CHAMPIGNON FILAMENTEUX

Domaine technique

L'invention est relative à un procédé de production de cellulases par un champignon filamenteux, nécessaires pour l'hydrolyse enzymatique de biomasse lignocellulosique mise en oeuvre, par exemple, dans les procédés de production des jus sucrés dits de seconde génération (2G). Ces jus sucrés peuvent être utilisés pour produire d’autres produits par voie chimique ou voie biochimique/fermentaire (par exemple, des alcools comme des

biocarburants du type éthanol, ou encore du butanol ou d’autres molécules, par exemple des solvants tels que l’acétone et d’autres molécules biosourcées...). Les cellulases peuvent également être employés dans d’autres procédés, notamment dans l’industrie chimique, papetière ou textile.

La mise au point de procédés économiquement viables de production de biocarburants de 2ème génération (dite « 2G »), si l’on prend cet exemple particulier de mise en oeuvre, fait l’objet de nombreuses études. Ces derniers sont produits, notamment, à partir de substrats ligneux comme différents bois (feuillus et résineux, miscanthus, ou « TCR », qui est l’acronyme pour Taillis à Croissance Rapide), des coproduits issus de l’agriculture (pailles de blé, pailles de riz, rafles de maïs, etc...) ou d’autres industries agroalimentaires, papetières, etc... Ils posent moins de problèmes de concurrence d'usage des terres agricoles avec l'alimentaire, par rapport aux biocarburants dits de première génération qui sont produits à partir de canne à sucre, maïs, blé ou betterave.

La biomasse lignocellulosique se caractérise par une structure complexe constituée de trois principales fractions: la cellulose (35 à 50%), qui est un polysaccharide essentiellement constitué d'hexoses ; l'hémicellulose (20 à 30%), qui est un polysaccharide essentiellement constitué de pentoses ; et la lignine (15 à 25%), qui est un polymère de structure complexe et de haut poids moléculaire, composé d'alcools aromatiques reliés par des liaisons éther. Ces différentes molécules sont responsables des propriétés intrinsèques de la paroi végétale et s'organisent en un enchevêtrement complexe. Parmi les trois polymères de base qui intègrent la biomasse lignocellulosique, la cellulose et l'hémicellulose sont ceux qui permettent la production de jus sucrés 2G.

De façon classique, le procédé de sa transformation en biocarburant de type éthanol comprend plusieurs étapes : Le prétraitement permet de rendre la cellulose accessible aux enzymes qui sont des cellulases. L'étape d'hydrolyse enzymatique permet la transformation de la cellulose en sucres, comme le glucose, qui sont ensuite transformés en éthanol lors de l'étape de fermentation par en général la levure Saccharomyces cerevisiae. Enfin l'étape de distillation va permettre de séparer et récupérer l'éthanol du moût de fermentation. A noter, comme évoqué plus haut, que l’on peut aussi choisir d’arrêter le procédé à l’obtention des sucres de type glucose, afin de les valoriser en tant que tels, ou encore les traiter différemment pour obtenir d’autres alcools ou molécules biosourcées.

Technique antérieure

Les différentes études technico-économiques démontrent que la réduction du coût des cellulases est un des points-clés des procédés de production biologique d'éthanol à partir des matières premières lignocellulosiques. A l'heure actuelle, les cellulases industrielles sont principalement produites par un champignon filamenteux, Trichoderma reesei, en raison de son fort pouvoir de sécrétion.

Depuis les années 1970, la transformation de matériaux lignocellulosique en éthanol, après hydrolyse des polysaccharides constitutifs en sucres fermentescibles, a fait l'objet de nombreux travaux. On peut citer par exemple les travaux de référence du National Renewable Energy Laboratory (Process Design and Economies for Biochemical Conversion of Lignocellulosic Biomass to Ethanol, Humbird et al., NREL/TP-5100-57764, May 201 1 ).

Les matériaux ligno-cellulosiques sont des matériaux cellulosiques, c'est-à-dire constitués à plus de 90% poids de cellulose, et/ou lignocellulosique, c'est-à-dire constitués de cellulose, d’hémicelluloses, qui sont des polysaccharides essentiellement constitués de pentoses et d'hexoses ainsi que de lignine, qui est une macromolécule de structure complexe et de haut poids moléculaire, à base de composés phénoliques.

Le bois, les pailles, les rafles de maïs sont les matériaux ligno-cellulosiques les plus utilisés, mais d'autres ressources, cultures forestières dédiées, résidus de plantes alcooligènes, sucrières et céréalières, produits et résidus de l'industrie papetière et des produits de transformation des matériaux ligno-cellulosiques sont utilisables. Ils sont constitués pour la plupart d'environ 35 à 50 % de cellulose, de 20 à 30 % d'hémicellulose et de 15 à 25 % de lignine.

