Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Furanderivaten aus D- Glucose in.

Aufgrund steigender Preise für fossile Rohstoffe und einem zu erwarteten Rückgang des Angebots solcher Rohstoffe besteht ein großes Interesse an der Nutzung von

nachwachsenden Rohstoffen. Dabei sind die Bereiche Energieerzeugung und Herstellung von Grundchemikalien zu unterscheiden. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf letzteren Bereich und betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Furanderivaten aus D- Glucose.

D-Glucose liegt in großer Menge in verschiedensten Biopolymeren vor, welche Bestandteile von nachwachsenden Rohstoffen sind. Beispiele dafür sind Stärke (z.B. Maisstärke) oder Cellulose (z.B. aus lignocellulosischer Biomasse). Zur Herstellung von Furanderivaten ist jedoch Fructose als Ausgangsmaterial wesentlich besser geeignet.

Eine gängige Möglichkeit zur Umwandlung von D-Glucose zu D-Fructose erfolgt unter Verwendung einer geeigneten D-Glucoseisomerase, z.B. D-Xylose-Isomerase, die D- Glucose als Substrat akzeptiert. Solche Verfahren sind schon lange bekannt, z.B. aus US2950228 und auch für den industriellen Einsatz geeignet, wie etwa in US3616221 oder US3868304 beschrieben.

Ein Problem dabei ist, dass üblicherweise maximal ca. 42 % der D-Glucose zu D-Fructose umgewandelt werden können. Eine weitere Anreicherung von D-Fructose gegenüber D- Glucose kann durch Trennverfahren erreicht werden. Eine Möglichkeit dazu ist die

Verwendung von chromatographischen Methoden, wie z.B. in US5221478 beschrieben. Für den Nahrungsmittelsektor wird dabei oft lediglich eine teilweise Anreicherung von D- Fructose angestrebt. Vor allem zur Produktion relativ reiner bis hoch reiner D-Fructose sind chromatographische Verfahren aber sehr aufwändig. Neben der Verwendung von Isomerasen wurden in der Literatur auch enzymatische Redoxreaktionen an Kohlenhydraten beschrieben.

So wird beispielsweise in DE69839381 eine Sorbitoldehydrogenase beschrieben, die zur Umwandlung von D-Sorbitol zu L-Sorbose eingesetzt werden und bei der Herstellung von Ascorbinsäure Anwendung finden kann.

In DE10247147 ist ein Verfahren beschrieben, bei dem unter Verwendung von D-Mannitol- 2-Dehydro genäse D-Fructose zu D-Mannitol reduziert wird.

In US4467033 ist die enzymatische Oxidation von L-Sorbitol zu L-Fructose beschrieben.

Beispiele für die Reduktion von D-Xylose zu Xylitol sind etwa in US20060035353 oder in Woodyer R. et al., FEBS J., 2005, Volume 272, p 3816- 3827 offengelegt.

Es wurde bereits gezeigt, dass geeignete Xylose-Reduktasen verwendet werden können, um D-Glucose zu D-Sorbitol zu reduzieren (z.B. Wang X. et al., Biotechnol. Lett, 2007, Volume 29, p 1409-1412).

Zucker-Redoxenzyme wie z.B. Sorbitol-Dehydrogenase werden auch für diagnostische Zwecke eingesetzt (z.B. DE60006330).

Bei diesen Verfahren handelt es sich um einzelne Redoxreaktionen, bei denen zur

Produktbildung jeweils entweder eine Reduktion oder eine Oxidation erfolgt.

Enzymkatalysierte Redoxreaktionen werden in industriellen Prozessen beispielsweise in der Herstellung von chiralen Alkoholen, α-Aminosäuren und α-Hydroxysäuren verwendet. Die bisher bekannten industriellen Prozesse verwenden in der Regel ein Redoxenzym zur Produktsynthese, sowie gegebenenfalls ein weiteres Enzym zur Kofaktor-Regenerierung. Davon zu unterscheiden sind Verfahren, bei denen zwei oder mehr an der Produktbildung beteiligte enzymatische Redoxreaktionen sowie die gegebenenfalls notwendigen

enzymatischen Reaktionen zur Kofaktor-Regenerierung (zeitgleich oder sequentiell) in einem Reaktionsansatz durchgeführt werden, ohne dass ein Zwischenprodukt isoliert wird. In letzter Zeit haben solche enzymatischen Kaskadenreaktionen - hier als Ein-Topf- Reaktionen bezeichnet - signifikante Aufmerksamkeit erlangt, da sie effektiv

Betriebskosten, Betriebszeit und Umweltauswirkungen reduzieren. Zusätzlich ermöglichen enzymatische Kaskaden von Redoxreaktionen Transformationen, die durch klassische chemische Verfahren nicht einfach umzusetzen sind.

So wurde ein Versuch beschrieben, die Deracemisierung von Racematen sekundärer Alkohole über ein prochirales Keton als Zwischenprodukt unter Verwendung eines EinTopf-Systems durchzuführen (J. Am. Chem. Soc, 2008, Volume 130, p. 13969-13972). Die Deracemisierung von sekundären Alkoholen wurde über zwei Alkoholdehydrogenasen (S- und R-spezifisch) mit unterschiedlicher Kofaktor-Spezifizität erreicht. Ein Nachteil des Verfahren ist die sehr geringe Konzentration des eingesetzten Substrats von 0,2-0,5%, was für industrielle Zwecke nicht geeignet ist.

Ein weiteres Ein-Topf-System wurde in WO 2009/121785 beschrieben, wobei ein

Stereoisomer eines optisch aktiven sekundären Alkohols zum Keton oxidiert und dann zum entsprechenden optischen Antipoden reduziert wurde und wobei zwei

Alkoholdehydrogenasen mit entgegengesetzten Stereoselektivitäten und unterschiedlichen Kofaktor- Spezifitäten verwendet wurden. Die Kofaktoren wurde mittels eines sogenannten „Hydrid-Transfer-Systems" unter Verwendung nur eines zusätzlichen Enzyms regeneriert. Um die Kofaktoren zu regenerieren, wurden verschiedene Enzyme wie z.B.

Formatdehydrogenase, Glucosedehydrogenase, Lactatdehydrogenase verwendet. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist die geringe Konzentration der verwendeten Substrate.

Im Gegensatz dazu sind bereits viele einzelne enzymatische Redoxreaktionen bekannt. Ein Anwendungsbeispiel ist die Herstellung chiraler Hydroxyverbindungen ausgehend von entsprechenden prochiralen Keto Verbindungen. In diesen Verfahren wird der Kofaktor mittels eines zusätzlichen Enzyms regeneriert. Diesen Verfahren gemeinsam ist, dass sie eine isolierte Reduktionreaktion darstellen und NAD(P)H regenerieren (siehe z.B.

EP1152054). Weitere Beispiele einer enzymatischen Herstellung von chiralen,

enantiomerenangereicherten, organischen Verbindungen, wie zum Beispiel Alkoholen oder Aminosäuren, wurden beschrieben (Organic Letters, 2003, Volume 5, p. 3649-3650;

US7163815; Biochem. Eng. J., 2008, Volume 39(2) p. 319-327; EP1285962). In den Systemen wurde als Kofaktor-Regenerierungsenzym eine NAD(P)H-abhängige Oxidase aus Lactobacillus brevis oder Lactobacillus sanfranciscensis verwendet. Bei den Versuchen handelt es sich auch um Einzelreaktionen zur Produktbildung.

Es entfallen bei den genannten einzeln ablaufenden Oxidations- oder Reduktionsreaktionen die Vorteile einer Ein-Topf-Reaktion, wie z.B. Wirtschaftlichkeit durch Zeit- und

Materialersparnis .

Eine Isolierung von Fructose aus wässrigen Lösungen ist z.B. gemäß einer Methode, die in US4895601 oder US5047088 beschrieben ist, möglich.

In der Literatur sind verschiedene Beispiele zur Produktion von Furanderivaten aus

Kohlenhydraten bekannt.

In solchen Verfahren wurden eine Vielzahl an sauren Katalysatoren verwendet: anorganische Säuren (siehe z. B. Chheda, J. N.; Roman-Leshkow, Y.; Dumesic, J. A. Green Chem. 2007, 9, 342-350), organische Säuren (z. B. Oxalsäure), Zeolithe (H-Form), Übergangsmetallionen (siehe z. B. Young, G.; Zhang, Y.; Ying, J. Y. Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 9345-9348; Tyrlik, S. K.; Szerszen, D.; Olejnik, M.; Danikiewicz, W. Carbohydr. Res. 1999, 315, 268- 272), heterogen gelöste Metallphosphate (siehe z. B. Asghari, F. S.; Yoshida, H. Carbohydr. Res. 2006, 341, 2379-2387) oder auch stark saure Kationenaustauscher (siehe z.B. Villard, R.; Robert, F.; Blank, L; Bernardinelli, G.; Soldo, T.; Hofmann, T. J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 4040-4045).

Als Lösungsmittel in solchen Prozessen wurde Wasser, als grünes Lösungsmittel, bevorzugt untersucht. Obwohl ein System aus Biomasse und Wasser als„green approach" gewertet werden kann, so kann bei Temperaturen von >300°C und Drücken von über 20 MPa, die benötigt werden um akzeptable Ausbeuten zu erzielen, nicht mehr von einem solchen gesprochen werden (siehe z. B. Qi, X.; Watanabe, M.; Aida, T. M.; Smith Jr., R. S. Cat. Commun. 2008, 9, 2244-2249).

