welches wenigstens 90 % Sequenzidentität mit einem Enzym der ID-Nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23 oder 25 aufweist. Wenn ein Enzym eingesetzt ist bzw. wird, welches wenigstens 90 % Sequenzidentität mit einem Enzym mit der ID-Nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 oder 25 aufweist, gelingt es, neben den bevorzugt abzubauenden Fumonisinen auch weitere Mykotoxine sicher und zuverlässig sauerstoffunabhängig ab- zubauen, wodurch eine weitgehende Entgiftung der beispielsweise auf pflanzlichen Rohprodukten vorhandenen Mykotoxine, insbesondere Fumonisine, erzielt werden kann.

Indem der Zusatzstoff so ausgebildet ist, wie dies einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung entspricht, daß die Enzyme, veränderten Enzyme und/oder zu wenigstens 90 % identen Enzyme mit einer Schutzhülle ummantelt eingesetzt sind, kann sichergestellt werden, daß die Enzyme, die zu wenigstens 90 % identen Enzyme oder veränderten Enzyme vor einem vorzeitigen Aktivitätsverlust gesichert sind und sicher und zuverlässig an der vorgesehenen Stelle beispielsweise im Magen-Darm-Trakt ihre Wirkung entfalten.

Indem der Zusatzstoff bevorzugt so weitergebildet ist, daß die Enzyme aus einer Carboxylesterase ID-Nr. 9, Tricarbal- lylat-Dehydrogenase ID-Nr. 11, einem Citratverwendungspro- tein ID Nr. 13, Alkohol-Dehydrogenase ID-Nr. 17, Amino- transferase ID-Nr. 19 und/oder ID-Nr. 25 und/oder Acetolac- tat-Synthase ID-Nr. 23 gewählt sind, werden im wesentlichen die zum Substratkatabolismus befähigten Enzyme zum Einsatz gebracht, so daß neben einer geringeren Menge an einzusetzenden Enzymen auch sichergestellt werden kann, daß keine unerwünschten Nebenreaktionen bei Einsatz der Enzyme auftreten.

Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung ist der Zusatzstoff so ausgebildet, daß eine Carboxylesterase ID- Nr. 9, eine Aminotransferase ID-Nr. 19 oder ID-Nr. 25, eine α-Ketosäure als Cosubstrat und ein inerter Träger enthalten sind. Indem der Zusatzstoff eine Carboxylesterase, eine Aminotransferase und eine α-Ketosäure als Cosubstrat neben einem inerten Träger aufweist, gelingt es insbesondere, Fu- monisine, welche in Nahrungsmitteln enthalten sind, zuerst zu hydrolysieren, indem von den Fumonisinen Tricarballyl- säurereste mit Hilfe einer Carboxylesterase abgespalten werden, und das so gebildete hydrolysierte Furaonisin in weiterer Folge unter Einwirkung der Aminotransferase und der α-Ketosäure als Cosubstrat, im vorliegenden Fall bevorzugt Brenztraubensäure, weiter umzusetzen, indem eine Aminogruppe von dem hydrolysierten Fumonisinmolekül durch eine Ketogruppe ersetzt wird, so daß ein für beispielsweise Säuger völlig ungefährliches 2-Keto-hydrolysiertes Fumoni- sin entsteht, welches unverändert ausgeschieden werden kann, und als Nebenprodukt Alanin gebildet wird, welches ebenfalls keinerlei negative Eigenschaften beispielsweise auf einen Organismus ausübt bzw. aufweist.

Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung ist der Zusatzstoff derart weitergebildet, daß eine Carboxylesterase ID-Nr. 9, wenigstens ein Adsorbens, insbesondere wenigstens ein Tonmineral, sowie gegebenenfalls ein inerter Träger enthalten sind. Bei Einsatz von lediglich einer Carboxylesterase ID-Nr. 9 und wenigstens ein Adsorbens kann die Detoxifizierung der Fumonisine auch so geführt werden, daß lediglich die Tricarballylsäurereste abgespalten werden und das so gebildete, hydrolysierte Fumonisin an dem Adsor- bens adsorbiert wird. Indem die Tricarballylsäurereste durch, den Einsatz der Carboxylesterase abgespalten werden, entsteht ein im wesentlichen langkettiges Molekül, welches leicht und zuverlässig adsorbiert werden kann, so daß lediglich durch einen gezielten Einsatz eines einzigen Enzyms eine vollständige Detoxifizierung durch insbesondere sauer- stoffunabhängigen Abbau des Fumonisins und anschließende Adsorption sichergestellt werden kann.