Le procédé de transformation biochimiques des matériaux ligno-cellulosiques en éthanol comprend une étape de prétraitement physico-chimique, suivie d'une étape d'hydrolyse enzymatique utilisant un cocktail enzymatique, d'une étape de fermentation éthanolique des sucres libérés, la fermentation éthanolique et l’hydrolyse enzymatique pouvant être conduites simultanément, et d'une étape de purification de l'éthanol. Le cocktail enzymatique est un mélange d’enzymes cellulolytiques (également appelées cellulases) et/ou hémicellulolytiques. Les enzymes cellulolytiques présentent trois grands types d'activités : endoglucanases, exoglucanases et cellobiases, ces dernières étant également appelées b-glucosidases. Les enzymes hémicellulolytiques présentent notamment des activités xylanases.

L'hydrolyse enzymatique est efficace et s'effectue dans des conditions douces. En revanche, le coût des enzymes reste très élevé, représentant de 20 à 50% du coût de transformation du matériau lignocellulosique en éthanol. De ce fait, beaucoup de travaux ont été conduits pour réduire ce coût : l’optimisation de la production d'enzymes d'abord, en sélectionnant les microorganismes hyperproducteurs et en améliorant les procédés de production desdites enzymes, la diminution de la quantité d'enzymes en hydrolyse ensuite, en optimisant l’étape de prétraitement, en améliorant l'activité spécifique de ces enzymes, et en optimisant la mise en œuvre de l’étape d’hydrolyse enzymatique.

De nombreux travaux se sont attachés à comprendre les mécanismes d'action et d'expression du cocktail enzymatique. Le but est de faire sécréter le cocktail le plus approprié à l'hydrolyse des matériaux ligno-cellulosiques en modifiant les microorganismes.

Trichoderma reesei est le microorganisme le plus utilisé pour la production de cellulases. Les souches sauvages ont la faculté d'excréter, en présence d'un substrat inducteur, la cellulose par exemple, le complexe enzymatique considéré comme le mieux adapté à l'hydrolyse de la cellulose. Les enzymes du complexe enzymatique contiennent trois grands types d'activités : les endoglucanases, les exoglucanases et les cellobiases et d'autres protéines possédant des propriétés indispensables à l'hydrolyse des matériaux ligno-cellulosiques sont également produites par Trichoderma reesei, les xylanases par exemple. La présence d'un substrat inducteur est indispensable à l'expression des enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques. La nature du substrat carboné a une forte influence sur la composition du complexe enzymatique. C'est le cas des xyloses, qui, associé à un substrat carboné inducteur comme la cellulose ou le lactose, permet d'améliorer significativement l'activité dite xylanase. La régulation des gènes de cellulases sur différentes sources de carbone a été étudiée dans le détail. Ils sont induits en présence de cellulose, de ses produits d'hydrolyse , comme le cellobiose, ou de certains oligosaccharides comme le lactose ou le sophorose (cf. Ilmén et al., 1997; Appl. Environ. Microbiol. 63: 1298-1306.)

Les techniques de génétique classique par mutation ont permis la sélection de souches de Trichoderma reesei hyperproductrices de cellulases telles que les souches MCG77 (Gallo - brevet US 4,275,167), MCG 80 (Allen, A.L. et Andreotti, R.E., Biotechnol- Bioengi 1982, 12, 451 -459 1982), RUT C30 (Montenecourt, B. S. et Eveleigh, D.E., Appl. Environ. Microbiol. 1977, 34, 777-782) et CL847 (Durand et al, 1984, Proc. Colloque SFM "Génétique des microorganismes industriels". Paris. H. HESLOT Ed, pp 39-50).

Le procédé de production de cellulases par Trichoderma reesei a fait l'objet d'améliorations importantes en vue d’une extrapolation à l'échelle industrielle. Pour obtenir de bonnes productivités en enzymes, il est nécessaire d'apporter une source de carbone rapidement assimilable pour la croissance de Trichoderma reesei, et un substrat inducteur qui permet l'expression des cellulases et la sécrétion dans le milieu de culture. La cellulose peut jouer ces deux rôles ; cependant, elle est difficile d'utilisation au stade industriel et il a été proposé de la remplacer par des sources de carbone solubles, de type glucose, xylose ou lactose, le lactose jouant également le rôle de substrat inducteur. D'autres sucres solubles comme le cellobiose et le sophorose ont été décrits comme inducteurs, mais ils sont relativement onéreux pour être utilisés au stade industriel. On a aussi constaté que les productions de cellulases par Trichoderma reesei, avec des substrats solubles, sont très inférieures à celles obtenues sur cellulose en "batch". Ceci est dû à l'effet répresseur des sucres facilement assimilables, à forte concentration. L'alimentation en continu en mode fed-batch des substrats carbonés solubles a permis de lever la répression catabolique en limitant la concentration résiduelle dans les cultures et en optimisant la quantité de sucre permettant d'obtenir un meilleur rendement et une meilleure productivité enzymatique.

