Asimismo, la presente invención describe un proceso optimizado, para la purificación y aislamiento de ß-caro- teno cristalino de elevada pureza, a partir del caldo de fermentación obtenido anteriormente, mediante una simplifi- cación del proceso de purificación e incremento de rendi- miento de recuperación utilizando disolventes considerados como"naturales"y/o aquellos incluidos en la clase 3 de la ICH (International Conference of Harmonization).

Estado de la técnica Los carotenoides son compuestos abundantes en los ve- getales, primera fuente de la que se obtuvieron, y han sido objeto de numerosos estudios debido a sus propiedades como antioxidantes y como precursores de vitamina A. Representan el más extendido grupo de pigmentos naturales existente en la naturaleza. Se utilizan en la industria como suplemento y colorante alimenticio en margarinas, aceites, salsas, so- pas, etc. (Ninet L. y Renaut J. 1979. En : Peppler HJ., Perlman D. (eds). Microbial Technology, 2nd edn, vol. l Academic Press, NY, pp. 529-544).

Los carotenoides son isoprenoides que contienen una cadena poliénica de dobles enlaces conjugados característi- ca, procedente de una condensación de dos precursores gera- nilgeranil (Pfander (1992). Meth. Enzimol.). Existen dos grupos de pigmentos : los carotenos y sus derivados oxige- nados, las xantofilas.

El ß-caroteno posee una fórmula empiric C4oHss, con un peso molecular de 536.85 y la siguiente formula molecular desarrollada : Trans Beta Caroteno La obtención de (3-caroteno como compuesto de alta pureza ha estado ligada a la reacción de síntesis química clásica, en procesos que hoy en dia son objeto de polémica al considerarse que vías alternativas partiendo de fuentes de origen natural via fermentación o productos naturales unidos a procesos de extracción empleando solventes y con- diciones de reacción menos drásticas, resultan más venta- josas.

Los carotenoides y demás componentes terpénicos deri- vados en general y el ß-caroteno en particular pueden obte- nerse a partir de fuentes naturales, bien sea productos vegetales : tomate, zanahoria, en los que se encuentra en porcentajes muy pequeños o partiendo de cultivos de algas, hongos, etc., seleccionados, en los que la proporción de estos componentes puede aumentar.

Procedimientos de obtención de oleorresinas ricas en carotenoides y en 6-y-caroteno a partir de vegetales, aceites o algas se describen en diversas patentes.

En la mayoría de los casos los procedimientos de ex- tracción descritos requieren una etapa de molienda/extru- sión del fruto para facilitar la extracción del solvente y liberar el contenido intracelular rico en (3-caroteno.

El procedimiento de extracción de. estos componentes debe hacer frente a la relativa baja concentración y a la particular disposición de los mismos en agrupaciones alma- cenadas intracelularmente. En consecuencia la extracción del ß-caroteno requiere métodos adecuados que permitan so- lubilizar el producto, previa preparación, para el acceso del agente solubilizante, bien mediante penetración de las paredes celulares o mediante rotura previa de las paredes celulares, liberando el contenido intracelular.

Los procedimientos descritos en US 3268606, US 2959522 utilizan disolventes halogenados como diclorometano, cloro- formo etc., o del tipo de hidrocarburos aromáticos : bence- no, tolueno, etc., se encuentran con las dificultades de toxicidad inherentes a este tipo de disolventes, y que se traducen en su inclusión dentro de los grupos I y II de la Guía para disolventes residuales de uso en aplicaciones farmacéuticas o alimentarias y según la cual los recomen- dables son los integrantes del grupo Clase III.

La mayoría de los métodos de extracción de (3-caroteno a partir de algas emplean aceites. Estos métodos no son los mas adecuados para obtener (3-caroteno en forma cristalina, sino para obtener extractos oleosos, como se describen en las patentes US 4680314 ; US4713398 ; US 5019668 ; US 5378369 en los que se solubiliza el ß-caroteno y se comercializa como tal.

El uso de C02 supercrítico se ve limitado por la esca- sa solubilidad encontrada en el para el P-caroteno. Se ha

contemplado el empleo de otros solventes a presión en condiciones supercríticas o como gases licuados, tales como propano o etileno en los cuales la solubilidad es mayor. No obstante el uso de estos disolventes hidrocarbonados difi- cultaría el uso del ß-caroteno en la industria alimentaria.

El ß-caroteno puede ser obtenido de forma alternativa a partir de caldos de fermentación de determinados hongos mucorales como Phycomyces, Blakeslea, etc., los cuales pre- sentan como ventaja frente a las fuentes naturales ante- riormente descritas, la elevada concentración de este com- puesto en relación a la cantidad de biomasa seca así como el posible incremento de producción utilizando cepas super- productoras obtenidas por técnicas de mutagénesis clásica o biología molecular o bien mediante la optimización del pro- ceso de fermentación utilizando materias primas complejas, determinados inductores de la producción o inhibidores de la producción de otros carotenoides estructuralmente rela- cionados que eviten la producción de los mismos.

En cualquiera de los métodos de producción de P-caro- teno con el hongo B. trispora se utilizan cultivos mixtos, debido a que se obtienen rendimientos de P-caroteno muy su- periores a los encontrados en las estirpes (+) y (-) por separado (Ciegler, A. 1965). Advan. Appl. Microbiol. 7 : 19).

Las harinas de cítricos han sido anadidas al medio de fermentación de ß-caroteno como sustituto de la ß-ionona, un estimulador químico de la ruta biosintética [Ciegler, A.

