本発明について、実施例を示してさらに� ��しく説明するが、本発明はこの実施例に限� ��されるものではなく、当業者は本発明の範� ��を逸脱することなく、種々の変更、修正、� ��よび改変を行うことができる。なお、以下� ��実施例では、重量%は単に「%」と記載する� �

<実施例1>
 By+培地(0.1%ペプトン、0.1%酵母エキス、0.5%ブ ドウ糖、50%海水、1.0%寒天)を含む寒天平板培� ��で保存しているラビリンチュラ12B株細胞の1 白金耳(約1mg)を、10mLのF培地(50%海水、1%ペプ� �ン、1%酵母エキス、8%グルコース)に接種し、 30℃で72時間培養した。培養後の培養液の濁� �(OD ₆₀₀ )は約36であった。この培養液4mLを、Z1培地(F� �地からグルコースを除いた培地)25mLに接種し 、30℃で48時間、培養を行った。培養中は経� �的に培養液のOD ₆₀₀ を測定し、また培養終了後の細胞の乾燥重量 、乾燥細胞から抽出した全脂質の量、全脂質 中のTGの量、リンの量、リンの量から算出さ� ��るリン脂質量と全脂質に対する比、及び全� ��質脂肪酸中のDHAの含量を求めた(表1)。 

 1白金耳のラビリンチュラ12B株細胞は、乾 燥重量に換算して約0.5mgの菌体重量に相当す� ��。この菌体を10mLのF培地に接種し、72時間培 養した場合の菌体の乾燥重量は、OD値から換� ��して246mgとなる。一方、1白金耳のラビリン� ��ュラ12B株細胞を10mLのZ1培地へ直接接種して7 2時間30℃で培養したが、培養終了時のOD値か� ��換算した細胞の乾燥重量は16.3mgであり、F培 地で培養した場合の7%であった。このことか� ��、Z1培地を用いて直接培養を行ったときの� �ビリンチュラ12B株の増殖性は極めて低いと� �えられる。

 一方、F培地で72時間培養した培地4mLに含� ��れるラビリンチュラ12B株細胞の乾燥重量(換 算値)は90.6mgであるが、これを接種したZ1培地 で48時間培養して最終的に得られるラビリン� ��ュラ12B株細胞の乾燥重量(換算値)は235mgと、 2.6倍に増加していた。また、Z1培地を用いた4 8時間の培養において、細胞から抽出される� �脂質量は38.8mgから22.0mgへと約43%減少し、全� �質中のTG(脂肪酸量として)は66.8%から5.4%へと� ��少していた。

 これらの結果は、炭素源を含まないZ1培� �における培養によって、ラビリンチュラ12B� �細胞に蓄積されていた内在性脂質、特にTGが 、ラビリンチュラ12B株の増殖のために消費さ れたことを示唆していると考えられる。

 その一方、Z1培地で48時間培養後のラビリ ンチュラ12B株細胞の細胞内全脂質中のリン脂 質含量(リンの量からの換算値)は、5.0mgから14 .8mgへと約3倍増加し、全脂質中のリン脂質含� ��は12.9%から67.3%へと約5倍増加した。また、� �脂質中のDHAの含量は、F培地で培養した細胞� ��は44.7%であるのに対して、Z1培地で培養した 細胞では培養時間に応じて増加し、48時間培� ��した場合は約57%であり、ラビリンチュラ12B� ��細胞において、リン脂質の構成脂質として� ��DHA含量の上昇したことを示す。

<実施例2>
 実施例1と同様にラビリンチュラ12B株細胞を 培養したF培地の培養液4mLを、Z1培地のペプト ンと酵母エキスを2%としたZ2培地、及びZ1培地 のペプトンと酵母エキスを4%としたZ4培地各25 mLに接種し、30℃で48時間培養した。培養後の 濁度、回収された細胞の乾燥重量、乾燥細胞 から抽出した全脂質量、全脂質中のリン量、 リン量から算出されるリン脂質量とそれらの 比及びDHA含量を求めた(表1)。リン脂質の定量 はホスファチジルセリン(シグマ)を標準品と� ��て無機リン量を定量することにより求めた� ��

 その結果、ペプトン、酵母エキスの含量� ��高めることでラビリンチュラ12B株細胞の細� ��収量は増加し(Z1培地で235mg、Z2培地で243mg、Z 4培地で339mg)、Z4培地では、接種時(F培地で培� ��した培養液4mL中の細胞乾燥重量90.6mg)の約4� �となった。また、全培養終了後の細胞から� �収される全脂質量は、Z2培地とZ4培地でそれ� ��れ28.5mgと40.0mgであった。