Indem gemäß einer Weiterbildung der Erfindung der Zusatzstoff in einem sauerstoffunabhängigen Milieu bei der Bio- ethanolherstellung, insbesondere gemeinsam mit einer Maische bzw. einem pflanzlichen Ausgangsmaterial, eingesetzt ist, indem der Zusatzstoff so gewählt ist, daß die darin enthaltenen Enzyme vollständig aus Bakterien stammen, die den Katabolismus von Fumonisinen über einen hochspezifischen Abbauweg katalysieren, gelingt es, sie mit hoher Spezifität, Aktivität und Effizienz einzusetzen, wodurch der Zusatzstoff auch in einem sauerstoffunabhängigen Milieu technologisch angewandt werden kann.

Schließlich zielt die vorliegende Erfindung auf die Verwendung von Genen, wie sie in den Sequenzen ID-Nr. 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 und 24 dargestellt sind, oder kompletten, rekombinanten Wirtsorganismen zur Expression von Enzymsequenzen ID-Nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 und 25 sowie gegebenenfalls von Cosubstraten zur Herstellung eines Zusatzstoffes für den Abbau von Mykotoxi- nen, insbesondere Fumonisinen, bei der Verarbeitung oder Verwendung von pflanzlichen Rohstoffen ab. Mit einem derart hergestellten Zusatzstoff gelingt ein vollständiger und zu- verlassiger Abbau von Mykotoxinen, insbesondere Fumonisi- nen, insbesondere in einem Sauerstoffunabhängigen Milieu.

In bevorzugter Weise werden gemäß der vorliegenden Erfin- düng ein Cosubstrat gewählt aus der Gruppe: einer Carboxyl- esterase ID-Nr. 9, einer Aminotransferase ID-Nr. 19, ID-Nr. 25 oder einer α-Ketosäure, und ein inerter Träger eingesetzt, mit welcher Verwendung insbesondere ^' Fumonisine sicher und zuverlässig beispielsweise in pflanzlichen Roh- Stoffen bzw. Ausgangsmaterialien zur Gänze zu unschädlichen Bestandteilen abgebaut werden können.

Eine weitere bevorzugte Verwendung ist dadurch gekennzeichnet, daß eine Carboxylesterase, wenigstens ein Adsorbens, insbesondere Tonmineral, sowie gegebenenfalls ein inerter Träger eingesetzt werden. Unter Verwendung einer Carboxyl- esterase und wenigstens eines Adsorbens gelingt es, Mykotoxine, insbesondere Fumonisine, sicher und zuverlässig durch lediglich den Einsatz eines einzigen Enzyms zu entgiften, indem mit diesem Enzym bzw. mit Hilfe dieses Enzyms die Tricarballylsäure-Seitenreste von dem Fumonisin abgespalten werden und das dabei gebildete, langkettige, hydrolysierte Fumonisin in der Folge an dem Adsorbens adsorbiert wird, wodurch das Toxin sicher und zuverlässig unschädlich ge- macht wurde.

Gemäß einer bevorzugten Verwendung wird der Zusatzstoff gemäß der Erfindung zur sauerstoffunabhängigen bzw. anaeroben Behandlung eines pflanzlichen Ausgangsmaterials bzw. einer Maische in der Bioethanolherstellung eingesetzt. In diesem Fall gelingt es, die in dem pflanzlichen Ausgangsmaterial bzw. Rohstoff enthaltenen Mykotoxine während der Bioethanolherstellung im sauerstoffunabhängigen Milieu sicher und zuverlässig unschädlich zu machen, so daß der Rückstand aus der Ethanolproduktion, nämlich der Trester oder die Trockenschlempe, nachfolgend entweder direkt oder nach Trocknung und Pelletierung ohne weitere Verarbeitung, ins- besondere Detoxifizierung, als Futtermittel, welches frei von Mykotoxinen bzw. insbesondere Fumonisinen ist, eingesetzt werden kann.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbei- spielen sowie Figuren näher dargestellt. In diesen zeigt: Fig. 1 den Fumonisin-katabolischen Gencluster, Fig. 2 die Michaelis-Menten-Kurve für Fumonisin-Carboxyl- esterase FumD, Fig. 3 eine Abbaukurve von hydrolysiertem Fumonisin B _x , Fig. 4 die Umwandlung von Fumonisin FBl in hydrolysiertes Fumonisin HFB 1 nach Zugabe von Carboxylesterase ID-Nr. 9 zeigt, und

Fig. 5 den Abbau von hydrolysiertem Fumonisin HFBl durch Zusatz von Aminotransferase ID-Nr. 19.