Le brevet FR-B-2 555 603 propose un protocole qui permet d'aboutir à une concentration en protéines de l'ordre de 35 à 40 g/L avec une productivité de l'ordre de 0,2 g/L/h et qui consiste en deux étapes : une première étape de croissance en mode "batch" où il est nécessaire d'apporter une source de carbone rapidement assimilable pour la croissance de Trichoderma reesei, puis une étape de production en mode "fed-batch" utilisant un substrat inducteur (exemple: le lactose) qui permette l'expression des cellulases et la sécrétion dans le milieu de culture. Le flux optimal appliqué est compris entre 35 et 45 mg.g Vh ¹ (milligrammes de substrat inducteur par milligramme de biomasse et par heure). On peut également citer le brevet EP-B-2 744 899 qui en propose une amélioration en sélectionnant notamment un bioréacteur ayant un coefficient de transfert volumétrique d’oxygène KLa particulier associé à une sélection particulière à la fois de la concentration en substrat carboné de croissance dans la première étape et d’un niveau de flux limitant de source de carbone dans la seconde étape.

Il s’est avéré, cependant, qu’il pouvait y avoir la formation d’une mousse, lors de l’étape de croissance plus particulièrement. Il peut s’agir d’une mousse dite « sèche », à savoir être constitutive d’une dispersion de gaz dans une phase liquide, et qui a donc une densité proche de celle d’un gaz et qui se forme en partie haute du bioréacteur. Il peut aussi s’agir d’une mousse dite « humide », qui est une mousse d’extension/d’augmentation du volume réactionnel dû à l’emprisonnement de bulles de gaz (d’air) dans le liquide. Sa densité est plus élevée que la mousse sèche (car son ratio gaz/liquide est plus faible). Qu’il s’agisse de l’une, de l’autre, ou d’un mélange de ces deux types de mousse, elles présentent un vrai problème de conduite industrielle du procédé.

En effet, pour ne citer que certains de leurs inconvénients, leur présence complique sérieusement la régulation du pH qui est usuellement réalisée lors de l’étape de croissance, puisque la mesure du pH devient plus difficile à réaliser / moins fiable en présence de mousse, et qu’en outre l’ajout de l’agent régulateur de pH pour maintenir le pH à la valeur voulue est plus compliqué, car il est plus difficile de contrôler sa répartition dans l’ensemble du milieu réactionnel. En outre, il est nécessaire d’utiliser à moindre capacité les bioréacteurs, pour laisser un espace suffisant au- dessus du milieu réactionnel liquide, pour éviter tout débordement.

Plusieurs solutions ont déjà été proposées pour lutter contre la formation de mousse. Une première solution a consisté à ajouter des agents anti-mousse au milieu réactionnel lors de l’étape de croissance. L’utilisation d’agents anti-mousse est certes efficace pour remettre en suspension liquide de la mousse, mais elle n’est pas dénuée d’inconvénients. Pour en citer quelques-uns : la remise en suspension liquide de la mousse entraîne une forte augmentation du pH, perturbant largement la régulation de pH qu’il faut mener, voire un basculement non voulu de l’étape de croissance à l’étape de production. Ceci peut être provoqué par l’apport massif en réactifs (sucres) bloqués en surface du fait de la mousse, qui, lorsqu’elle s’effondre sous l’effet de l’anti-mousse, viennent brutalement en contact avec la biomasse en grande quantité. L’ajout d’agents anti-mousse provoque également une baisse de la concentration d’oxygène dissous dans le milieu (car il fait coalescer les bulles d’air), ce qui peut avoir un impact sur les microorganismes qui sont aérobies stricts ou sur leur productivité. En outre, ces agents sont souvent à base d’huiles, qui ne s’éliminent pas toutes seules : une fois la production d’enzymes terminée, si l’on effectue la séparation entre les enzymes et le reste de la biomasse (les champignons), notamment par des technologies conventionnelles utilisant des moyens de filtration par membrane, ces agents anti-mousse sont susceptibles de colmater les membranes, et il peut donc être nécessaire d’avoir à ajouter une étape de séparation de ces agents une fois la production terminée, sans laquelle on aboutit à des mauvaises performances de séparation. Leur ajout présente, en outre, un coût de production supplémentaire.