Eine spezielle Furanverbindung die aus Kohlenhydraten in Gegenwart von sauren

Katalysatoren hergestellt werden kann, stellt Hydroxymethylfurfural (im Weiteren HMF) dar. Prozesse zur Produktion von HMF sind ebenfalls literaturbekannt. HMF kann in wässriger Lösung in Gegenwart von homogenen und heterogenen Säuren aus

Kohlenhydraten gewonnen werden. Die erreichten Ausbeuten hierbei betragen je nach Kohlenhydrat-Substrat und Reaktionsbedingungen zwischen 30 und 60 %. Wird Wasser als Lösungsmittel eingesetzt, so werden auch hier Reaktionsbedingungen von 300 °C und 27 MPa beschrieben. Zudem wird die Bildung von Nebenprodukten wie Lävulinsäure (LS) oder unlöslichen Huminsäuren beschrieben (siehe z.B. Bicker, M., Kaiser, D., Ott, L., Vogel, H., J. of Supercrit. Fluids 2005, 36, 118-126; Szmant, H. H., Chundury, D. D., J. Chem. Techn. Biotechnol. 1981, 31, 135-145; Srokol, Z., Bouche, A.-G., van Estrik, A., Strik, R. C. J., Maschmeyer, T., Peters, J. A., Carbohydr. Res. 2004, 339, 1717-1726).

Ein Durchflussprozess unter superkritischen Bedingungen ausgehend von D-Glucose wurde von Aida et al. beschrieben (Aida, T. A.; Sato, Y.; Watanabe, M.; Tajima, K.; Nonaka, T.; Hattori, H.; Arai, K. J. of Supercrit. Fluids, 2007, 40, 381-388).

Organische Lösungsmittel können bei der HMF-Herstellung ebenfalls geeignet sein. Eine wichtige Einschränkung ist hierbei jedoch, dass sie in manchen Fällen schwer vom Produkt abzutrennen sind (siehe z. B. Bao, Q.; Qiao, K.; Tomido, D.; Yokoyama, C. Catal. Commun. 2008, 9, 1383-1388; Halliday, G. A.; Young Jr., R. J.; Grushin, V. V. Org. Lett. 2003, 5, 2003-2005). Zusätzlich sind viele in der Vergangenheit eingesetzte Lösungsmittel nicht für mögliche Folgereaktionen geeignet, sondern erzeugen Nebenprodukte, sofern sie nicht abgetrennt werden. Häufig eingesetzte Lösungsmittel für die Umsetzung von

Kohlenhydraten zu HMF sind Dimethylsulfoxid (DMSO) und Dimethylformamid (DMF). Im Vergleich zu Wasser als Lösungsmittel können die Umsetzungen von Kohlenhydraten zu HMF in diesen Fällen schon bei vergleichsweise niedrigen Temperaturen von 80 - 140 °C durchgeführt werden und liefern deutlich höhere Ausbeuten (bis zu 95 % in DMF) in kürzeren Reaktionszeiten (30 min bis 2 h) (siehe z. B. Halliday, G. A., Young Jr., R. J., Grushin, V. V., Org. Lett. 2003, 5, 2003-2005; WO2009076627. Es wird vermutet, dass DMSO in der Dehydratisierung von D-Fructose (oder anderen Kohlenhydraten) zu HMF (und vergleichbaren Verbindungen) als Katalysator agiert (siehe: Amarasekara, A. S.;

Williams, L. D.; Ebede, C. C. Carbohydr. Res. 2008, 343, 3021-3024).

Reaktionsgemische aus Wasser/DMSO oder Wasser/Toluol wurden ebenfalls in einer kontinuierlichen Reaktionsführung eingesetzt, wobei Reaktionszeiten von 4-6 h bei 140- 180°C benötigt wurden, um bestenfalls 80 % Ausbeute an HMF zu erhalten (siehe Chheda, J. N., Roman-Leshkov, Y., Dumesic, J. A., Green Chem. 2007, 9, 342-350).

Ionische Flüssigkeiten können sowohl als neutrale Lösungsmittel als auch als aktive

Br0nsted-Säuren agieren, wobei die Abtrennung der ionischen Flüssigkeiten auch weiterhin ein Problem darstellt. Immobilisierte ionische Flüssigkeiten wurden zudem als Br0nsted- Säure-Katalysatoren verwendet (siehe Bao, Q.; Qiao, K.; Tomido, D.; Yokoyama, C. Catal. Commun. 2008, 9, 1383-1388).

Alle bis heute bekannten Prozesse weisen verschiedene Nachteile auf, beispielsweise geringe Anfangskonzentration des Substrates, niedrige Gesamtausbeuten.

Es wurde nun überraschenderweise eine Möglichkeit gefunden, eine bessere Gesamtausbeute bei der Gewinnung von Furanderivaten aus D-Glucose zu erreichen, bei der überraschend hohe Anfangskonzentration der D-Glucose verwendet werden können.

In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung von

Furanderivaten aus D-Glucose zur Verfügung, dass dadurch gekennzeichnet ist, dass

A) D-Glucose in einem enzymatischen Verfahren unter Verwendung und Regenerierung von Redoxkofaktoren in D-Fructose übergeführt wird, wobei als Resultat mindestens zweier weiterer im selben Reaktionsansatz ablaufender enzymatisch katalysierter Redoxreaktionen einer der beiden Redoxkofaktoren in seiner reduzierten Form anfällt und der jeweils andere in seiner oxidierten Form, wobei D-Glucose unter Beteiligung von zwei oder mehr Oxidoreduktasen in D-Fructose übergeführt wird, und

B) D-Fructose zu Furanderivaten umgesetzt wird. Ein Verfahren, das durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, wird hier auch als Verfahren gemäß/nach vorliegender Erfindung bezeichnet.

Eine besondere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass als Redoxkofaktoren in Stufe A) NAD ⁺ /NADH und/oder NADP ⁺ /NADPH verwendet werden.

In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung von Furanderivaten aus D-Glucose zur Verfügung, dass dadurch gekennzeichnet ist, dass in Stufe A) D-Glucose in einem enzymatischen Verfahren unter Verwendung und Regenerierung der Redoxfaktoren NAD ⁺ /NADH und/oder NADP ⁺ /NADPH in D-Fructose übergeführt wird, wobei als Resultat mindestens zweier weiterer im selben Reaktionsansatz ablaufender enzymatisch katalysierter Redoxreaktionen (Produktbildungsreaktionen) einer der beiden Redoxkofaktoren in seiner reduzierten Form anfällt und der jeweils andere in seiner oxidierten Form, wobei

- bei der Regenerierungsreaktion, die den reduzierten Kofaktor wieder in seine

ursprüngliche oxidierte Form überführt, Sauerstoff oder eine Verbindung der allgemeinen Formel

worin Ri für eine geradkettige oder verzweigtkettige (C ₁ -C ₄ )-Alkylgruppe oder für eine (C ₁ -C ₄ )-Carboxyalkylgruppe steht, reduziert wird, und

- bei der Regenerierungsreaktion, die den oxidierten Kofaktor wieder in seine ursprüngliche reduzierte Form überführt, ein (C ₄ -C8)-Cycloalkanol oder eine Verbindung der allgemeinen Formel worin R ₂ und R ₃ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, (C ₁ -C _ö )-Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist, (C ₁ -C _ö )-Alkenyl, worin Alkenyl geradkettig oder verzweigt ist und ein bis drei Doppelbindungen enthält, Aryl, insbesondere C _Ö -C ₁₂ Aryl, Carboxyl, oder (C ₁ -C ₄ )-Carboxyalkyl, insbesondere auch Cycloalkyl, z.B. C ₃ -Cg Cycloalkyl, oxidiert wird.

In einem weiteren Aspekt in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung ist R eine substituierte oder unsubstituierte, z.B. eine unsubstiuierte Cl-C4-Alkylgruppe.

In einem weiteren Aspekt sind in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung R ₂ und R unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus H, (CrC ₆ )- Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist, (CrC ₆ )- Alkenyl, worin Alkenyl geradkettig oder verzweigt ist und ein bis drei Doppelbindungen enthält, Aryl, insbesondere C _Ö -C ₁₂ Aryl, Carboxyl, oder (C ₁ -C ₄ )-Carboxyalkyl.

Als„Oxidationsreaktion(en)" und„Reduktionsreaktion(en)" werden hier diejenigen enzymkatalysierten Redoxreaktionen bezeichnet, die nicht Teil der Kofaktor-Regenerierung sind und in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung an der Bildung des Produkts beteiligt sind.„Oxidationsreaktion(en)" und„Reduktionsreaktion(en)" sind unter dem Begriff„Produktbildungsreaktionen" zusammengefasst. Die Produktbildungsreaktionen in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung beinhalten jeweils mindestens eine Oxidationsreaktion sowie mindestens eine Reduktionsreaktion.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass Oxidationsreaktion und

Reduktionsreaktion zeitlich parallel ablaufen.