In Fig. 1 ist ein Fumonisin katabolischer Gencluster als Teilsequenz von 15420 Basenpaaren eines mikrobiellen Stammes mit der Hinterlegungsnummer DSM 16254 dargestellt. In dem .fum-Gencluster des prokaryotischen Stammes DSM 16254 wird die Transkription der offenen Leserahmen durch einen bidirektionalen Promotor gesteuert bzw. geregelt, welcher zwischen fumA und fuml angeordnet ist. Der Cluster codiert Proteine, welche in der Regulierung der Genexpression, wie beispielsweise FumB und FumC, in der Substraterkennung und dem Transport, wie beispielsweise FumJ, FumA und FumG und in einem Substratkatabolismus, wie beispielsweise FumD, FumE, FumF, FumH, Fuml und FumK involviert sind. Beispiele

Beispiel 1: Die Enzymkinetik von Fumonisincarboxylesterase .

Das fuwD Gen (Sequenz ID-Nr. 8) , welches eine Fumonisincar- boxylesterase codiert, wurde kloniert und in Pichia pa- storis unter Verwendung von Standardverfahren exprimiert. Das his-getaggte Enzym wurde rückgewonnen und aus der überstehenden Lösung der Kultur durch Affinitätschromatographie gereinigt. Die Enzymkonzentration wurde bestimmt und die enzymkinetischen Parameter wurden mit sieben unterschiedlichen Substratkonzentrationen im Bereich zwischen 50 μg bis 25 mg FBi pro Liter und einer Enzymkonzentration von 0,33 ng/ml bestimmt. Die Reaktionen wurden in 20 mM Tris-Cl (pH 8,0) Puffer mit 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin gepuffert und bei 30 ⁰ C inkubiert. Proben wurden nach 0, 30, 60 120 und 240 Minuten Inkubation genommen und durch HPLC-MS/MS analysiert. Fumonisin B ₁ (FBi) und hydrolysiertes Fumonisin B ₁ wurden quantifiziert basierend auf einer Kalibrierung mit den gereinigten Referenzsubstanzen und einem vollständig ¹³ C markierten, internen FBl Standard.

Fig. 2 zeigt die Michaelis-Menten-Kurve für die Hydrolyse von Fumonisin Bl (FBl) durch Fumonisin-Carboxylesterase FumD, welcher bei einer Enzymkonzentration von 0,33 ng/ml in Tris-Cl-Puffer (pH 8,0) bestimmt wurde, wobei anfängliche Enzymgeschwindigkeiten gegen die Substratkonzentration aufgetragen wurden. Die Michaelis-Menten-Kurve zeigt einen Abfall bei höheren Substratkonzentrationen, da die Enzymgeschwindigkeit basierend auf dem Produkt, d.h. hydrolysier- ter FBi-Bildung berechnet wurde. Da hydrolysiertes FB _x aus FBi in einer zweistufigen Reaktion über partiell hydrolysiertes FBi mit lediglich einer Tricarballylsäure-Seiten- kette, die zurückbehalten wurde, und einer Seitenkette aus- gebildet wird, die abgespalten wurde, war die Endprodukt- bildung bei hohen Substratkonzentrationen verzögert. Die Michaelis-Menten-Konstante K _M wurde als 0,90 μmol/1 berechnet, was 650 ppb äquivalent ist, und die Umwandlungszahl war 900 pro Sekunde.

Aus Fig. 2 ergibt sich, daß Fumonisine mit der Carboxyl- esterase in den relevanten Konzentrationsbereichen rasch und vollständig hydrolysiert werden können.

Beispiel 2: Die katalytische Aktivität von HFBl (hydroly- siertes Fumonisin Bl) Aminotransferase

Sequenzen ID-Nr. 18 und 24 wurden unter Verwendung von Standardverfahren kloniert und in E. coli exprimiert unter Steuerung bzw. Regelung eines Bakteriophagen T7 Promotors. Die Bakterienzellen wurden gesammelt in 50 mM Natriumphosphatpuffer, neuerlich suspendiert und durch Ultraschall Iy- siert. Hydrolysiertes Fumonisin wurde hinzugefügt und die Proben wurden bei 25 ⁰ C inkubiert. Proben wurden in Zeitintervallen genommen und durch HPLC-MS/MS analysiert. Es wurde keine Reduktion der hydrolysierten FB _x Konzentration beobachtet. Wenn ein Cosubstrat, wie beispielsweise eine α- Ketosäure, wie Brenztraubensäure oder Oxalacetat, zu der Reaktion hinzugefügt wurde, konnte ein vollständiger Abbau des hydrolysierten Fumonisins zu 2-Keto-HFBχ beobachtet werden, wie dies in Fig. 3 dargestellt ist. Diese Substanz ist für Säuger vollständig unschädlich.