1965. Adv. Appl. Microbiol. 7,1-34]. La adición de deriva- dos de cítricos, previamente tratados con alcali, permitie- ron incrementar el contenido de ß-caroteno hasta 1.7 g/1 [Upjohn Co., 1965. Dutch Patent 65/00,788].

Un estudio analítico encaminado a identificar el o los factores estimulantes de la producción de (3-caroteno, con- tenidos en las harinas de cítricos, reveló que el ácido

cítrico es el principal componente además de una pequena cantidad de ácido málico, así como un tercer ácido no identificado, cuyo Rf es similar al ácido glucónico o al ácido 2-ketoglucónico. Este estudio concluye que la función del ácido cítrico en el incremento de la producción es no específica y podría actuar como un precursor de metabolitos tempranos de la ruta biosintética. Adicionalmente se encon- traron un 42% de carbohidratos, de ellos el 50% sacarosa y el resto azúcares reductores (glucosa y fructosa) [Pazola, Z., Ciegler, A., Hall, H. H. 1966. Nature 5043 : 1367-1368].

Las lecitinas son compuestos con una estructura de glicerofosfatidilcolina, estando presentes en todos los organismos vivos (plantas y animales), siendo constituyen- tes significativos del tejido nervioso y del cerebro. Son sustancias incoloras, untuosas al tacto, que funden alrede- dor de 60°C y se descomponen por calentamiento a poco de rebasar los 100°C. La molécula de lecitina la constituye una mezcla de diglicéridos de ácido esteárico, palmitic y oleico, ligados al éster de colina del ácido fosfórico.

Como la molécula tiene carácter dipolar, se emplean profu- samente como surfactante y emulsificante comestible, de origen natural, con aplicación en la industria alimentaria general (chocolate, margarina, etc.), dietética, farma- céutica y cosmética [Furia, T. E. (ed.). CRC Handbook of Food Additives. 2nd ed. Cleveland : The Chemical Rubber Co., 1972.879]. La lecitina comercial procede fundamentalmente de la soja, obtenida como un subproducto de la fabricación del aceite de soja, aunque también puede obtenerse del malz y otras semillas vegetales [Hawley, G. G. The condensed Chemical Dictionary. 9th ed. New York : Van Nostrand Reinhold Co., 1977.509]. La lecitina de soja contiene ác. Palmitic 11.7%, esteárico 4%, palmitoleico 8.6%, oleico 9.8%, linoleico 55%, linolénico 4%, ácidos C20-C22 (incluyendo araquidónico) 5.5% [The Merck Index. 9th ed. Rahway, New Yersey : Merck & Co., Inc., 1976.712].

El efecto de la lecitina de soja sobre la fermentación ha sido estudiado fundamentalmente en relación con su uti- lización en piensos como suplemento fosfolipídico y el efecto sobre la fermentación del rumen, con incidencia so- bre la digestibilidad de las grasas y el nivel sérico de triglicéridos y colesterol de terneros y ovejas (Jenkins TC, Jiménez T, y Cross DL (1989)"Influence of phospho- lipids on ruminal fermentation in vitro and on nutrient digestión and serum lipids in sheep"J Anim Sci 67 (2) : 529- 537; Jenkins TC y Fotouhi, N (1990)"Effects of lecithin and corn oil on site of digestion, ruminal fermentation and microbial protein síntesis in sheep"J Anim Sci 68 (2) : 460- 466; Jenkins TC (1990)"Nutrient digestion, ruminal fermen- tation and plasma lipids in steers fed combinations of hydrogenated fat and lecithin Dairy Sci 73 (10) : 2934- 2939) así como sobre la producción de leche en vacas (Abel- Caines SF, Grant RJ y Morrison M (1998)"Effect of soybean hulls, soy lecithin, and soapstock mixtures on ruminal fermentation and milk composition in dairy cows"J Dairy Sci 81 (2) : 462-470).

En la producción de mildiomicina mediante fermentación por Actinomycetes, se encontró en algunos casos un incre- mento importante de producción por la incorporación al medio de cultivo de componentes de naturaleza N-metilo (especialmente grupos trimetil-amonio), entre ellos colina, betain, lecitina, tetrametilamonio, etc., ó sustancias naturales ricas en dichos compuestos, ó incluso una combi- nación de ambos, para evitar una posible sobredosificación de otros componentes de la sustancia natural en cuestión [US 4.334.022].

Otras patentes desarrolladas en los anos 80 se refieren a la incorporación de la lecitina para favorecer el proceso fermentativo en la harina de soja desgrasada con el fin de mejorar su procesabilidad y digestibilidad [JP 58116648] así como a su efecto activador sobre el cultivo

de microorganismos utilizados en el procesamiento de alimentos [DE 3546511; EP 0223161]. Por otra parte, el ca- rácter emulsionante de este compuesto ha sido tenido en cuenta en aplicaciones de eliminación de aceites por via microbiana [DE 149056] ó en el tratamiento por enzimas de efluentes orgánicos de desecho [EP 0421223] y en la for- mación de compost a partir de residuos de alto contenido en grasas [JP 7033570].

En una aplicación reciente, la lecitina se ha empleado también para la mejora del medio de cultivo del hongo Lagenidium giganteum, permitiendo un mayor crecimiento y además una mayor efectividad como agente de biocontrol frente a los mosquitos del hongo incubado en tales condi- ciones [WO 98/58049].