Enzyme und Redoxenzyme in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung schließen Oxidoreduktasen ein. Oxidoreduktasen sind Enzyme, die Redoxreaktionen katalysieren. Oxidoreduktasen schließen beispielsweise Dehydrogenasen, Reduktasen, Oxidasen, Katalasen ein. Die Nennung einer Säure oder des Salzes einer Säure schließt hier den jeweils nicht genannten Begriff ein. Ebenfalls schließt die Nennung von Säuren, insbesondere

Gallensäuren, hier alle davon abgeleiteten Ester mit ein. Weiter sind hier (partiell) mit Schutzgruppen versehene Verbindungen bei der Nennung der zugrundeliegenden Substanzen mit eingeschlossen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass als Verbindung der Formel I (2- Oxosäure) Pyruvat (Redoxkosubstrat) eingesetzt wird, welches mittels einer

Laktatdehydro genäse zu Laktat reduziert wird, das heißt, dass bei der

Regenerierungsreaktion, die den reduzierten Kofaktor wieder in seine ursprüngliche oxidierte Form überführt mittels einer Laktatdehydrogenase Pyruvat zu Laktat reduziert wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass als Verbindung der Formel II

(Redoxkosubstrat) ein sekundärer Alkohol, insbesondere 2-Propanol (Isopropylalkohol, IPA) eingesetzt wird, welches mittels einer Alkoholdehydrogenase zu Aceton oxidiert wird, das heißt, dass bei der Regenerierungsreaktion, die den oxidierten Kofaktor wieder in seine ursprüngliche reduzierte Form überführt mittels einer Alkoholdehydrogenase 2-Propanol zu Aceton oxidiert wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass als Redoxkosubstrat Sauerstoff eingesetzt wird, welcher mittels einer NADH Oxidase reduziert wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass als Redoxkosubstrat ein sekundärer Alkohol Malat eingesetzt wird, welches mittels einer Oxalacetat-decarboylierenden

Malatdehydrogenase („Malatenzym") zu Pyruvat und C0 ₂ oxidiert wird, z.B. dass bei der Regenerierungsreaktion, die den oxidierten Kofaktor wieder in seine ursprüngliche reduzierte Form überführt mittels einer Malatdehydrogenase Malat zu Pyruvat und C0 ₂ oxidiert wird.

Das entstehende Pyruvat wird bei dieser Ausführungsform in einer weiteren Redoxreaktion umgesetzt, die nicht zur Produktbildung dient, sondern die zweite Kofaktor- Regenerierungsreaktion darstellt.

Geeignete Quellen für D-Glucose in einem Verfahren nach vorliegender Erfindung schließen zum Beispiel enzymatische oder nicht-enzymatische Hydrolysate von Stärke, insbesondere Maisstärke, enzymatische oder nicht-enzymatische Hydrolysate von Saccharose oder enzymatische oder nicht-enzymatische Hydrolysate von Cellulose ein. Cellulose, die in einem Verfahren nach vorliegender Erfindung verwendet wird kann zum Beispiel gewonnen werden aus Biomasse, vorzugsweise aus lignocellulosischer Biomasse, wie zum Beispiel Holz, Stroh, wie Weizenstroh, Maisstroh, Bagasse, Sisal, Energiegräser. Zur enzymatischen Hydrolyse von Maisstärke können z. B. Amylasen eingesetzt werden. Für enzymatische Spaltung von Saccharose eignen sich z. B. Invertasen. Zur enzymatischen Spaltung von Cellulose können z. B. Cellulasen eingesetzt werden. Für die nicht-enzymatische Spaltung genannter Mehrfachzucker eignet sich zum Beispiel eine säurekatalysierte Spaltung.

Die Stufe A) in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung wird in einem wässrigen System, dem gegebenenfalls ein Puffer zugesetzt wird, durchgeführt. Geeignete Puffer schließen zum Beispiel Acetat-, Kaliumphosphat-, Tris-HCl- und Glycin-Puffer zum

Beispiel mit einem pH- Wert von 5 bis 10,5, vorzugsweise von 6 bis 10 ein. Weiters, oder alternativ können dem System bei der Umsetzung von D-Glucose zu D-Fructose Ionen zur Stabilisierung der Enzyme, wie zum Beispiel Mg ²⁺ oder sonstige Zusätze wie zum Beispiel Glycerin zugesetzt werden.

In einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung wird in Stufe A) D-Glucose in D- Fructose gemäß dem Reaktions Schema 1

Reaktions Schema 1

D-Glucose D-Fructose

übergeführt.

In einem weiteren Aspekt ist die vorliegende Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass bei der Umwandlung von D-Glucose zu D-Fructose zuerst eine enzymatisch katalysierte Reduktion und anschließend eine enzymatisch katalysierte Oxidation durchgeführt werden.

In einem besonderen Aspekt ist die vorliegenden Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass eine Isomerisierung der D-Glucose durch Reduktion zu D-Sorbitol erfolgt, das zur D- Fructose oxidiert wird, insbesondere nach dem folgenden Reaktions Schema 2

Reaktions Schema 2

D-Glucose D-Sorbitol D-Fructose

Eine weitere besondere Ausführungsform des Verfahrens nach vorliegender Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass sowohl Reduktions- als auch Oxidationsreaktion(en) zur Umwandlung von D-Glucose zu D-Fructose im selben Reaktionsansatz ohne Isolierung von Zwischenprodukten erfolgen. Geeignete Enzyme zur Reduktion von D-Glucose zu D-Sorbitol sind bekannt und schließen z.B. Xylosereduktasen ein, die beispielsweise aus Candida tropicalis oder aus Candida parapsilosis erhältlich sind.

Geeignete Enzyme zur Oxidation von D-Sorbitol zu D-Fructose sind bekannt und schließen z.B. Sorbitoldehydrogenasen ein, die beispielsweise aus Schafsleber, Bacillus subtilis oder Malus domestica erhältlich sind.

Eine besondere Ausführungsform des Verfahrens gemäß vorliegender Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass an der Umwandlung von D-Glucose zu D-Fructose mindestens eine Dehydrogenase, sowie Redoxkofaktor(en), z.B. der/die Redoxkofaktor(en) NAD ⁺ /NADH und/oder NADP ⁺ /NADPH, eingesetzt werden.

Sowohl die Enzyme, als auch die Redoxkofaktoren können dabei entweder in löslicher Form oder an einen Träger (Feststoff) immobilisiert zum Einsatz kommen.

Eine weitere, besondere Ausführungsform des Verfahrens nach vorliegender Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass der/die Redoxkofaktor(en) NAD ⁺ /NADH und/oder

NADP ⁺ /NADPH durch mindestens ein weiteres Redoxenzym regeneriert (wieder in ihren ursprünglichen Redoxzustand überführt) werden.

Redoxenzyme, die geeignet sind, NAD ⁺ /NADH und/oder NADP ⁺ /NADPH durch zu regenerieren sind bekannt und dem Fachmann geläufig und schließen z.B. Dehydrogenasen ein.

Bei einem Verfahren nach vorliegender Erfindung können in Stufe a) sowohl Einzelenzyme als auch Fusionsproteine umfassend zwei Redoxenzyme zum Einsatz kommen.

Eine weitere, besondere Ausführungsform des Verfahrens nach vorliegender Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass enzymatische Redoxreaktionen zur Umsetzung von D- Glucose zu D-Fructose durch solche Dehydrogenasen katalysiert werden, welche die Redoxkofaktoren NAD ⁺ /NADH und/oder NADP ⁺ /NADPH verwenden. Dabei bezeichnet NAD ⁺ die oxidierte Form und NADH die reduzierte Form von

Nicotinamidadenindinucleotid während NADP ⁺ die oxidierte Form und NADPH die reduzierte Form von Nicotinamidadenindinucleotidphosphat bezeichnen. Ein Zusatz von Redoxkofaktoren ist u. U. nicht notwendig, wenn die Enzym-Lösungen diese bereits in ausreichender Konzentration enthalten. Falls die Redoxkofaktoren NAD(P) ⁺ und/oder NAD(P)H bei der Umsetzung von D-Glucose zu D-Fructose zugesetzt werden, beträgt die zugesetzte Konzentration in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung üblicherweise von 0,001 mM bis 10 mM, vorzugsweise von 0,01 mM bis 1 mM.

Bevorzugt werden verwendete Redoxkofaktoren bei der Umsetzung von D-Glucose zu D- Fructose im selben Reaktionsansatz durch mindestens ein weiteres Redoxenzym unter Verbrauch von Co-Substraten regeneriert.

Eine weitere, besondere Ausführungsform des Verfahrens nach vorliegender Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Redoxkofaktor bei der Umsetzung von D- Glucose zu D-Fructose im selben Reaktionsansatz durch mindestens ein weiteres

Redoxenzym unter Verbrauch von Co-Substraten regeneriert wird.

Weitere Redoxenzyme zur Regenerierung der Redoxfaktoren sind dem Fachmann bekannt und schließen z.B. Alkoholdehydrogenasen, NADH-Oxidasen, Hydro genasen,

Laktatdehydro genasen oder Formiatdehydrogenasen ein.

Eine weitere, besondere Ausführungsform des Verfahrens nach vorliegender Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass NAD ⁺ bei der Umsetzung von D-Glucose zu D-Fructose im selben Reaktionsansatz durch eine NADH-Oxidase regeneriert wird.

Eine weitere, besondere Ausführungsform des Verfahrens nach vorliegender Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass NADPH bei der Umsetzung von D-Glucose zu D-Fructose im selben Reaktionsansatz durch eine Alkoholdehydrogenase regeneriert wird. NADH-Oxidasen und Alkoholdehydrogenasen sind dem Fachmann bekannt.