Beispiel 3: Enzymaktivität in Darmmilieu

Zur Ãœberprüfung der enzymatischen Aktivität von FUM-Car- boxylesterase im Verdauungstrakt wurden schlachtfrische Schweinedärme verwendet und unter Ausschluß von Sauerstoff ins Labor transportiert und in einer anaeroben Sterilwerkbank untersucht. Etwa 10 cm lange Stücke von Duodenum und Jejunum wurden abgebunden und herausgeschnitten. Mit Kanü- len wurde Fumonisin Bl in konzentrierter wäßriger Lösung auf eine Endkonzentration von etwa 10 ppm verdünnt eingespritzt und mit Darminhalt vermischt. Anschließend wurden 5 μg Fumonisin-Carboxylesterase in wäßriger Lösung, bzw. dasselbe Volumen Wasser in den Negativkontrollen, eingespritzt und eingemischt. Die Darmabschnitte wurden bei 39 ⁰ C inkubiert. Mit Hilfe von Kanülen wurden Proben gezogen und durch HPLC-MS/MS analysiert. Dabei zeigte sich, daß Fumonisin Bl im Duodenum und Jejunum zum Zeitpunkt der ersten Probenahme nach zwei Stunden bereits vollständig hydroly- siert war.

Beispiel 4 : Ermittlung des Temperaturbereichs der Aktivität von Fumonisin-Carboxylesterase

Zur Ermittlung des Temperaturbereichs, in dem Fumonisin- Carboxylesterase aktiv ist, wurden 1,6 ng/ml FUM-Carboxyl- esterase in 20 mM Tris-Cl Puffer, pH 7,0, mit 0,1 mg/ml BSA und 10 ppm Fumonisin Bl bei unterschiedlichen Temperaturen inkubiert. Dabei zeigte sich, daß das Temperaturoptimum für das Enzym bei 30 ⁰ C lag. Auch bei 40 ⁰ C und sogar 50 ⁰ C wurde enzymatische Aktivität noch eindeutig festgestellt. Somit ist diese FUM-Carboxylesterase zur Anwendung unter den Temperaturbedingungen wie im Verdauungstrakt, oder im Zuge von Prozeßschritten der Lebens- oder Futtermittelher- Stellung, die bei erhöhter Temperatur stattfinden, geeignet. Beispiel 5 : Bestimmung des pH-Bereichs der Aktivität von Fumonisin-Carboxylesterase

Zur Bestimmung des pH-Bereichs, in dem Fumonisin-Carboxyl- esterase aktiv ist, wurde Teorell-Stenhagen-Puffer verwendet. Dieser Puffer läßt sich durch die Kombination von Ci- trat, Phosphat und Borat über einen Bereich, von 10 pH Einheiten mit gleicher Pufferkapazität einstellen. FUM-Carbo- xylesterase wurde in einer Konzentration von 3,3 ng/ml mit 10 ppm Fumonisin Bl bei verschiedenen pH-Werten in diesem Puffer bei 25 ⁰ C inkubiert. Die höchste Aktivität zeigte sich bei pH 8,0, aber es konnte im gesamten Bereich von pH 5 bis pH 10 Aktivität festgestellt werden. Durch die Aktivität in diesem breiten pH-Bereich wird die technologische Anwendung des Enzyms als Futtermittelzusatz bzw. im Zuge der Verarbeitung von Lebens- und Futtermitteln ermöglicht.

Beispiel 6 : Fütterungsversuch mit Ferkeln

Der Versuch wurde in einem Versuchsstall mit 12 Buchten für jeweils 10 Tiere durchgeführt. Der Stall war ausgestattet mit Spaltenboden, Schalentränkern und einem computergesteuerten FütterungsSystem. Die Automaten waren entlang der Buchtenwände angeordnet. Das Stallklima wurde täglich auto- matisch aufgezeichnet und die Temperatur nach den Standardempfehlungen zur Ferkelaufzucht eingestellt.

120 gemischt-geschlechtliche Absetzferkel (Alter: ca. 4 Wochen, durchschnittliches Einstellgewicht 8,21 kg) wurden für diesen Versuch eingesetzt. Jedes Ferkel wurde mit einer Ohrmarke versehen und einzeln gewogen. Die 120 Ferkel wurden auf 12 Buchten zufällig verteilt. Alle Ferkel entstamm- ten dem österreichischen Zuchtprogramm ÖHYB (= (Edelschwein x Landrasse) x Pietrain) .