Une autre solution a été envisagée dans la demande de brevet EP-1 204 738 : il s’agit de lutter contre ce phénomène de moussage en modifiant génétiquement la souche de champignon utilisée, afin d’éviter que la souche ne sécrète des hydrophobines, et notamment les HFBII, jugées responsables de la formation de mousse. Cependant, cette solution est lourde à mettre en oeuvre, puisqu’elle nécessite de procéder à ces modifications génétiques sur chacune des souches d’intérêt.

L’invention a alors pour but de mettre au point un procédé de production d’enzymes amélioré, évitant ou limitant tout au moins le phénomène de moussage, sans engendrer certains au moins des inconvénients précités, et notamment sans engendrer de complication dans la conduite du procédé ni contraindre à réaliser des modifications génétiques spécifiques sur les microorganismes.

Résumé de l’invention

L’invention a tout d’abord pour objet un procédé de production d’enzymes par une souche appartenant à un champignon filamenteux, ledit procédé comprenant deux étapes :

(a) une première étape de croissance des champignons, en présence d'au moins un substrat carboné de croissance, dans un bioréacteur agité et aéré en phase batch, à un pH inférieur ou égal à 4,6 ;

(b) une deuxième étape de production d'enzymes, à partir du milieu de culture obtenu à la première étape (a), en présence d'au moins un substrat carboné inducteur, à un pH inférieur ou égal à 4,6.

On choisit donc selon l’invention de réaliser non seulement la deuxième étape de production d’enzymes à un pH relativement acide, mais également la première étape de croissance, jusque-là plutôt réalisée à des pH moins acides, de par exemple au moins 5. Alors qu’on se serait attendu à ce qu’opérer la première étape à un pH aussi acide conduirait à un ralentissement de la croissance des microorganismes, il s’est avéré qu’il n’en a rien été, et, qu’en outre, de façon tout-à-fait surprenante, on évitait ou limitait grandement l’apparition de mousse lors de cette étape. En abaissant ainsi le pH lors de l'étape de croissance, on règle le problème du moussage sans impacter le rendement de production d’enzymes au final.

De préférence, on régule le pH de l’étape de croissance pour le maintenir dans la gamme requise. De préférence, on régule aussi le pH de l’étape de production. La régulation se fait de façon connue, notamment par suivi du pH en continu ou séquentiellement avec des capteurs ad hoc, et ajout (d’acide ou d base en cours d’étape pour rester à la consigne. Alternativement on peut contrôler le pH de l’une et/ou l’autre des étapes en utilisant une solution tampon.

La solution de l’invention est étonnamment simple, puisque rien ne laissait présager que modifier, vers une plus forte acidité, dans des proportions raisonnables (sans descendre, de préférence en dessous de 3,5 ou 3,6 ou 3,7), le pH lors de la croissance allait avoir des conséquences sur le phénomène complexe du moussage. Elle est très avantageuse en termes de conduite de production industrielle : - le bioréacteur dans lequel l’étape de croissance est réalisée est tout-à-fait équipé pour réguler le pH à ces valeurs, il n’y donc aucune difficulté à mettre en œuvre l’invention avec des bioréacteurs conventionnels ; - puisqu’il n’y a pas ou très peu de mousse formée, on peut calculer au plus juste la taille du bioréacteur, et augmenter son volume utile (il n’est plus nécessaire de prévoir un volume supplémentaire « perdu » destiné à contenir d’éventuels débordements de mousse excessifs) ;

- il n’est plus nécessaire d’ajouter des agents anti-mousse, ou on peut tout au moins en réduire très fortement la teneur, on évite ainsi un additif qu’il est ensuite difficile de séparer ;

- il est plus facile de piloter le bioréacteur, puisque, en l’absence de mousse, la régulation de pH, l’ajout contrôlé de substrat carboné etc ... sont grandement facilités.

De préférence, le pH à l’étape (a) de croissance et/ou à l’étape (b) de production est d’au moins 3,5, et notamment inférieur ou égal à 4,4, il est notamment compris entre 3,5 et 4,4 ou entre 3,8 et 4,4: on vient ainsi rapprocher le pH de l’étape de croissance du pH de l’étape de production.

De préférence, le pH en étape de croissance est maintenu à au moins 3,6, notamment au moins 3,7 ou au moins 3,8.

De préférence, le pH en étape de croissance est maintenu à au plus 4,4.

Selon un mode de réalisation, le pH à l’étape (a) de croissance est sensiblement identique au pH à l’étape (b) de production. Si, notamment, les deux étapes sont conduites dans le même bioréacteur, choisir les mêmes pH simplifie ainsi la régulation du pH sur toute la durée de procédé. On peut ainsi avoir la même consigne de régulation sur les deux étapes ou utiliser la même solution tampon.