Alkoholdehydrogenasen schließen z.B. solche aus Lactobacillus kefir ein. Geeignete NADH Oxidasen sind zum Beispiel erhältlich aus Leuconostoc mesenteroid.es, Streptococcus mutans, Clostridium aminovalericum.

Eine weitere, besondere Ausführungsform des Verfahrens nach vorliegender Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass NADPH bei der Umsetzung von D-Glucose zu D-Fructose im selben Reaktionsansatz durch die Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir regeneriert wird.

Zur Regenerierung der Redoxenzyme müssen Co-Substrate vorhanden and gegebenenfalls zugesetzt werden

Als Co-Substrate werden Substanzen bezeichnet, die bei der Regenerierung von

NAD ⁺ /NADH und/oder NADP ⁺ /NADPH (oder anderer Redoxcofaktoren) reduziert oder oxidiert werden. Geeignete Co-Substrate bei einem Verfahren nach vorliegender Erfindung schließen beispielsweise Alkohole (z.B. 2-Propanol), Milchsäure und deren Salze,

Brenztraubensäure und deren Salze, Sauerstoff, Wasserstoff und/oder Ameisensäure und deren Salze ein.

NADPH kann beispielsweise durch die Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir unter Zusatz des Co-Substrats 2-Propanol (Isopropanol), das zu Aceton oxidiert wird, regeneriert werden.

Mögliche Reaktionswege für die Umwandlung von D-Glucose zu D-Fructose gemäß einem Verfahren nach vorliegender Erfindung sind in den nachfolgenden Reaktions Schemata 3 und 4 gezeigt:

Reaktions Schema 3 Glucose Fructose

2-Propanol Lactat Pyruvat

CtXR Xylosereduktase aus Candida tropicalis

SISDH Sorbitoldehydrogenase aus Schafsleber

LkADH Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir, NADP(H)-abhängig LacDH Laktatdehydrogenase, NAD(H)- abhängig

Reaktions Schema 4

Glucose So bitol Fructose

Aceton 2-Prcpanol

CtXR Xylosereduktase aus Candida tropicalis

BsSDH Sorbitol-Dehydrogenase aus Bacillus subtilis

LkADH Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir, NADP(H)-abhängig SmOxo NADH Oxidase aus Streptococcus mutans

Es wurde gefunden, dass in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung bei der Umsetzung von D-Glucose zu D-Fructose eine hohe Anfangskonzentration der D-Glucose in der wässrigen Reaktionsmischung von >5 % (w/v) D-Glucose, bevorzugt > 10 % (w/v) D- Glucose, insbesondere bevorzugt > 15 % (w/v) D-Glucose eingesetzt werden kann.

In einer weiteren, bevorzugten Ausführungsform wird die D-Glucose in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung in der wässrigen Reaktionsmischung in einer Konzentration von >5 % (w/v) D-Glucose, bevorzugt > 10 % (w/v) D-Glucose, insbesondere bevorzugt > 15 % (w/v) D-Glucose, wobei eine Konzentration von 50% (w/v), vorzugsweise 40% (w/v), insbesondere bevorzugt 35% (w/v) nicht überschritten werden sollte.

Aufgrund der temperaturabhängigen Löslichkeit von D-Glucose ist bei der Durchführung des Verfahrens die Glucose-Konzentration der jeweiligen Reaktionstemperatur anzupassen.

Enzyme können in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung als solche,

gegebenenfalls in der Form von Zell-Lysaten, gegebenenfalls als

rekombinant überexprimierte Proteine, beispielsweise als in E. coli rekombinant

überexprimierte Proteine verwendet werden, wobei weiterhin bevorzugt die entsprechenden Zell-Lysate ohne weitere Aufreinigung eingesetzt werden können. Je nach dem zu produzierenden Enzym können auch andere Mikroorganismen zur Expression eingesetzt werden, z.B. Mikroorganismen, die dem Fachmann bekannt sind. Feste Bestandteile der jeweiligen Mikroorganismen können in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung entweder abgetrennt werden oder in der Reaktion mit eingesetzt werden (z.B. Ganzzell- Biokatalysatoren). Es können auch Kulturüberstände oder Lysate von Mikroorganismen eingesetzt werden, die ohne rekombinante DNA-Technologie bereits ausreichende Enzym- Aktivitäten aufweisen. In einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung können sowohl Enzyme als auch Redoxkofaktoren entweder in löslicher Form oder an Feststoffe immobilisiert zum Einsatz kommen. Die Enzym-Einheit 1 U entspricht dabei derjenigen Enzymmenge, die benötigt wird, um 1 μιηοΐ Substrat pro min umzusetzen.

Überraschenderweise wurde gefunden, dass in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung bei der Umsetzung von D-Glucose zu D-Fructose ein hoher Umsatz erreicht werden kann, beispielsweise ein Umsatz von >70 (w/v), wie >90 (w/v), z.B. >98 (w/v) und bis zu 99,9% (w/v), oder gar ein vollständiger Umsatz erreicht werden kann.

Abhängig von den verwendeten Enzymen kann das Verfahren nach vorliegender Erfindung, beispielsweise in Stufe a), bei Temperaturen von 10°C bis 70°C, vorzugsweise von

Raumtemperatur, z.B. 20°C, bis 50°C durchgeführt werden.

Die D-Fructose, die gemäß Stufe a) der vorliegenden Erfindung gewonnen werden kann, kann, z.B. mit Hilfe einer Kristallisation, isoliert werden.

Der beispielsweise bei der Spaltung von Saccharose anfallende 50-%ige D-Glucose-Anteil kann mit einem zweistufigen, enzymatischen Redoxverfahren nach vorliegender Erfindung zu D-Fructose umgewandelt werden, wobei es zu einer Erhöhung des Anteils von D- Fructose am Gesamt-Zuckergehalt kommt. Damit ist ein geeignetes Ausgangsmaterial zur weiteren Umwandlung in Furanderivate zugänglich, wobei überraschenderweise gefunden wurde, dass sich das Zwischenprodukt D-Fructose, das nach einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung erhalten wird, besonders gut für die weitere Umwandlung zu Furanderivaten eingesetzt werden kann.

Die Umsetzung der D-Fructose zu Furanderivaten in Stufe B) gemäß vorliegender Erfindung kann nach einer geeigneten Methode erfolgen, z.B. nach einer üblichen Methode, oder wie hierin beschrieben.

Gemäß üblicher Methoden kann die Umsetzung der D-Fructose zu Furanderivaten in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung in Gegenwart eines Katalysators, z.B. eines sauren Katalysators, wie einer anorganischen Säure, organische Säure, z. B. Oxalsäure, eines Zeolith (H-Form), von Übergangsmetallionen, eines heterogen gelösten Metallphosphats, eines stark sauren Kationenaustauscher, erfolgen.

Als Lösungsmittel in solchen Prozessen kann Wasser oder ein organisches Lösungsmittel Verwendung finden, z.B. Dimethylsulfoxid (DMSO), Dimethylformamid (DMF), N- Methylpyrrolidon. Bevorzugt erfolgt die Umsetzung der D-Fructose zu Furanderivaten in Stufe B) gemäß vorliegender Erfindung in Gegenwart eines sauren Katalysators und in Gegenwart von N- Methyl-pyrrolidon (N-Methyl-2-pyrrolidon, NMP) der Formel

Die Umsetzung der D-Fructose zu Furanderivaten in Stufe B) gemäß vorliegender Erfindung kann entweder als Batch-Prozess oder als kontinuierlicher Prozess durchgeführt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Stufe B) gemäß vorliegender Erfindung unter Mikrowellen-Erhitzung durchgeführt.

Besondere Ausführungsformen des Verfahrens nach vorliegender Erfindung sind dadurch gekennzeichnet, dass bei der Umsetzung von D-Fructose zu Furanderivaten N-Methyl-2- pyrrolidon (NMP) entweder als Reaktions-Lösungsmittel, oder als Co-Lösungsmittel, nämlich als Beimischung zu einem anderen Lösungsmittel, verwendet wird.

In einer besonderen Ausführungsform eines Verfahrens gemäß vorliegender Erfindung wird in Stufe b) NMP als (Co)lösungsmittel, z.B. als Reaktionslösungsmittel oder als

Beimischung zu einem anderen Lösungsmittel, verwendet.

In einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung kann, wenn NMP als Lösungsmittel eingesetzt wird, NMP als einziges Lösungsmittel eingesetzt werden, oder NMP wird zusammen mit einem Co-Lösungsmittel verwendet, wobei im Falle der Verwendung eines Co-Lösungsmittels eine NMP-Konzentration von bis zu 70% (v/v), beispielsweise bis zu 60% (v/v) bezogen auf die Gesamtlösungsmittelmenge eingesetzt werden kann. Als Co- Lösungsmittel kommen z.B. Wasser oder organische Lösungsmittel, z.B. solche, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, wie Ν,Ν-Dimethylsulfoxid (DMSO) oder N,N- Dimethylformamid (DMF) in Betracht. In einem Verfahren gemäß Stufe B) der vorliegenden Erfindung kann die D-Fructose in einer Menge von bis zu 40% (w/v) eingesetzt werden und wird im allgemeinen in einer Menge von 5 bis 20% eingesetzt, obwohl die Reaktion auch in niedrigerer Konzentration abläuft, beispielsweise in einer D-Fructose Konzentration von (etwa) 1% (w/v). Der Minimalwert ist dabei eher durch die Wirtschaftlichkeit und nicht chemisch definiert.