En la producción de beta-caroteno por fermentación de Blakeslea trispora se ha descrito la utilización de algunos agentes surfactantes (como el Span 20, monolaurato de Sor- bitán, SIGMA) para incrementar la producción, gracias a que permiten un crecimiento disperso del micelio (Seon-Won Kim, Weon-Taek Seo y Young-Hoon Park (1997)"Enhanced production of P-carotene from Blakeslea trispora with Span 20"Bio- technology Letters 19 (6) : 561-562). Sin embargo, no se des- cribe efecto alguno sobre la relación del contenido en ß- caroteno producido respecto a otros carotenoides también presentes en los cultivos de Blakeslea trispora (y-caroteno, P-zea-caroteno, etc.).

Los procesos para obtener el (3-caroteno a partir de caldos de fermentación, descritos hasta el momento, impli- can generalmente una etapa de extracción y sucesivas cris- talizaciones y recristalizaciones e incluso etapas de puri- ficación cromatográfica, lo que debido a la naturaleza de estas sustancias, exige un consumo elevado de disolventes debido a la baja solubilidad de los mismos (US 5310554; EP 0242148 ; US 3369974, Biochemistry and Molecular Biology

International, 39,1077-1084 (1996) y a menudo las purezas alcanzadas en el producto son excesivamente bajas.

Además, los disolventes habitualmente empleados, di- clorometano, cloroformo, hexano, benceno o tolueno, difi- cultan el uso del (3-caroteno obtenido en la industria ali- mentaria por su toxicidad.

Cuando los cristales de P-caroteno son obtenidos di- rectamente por cristalización del extracto organic a par- tir de un caldo de fermentación mediante evaporación direc- ta del disolvente, los cristales obtenidos no poseen la pu- reza necesaria comparados con el a-caroteno sintético, siendo necesarias diversas etapas de recristalización y/o purificación con el consiguiente consumo de disolvente, complejidad del proceso y pérdidas de producto que originan unos bajos rendimientos de recuperación del mismo.

Recientemente se ha descrito la preparación de crista- les de ß-caroteno en la patente PCT WO 98/03480, por suce- sivos lavados con agua o alcoholes de bajo peso molecular, partiendo de un extracto de acetato de etilo obtenido por extracción de la biomasa procedente de un caldo de fer- mentación, que aun obteniendo una alta pureza en cristales de (3-caroteno, exige un consumo elevado de solventes como acetato de etilo y etanol, sucesivas etapas de lavado y cristalización que dan lugar a que los rendimientos de recuperación del producto sean bajos.

Resumen del invento El objeto de la presente invención es el incremento de la producción de P-caroteno, en un proceso de fermentación con hongos mucorales (Blakeslea, Phycomyces, etc.), mas específicamente Blakeslea trispora mediante el cultivo del hongo en un medio de fermentación que contiene cantidades variables de lecitina de soja, aplicándose al cultivo una

estrategia definida de control de pH durante la fermen- tación.

Asimismo, en esta invención se describe la obtención de a-caroteno cristalino de elevada pureza a partir de un caldo de fermentación, empleando disolventes considerados como naturales. Disolventes naturales serían aquellos que, por una parte sean toxicológicamente inocuos y/o los que estén incluidos en la clase 3 de la ICH (International Conference of Harmonization).

En su consideración general el proceso comprende las siguientes etapas : 0) Fermentación en un medio de cultivo con lecitina y en condiciones de control de pH predeterminadas 1) Separación de la Biomasa húmeda desde la fuente natural de biosíntesis (el caldo de Fermentación por ejemplo) 2) Purificación de la Biomasa húmeda por tratamiento con alcohol 3) Separación de la Biomasa purificada del alcohol 4) Acondicionamiento de la Biomasa purificada mediante se- cado mas disgregación o ruptura de la misma 5) Extracción sólido-líquido del P-caroteno con un disol- vente orgánico 6) Concentración del extracto rico 7) Precipitación/cristalización por adición de alcohol 8) Filtración 9) Secado El método aquí descrito nos permite recuperar (3-caro- teno cristalino con una pureza superior al 90%, preferible- mente superior al 95% y más preferiblemente superior al 98%.

Descripción detallada del invento La presente invención describe un procedimiento para incrementar la producción de (3-caroteno, en un proceso de fermentación con hongos mucorales (Blakeslea, Choanephora o Phycomyces, más específicamente Blakeslea trispora. La invención consiste en cultivar el hongo B. trispora en un medio de fermentación que contiene subproductos derivados de la manipulación de cítricos, en particular harinas de cítricos, los cuales han sido obtenidos mediante un proceso de eliminación de pectinas por tratamiento con hidróxido calcico y sucesivos tratamientos de cambio de pH y lavados para concentrar determinados componentes que inducen la producción de (3-caroteno. Dentro de las harinas de cítri- cos, pueden ser utilizadas harinas procedentes de, por ejemplo naranja, pomelo, mandarina, etc. y dentro de cada una de ellas las diferentes variedades de cada uno de ellos como por ejemplo Navel, Navelina, Clementina Wasinghton, Valencia-late etc.

La invención consiste por una parte en que el medio de cultivo contiene también lecitina de soja y por otra parte en aplicar una estrategia definida de control de pH durante la fermentación. El efecto conjunto de estas variables permite un incremento en la producción de beta-caroteno y en la concentración relativa de este respecto de otros carotenoides minoritarios.

Los organismos utilizados para la fermentación pueden ser estirpes aisladas (+) o (-) o una mezcla de las estir- pes (+) y (-) de hongos mucorales, más específicamente B. trispora o bien mutantes de B. trispora superproductores de (3-caroteno. Varias mezclas de estirpe (+) y (-) del hongo pueden ser utilizadas en el proceso de fermentación de esta invención.