Selon un autre mode de réalisation, le pH à l’étape (b) de production peut être choisi plus acide que le pH à l’étape (a) de croissance, par exemple d’au moins 0,3 à 0,6, notamment un pH plus acide (plus faible donc) de 0,4 à 0,6.

Avantageusement, le pH, lors de l’étape (a) de croissance, est régulé par ajout contrôlé d’un composé azoté, notamment de l’ammoniaque, qui joue à la fois le rôle d’agent basique et d’agent source d’azote pour la croissance des microorganismes. Avantageusement, l’étape (b) de production s’opère en mode batch, fed-batch ou continu ou selon plusieurs de ces modes successivement.

Optionnellement, le procédé selon l’invention peut comprendre une étape intermédiaire (c) entre l’étape (a) et l’étape (b), cette étape intermédiaire (c) étant une étape de dilution du milieu de culture obtenu à l’étape (a) de croissance.

En outre, l’étape (a) de croissance et l’étape (b) de production peuvent être réalisées dans le même bioréacteur ou dans deux réacteurs distincts, avec transfert du milieu réactionnel d’un réacteur à l’autre. Le premier cas est le plus simple, avec un seul réacteur on évite d’avoir à transférer le milieu réactionnel. Le second cas permet d’adapter précisément les caractéristiques et équipements de chacun des bioréacteurs en fonction des besoins de chacune des étapes.

De préférence, lors de la première étape (a) de croissance, la concentration en substrat carboné de croissance est choisie comprise entre 15 et 60 g/l.

De préférence, la deuxième étape (b) de production est opérée avec un flux limitant de substrat carboné inducteur, notamment compris entre 30 et 140 mg.g Vh ¹ , (c’est-à-dire entre 30 et 140 grammes par gramme de biomasse et par heure), de préférence entre 35 et 45 mg.g Vh ¹ , et de préférence avec une solution aqueuse de substrat carboné inducteur à une concentration comprise entre 200 et 600 g/l.

La souche utilisée dans le procédé selon l’invention est de préférence une souche de Trichoderma reesei ou de Trichoderma reesei modifiée par mutation sélection ou recombinaison génétique. Mais il est inutile de la modifier génétiquement dans le but d’empêcher la formation d’hydrophobines lors de sa croissance. Il peut s’agir notamment des souches CL847, RutC30, MCG77, ou MCG80 mentionnées plus haut.

Le procédé selon l’invention produit de préférence des enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques (des cellulases).

Avantageusement, le procédé selon l’invention est opéré en l’absence d’agents anti-mousse, notamment lors de l’étape (a) de production. Ne plus avoir recours à des angents anti mousse est très avantageux économiquement. En outre, l’ajout de ces agents peut entraîner des problèmes de limitation de transfert d’oxygène de l’air fourni au bioréacteur vers la phase liquide comprenant les champignons, ce qui nuit à leur croissance. Ces agents peuvent en outre poser des problèmes lors de la filtration du milieu de culture en fin d’étape de production.

L’invention a également pour objet l’utilisation des enzymes obtenues par le procédé décrit précédemment pour l’hydrolyse enzymatique de biomasse cellulosique/hémicellulosique terrestre ou marine.

L’invention sera ci-après décrite plus en détails à l’aide d’exemples de réalisation non limitatifs.

Liste des figures

La figure 1 représente des photos des bioréacteurs utilisés selon des exemples conformes et non conformes au procédé de l’invention avec une souche, photos prises pendant l’étape de croissance du procédé.

La figure 2 représente des photos des bioréacteurs utilisés selon des exemples conformes et non conformes au procédé de l’invention avec une souche différente, photos prises pendant l’étape de croissance du procédé.

La figure 3 est un graphe représentant la concentration en gramme par litre de biomasse et de protéines produite selon un exemple comparatif.

La figure 4 est un graphe représentant la concentration en gramme par litre de biomasse et de protéines produite selon un exemple de réalisation de l’invention.

La figure 5 est un graphe représentant la concentration en gramme par litre de biomasse et de protéines produite selon un exemple de réalisation de l’invention.

Description des modes de réalisation

La présente invention a mis au point un procédé de production d’enzymes, notamment de cellulases, permettant d’éviter l’apparition de la mousse. Il est apparu de manière surprenante que le fait de travailler lors de la croissance à des bas pH (inférieurs à 4,6 notamment inférieurs ou égaux à 4,4) ne ralentit pas la croissance du microorganisme et permet d’éviter l’apparition de la mousse.