Saure Katalysatoren in Stufe B) in einem Verfahren nach vorliegender Erfindung schließen übliche saure Katalysatoren, die bei der Umwandlung von Fructose in Furanderivate eingesetzt werden können, ein. Bevorzugt ist der Katalysator eine Br0nsted-Säure.

Dabei können homogene Säurekatalysatoren, z.B. Schwefelsäure oder Salzsäure, oder heterogene Säurekatalysatoren, beispielsweise Kationenaustauscherharze wie

Montmorillonite, bevorzugt Montmorillonit KSF® oder Amberlite, z.B. Amberlite®, bevorzugt Amberlite 15®, verwendet werden. Außerdem können in einem Verfahren nach vorliegender Erfindung Lewis-Säure-Katalysatoren, wie CrCl ₂ , A1C1 ₃ , Si0 ₂ -MgCl ₂ oder ein SILP(silica supported ionic eingesetzt werden. Im Allgemeinen liefern diese jedoch nicht so gute Ergebnisse, wie die oben genannten Katalysatoren.

In einem weiteren Aspekt ist ein Verfahren nach vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass bei der Umsetzung von D-Fructose zu Furanderivaten in Stufe B) als saurer Katalysator

ein homogener Säurekatalysator, bevorzugt Schwefelsäure oder Salzsäure;

ein heterogener Säurekatalysator, bevorzugt ein Ionenaustauscher, z.B. ein

Montmorillonit, wie Montmorillonit KSF® oder ein Amberlit, wie Amberlite®, bevorzugt Amberlite 15®

ein Lewis-Säurekatalysator wie z.B. CrCl ₂ , AICI ₃ oder Si0 ₂ -MgCl ₂

ein SILP-Katalysator,

bevorzugt ein homogener oder heterogener Säurekatalysator,

eingesetzt wird.

Die Menge eines benötigten Katalysators in Stufe B) kann der Fachmann problemlos durch einfache Vorversuche herausfinden. Die Menge hängt dabei von der Art des verwendeten Katalysators ab. Beispielhaft sind nachfolgend Katalysator- Mengen bezogen auf die eingesetzte Fructose- Menge angegeben, insbesondere für den Fall, dass NMP als Lösungsmittel verwendet wird:

Katalysator Menge

IN HCl 20 bis 200% (v/w)

HCl (37%) 2 bis 25% (v/w)

IN H ₂ S0 ₄ 20 bis 200% (v/w)

H ₂ S0 ₄ conc 2 bis 25% (v/w)

Montmorillonite KSF® 1 bis 50% (w/w)

Amberlite 15® 1 bis 50% (w/w)

CrCl ₂ , A1C1 ₃ 1 bis 20% (w/w)

Si0 ₂ -MgCl ₂ 20 bis 200% (w/w)

SILP 10-200% (w/w)

Dabei sind bei einer Konzentration von etwa 10% (w/v) D-Fructose die angegebenen Werte unproblematisch, bei höheren Fructose-Konzentrationen ist die Menge der Katalysatoren so zu begrenzen, dass die Fructose in der verbleibenden Lösungsmittelmenge noch gelöst werden kann.

Das Verfahren in Stufe B) gemäß vorliegender Erfindung wird bei geeigneten Temperaturen durchgeführt. Geeignete Temperaturen schließen, insbesondere wenn NMP als

Lösungsmittel verwendet wird, Temperaturen von 100 bis 220°C, bevorzugt von 115 bis 200°C, insbesondere bevorzugt 135 bis 185°C ein.

Die Reaktionen in Stufe B) unter Verwendung von NMP als Lösungsmittel wurden experimentell durchgehend in geschlossenen Gefäßen (Batch, Mikrowelle) durchgeführt, ohne aktive Druckkontrolle. Aus den Mikrowellenläufen kann man als Maximaldruck bei NMP etwa 2-4 bar ansetzen, stark abhängig von den Additiven. Wird z.B. HCl als

Katalysator eingesetzt, so steigt der entstehende Druck auf bis zu 15 bar an. Im

kontinuierlichen Betrieb wurde ein konstanter Rückdruck zur Vermeidung des Siedens des Lösemittels, etwa bis zu 40 bar angelegt. Druck entsteht entweder als Dampfdruck von Lösungsmittel(n) oder Additiven oder es wird ein systembedingter (Pump-)Druck angelegt. Für den Reaktionsmechanismus erscheint der Druck aber nicht entscheidend.

Es hat sich herausgestellt, dass das hauptsächlich entstehende Furanderivat in einem

Verfahren gemäß vorliegender Erfindung Hydroxymethylfurfural (HMF) der Formel

Hydroxymethylfurfural (HMF)

ist.

In einem weiteren Aspekt ist ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass das Furanderivat Hydroxymethylfurfural ist.

In einem Verfahren nach vorliegender Erfindung soll unter„HMF-Selektivität" jener Anteil der verbrauchten D-Fructose verstanden werden, der zu HMF umgesetzt wird.

Furanderivate, die mit einem Verfahren nach vorliegender Erfindung hergestellt werden, können entweder direkt verwendet werden oder in weiteren chemischen Reaktionen zu Folgeprodukten umgesetzt werden. Beispielsweise kann Hydroxymethylfurfural weiter zu 2,5-Furandicarbonsäure (FDC

2,5-Furandicarbonsäure (FDCA) oxidiert werden. FDCA eignet sieht sich bekanntlich als Monomer zur Herstellung von Polymeren wie zum Beispiel Polyethylenfuranoat (PEF), das ähnlich eingesetzt werden kann wie Polyethylenterephthalat (PET), zum Beispiel für Hohlkörper, insbesondere Flaschen wie z.B. Getränke-Flaschen, Flaschen für Kosmetika oder Flaschen für Reinigungsmittel. Bei gleichzeitiger Verwendung von Ethylenglycol aus regenerativen Quellen und FDCA, welches zugänglich ist aus HMF, hergestellt in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung, kann PEF gewonnen werden, das praktisch vollständig aus nachwachsenden Rohstoffen besteht.

In einem weiteren Aspekt ist die vorliegende Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass hergestellte Furanderivate weiter umgesetzt werden, z.B. dass Hydroxymethylfurfural weiter zu 2,5-Furandicarbonsäure oxidiert wird, das gegebenenfalls einer Polymerisation unterworfen wird, z.B. zur Herstellung von Polymeren, wie etwa Polyethylenfuranoat (PEF) eingesetzt wird.

Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1

Zeigt Ergebnisse bei der Dehydratisierung von D-Fructose in N-Methyl-2-pyrrolidon mit Schwefelsäure als Katalysator gemäß Beispiel 5

Fig. 2 und Fig. 3

Zeigen Ergebnisse bei der Dehydratisierung von D-Fructose in N-Methyl-2-pyrrolidon mit Schwefelsäure als Katalysator - Durchführung im Mikrowellenreaktor gemäß Beispiel 12

Fig. 4 und Fig. 5

Zeigen Ergebnisse bei der Dehydratisierung von D-Fructose in N-Methyl-2-pyrrolidon mit Salzsäure als Katalysator - Durchführung im Mikrowellenreaktor gemäß Beispiel 13

Fig. 6

Zeigt Ergebnisse bei der Dehydratisierung von D-Fructose in N-Methyl-2-pyrrolidon mit Montmorillonit KSF® als Katalysator - Durchführung im Mikrowellenreaktor gemäß Beispiel 14

Fig. 7

Zeigt Ergebnisse bei der Dehydratisierung von D-Fructose in N-Methyl-2-pyrrolidon mit Salzsäure als Katalysator - Reaktion im Durchflussreaktor gemäß Beispiel 15 Fig. 8

Zeigt eine Übersicht der getesteten Bedingungen bei der Dehydratisierung von D-Fructose

Fig. 9

Zeigt einen schematischen Reaktionsaufbau für stopped flow Mikrowellenreaktionen und continuous flow Reaktionen zur Herstellung von Furanderivaten aus D-Fructose

In den folgenden Beispielen sind alle Temperaturangaben in Grad Celsisus (°C).