 また、Z2培地、Z4培地で培養したラビリン チュラ12B株の細胞全脂質中のリン脂質含量は それぞれ14.9mg、20.8mgであり、Z1培地で培養し� ��場合の14.8mgよりも増加したが、割合はZ2培� �、Z4培地でそれぞれ52.3%及び52.0%であり、Z1培 地の場合の67.3%より低下した。また、全脂質� ��占めるTGの割合もZ培地のペプトンや酵母エ� ��スの濃度が上昇するにつれて増加した。

 すなわち、Z培地のペプトンや酵母エキス 濃度を上げることは、全脂質に対するリン脂 質の割合は低下させるが、細胞の増殖量の増 加によってリン脂質の生産量を高めることが 確認された。

<実施例3>
 Z1培地に、1mM K ₂ PO ₄ 、1mM K ₂ PO ₄ と1mMセリン、1mM K ₂ PO ₄ と1mMエタノールアミンをそれぞれ添加した培 地(以下、それぞれZ1p、Z1ps、Z1paと表す)を用� �し、実施例1と同様の培養を行って、培養後� ��濁度、回収された細胞の乾燥重量、乾燥細� ��から抽出した全脂質量、全脂質中のリン量� ��リン量から算出されるリン脂質量とそれら� ��比及びDHA含量を求めた。

 その結果、Z1psにおいてリン脂質量の増加 (15.2mg)が認められた。この結果は培地に無機� ��ン及びアミノ酸を添加することにより、リ� ��脂質の生産量を増加させることができるこ� ��が確認された。

 上記実施例1~3における分析結果を表1に示 す。

<実施例4>
1)BY+培地の寒天プレートに保存しているラビ� ��ンチュラ12B株の細胞の1白金耳分を500mLフラ� ��コ中の200mLのF培地に接種し、30℃、3日間前� ��養を行った。この前培養液100mLを、625mLのZ1� ��地/2.5L容積のジャーファーメンター(JF:東京� ��科器械社製)に加え、JFの上部空間(ヘッドス ペース)に対して通気(1000mL/分)しながら、30℃ 、攪拌速度300rpmで24時間培養した。この培養� ��件によって、消泡剤を使用することなく培� ��液の発泡による損失を抑制することができ� ��。培養液30mLを回収し、細胞の乾燥重量、全 脂質量、全リン脂質量を求め、全培養液当り に換算した。DHA含量の含量は、全脂質をメタ ノリシス後、GCにより求めた。また、容器を� ��ラスコとし、通気を行なわずに培養時間を4 8時間とした以外は上記と条件で培養したフ� �スコ培養を対照として用意した。

 上記の培養条件において、培養後の培養� ��の細胞濃度は5.7mg/mLとなり、時間当りのリ� �脂質量は565μg/mL/24時間であった。この値は� �対照(フラスコ培養:225μg/mL/24時間)の約2倍で� ��った。

2)JFの撹拌速度を500rpmとした他は上記1)と同 じ条件で培養を行ったところ、培養後の培養 液の細胞濃度は6.9mg/mLに達し、時間当りのリ� ��脂質量は642μg/mL/24時間となった。

3)JFの上部空間(ヘッドスペース)に加えて、 培地中にも通気(110mL/分)を行った他は、上記1 )と同じ条件で培養を行ったところ、培養後� �培養液の細胞濃度は7.7mg/mLとなり、リン脂質 量の生成速度は755μg/mL/24時間(対照であるフ� �スコ培養の約3倍)に上昇した。

 上記1)、2)、3)の結果を表2に示す。

<分析方法>
 上記の実施例における各種の分析は、次に� ��すとおりに行った。

1)全脂質の抽出
 乾燥菌体よりクロロホルム-メタノールを用 いた定法(非特許文献11)によって抽出される� �質を全脂質とした。全脂質中の脂肪と極性� �質を分離するために、全脂質サンプル100μg� �、シリカゲルプレート(メルク社製シリカゲ� ��G60)を用いて1次元薄層クロマトグラフィー(T LC)を行った。展開溶媒の組成はヘキサン-エ� �テル-酢酸(50:50:1、体積比)である。展開後、� ��リムリンをプレートに噴霧し、UV照射下で� �ポットの位置を確認した。TGの同定は標準物 質とRf値の比較により行った。