Le mode de conduite du procédé comporte 2 phases:

- Une phase en mode batch qui dure de préférence entre 30 et 50 heures, avec un pH avantageusement inférieur ou égal à 4,4 et avec une concentration en substrat carboné de 15 à 60 g/L préférence

- Une phase en mode fed-batch qui dure de préférence entre 100 et 200 heures, notamment entre 100 et 150 heures, avantageusement à un pH inférieur ou égal à 4,4 également, et avec un flux limitant de source de carbone de 35 à 140mg.g ¹ .h ¹ , et de préférence entre 35 et 45 mg.g Vh ¹ . Les souches industrielles utilisées appartiennent à l'espèce Trichoderma reesei, modifiées pour améliorer les enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques par les procédés de mutation-sélection, comme par exemple la souche CL847 ((un de ces procédés est notamment décrit dans le brevet US 4,762,788). Des souches améliorées par les techniques de recombinaison génétique peuvent être également utilisées. Ces souches sont cultivées en fermenteurs agités et aérées dans des conditions compatibles avec leur croissance et la production des enzymes.

Les sources de carbone principales peuvent être des sucres solubles comme le lactose, le glucose ou le xylose :

Le substrat carboné de croissance est choisi de préférence parmi le lactose, le glucose, le xylose, les résidus obtenus après fermentation éthanolique des sucres monomères des hydrolysats enzymatiques de biomasse cellulosique, et/ou un extrait brut de pentoses hydrosolubles provenant du prétraitement d'une biomasse cellulosique.

Le substrat carboné inducteur est choisi de préférence parmi le lactose, le cellobiose, le sophorose, les résidus obtenus après fermentation éthanolique des sucres monomères des hydrolysats enzymatiques de biomasse cellulosique, et/ou un extrait brut de pentoses hydrosolubles provenant du prétraitement d'une biomasse cellulosique.

Ce type de résidu /extrait peut donc être utilisé aussi comme source de carbone totale, c'est- à-dire à la fois pour la croissance du microorganisme et l'induction du système d'expression. Cette source de carbone est utilisable plus particulièrement par les souches améliorées génétiquement et notamment les souches recombinantes.

Les conditions opératoires de pH et de température, pour l’étape de croissance et l’étape de production, sont les suivantes :

- pH entre 3,5 et 4,4 ;

- température entre 20 et 35 °C. On choisit de préférence un pH de 4,4 et une température de 27°C durant la phase de croissance et un pH de 4 ou de 4,4 également, et une

température de 25°C durant la phase de production en mode fed-batch.

La vvm (taux d'aération exprimé en volume d'air par volume de milieu réactionnel et par minute) appliquée durant le procédé est comprise entre 0,3 et 1 ,5 min ¹ et la rpm (vitesse de rotation) doit permettre de réguler la pression en 0 ₂ entre 20% et 60%. On choisit de préférence une aération de 0,3 à 0,5 vvm et une agitation permettant de réguler la pression en 0 ₂ à 30 % ou 40%.

Selon sa nature, le substrat carboné choisi pour l'obtention de la biomasse est introduit dans le fermenteur avant stérilisation, ou est stérilisé séparément et introduit dans le fermenteur après stérilisation. La concentration en substrat carboné est comprise entre 200 et 600 g/L selon le degré de solubilité des substrats carbonés utilisés (notamment en ce qui concerne le le substrat inducteur).

Exemples

Une préculture des souches est réalisé dans 2 fioles de Fernbach avec un volume utile de 500 mL, qui sont ensemencées avec chacune un tube de spores de T reesei TR3002 et CL847. Elles sont placées dans un incubateur de référence commerciale INFORS HT Multitron à 30 °C, avec une agitation orbitale de 150 rpm pendant 72 heures. Elles sont ensuite dispatchées sur 8 fioles stérilisées à vide (80 mL par fiole) qui serviront à ensemencer chaque fermenteur/bioréacteurs.

Les conditions opératoires de production de cellulases à partir des souches obtenues en fin de préculture sont les suivantes :

Les expériences comportent deux phases .

- une phase de croissance sur glucose à une température de 27 °C et un pH (régulé par de l'ammoniaque 5,5 M), allant de 4,0 à 5,5 selon les expériences. L'aération est fixée à 0,2 L/min (0,3 vvm) et la consigne de P 0 est fixée à 40 %. Elle est maintenue constante grâce à l'agitation,

- une phase de production d'enzymes induite par un flux limitant de la solution de fed-batch après 30 heures de culture. La solution est injectée avec un débit constant de 0,5 g de substrat carboné par heure. La consigne de température est modifiée à 25 °C. Cette phase dure entre 160 et 220 heures selon la disponibilité du substrat et le déroulement de l’expérience.