Die folgenden Abkürzungen werden verwendet:

EtOAc Ethylacetat

FDCA Furandicarbonsäure

h Stunde(n)

HMF 5 -Hydroxymethylfurfural

HPLC High-performance liquid chromatography

IPA Isopropylalkohol (2-Propanol)

LS Lävulinsäure

MeOH Methanol

NMP N-Methylpyrrolidon (N-Methyl-2-pyrrolidon)

PET Polyethylenterephthalat

PEF Polyethylenfuranoat

RT Raumtemperatur

SILP Supported Ionic Liquid Phase

TFA Trifluoressigsäure

Beispiel 1

Umsatz von D-Glucose zu D-Fructose durch eine Xylosereduktase und eine

Sorbitoldehydrogenase unter der Verwendung einer Alkoholdehydrogenase zum Recycling des NADPH und einer Lactatdehydrogenase zum Recycling des NAD ⁺

Ein 0,5 ml Ansatz enthält 50 mg/ml D-Glucose und 6 U/ml der rekombinanten

Xylosereduktase aus Candida tropicalis (überexprimiert in E.coli BL21 (DE3)) und 0,1 mM NADP ⁺ . Zur Regeneration des Kofaktors werden 7 % (v/v) IPA und 6 U/ml der

rekombinanten Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir (überexprimiert in E.coli BL21 (DE3)) zugefügt. Die Enzyme werden in Form von Zell-Lysat eingesetzt. Die

Reaktion findet für 24 h bei 40° C und pH = 9 (50 mM Tris-HCl-Puffer) unter

kontinuierlichem Schütteln (900 rpm) in einem offenen System statt. Das offene System führt zur Entfernung des gebildeten Acetons, was die Reaktion in Richtung D-Sorbitol- Bildung treibt. Im offenen System verdampfen Wasser und IPA ebenfalls, sodass diese nach 6 h und 21 h nachdosiert werden. Dabei werden jeweils wieder ein Gesamtvolumen von 0,5 ml sowie eine IPA-Konzentration von 7 % (v/v) eingestellt. Nach 24 h wird das

Reaktionsgefäß bei 60°C unter Vakuum inkubiert, um die Enzyme zu deaktivieren und die organischen Lösungsmittel zu verdampfen. Nach dem Abkühlen auf RT werden die rekombinante D-Sorbitoldehydro genäse aus Bacillus subtilis (überexprimiert in E.coli BL21 (DE3)) in einer Endkonzentration von 5 U/ml, ZnCl ₂ in einer Endkonzentration von 1 mM und NAD ⁺ in einer Endkonzentration von 0,1 mM zugefügt. Zur Kofaktor- Regenerierung werden 5 U/ml (Endkonzentration) Laktat-Dehydrogenase aus Kaninchenmuskel (Sigma Aldrich) und 300 mM Pyruvat eingesetzt. Der Ansatz wird auf 0,5 ml mit Wasser aufgefüllt. Die Reaktion findet für weitere 24 h bei 40°C unter kontinuierlichem Schütteln (900 rpm) im geschlossenen System statt. Es wird ein Umsatz der D-Glucose zu D-Fructose von >90 erreicht.

Beispiel 2

Umsatz der D-Glucose zu D-Fructose durch eine Xylosereduktase und eine Sorbitoldehydrogenase unter der Verwendung einer Alkoholdehydrogenase zum Recycling des NADPH und einer Oxidase zum Recycling des NAD ⁺

Ein 0,5 ml Ansatz enthält 50 mg/ml D-Glucose, 6 U/ml der rekombinanten Xylosereduktase aus Candida tropicalis (überexprimiert in E.coli BL21 (DE3)) und 0,1 mM NADP ⁺ . Zur Regeneration des Kofaktors werden 7 % (v/v) IPA und 6 U/ml der rekombinanten

Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir (überexprimiert in E.coli BL21 (DE3)) zugefügt. Die Enzyme werden in Form von Zell-Lysat eingesetzt. Die Reaktion findet für 24 h bei 40°C und pH = 8 (50 mM Tris-HCl-Puffer) unter kontinuierlichem Schütteln (900 rpm) in einem offenen System statt. Das offene System führt zur Entfernung des entstehenden Acetons, was die Reaktion Richtung D-Sorbitol-Bildung treibt. Im offenen System verdampfen Wasser und IPA ebenfalls, sodass diese nach 6 h und 21 h nachdosiert werden. Dabei werden jeweils wieder ein Gesamtvolumen von 0,5 ml sowie eine IPA- Konzentration von 7 % (v/v) eingestellt. Nach 24 h wird das Reaktionsgefäß bei 60°C unter Vakuum inkubiert um die Enzyme zu deaktivieren und IPA, sowie entstandenes Aceton zu

verdampfen. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur werden die rekombinante D- Sorbitoldehydrogenase aus Bacillus subtilis (überexprimiert in E.coli BL21 (DE3)) in einer Endkonzentration von 5 U/ml, CaCl ₂ in einer Endkonzentration von 1 mM und eine

Mischung (1: 1) aus NAD ⁺ und NADH in einer Endkonzentration von 0,1 mM zugefügt. Zur Kofaktor- Regenerierung werden 10 U/ml (Endkonzentration) der NADH-Oxidase aus Leuconostoc mesenteroides (überexprimiert in E.coli BL21 (DE3)) eingesetzt. Die Enzyme werden in Form von Zell-Lysat eingesetzt. Der Ansatz wird auf 0,5 ml mit Wasser aufgefüllt. Die Reaktion findet für weitere 24 h bei 40°C unter kontinuierlichem Schütteln (900 rpm) im offenen System statt, um genug Sauerstoffversorgung für die NADH-Oxidase aus der Luft zu gewährleisten. Im offenen System bei 40°C verdampft Wasser. Es wird daher nach 6 h und 21 h mit Wasser auf 0,5 ml aufgefüllt. Es wird ein Umsatz der D-Glucose zu D-Fructose von ca. 98% erreicht.

Beispiel 3

Aufarbeitung und Analytik der Zucker

Der Ansatz wird für 10 min bei 65°C inkubiert um die Enzyme zu deaktivieren und anschließend zentrifugiert. Der Überstand wird dann über einen 0,2 μΜ PVDF Filter filtriert und mittels Ligand-Exchange-HPLC analysiert (Agilent Technologies, Inc.). Aufgetrennt werden Zucker und Polyole dabei über eine Blei-Säule von Showa Denko K.K. (Shodex® Sugar SP0810) mit einem Fluss von 0,5 ml/min Wasser (VWR International GmbH, HPLC Grade) bei 80°C. Die Detektion erfolgt mittels Lichtbrechungsdetektor (RID, Agilent 1260 Infinity®, Agilent Technologies, Inc.). Es wird ein Inlinefilter von Agilent Technologies, Inc. sowie als Vorsäulen eine Anionen- Austauscher-Säule (Shodex® Axpak-WAG), eine Reversed-Phase Säule (Shodex® Asahipak® ODP-50 6E) und eine Zucker- Vorsäule (SUGAR SP-G), jeweils von Showa Denko K.K., verwendet.

Beispiel 4

Materialien und Methoden für die Umsetzung von D-Fructose zu Furanderivaten

Im Rahmen dieser Erfindung wurden Dehydratationsreaktionen von D-Fructose zu HMF unter verschiedenen Reaktionsbedingungen durchgeführt, wahlweise als Standart-Batch- Prozess, unter Mikrowellen-assistierter Erhitzung oder mittels "continuous flow"- Bedingungen. Fig. 8 zeigt eine Übersicht über die getesteten Bedingungen.

Überraschenderweise wurde gefunden, dass NMP als Lösungsmittel bei der Reaktion im Vergleich zu bisher bekannten Systemen in Kombination mit homogenen oder heterogenen Katalysatoren sowohl im Mikrowellen-assistierten-Verfahren als auch unter "continuous flow"-Bedingungen höhere Umsätze liefert.

Synthese von SiÖ ₂ -MgCl ₂

Si0 ₂ -MgCl ₂ wurde hergestellt in Anlehnung an eine Vorschrift von Yasuda et al. (Yasuda, M.; Nakamura, Y.; Matsumoto, J.; Yokoi, H. Shiragami, T. Bull. Chem. Soc. Jpn. 2011, 84, 416-418).

Synthese von SILPs

Der SILP Katalysator wurde entsprechend bekannter Vorschriften (Fu, S.-K.; Liu, S.-T. Synth. Commun. 2006, 36, 2059-2067) unter Verwendung von N-Methylimidazol hergestellt. Zur Immobilisierung wurde die erhaltene ionische Flüssigkeit mit 200 Gew.- Silica-Gel in trockenem Chloroform (100 mL pro 10 g Si0 ₂ ) vermischt und 24 h auf 70 °C erhitzt. Der erhaltene Feststoff wurde abfiltriert, mit Chloroform gewaschen und unter reduziertem Druck getrocknet. Das erhaltene Silica-Gel wies eine Beladung von ca. 16 Gew.- an Katalysator auf.

Allgemeine Bedingungen Batch Reaktionen Falls nicht anders beschrieben wurden alle Batch-Reaktionen im 4 mL Schraubdeckelglas durchgeführt. Die Erwärmung wurde in geeigneten Aluminiumblöcken bis zur gewünschten Temperatur durchgeführt.

Mikrowellenreaktionen im Batch-V erfahren

Mikrowellen-Reaktionen wurden im Batch- Verfahren an einer Biotage-Initiator Sixty laboratory Mikrowelle durchgeführt, die mit einem Autosampier ausgerüstet war, um sequentielle Reaktionsführungen zu ermöglichen. Das Absorbtionslevel wurde auf

Maximalwert eingestellt, wodurch die maximale Energiezufuhr automatisch auf 400 W geregelt wurde.

Stopped flow Mikrowellenreaktionen und continuous-flow Reaktionen

Stopped flow Reaktionen zur Optimierung einer semi-kontinuierlichen Prozessführung wurden an einem an einem CEM® Discover System mit CEM® Voyager Upgrade und mittels externem Drucksensor durchgeführt. Für Reaktionen in kontinuierlicher

Prozessführung wurde ein kartuschenbasiertes Reaktor System X-Cube von ThalesNano®, ausgerüstet mit einem Gilson® GX-271 Autosampier zur automatischen Produktsammlung, verwendet. Zwei Quarzsand Kartuschen (CatCart®, 70 x 4 mm) wurden hierbei als

Reaktionszone eingebaut.