2)リン脂質の同定
 全脂質(1mg)を、クロロホルム-メタノール-水 (65:25:4,体積比)を展開溶媒Aとした1次元展開、 次いでクロロホルム-アセトン-メタノール-酢 酸-水(50:20:10:10:1,体積比)を展開溶媒Bとした2� �元展開による二次元TLCを行い、極性基に特� �的な試薬を吹きつけた。対象となるスポッ� �をプレートからかきとり、クロロホルム-メ� ��ノール混液を用いてリン脂質を抽出した。� ��ン脂質の同定は、TLCプレート上での検出試� ��との反応性、及び抽出物とリン脂質標準物� ��との異なる3種類の展開溶媒(展開溶媒A、B及 びクロロホルム-メタノール-アンモニア水(50: 20:10、体積比)からなる溶媒C)を用いた1次元TLC におけるRfの比較により行った。

 F培地で30℃、72時間培養後、及びZ1培地で 30℃、48時間培養後のラビリンチュラ12Bから� �出した全脂質の1次元TLCの結果を、図1に示す 。スポット1がTG、スポット2が遊離脂肪酸で� �る。原点(スポット3)が極性脂質である。TG、 遊離脂肪酸、極性脂質、及びそれ以外の中性 脂質の脂肪酸量を基にした割合を表2に示す� �

 F培地からZ培地への移行によりTGが減少し 、遊離脂肪酸と極性脂質の割合が増加した。 Z2培地、Z4培地で培養した場合もZ1培地で培養 した場合と同様、TGの減少、極性脂質の増加� ��傾向を示したが、Z1培地の場合ほど顕著で� �なかった。Z2培地を用いて培養した細胞の場 合を除いて極性脂質のDHA含量はTGのDHA含量を� ��回っていた。

 全脂質の2次元TLCの結果を図2に示す。図2aは プレートに蛍光物質(プリムリン)を噴霧した� ��に紫外線照射下で撮影したものであり、図2 bは図2aを模式的に図示したものである。各ス ポットには図2bに示すように番号を付した。� ��スポットを与える脂質の検出試薬に対する� ��応性を調べた。脂質1、2、3、4、6、7、8、9� �Dittmer試薬に陽性であり、リン脂質であるこ� ��がわかった。これらの脂質の他の検出試薬� ��対する反応性から、脂質2はホスファチジル イノシトール(PI)、脂質3と4はホスファチジル コリン(PC1とPC2)、脂質6と7はホスファチジル� �タノールアミン(PE1とPE2)と同定された。この 結果は、それぞれの標準物質とのR _f 値の比較によって確認された。PC、PEともに2� ��のスポットを与えるのは、構成する脂肪酸( 特にDHAの含量)が異なるためであると考えら� �る。他のリン脂質を含む極性脂質は未同定� �ある。0は原点をあらわし、スポット5と番号 のないスポットはDittmer試薬に対して陰性の� �質である。

3)リン脂質の組成とDHA含量
 Z1培地で30℃48時間培養後のラビリンチュラ1 2B株細胞から抽出した全脂質に対して二次元T LCを行った後、Z1培地由来の脂質の全スポッ� �をかきとり、Istokovicsらの方法 (Can.J.Microbiol. 、1988年、第44巻、第1051-1059頁)に従ってリン� �定量した。全リン脂質中、PCは61.3%、PEは11.9% 、PIは12.5%、その他が14.6%であった。PCとPEに� �いて脂肪酸量を基にした場合、PC1とPC2はそ� �ぞれ46.0%、54.0%であり、PE1とPE2はそれぞれ46.7 %、53.3%であった。

 さらに、既知量(200μg)の内部標準物質と� �るheneicosanoic acidとともに定法によってメタ� ��リシスし、脂肪酸メチルエステルをGCによ� �分析した。PC1とPC2は全脂肪酸の39.2%及び66.8%� ��DHA、PE1とPE2は全脂肪酸の23.0%、33.3%がDHAであ った。PIのDHA含量は20.9%であった。このこと� �らDHAがPC、特にPC2の構成脂質であることが分 かった。計算で求めた全PC、全PEのDHA含量は� �れぞれ54.0%と28.4%であった。以上の結果を表3 に示す。なお、表3のリン脂質のDHA含量の値� �、Z1培地で培養した細胞に由来する全脂質の DHA含量56.5%(表1)や極性脂質のDHA含量56.6%、TGの DHA含量(52.6%)に比べると低いが、これはTLCあ� �いはGCの過程で多価不飽和脂肪酸の分解が起 きているためである。