Un prélèvement est réalisé chaque jour avec suivi du poids sec, des concentrations en glucose, lactose, galactose, xylose. Des surnageants de culture de 5 mL sont stockés à 4 °C pour les dosages enzymatiques et des protéines réalisés en fin de culture.

Exemple 1 :

L’exemple 1 est réalisé à partir de la souche TR3002. Cette souche est décrite dans les publications suivantes : Ben Chaabane F, Jourdier E, Licht R, Cohen C and Monot F (2012)

« Kinetic characterization of Trichoderma reesei CL847 TR3002: an engineered strain producing highly improved cellulolytic cocktail ». Journal of Chemistry and Chemical

Engineering 6 (2), 109-1 17, et Ayrinhac C, Margeot A, Ferreira NL, Ben Chaabane F, Monot F, Ravot G, Sonet J.-M and Fourage L (201 1 )“Improved saccharification of wheat straw for biofuel production using an engineered secretome of Trichoderma reesei”. Organic Process Research and Development 15 (1 ), 275 - 278. - La phase de croissance est réalisée à pH 4 à 27°C et avec une concentration de glucose de 15 g/L

- la phase de production est réalisée à pH 4 à 25°C, avec une concentration en lactose de 220 g/L, correspondant à un débit spécifique de lactose de fed-batch de 45 mg par gramme de biomasse et par heure.

Exemple 2 : (comparatif)

L’exemple 2 est réalisé à partir de la souche TR3002 .

- La phase de croissance est réalisée à pH 4, 8 à 27°C et avec une concentration de glucose de 15 g/L

- la phase de production est réalisée à pH 4,8 à 25°C, avec une concentration en lactose de 220 g/L, correspondant à un débit spécifique de lactose de fed-batch de 45 mg par gramme de biomasse et par heure.

Exemple 3 : (comparatif)

L’exemple 3 est réalisé à partir de la souche TR3002.

- La phase de croissance est réalisée à pH 5,5 à 27°C et avec une concentration de glucose de 15 g/L

- la phase de production est réalisée à pH 5,5 à 25°C, avec une concentration en lactose de 220 g/L, correspondant à un débit spécifique de lactose de fed-batch de 45 mg par gramme de biomasse et par heure.

Exemple 4 :

L’exemple 4 est réalisé à partir de la souche TR3002 .

- La phase de croissance est réalisée à pH 4,4 à 27°C et avec une concentration de glucose de 15 g/L

- la phase de production est réalisée à pH 4,4 à 25°C, avec une concentration en lactose de 220 g/L, correspondant à un débit spécifique de lactose de fed-batch de 45 mg par gramme de biomasse et par heure.

Exemple 5 :

L’exemple 5 est réalisé à partir de la souche CL847. Cette souche est décrite dans les publications suivantes : - Jourdier E, Poughon L, Larroche C, Monot F and Ben Chaabane F (2012) « A new stoichiometric miniaturizationstrategy for screening of industrial microbial strains: application to cellulase hyper-producing Trichoderma reesei strains ». Microbial Cell Factories 1 1 , 70 (Impact Factor : 3,60), et Jourdier E, Ben Chaabane F, Poughon L,

Larroche C and Monot F (2012)“Simple Kinetic Model of Cellulase Production by Trichoderma Reesei for Productivity or Yield Maximization”. Chemical Engineering

Transactions 27, 313-318.

- La phase de croissance est réalisée à pH 4 à 27°C et avec une concentration de glucose de 15 g/L

- la phase de production est réalisée à pH 4 à 25°C, avec une concentration en lactose de 220 g/L, correspondant à un débit spécifique de lactose de fed-batch de 45 mg par gramme de biomasse et par heure.

Exemple 6 :

L’exemple 6 est réalisé à partir de la souche CL847.

- La phase de croissance est réalisée à pH 4, 4 à 27°C et avec une concentration de glucose de 15g/L

- la phase de production est réalisée à pH 4,4 à 25°C, avec une concentration en lactose de 220 g/L, correspondant à un débit spécifique de lactose de fed-batch de 45 mg par gramme de biomasse et par heure.

Exemple 7 (comparatif)

L’exemple 7 est réalisé à partir de la souche CL847 .

- La phase de croissance est réalisée à pH 4,8 à 27°C et avec une concentration de glucose de 15 g/L

- la phase de production est réalisée à pH 4,8 à 25°C, avec une concentration en lactose de 220 g/L, correspondant à un débit spécifique de lactose de fed-batch de 45 mg par gramme de biomasse et par heure.

Exemple 8 : (comparatif)

L’exemple 8 est réalisé à partir de la souche CL847 .