El proceso de fermentación puede realizarse ~en cual- quier medio de cultivo que contenga una o más fuentes de carbono, una o mas fuentes de nitrógeno, sales minerales, tiamina y proporciones variables de harinas de cítricos procedentes de un único cítrico y una única variedad o mez- clas de harinas de cítricos de diferentes frutos y/o varie- dades y lecitina de soja en proporciones variables que van desde un 0.1 % al 10 % y preferiblemente del 0.5 % al 5 % y más preferiblemente entre el 0.5 % al 1.5 %.

Las fuentes de carbono que se pueden utilizar como nu- trientes sencillos o complejos incluyen carbohidratos o grasas, como por ejemplo dextrinas, almidones, glucosa, sacarosa, fructosa, aceites animales o vegetales. Dentro de las fuentes de nitrógeno pueden utilizarse fuentes orgáni- cas e inorgánicas como por ejemplo harina de soja, harina de maíz, destilados solubles, extracto de levadura, harina de algodón, peptonas, caseína o sulfato amónico. Entre las sales minerales que pueden adicionarse al medio de cultivo se encuentran fosfatos, sulfatos, cloruros de cationes monovalentes como sodio, potasio o amonio o divalentes como calcio o magnesio. Las proporciones de los nutrientes se determinan en base a las necesidades de crecimiento del microorganismo y a los niveles de producción.

La fermentación se lleva a cabo en condiciones aeróbi- cas y en cultivo sumergido. La temperatura de fermentación puede oscilar entre 20°C y 32°C aunque se prefiere entre 25°C y 28°C.

El pH del cultivo evoluciona libremente en las pri- meras horas, en que tiene lugar el crecimiento inicial del hongo en el fermentador, y se controla posteriormente por medio de adición de ácido y/o álcali en el rango 6,5-7,2, aunque preferiblemente 6,7-6,9. El inicio del control de pH depende de la evolución del crecimiento, pero en general tiene lugar entre las 12 y las 50 horas de fermentación, preferiblemente entre 24 y 36 horas.

La incorporación de la lecitina en el medio, debido al carácter anfipático de dicha molécula, favorece la emulsion de los aceites en medios de cultivo en que éstos se encuentran en elevada concentración, como es el caso fre- cuentemente en los medios de fermentación de beta-caroteno.

Esta acción por una parte favorece la utilización del aceite por parte del microorganismo y por otra parte se ha encontrado que activa sorprendentemente la ruta de la carotenogénesis favoreciendo la transformación del gamma- caroteno en beta-caroteno, aumentando la producción de este último y su concentración relativa respecto a otros caro- tenoides, en especial el gamma-caroteno, con lo que se re- duce de forma importante la presencia de este en el pro- ducto final, incrementando su pureza en all-trans-beta- caroteno.

Este efecto, además, se ve potenciado cuando se efec- túa un adecuado control de pH durante la fermentación, de forma que el ajuste de pH a partir de las 24-36 horas de fermentación favorece la reducción del gamma-caroteno de forma aún más acusada, incrementando la concentración rela- tiva de la forma beta.

La presencia de gamma-caroteno en los caldos de fer- mentación de hongos mucorales en cultivos en fase estacio- naria ha sido anteriormente descrita (Murillo FJ, Torres- Martinez S, Aragon CM y Cerda-Olmedo E (1981)"Substrate transfer in carotene biosíntesis in Phycomyces"Eur J Biochem 119 (3) : 511-516; Candau R, Bejarano ER, Cerda-Olmedo E (1991)"In vivo chanelling of substrates in an enzyme agrégate for beta-carotene biosíntesis"Proc Natl Acad Sci USA 88 (11) : 4936-4940; Fraser PD, Ruiz-Hidalgo MJ, Lopez- Matas MA, Alvarez MI, Eslava AP y Bramley PM (1996) "Carotenoid biosíntesis in wild type and mutant strains of Mucor circinelloides"Biochim Biophys Acta 1289 (2) : 203- 208).

Esta presencia se ha descrito también en Blakeslea trispora (Mehta BJ y Cerda-Olmedo E (1999)"Lycopene cyclization in Blakeslea trispora"Mycoscience 40 (3) 307- 310). En ambos casos se describen efectos inhibitorios por parte de algunas sustancias como la nicotina, 2- (4-cloro- feniltio)-trietilamina, alfa-picolina e imidazol sobre la producción de beta-caroteno, favoreciendo sin embargo la acumulación de licopeno y gamma-caroteno debido al bloqueo de la licopeno-ciclasa. Sin embargo, no se han descrito anteriormente procedimientos encaminados a reducir el con- tenido en gamma-caroteno de las fermentaciones de B. tris- pora incrementando la producción de beta-caroteno y por tanto la pureza del producto final obtenido.

Este efecto de reducción del contenido en gamma- caroteno de los caldos de fermentación de Blakeslea tris- pora resultado de la presente invención tiene trascendencia en el sentido de que permite cumplir las especificaciones de producto final que tanto a nivel de Farmacopea como de legislación alimentaria establecen la necesidad de un mínimo del 96% de pureza de beta-caroteno en el producto final.

Dada la característica del componente carotenoide bio- sintetizado en la fermentación, de ser intracelular, el procedimiento de recuperación a partir del caldo de culti- vo, preparado de acuerdo con los procedimientos al uso, implica la separación de la biomasa del caldo, con el pro- pósito de eliminar o reducir las pérdidas en el caldo sin biomasa.