Alternativ wurde eine Perfluoralkoxyalkan-Kapillare eingesetzt (PFA-Kapillare, 0.8 mm Innendurchmesser, 1.6 mm Außendurchmesser), welche um einen beheizbaren

Aluminiumzylinder gewickelt wurde. Die Substrate wurden mittels einer Shimadzu LC- 10AD HPLC Pumpe in der gewünschten Flussrate zugegeben. Exakte Volumina (Säule 16,0 mL; Totvolumen vor und nach der Säule jeweils 1,0 mL) wurden bestimmt, in dem definierte Flussraten des reinen Lösungsmittels mit einer Digitalstoppuhr verfolgt wurden. Der Reaktionsaufbau ist in Fig. 9 dargestellt.

Analyse der Reaktionen zur Umsetzung von D-Fructose zu Furanderivaten

Zur quantitativen HPLC-Analyse wurden Proben der Reaktionssamples (22 μL· falls nicht anders angegeben) mit entionisiertem Wasser auf 1 mL verdünnt. Bei Reaktionsproben, die eine unterschiedliche Konzentration aufwiesen, wurde die Verdünnung so angepasst, dass die maximale Konzentration 2 mg/ml nicht überschritt. Zu dieser Lösung wurden 100 μΐ _^ 3-Hydroxybenzylalkohol als interner Standard

hinzugegeben, woraufhin die Probe gründlich durchmischt wurde. Feste Rückstände wurden mittels Zentrifugieren (5 min, 20000 G) oder Filtration (Phenex PTFE, 4 mm, 0.2 μιη) abgetrennt. Quantifizierung erfolgte ausgehend von den Flächen der Peaks im RI-Spektrum im Vergleich zum internen Standard.

Die Proben wurden mittels HPLC an einem Thermo Scientific® Surveyor Plus System oder einem Shimadzu® Nexera System jeweils ausgestattet mit PDA Plus- und RI Detektor analysiert. Für die Trennung wurde als stationäre Phase eine Ionenauschlusssäule von Phenomenex® (Rezex RHM-Monosaccharide H+ (8%), 150 x 7.8 mm, aufgebaut aus quervernetzter Matrix von sulfoniertem Styrol und Divinylbenzol, H ⁺ -Form) und ein

Laufmittelgemisch aus Wasser (HPLC-grade) und 0,1 % TFA (HPLC-grade) als Eluent verwendet. Die Säulentemperatur wurde konstant und auf 85 °C gehalten, wobei die Laufzeit auf 25 Minuten optimiert wurde. Produktquantifizierung wurde anhand eines internen Standards durch Integration des Rl-Signals durchgeführt. Mittels PDA wurden zusätzlich die Wellenlängen 200 nm, 254 nm und 280 nm zur weiteren Reaktionsanalyse aufgezeichnet.

GP1 - D-Fructose-Dehydratisierung im Batch- 'erfahren

In einer Standardreaktion zur Reaktionsoptimierung wurden 100 mg D-Fructose (0,56 mmol) und der jeweilige Katalysator in der gewünschten Menge in ein Glasvial gegeben und mit 1 mL frisch destilliertem NMP versetzt. Die erhaltenen Lösung/Suspension wurde auf die gewählte Temperatur erhitzt und für die gewünschte Zeit reagieren gelassen.

GP2 - D-Fructose-Dehydratisierung im Mikrowellen-Batch- 'erfahren

In einer Standardreaktion zur Reaktionsoptimierung wurden 100 mg D-Fructose (0,56 mmol) und der jeweilige Katalysator in der gewünschten Menge in ein Mikrowellen-Gefäß (0,5 - 2,0 mL) gegeben. Das Gefäß wurde mit einem Rührmagneten ausgestattet und mit 1 mL NMP aufgefüllt. Die Strahlungsintensität der Mikrowelle wurde von einem

firmeneigenen Regulationsalgorithmus automatisch eingestellt, um die gewünschte

Temperatur zu erreichen. Eine schnelle Kühlung des Reaktionsgefäßes wurde mittels eingeblasener Druckluft von mindestens 6 bar realisiert.

GP3 - D-Fructose-Dehydratisierung im Mikrowellen stopped flow Verfahren In einer Standardreaktion zur Reaktionsoptimierung wurden eine D-Fructose Standardlösung (1 mL; c = 100 mg/mL in NMP) und Salzsäure (100 μί; c = 1 mol/L) in ein

Mikrowellengefäß gefüllt und mit einem Rührmagneten versehen. Nach Versiegelung des Vials mittels Snap-Cap wurde die Lösung für die gewünschte Zeit auf die gewünschte Temperatur erhitzt. Um eine schnellstmögliche Erwärmung herbeizuführen wurde die zugeführte Energie entsprechend der nachfolgenden Tabelle 1 eingestellt.

Tabelle 1

Leistungseinstellung der Mikrowelle und zugehörige Temperaturen

Eine schnelle Kühlung des Reaktionsgefäßes wurde mittels eingeblasener Druckluft von mindestens 6 bar realisiert.

GP4 - D-Fructose-Dehydratisierung im Kartuschen-basierten Reaktor sy stein

In einer Standardreaktion zur Reaktionsoptimierung wurde eine D-Fructose Standardlösung (1 mL; c = 100 mg/mL in NMP) mit Salzsäure (c = 1 mol/L) gemischt und durch eine Reagenzpumpe in das Reaktions System gepumpt. Während des Aufheizprozesses wurden mehrere Vorproben entnommen, um eine stabile Temperatur und eine stabile Flussrate zu überwachen. Als Reaktionstemperatur wurden 150°C, 180°C und 200°C gewählt, wobei der Reaktionsdruck auf 40 bar reguliert wurde. Hierfür wurden Flussraten zwischen 0,2 und 0,6 ml/min gewählt. Reaktionsproben wurden in 2,5 mL Mengen aufgefangen und analysiert.

Beispiel 5

Verwendung von Schwefelsäure als Katalysator zur Dehydratisierung von D-Fructose

Es wurden verschiedene Temperaturen, Reaktionszeiten und Säurekonzentrationen verglichen. Die Reaktionen wurden nach„GP1" (Beispiel 4) durchgeführt. Als Katalysator wurde entweder 100 μΐ 1 N Schwefelsäure oder 10 μΐ konzentrierte Schwefelsäure verwendet. In Tabelle 2 sind die Ergebnisse zusammengefasst. Tabelle 2

Schwefelsäure als Katalysator zur Dehydratisierung von D-Fructose

Die Bildung schwarzer unlöslicher Polymere und Humine wurde unter den verwendeten optimalen Bedingungen nicht beobachtet. Um den Verlauf der Reaktion zu analysieren wurde eine Zeitreihe für eine repräsentative Reaktion aufgenommen (H ₂ S0 ₄ conc, 150°C, siehe Fig. 1.

Beispiel 6

Verwendung von Chrom-(II)-chlorid als Katalysator zur Dehydratisierung von D- Fructose

Wie von Zhao, H.; Holladay, J. E.; Brown, H.; Zhang, Z. C. Science 2007, 316, 1597-1600 beschrieben, kann Chrom-(II)-chlorid als effizienter Katalysator zur Dehydratisierung von D-Fructose eingesetzt werden. In diesem Beispiel ist der Effekt CrCl ₂ in N-Methyl-2- pyrrolidon gezeigt. Die Experimente wurden nach Vorschrift„GP1" (Beispiel 4) durchgeführt. Während relative geringe Ausbeuten an HMF erreicht wurden, konnten signifikante Mengen an teerartigen Verbindungen beobachtet werden (Tabelle 3).

Tabelle 3

Chrom- (II) -chlorid als Katalysator zur Dehydratisierung von D-Fructose

Menge ReaktionsFructose- HMF HMF LS

Temp.

Katalysator zeit Verbrauch Ausbeute Selektivität Ausbeute

10 mg CrCl ₂ 100°C 3 h 86% 51% 59% < 1%

10 mg CrCl ₂ 150°C 3 h 100% 39% 39% < 1% Beispiel 7

Verwendung von MontmoriUonit KSF® als Katalysator zur Dehydratisierung von D- Fructose

100 mg D-Fructose wurde in Gegenwart von 1 ml N-Methyl-2-pyrrolidon unter Rühren inkubiert (Vorschrift„GPl", Beispiel 4). Als Reaktionszeit wurde einheitlich 3 h gewählt. Dabei wurden unterschiedliche Mengen an Montmorrilonite KSF® als Katalysator zugegeben. Tabelle 4 fasst die Ergebnisse zusammen. Unter den besten Bedingungen konnte eine HMF- Ausbeute von 61 % bei einer HMF-Selektivität von 63 % erreicht werden.