- La phase de croissance est réalisée à pH 5,5 à 27°C et avec une concentration de glucose de 15 g/L

- la phase de production est réalisée à pH 5,5 à 25°C, avec une concentration en lactose de 220 g/L, correspondant à un débit spécifique de lactose de fed-batch de 45 mg par gramme de biomasse et par heure. L’observation visuelle de l’apparition ou de la non-apparition de mousse donne les résultats regroupés dans le tableau 1 ci-dessous

Tableau 1

Les figures 1 et 2 représentent des photographies des bioréacteurs des exemples 1 ,2, 3, 5, 6, 7, 8 après 24 h : (la référence 1 correspond à l’exemple 1 , et ainsi de suite).

Du tableau 1 et des figures 1 et 2, on constate que, quelle que soit la souche utilisée (CL847 ou TR3002), un pH supérieur ou égal à 4,8 en phase de croissance entraîne la production de mousse dès 24 heures. Par la suite, cette mousse n’est pas contrôlable, ce qui se traduit par l’arrêt des fermentations à un pH aussi élevé, car il y a débordement ou sporulation. Les cultures avec un pH inférieur ou égal à 4,4 n’ont, quant à elles, pas moussé.

Pour vérifier si la sélection du pH de croissance à des valeurs d’au plus 4,4 conformément à l’invention avait, par ailleurs, un impact sur la performance de la souche, on a calculé pour cela la vitesse spécifique de production de protéines qp Cette vitesse spécifique qp est égale à rp/X, avec rp la productivité en protéines en g/L/h, et X la concentration en biomasse en g/L. Les valeurs de qp obtenues sont les suivantes :

Exemple 1 (pH 4 croissance, souche TR3002) : qp = 28,4 mgP/gX/h

Exemple 2 (pH 4,8 croissance, souche TR3002): qp = 27,7 mgP/gX/h

Exemple 4 (pH 4,4 croissance, souche TR3002 ): qp = 25,4 mgP/gX/h Exemple 5 (pH 4 croissance, souche CL847 ): qp = 8,5 mgP/gX/h

Exemple 6 (pH 4,4 croissance, souche CL847 ): qp = 9,4 mgP/gX/h

Pour les exemples 7 et 8, les valeurs de qp ne sont pas significativement différentes de celles des exemples 5 et 6, tant que le moussage n’a pas démarré, le moussage ayant ensuite interrompu les expérimentations pour ces deux exemples.

On constate donc que, pour une souche donnée, abaisser le pH de croissance n’a pas eu d’impact significatif sur la vitesse spécifique qp, ni sur la productivité globale du procédé. En effet la concentration finale en protéines, pour une même durée de production, n’est pas non plus affectée par l’abaissement du pH de croissance : on obtient des quantités autour de 40g/L pour les exemples avec la souche TR3002 quel que soit le pH de croissance, et des quantités autour de 25g/L pour les exemples avec la souche CL847 quel que soit le pH de croissance.

La figure 3 indique la production en g/L de biomasse (ligne avec des points) et de protéines (ligne avec des triangles) en fonction du temps exprimé en heure pour l’exemple 2 comparatif, la figure 4 représente le même type de graphe pour l’exemple 1 selon l’invention, et la figure 5 pour l’exemple 4 selon l’invention : la comparaison de ces graphes confirme que la production en protéines reste au même niveau, qu’on abaisse ou non le pH de croissance. On voit aussi (exemple 4, figure 5) qu’adopter le même pH pour la croissance et la production n’impacte pas non plus négativement la production de protéines.

On a également évalué les niveaux d’activité enzymatique des enzymes produites, par la mesure de l’Activité dite papier filtre (« FPase ») . Cette méthode permet de doser l'activité globale du pool enzymatique (endoglucanases et exoglucanases). L'activité FPase est mesurée sur papier Whatman N° 1 (procédure recommandée par la commission biotechnologique IUPAC) : on détermine la prise d'essai de la solution enzymatique qui réalise 4 % d’avancement de la réaction enzymatique en 60 minutes. Le principe de l'activité papier filtre est de déterminer par dosage au DNS (acide dinitrosalicylique) la quantité de sucres réduits issue d'un papier Whatman N°1.

Les valeurs de FPase obtenues pour les 8 exemples, et traduisant donc l’activité globale du cocktail enzymatique, et donc sa qualité, présentent des valeurs classiques pour les souches utilisées, à savoir comprises entre 0,8 et 1 IU /mg.

On en conclut que si l’invention permet d’éviter le moussage de façon particulièrement simple et efficace, elle n’a pas d’impact négatif par ailleurs ni sur le rendement de production des enzymes, ni sur leur qualité.