Esta separación puede hacerse por los procedimientos establecidos de A) Filtración, empleando las tecnologías al uso de filtros, bien sean de bandas, rotatorios, prensas, etc., en los que una barrera constituida por la tela filtrante separa la biomasa y permite pasar la fase liquida sin biomasa, o B) Centrifugación, en la que haciendo uso de la diferencia de densidades entre el caldo y la biomasa

(normalmente mayor) se emplea una máquina del tipo de un separador centrífugo, decantador o similar, en el que la fase pesada se concentra y se separa de la fase liquida con la menor cantidad posible de biomasa. El reducir pérdidas y optimizar las características de cada fase respectiva con- siguiendo la mayor cantidad de biomasa con el mayor conte- nido de residuo seco y eliminar la mayor cantidad de caldo de fermentación, con la menor cantidad de materia activa es una de los objetivos de esta invención.

El micelio húmedo resultante contiene más del 95% de los carotenoides producidos en la fermentación, preferible- mente mas del 97% y más preferiblemente más del 99%. El contenido en carotenoides de la fase acuosa es, por tanto, inferior al 5%, preferiblemente inferior al 3% y más prefe- riblemente inferior al 1%.

Este sólido húmedo del micelio, estaría en disposición de permitir, mediante las etapas ulteriores, la separación de beta-caroteno, pero la comprobación de que, relacionado con la Fermentación, mantiene un porcentaje relativamente elevado de componentes lipofílicos, entre 15 y 20 % (ácidos grasos y aceites) y que en etapas ulteriores plantean pro- blemas de purificación, conducen a introducir, en este punto, una etapa de purificación de la biomasa.

Esta etapa de purificación implica una resuspensión de la biomasa con una cantidad de alcohol : metanol, etanol, propanol, isopropanol, o cualquier otro alcohol en el que la solubilidad del (3-caroteno sea muy baja, en proporción adecuada para conseguir la máxima purificación de los componentes lipidicos, es decir el micelio húmedo se re- suspende con una cantidad de alcohol que oscila entre 1 ml/g y 10 ml/g de micelio húmedo. La temperatura de resus- pensión oscila entre la temperatura ambiente y la de ebu- llición del alcohol. El tiempo de contacto oscila entre 5 minutos y 24 horas. La resuspensión alcohólica así pre- parada se filtra o centrifuga, de modo que el contenido en

sólidos en el filtrado o clarificado sea prácticamente nulo. El micelio húmedo resultante, que contendrá alcohol más agua en diversa proporción, contiene más del 93% de los carotenoides producidos en la fermentación, preferiblemente más del 95% y más preferiblemente más del 97%.

En la mezcla resultante de restos de caldo con alcohol el contenido en carotenoides es inferior al 2%, preferi- blemente inferior al 1%. Mediante este tratamiento con al- cohol se consigue eliminar una serie de sustancias lipofí- licas solubles en alcohol, en cantidad variable en función de las características del caldo utilizado, efectuando una purificación previa extremadamente importante y que nos va a permitir obtener un producto final cristalino de elevada pureza. Además, al eliminar una proporción variable de agua del micelio húmedo inicial, se facilita considerablemente el proceso de secado.

Alternativamente al conjunto de estas dos etapas de separación de la Biomasa y de purificación por resuspen- sión, se plantea el hecho de que mezclando directamente el caldo de cosecha con el alcohol en proporciones de volumen entre 1 : 0,5 y 1 : 5 (caldo/alcohol) y a temperaturas entre la temperatura ambiente y la de ebullición de la mezcla, pre- ferentemente entre temperatura ambiente y 50°C, manteniendo el tiempo mínimo de contacto se consigue un efecto de purificación equivalente al descrito, con lo que se simpli- fica el proceso al eliminar una operación de separación sólido/liquido.

El hecho de que el producto carotenoide sea intrace- lular implica que la biomasa purificada requiere un acondi- cionamiento bien mediante secado más molienda, secado más disgregación o solo disgregación de la biomasa, que favo- rezca la mezcla con disolventes y facilite la extracción de éstos.

El micelio deshidratado/purificado se seca. El secado puede hacerse por los procedimientos habituales en lotes

(batch) o en continuo. La temperatura de secado oscila en- tre la temperatura ambiente y 150°C, preferiblemente no debe sobrepasar los 60°C y mas preferiblemente estar por debajo de 50°C. El tiempo de secado es función de la temperatura empleada, oscilando entre 1 hora y 72 horas.

Debido a la posible descomposición de estos carotenoides por oxidación con el oxígeno atmosférico, es conveniente efectuar esta operación de secado en ausencia de oxígeno, bien bajo atmósfera de nitrógeno o al menos a vacío.

Para conseguir una buena accesibilidad del disolvente al carotenoide a extractar es necesaria una operación de ruptura previa del micelio, de modo que la superficie de contacto sea máxima. El tamano de partícula óptimo del mi- celio seco y roto debe ser inferior a 3 mm, preferiblemente inferior de 1 mm y mas preferiblemente inferior a 0.5 mm.

La molienda puede hacerse sobre el producto seco, me- diante los sistemas mecánicos con partes giratorias o fi- jas : mazas, tamices, etc., por el paso a través de cilin- dros giratorios presionando uno sobre el otro o mediante el sistema de secado tipo flash (instantáneo) en el equipo jet mill (molino de chorro) donde el producto húmedo se alimen- ta a una corriente de un gas en recirculación y a tempera- tura elevada, de manera que el tiempo de residencia sea el mínimo para conseguir vaporizar el contenido de componentes líquidos, y se transporta, al variar las densidades el producto, hasta un ciclón donde se recupera.