Tabelle 4

MontmoriUonit KSF® als Katalysator zur Dehydratisierung von D-Fructose

Fructose- HMF HMF LS

Katalysator Temp. Teer

Verbrauch Ausbeute Selektivität Ausbeute

1 mg 120°C 37% 11% 31% < 1% nein

3 mg 120°C 54% 20% 38% < 1% nein

5 mg 120°C 65% 30% 46% < 1% nein

7 mg 120°C 73% 32% 44% < 1% nein

10 mg 120°C 80% 41% 52% < 1% nein

20 mg 120°C 90% 43% 48% < 1% nein

40 mg 120°C 94% 43% 46% < 1% nein

1 mg 130°C 31% 11% 35% < 1% nein

3 mg 130°C 73% 35% 48% < 1% nein

5 mg 130°C 87% 46% 53% < 1% nein

7 mg 130°C 92% 50% 55% < 1% nein

10 mg 130°C 94% 49% 52% < 1% nein

20 mg 130°C 96% 54% 57% < 1% nein

40 mg 130°C 97% 54% 55% < 1% ja

1 mg 140°C 72% 30% 42% < 1% nein

3 mg 140°C 91% 46% 51% < 1% nein

5 mg 140°C 95% 53% 56% < 1% nein

7 mg 140°C 96% 53% 55% < 1% nein Fructose- HMF HMF LS

Katalysator Temp. Teer

Verbrauch Ausbeute Selektivität Ausbeute

10 mg 140°C 98% 55% 56% < 1% nein

20 mg 140°C 98% 56% 57% < 1% nein

40 mg 140°C 99% 56% 56% < 1% ja

1 mg 150°C 94% 44% 46% < 1% nein

3 mg 150°C 96% 52% 54% < 1% nein

5 mg 150°C 98% 56% 57% < 1% nein

7 mg 150°C 98% 57% 59% < 1% nein

10 mg 150°C 98% 58% 59% < 1% ja

20 mg 150°C 97% 61% 63% < 1% ja

40 mg 150°C 97% 61% 63% < 1% ja

Beispiel 8

Verwendung von Amberlite 15® als Katalysator zur Dehydratisierung von D-Fructose

Dieses Beispiel zeigt die Verwendung eines starken Ionenaustauschers mit Sulfonsäureresten basieren auf einem makro vernetzen Harz. 100 mg D-Fructose wurde in Gegenwart von 1 ml N-Methyl-2-pyrrolidon 3 h bei 100°C unter Rühren inkubiert (Vorschrift„GP1, Beispiel 4). Dabei wurde Amberlite 15® als Katalysator zugegeben. In Tabelle 5 ist das Ergebnis dieses Experiments gezeigt. Im Gegensatz zu Montmorillonit KSF® konnte bei der relativ niedrigen Temperatur eine höhere Ausbeute erreicht werden. Die Bildung von teerartigen Verbindungen wurde vermieden.

Tabelle 5

Amberlite 15® als Katalysator zur Dehydratisierung von D-Fructose

Beispiel 9

Verwendung von Si0 ₂ -MgCl ₂ als Katalysator zur Dehydratisierung von D-Fructose

Da ein Silicagel-Magnesiumchlorid- Komplex katalytische Aktivität bei der

Dehydratisierung von Kohlenhydraten in Acetonitril zeigte (Yasuda, M.; Nakamura, Y.; Matsumoto, J.; Yokoi, H. Shiragami, T. Bull. Chem. Soc. Jpn. 2011, 84, 416-418), wurde dieser Katalysator auf seine Eignung in N-Methyl-2-pyrrolidon getestet. Unter

Reaktionsbedingungen wie in„GP1" (Beispiel 4) wurde im besten Fall eine Ausbeute von 26% HMF erreicht (siehe Tabelle 6). Wurde allerdings lediglich Silica-Gel verwendet, sank die Ausbeute auf unter 1 %. Dabei wurde die Bildung großer Mengen teerartiger

Verbindungen beobachtet.

Tabelle 6

Si0 ₂ -MgCl ₂ als Katalysator zur Dehydratisierung von D-Fructose

Beispiel 10

Verwendung von AICI3 als Katalysator zur Dehydratisierung von D-Fructose

AICI ₃ wurde als Beispiel für einen Lewissäure-Katalysator unter Reaktionsbedingungen „GP1" (Beispiel 4) getestet. Dazu wurde frisch sublimiertes AICI ₃ verwendet. Es wurden ähnliche Ergebnisse wie mit Amberlite 15® erzielt. Der Katalysator ist allerdings

Hydrolyse-empfindlich und kann daher nicht für wiederholte Anwendungen oder in kontinuierlichen Prozessen eingesetzt werden. Es entstanden außerdem größere Mengen an teerartigen Verbindungen (Ergebnis siehe Tabelle 7).

Tabelle 7

AICI ₃ als Katalysator zur Dehydratisierung von D-Fructose

Beispiel 11

Verwendung von SILPs kombiniert mit Chrom- (II) -chlorid als Katalysator zur Dehydratisierung von D-Fructose

Unter Anwendung der Reaktionsbedingungen„GP1" (Beispiel 4) wurde eine Kombination aus CrCl ₂ und SILPs (silica-supported ionic liquid phase, siehe Beispiel 4) getestet. Nach 20 min konnte eine Ausbeute von fast 50 % HMF erreicht werden. Diese konnte allerdings bei längeren Reaktionszeiten nicht gesteigert werden. Außerdem konnte bei kürzeren

Reaktionszeiten eine Umwandlung von D-Fructose zu D-Glucose festgestellt werden (Tabelle 8).

Tabelle 8

SILPs kombiniert mit CrCl ₂ als Katalysator zur Dehydratisierung von D-Fructose

Beispiel 12

Verwendung von Schwefelsäure als Katalysator zur Dehydratisierung von D-Fructose (Mikrowellen-Erhitzung)

Um eine bessere Kontrolle über Aufheizphase und Abkühlphase sowie über die

Reaktionstemperatur zu erreichen, wurde ein Mikrowellen-basiertes System zur Temperatur- Einstellung angewendet. Unter Verwendung von N-Methyl-2-pyrrolidon wurden Proben wie in Vorschrift "GP2" (Beispiel 4) beschrieben hergestellt. Unter den verwendeten

Reaktionsbedingungen wurde keine Bildung von teerartigen Verbindungen festgestellt. Es konnte maximal ein vollständiger Umsatz von D-Fructose und eine Ausbeute von 83 % HMF erreicht werden (Fig. 2 und Fig. 3).

Beispiel 13

Verwendung von Salzsäure als Katalysator zur Dehydratisierung von D-Fructose (Mikrowellen-Erhitzung)

Die Dehydratisierung von D-Fructose wurde in einem stopped-flow Mikrowellenreaktor nach Vorschrift„GP3" (Beispiel 4) durchgeführt. Höhere Temperaturen waren notwendig, um einen vollständigen Umsatz von D-Fructose zu erreichen. Während bei niedrigeren Temperaturen längere Reaktionszeiten die Ausbeute von HMF verbesserten, sank diese bei höheren Temperaturen mit steigender Reaktionszeit (Abbildungen 4 und 5. Bei

vollständigem Umsatz von D-Fructose konnte eine maximale Ausbeute von 89 % HMF erreicht werden.

Beispiel 14

Verwendung von Montmorillonit KSF® als Katalysator zur Dehydratisierung von D- Fructose (Mikrowellen-Erhitzung)

Da mit Mikrowellen- Verfahren eine schnelle Aufheizung/Abkühlung sowie eine sehr gute Kontrolle der Temperatur im Reaktionsgefäß erfolgen kann, wurde auch der heterogene Katalysator Montmorillonit KSF® zur Dehydratisierung von D-Fructose in N-Methyl-2- pyrrolidon verwendet. Es wurden Reaktionsbedingungen nach„GP2" (Beispiel 4) verwendet. Die Reaktionszeit lag bei 5 min. Obwohl lediglich vergleichsweise geringe D- Fructose-Umsätze und HMF- Ausbeuten erreicht wurden, konnte die Bildung von teerartigen Verbindungen vermieden werden (Ergebnisse siehe Tabelle 9).

Tabelle 9

Montmorillonit KSF® als Katalysator zur Dehydratisierung von D-Fructose (Mikrowellen- Erhitzung)

Um die besten Reaktionsbedingungen zu finden wurden verschiedene Reaktionszeiten unter Verwendung von 20 mg Katalysator bei 150°C getestet (Abbildung 6).

Beispiel 15 Verwendung von Schwefelsäure zur Katalyse der Umsetzung von D-Fructose zu Furanderivaten (kontinuierlicher Prozess)

D-Fructose (10 % w/v) und konzentrierte Schwefelsäure (1 % v/v) wurden in N-Methyl-2- pyrrolidon gelöst. Die Mischung wurde mittels einer PFA-Kapillare unter kontinuierlichem Fluss durch den Reaktor gepumpt (Reaktionstemperatur 150°C). Nachdem die ersten 18 ml verworfen wurden, wurden weitere 10 ml zur Analyse gesammelt. Durch eine Reihe von Flussraten wurde der Effekt unterschiedlicher Verweilzeiten im Reaktor getestet (Tabelle 10).

Tabelle 10

Schwefelsäure zur Katalyse der Umsetzung von D-Fructose zu Furanderivaten

(kontinuierlicher Prozess)

Unter den untersuchten Bedingungen wurde keine Bildung von schwarzen unlöslichen Polymeren und Huminen beobachtet.

Beispiel 16

Verwendung von Salzsäure zur Katalyse der Umsetzung von D-Fructose zu

Furanderivaten (kontinuierlicher Prozess)

In diesem Beispiel wurde Salzsäure als Katalysator zur Dehydratisierung von D-Fructose in NMP unter kontinuierlichem Fluss eingesetzt (Reaktionsbedingungen siehe Vorschrift „GP4", Beispiel 4). Eine maximale Ausbeute von 75 % HMF konnte bei einer

Reaktionstemperatur von 180°C und einem Fluss von 0,6 ml/min erreicht werden. Dabei wurde eine Selektivität von 76 % HMF erreicht. Meist lag der Anteil von Lävulinsäure (LS) unter 1 % (Ergebnisse siehe Fig. 7).