Direkt nach dem Absetzen wurden die Ferkel für 2 Tage mit einem Starterfutter gefüttert, nach dieser Eingewöhnungs- phase erfolgte die Umstellung auf das Versuchsfutter . Die Fütterung erfolgte 2-phasig: Absetzphase Tag 1 - 14, Aufzuchtphase Tag 15 - 42. Das Versuchsfutter wurde buchtenindividuell über die Spotmix-Fütterungsanlage gemischt und je nach Anzahl der Ferkel, Gewichtsentwicklung und Futterverzehr zweimal täglich trocken zugeteilt. Wasser stand zur Aufnahme ad libitum zur Verfügung. Die 12 Buchten wurden in vier verschiedene Applikationsgruppen zu je drei Wiederholungen geteilt und erhielten die folgenden Einmischungen ins oben beschriebene Futter:

In der Positiv-Kontrolle wurden bei fast der Hälfte der Tiere respiratorische Probleme beobachtet, wobei es auch zu einem Ausfall kam. Alle anderen Gruppen erschienen gesund. Leistungsdaten

Beispiel 7: Enzymatischer Abbau von Fumonisinen in der Bioethanolmaische

Proben von Maismaische zur Bioethanolherstellung wurden genommen und bei 30 bis 65 ⁰ C unter Rühren inkubiert, wobei der Abbau von Fumonisin Bl nach Zugabe von 770 Units Carbo- xylesterase ID-Nr. 9 pro Kubikmeter Maische unter Rühren (Rührzeit in Minuten) untersucht wurde. Proben wurden nach der Probennahme durch Aufkochen inaktiviert und danach für die Analytik abzentrifugiert und ein Aliquot des Ãœberstan- des abgedampft. Der Rückstand wurde in 200 μl Probenpuffer, der C13-markierten, internen Fumonisin-Standard enthielt, aufgenommen, 1,5 min geschüttelt, abzentrifugiert und dann einer LC-MS-Analyse unterzogen. Hieraus ergibt sich, daß, wie dies in Fig. 4 dargestellt ist, Fumonisin FBl vollstän- dig in hydrolysiertes Fumonisin HFBl umgewandelt wird. Nach Zusatz von Aminotransferase ID-Nr. 19 wird das hydrolysier- te Fumonisin HFBl vollständig zu unschädlichen Bestandteilen abgebaut, wie dies in Fig. 5 dargestellt ist. Beispiel 8 : Abbau von Fumonisinen und ihren Derivaten in Maistortillabrei und Cornflakesbrei

Die Wirksamkeit der Fumonisin-abbauenden Enzyme wurde in Maisbreiproben ("com grits") für die Maistortilla- und Cornflakes-Herstellung untersucht. Fumonisin-kontaminierter Mais (ca. 1 ppm) wurde zu Maismehl vermählen, mit Wasser versetzt und aufgekocht. Für die Tortilla-Herstellung wurde der auf ca. 50 bis 60 ⁰ C abgekühlte Maisbrei mit einer Mi- schung von Proteinasen in alkalischer Lösung versetzt. Nach 30 bis 180 min, wenn der pH unter 9, vorzugsweise unter pH 8, gefallen ist, wurde eine Mischung aus Carboxylesterase und Aminotransferase (jeweils 500 - 1000 Units/m ³ ) hinzugefügt und für weitere 30 bis 60 min inkubiert. Im Falle der Cornflakes-Herstellung wurde ein Maisbrei aus gemahlenem Mais und Gerstenmalz für ca. eine Stunde im Druckgefäß aufgekocht; nach Abkühlung unter 60 ⁰ C (vorzugsweise 50 ⁰ C) wurde eine Enzymmischung, bestehend aus Carboxylesterase und Aminotransferase (jeweils 500 - 1000 Units/m ³ ) , hinzu- gefügt und für weitere 30 bis 60 min inkubiert. Aus dieser Mischung wurden dann Proben gezogen und auf FBl- bzw. HFBl- Rückstände wie in Beispiel 7 untersucht. HFBl-Levels waren in sämtlichen Proben unter 80 ppb, offensichtlich wurde das aus FBl entstandene HFBl kontinuierlich weiter umgesetzt. Die gemessenen Werte für FBl sind in der u.a. Tabelle angeführt . Tabelle: Enzymatischer Abbau von FBl und HFBl in Maisbrei; Fumonisinkonzentration in ppb (μg/kg)