Durante el tiempo de secado y en el trayecto tiene lu- gar asimismo un efecto de homogeneización al chocar las partículas con las paredes.

Para la extracción del (3-caroteno a partir de un mice- lio acondicionado tal y como se ha descrito, se pueden emplear diversos disolvente orgánicos. Esta invención se referirá al uso de disolventes de grado alimentario consi- derados como naturales, tales como los esteres de acilo, preferiblemente acetatos de etilo, propilo, isopropilo,

butilo, isobutilo, que conjugan la solubilidad razonable- mente elevada para los componentes carotenoides con su com- patibilidad como disolventes incluidos en el Grupo de Clase 3 de la ICH. Estos disolventes son admisibles tanto a nivel espanol como comunitario, en los ámbitos tanto farmacéutico como alimentario (RDL 12/04/96 y RDL 16/10/96).

La temperatura de extracción oscila entre la tempera- tura ambiente y la de ebullición del disolvente, preferi- blemente entre 50°C y 80°C. El tiempo de extracción será el mínimo necesario para conseguir la solubilización, entre 1 segundo y 1 hora, preferiblemente entre 1 minuto y 15 minu- tos. La cantidad de disolvente empleada depende de la tem- peratura y de la riqueza del micelio en carotenoides, oscilando entre 5 ml/g y 20 ml/g. El número de extracciones varia desde 1 hasta 3. La cantidad de carotenoides extrac- tados es superior al 85%, preferiblemente superior al 90% y más preferiblemente superior al 95%.

Una vez obtenido el extracto rico en carotenoides es necesario concentrarlo hasta un determinado volumen. La concentración final de carotenoides en el disolvente tras concentrar oscila preferentemente entre 10 y 40 g/l. La temperatura de concentración debe ser inferior a 80°C, pre- feriblemente inferior a 70°C y mas preferiblemente inferior a 50°C. E1 tiempo de concentración debe ser inferior a 1 hora, preferiblemente inferior a 30 min., y mas preferible- mente inferior a 15 min.

Una vez concentrado el extracto al volumen requerido se hace necesario adicionar un insolubilizante de los caro- tenoides, concretamente un alcohol y más concretamente me- tanol, etanol, isopropanol, anhidros, o cualquier otro al- cohol en el que la solubilidad del ß-caroteno sea muy baja, en proporciones entre 1/1 y 6/1 respecto al volumen del di- solvente tras la concentración, con lo cual el rendimiento en p-caroteno cristalino aumenta considerablemente. La adi- ción del alcohol ejerce también un efecto purificante, re-

cuperándose un producto más puro que cuando no se adiciona.

El tiempo de cristalización oscila entre 15 min. y 24 ho- ras, preferiblemente entre 1 h y 12 h y más preferiblemente entre 3 y 8 horas. La temperatura de cristalización debe ser inferior a 25°C, preferiblemente inferior a 5°C.

La separación de los cristales de las aguas de crista- lización se puede efectuar por filtración o centrifugación, desplazando las aguas de cristalización que bañan los cris- tales lavando con el mismo alcohol empleado para insolubi- lizar.

Los cristales obtenidos se secan a vacío y temperatura ambiente durante al menos 1 h. hasta obtener un contenido de disolventes residuales acorde con las especificaciones de concentración máxima establecidas por la legislación, y que, en el caso del a-caroteno, se establece en una pérdida por secado < 0,2%.

La pureza en beta-caroteno de los cristales obtenidos, corresponde a un Título-determinado por espectrofoto- metría mediante lectura de la Absorción a 455 nm disuelto en ciclohexano (El% lcm = 2500) según método espectrofo- tométrico de la USP, EP, BP, superior a 90%, preferen- temente superior al 95% y mas preferentemente superior al 98% con un contenido en otros carotenoides inferior al 4%, preferiblemente inferior a 2%.

Asimismo el producto cristalino obtenido puede mane- jarse y comercializarse como tal o formando parte de formu- laciones en las que la proporción de-caroteno varíe entre el 1 y el 85%, mezclado con diversos excipientes o com- puestos, como es el caso de aceites de soja, maíz, oliva, etc. con diversos grados de pureza y acompañado de anti- oxidantes tipo tocoferol. Un objeto de la presente inven- ción es proporcionar una formulación de carotenoides dis- persable en agua, que contiene aproximadamente 1 a 25 partes en peso de polvo seco de carotenoide encapsulado en una matriz de almidón de calidad alimentaria que proporcio-

na a-caroteno incluido en el polvo encapsulado en una condición estable.

Los productos de la presente invención son formulacio- nes sólidas de a-caroteno, dispersables en agua.

Los almidones utilizados son un almidón modificado de malz de calidad alimentaria de elevado peso molecular, que permite un sencillo emulsionamiento de la fase orgánica en agua. Después de separar el disolvente, la dispersión satisface la gama de colores del a-caroteno. Este almidón alimentario modificado no produce suficiente redispersabi- lidad del polvo seco. Por ello, se añade también otro almi- dón. La segunda variedad es una mezcla de almidones de calidad alimentaria de diferentes pesos moleculares en un rango de 1.000-700.000; este segundo tipo de almidón pro- porciona una buena dispersabilidad del producto final.

Como el P-caroteno es sensible a la oxidación, se pue- den disolver antioxidantes en el disolvente que contiene el P-caroteno para intensificar la estabilidad contra el deterioro. En la presente invención se puede utilizar cual- quier antioxidante autorizado en alimentos, incluido entre otros el a-tocoferol de origen natural o sintético. El nivel de antioxidante será el suficiente para proteger al P-caroteno. Este tendrá que ser 0,1 a 0,3 veces la cantidad de a-caroteno. También se puede añadir palmitato de ascor- bilo a la formulación debido al efecto antioxidativo sinér- gico de la asociación de ambos antioxidantes.

El método de esta invención es especialmente aplicable para la recuperación de (3-caroteno cristalino de una fuente microbiana, preferiblemente algas, hongos o levaduras, mas preferiblemente de hongos del orden de los Mucorales, y mas preferiblemente B. trispora.

La extrema pureza conseguida en los cristales obteni- dos por la presente metodología y el empleo de disolventes considerados como naturales hace que estos cristales sean

aplicables en la industria alimentaria, farmacéutica o de cosméticos.

Ejemplo 1.

La adición de lecitina de soja al medio de cultivo disminuye el contenido en gamma-caroteno cuando se fermenta en matraz.

Se prepara un medio de inocule que contiene por litro : harina de soja, 23 g; harina de maíz, 47 g; fosfato mono- potásico 0,5 g; clorhidrato de tiamina, 0,002 g. Su pH ini- cial es de 6,3. El medio se reparte en matraces Erlenmeyer de 500 ml a razón de 67 ó 100 ml. Después de esterilizar, se siembran a partir de suspensiones de esporas las estirpes B. trispora estirpe (+) y B. trispora estirpe (-) en matraces separados y se incuban a 25°C durante 48 horas.

Se prepara un medio base de fermentación que contiene por litro : harina de soja, 44 g; harina de maíz, 19 g; harina de naranja, 10 g; fosfato monopotásico dibásico 0,5 g; isoniazida, 0,28 g; clorhidrato de tiamina, 0,002 g; aceite vegetal 100 g. El medio de cultivo que contiene lecitina de soja se prepara según la descripción anterior y se suplementa con un 1% de lecitina. El pH se ajusta a 6,3.

El medio se reparte en matraces Erlenmeyer de 250 ml a razón de 20 ml.

Para la fermentación de (3-caroteno se inoculan matraces que contienen medio de fermentación con un 10% de un cultivo mixto de las estirpes de B. trispora (+) y B. trispora (-). Todos los matraces se incuban a 25°C en un agitador orbital a 250 rpm. A las 48 horas de fermentación se adiciona p-ionona en los matraces que corresponde, a razón de 1 ml por litro de medio de cultivo y se recoge el micelio al 6° dia de fermentación.

La extracción de (3-caroteno se realiza mediante cualquier método descrito de rotura celular que permita

liberar el contenido intracelular, se solubiliza en cual- quier solvente en el que resulte soluble como por ejemplo acetona. Su concentración se puede determinar mediante medida espectrofotométrica, pero se prefiere el uso de cromatografía liquida (HPLC), mediante de cualquiera de los métodos descritos en la bibliografía.

La adición de lecitina de soja incrementa la pro- ducción de ß-caroteno en un 5% y disminuye la producción de y-caroteno en un 60%. (ver Figura 1). Este experimento demuestra que la lecitina permite incrementar la producción de a-caroteno y además obtener un producto mas puro.

Ejemplo 2 La incorporación de lecitina al medio de cultivo incrementa la producción de beta-caroteno y reduce el nivel relativo de gamma-caroteno en fermentador piloto. Cuando se combina con el control de pH, el efecto sobre la producción de gamma-caroteno es aún mayor.

Se prepara un medio de inocule que contiene por litro : harina de soja, 23 g; harina de maíz, 47 g; fosfato monopo- tásico 0,5 g; clorhidrato de tiamina, 0,002 g. Su pH ini- cial es de 6,3. El medio se reparte en matraces Erlenmeyer de 2000 mL a razón de 500 mL. Después de esterilizar, se siembran a partir de suspensiones de esporas B. trispora estirpe (+) y B. trispora estirpe (-) en matraces separados y se incuban a 25°C durante 48 horas, con agitación orbital a 250 rpm y 5 cm. de excentricidad.

Se transfiere estérilmente cada una de las cepas a un tanque intermedio de crecimiento con un medio de cultivo cuya composición por litro es : Pharmamedia, 29 g; harina de maíz, 47 g; fosfato monopotásico 0,5 g; clorhidrato de tiamina, 0,002 g; antiespuma, 1 g. Su pH inicial es de 6,0.

Después de incubar 36-48 h, se realiza la mezcla de las cepas (+) y (-) y se siembra con un 10% de la mezcla el medio base de fermentación, cuya composición por litro es la siguiente : harina de soja, 50 g; harina de maíz, 25 g; harina de naranja, 15 g; fosfato monopotásico dibásico 0,5 g; isoniazida, 0,28 g; clorhidrato de tiamina, 0,002 g; aceite vegetal 80 g; antiespuma, 0,175 g. Este medio de cultivo se suplementa con un 1% de lecitina de soja.

La fermentación se verifica a una temperatura de 25- 28°C con agitación variable entre 150 y 250 rpm y una aireación de 1-1,5 v/v/m. El control de pH se realiza con amoniaco ó ácido sulfúrico, manteniéndose dos condiciones diferentes dependiendo del ensayo : sin control de pH con un rango entre 6,5 y 7,5, ó con control a 6,8 0,1 desde las 36 horas de fermentación. Entre las 40 y 50 horas de fermentación se adicionan 10 g/L de una solución de- ionona al 10% en aceite vegetal. Entre las 50 y 60 horas se adicionan 10 g/L de una solución de etoxiquina al 2,5% en aceite vegetal.

La fermentación se prolonga durante 100-140 horas, al cabo de las cuales se valora la producción de (3-caroteno : la extracción de-caroteno se realiza mediante cualquier método descrito de rotura celular que permita liberar el contenido intracelular, se solubiliza en cualquier solvente en el que resulte soluble como por ejemplo acetona. Su concentración se puede determinar mediante medida espectro- fotométrica, pero se prefiere el uso de cromatografía liquida (HPLC), mediante cualquiera de los métodos descri- tos en la bibliografía.

Los resultados de las pruebas realizadas con medio de cultivo con y sin lecitina y las dos condiciones de control de pH anteriormente citadas se recogen en la tabla siguiente : MEDIO DE pH BETA-CAROTENO GAMMA-CAROTENO CULTIVO(%) (% respecto de beta-caroteno) Sin lecitina Rango 6.5-100 5.6 7.5 Sin lecitina Control 6.8 95 3.2 desde 36h Con lecitina Rango 6.5-105 4.4 7.5 Con lecitina Control 6.8 105 2.1 desde 36h

Estos datos indican de forma clara que la incorpora- ción de lecitina al medio de cultivo incrementa la produc- ción de beta-caroteno (5% de incremento) y reduce el nivel relativo de gamma-caroteno (en un 43%). Cuando se combina con el control de pH, el efecto sobre la producción de gamma-caroteno es aún mayor (63%).

Ejemplo 3 Se cosechan 3 1 de caldo fermentación. El título del caldo es de 6 g de p-caroteno por litro. La biomasa de este caldo se recupera mediante filtración por Buchner, obte- niendo 1000 g de biomasa húmeda. La biomasa húmeda se re- suspende en 3 1 de isopropanol azeótropo 85/15 y se agita durante 30 minutos. La biomasa purificada se vuelve a recuperar mediante Buchner.

Esta biomasa se seca en estufa bajo vacío a tempera- tura inferior a 45° C y en un tiempo de 18 horas, hasta que

el contenido en disolventes residuales es del orden 1-2%.

Se obtienen 270 g de biomasa seca y purificada con un con- tenido de-caroteno equivalente a una riqueza del 6,5%.

La biomasa seca se muele en molino de martillos y tamiz de 1 mm obteniéndose un sólido con la misma riqueza específica y acondicionado para permitir la extracción con el disolvente.

La extracción se efectúa mezclando los 270 g de biomasa molida con 4500 ml de acetato de isobutilo a 70°C, manteniéndose en agitación durante 5 minutos. Se separa la biomasa agotada del disolvente rico filtrando por placa filtrante. La biomasa agotada se lava con 500 ml de acetato de isobutilo caliente sobre el propio filtro, mezclando los dos disolventes. El total de acetato de isobutilo rico se concentra bajo vacío y manteniéndose la temperatura por debajo de 45°C hasta reducir el volumen a 700 ml, con lo que ha cristalizado en parte el (3-caroteno. Para completar la cristalización y obtener un (3-caroteno mas puro, se añaden 2100 ml de isopropanol. La mezcla se mantiene en agitación entre 0-5°C y bajo nitrógeno durante 3 horas. Se filtra por Buchner, lavando los cristales con 25 ml de isopropanol sobre el Buchner. Se recogen los cristales y se secan, obteniéndose 14 g de cristales de (3-caroteno con una pureza del 96% medida en espectrofotómetro.

Ejemplo 4 Se cosecha una cantidad de caldo de fermentación del orden de 500 1, con un título en (3-caroteno de 5,5 g/1. Se mezcla directamente con 1500 1 de isopropanol azeótropo con agua 85-15 y se calienta la mezcla a 40°C. Después de mantener en agitación durante 30 min. se procede a separar la biomasa del líquido por centrifugación con un decanta-

dor. Se recogen del orden de 180 Kg. de biomasa húmeda purificada.

Esta biomasa se seca en secadero rotativo bajo vacío hasta conseguir un contenido en disolventes residuales del orden de 1-2%. La temperatura ha de ser inferior a 45°C y el tiempo del orden de 12-24 h. Se obtienen 45 Kg. de biomasa seca con un contenido P-caroteno equivalente a una riqueza específica del 5,9 %, pureza ligeramente inferior.

La biomasa seca se muele en molino con martillos y tamiz de 1 mm obteniéndose un sólido con la misma riqueza específica y acondicionado para permitir la extracción con el disolvente.

Como alternativa la biomasa húmeda se seca en un turbo secador flash (tipo jet mill) en cuyo caso no es necesaria la molienda.

La extracción se efectúa mezclando los 45 Kg. de sólido molido con 800 1 de Acetato de Isobutilo a 70°C y se mantiene en agitación durante 15 min. Se separa la biomasa agotada del disolvente rico por centrifugación con decan- tador. El total de Acetato de Isobutilo se concentra bajo vacío y manteniendo la temperatura por debajo de 45°C hasta reducir el volumen a 110 1, con lo que se ha cristalizado en parte el P-caroteno. Para completar la cristalización del ß-caroteno se añaden 330 1 de isopropanol. Se mantiene la mezcla en agitación mientras se enfría, durante 3 h a 0- 5°C. Se filtra por un Buchner recogiendo los cristales de beta-caroteno que se secan. Se obtienen 2,1 Kg de producto con una pureza de 96 % por espectrometría.

Descripción de la figura 1 A : Porcentaje de producción de (3-caroteno con lecitina (columna de la derecha) o sin ella (izquierda).

B : Porcentaje de producción de y-caroteno con lecitina (columna de la derecha) o sin ella (izquierda).