本発明は、1の態様において、脂肪組織由 来細胞を培養することを特徴とする、脂肪組 織由来細胞から肝小葉様細胞塊を得る方法に 関するものである。本発明は、肝臓の最小機 能単位である肝小葉に類似する細胞塊を形成 できる点で非常に優れている。脂肪組織由来 細胞とは、内臓脂肪組織または皮下脂肪組織 から得られる細胞または細胞集団、あるいは 間葉系肝細胞、ES細胞の様な幹細胞から分化� ��導された生体内の脂肪組織に含まれる細胞� ��類似した細胞または細胞集団をいう。通常� ��は、脂肪組織由来細胞とは、脂肪組織由来� ��細胞、脂肪組織由来間質細胞、後述の脂肪� ��織由来多系統前駆細胞、脂肪前駆細胞また� ��これらに類似する細胞のいずれか、あるい� ��これら全てまたは一部からなる混合物を含� ��細胞集団をいう。脂肪組織由来細胞は、当� ��者に公知の手段・方法により脂肪組織など� ��ら得ることができる。さらに、得られた脂� ��組織由来細胞を、当業者に公知の手段・方� ��を用いて増殖させ、例えば、形質を安定さ� ��てもよい。脂肪組織由来細胞を、デキサメ� ��ゾンおよびアスコルビン酸を含む培地、例� ��ば、ITS(10.0mg/L インスリン、5.5mg/L トラン� �フェリン、6.7ng 亜セレン酸ナトリウム)、1nM  デキサメサゾン、0.1mM アスコルビン酸、10n g/mL rhEGF、および5% FCSを添加した60% DMEM(低� �ルコース)および40% MCDB201培地中、フィブロ� ��クチンコートディッシュなどの培養器にて� ��養することにより、脂肪組織由来細胞を増� ��させてもよい。

 脂肪組織由来細胞が由来する動物種は、� ��に限定されず、好ましくは、例えば、マウ� ��、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウ� ��、サルなどを含む哺乳類、より好ましくは� ��ヒトである。得られた肝小葉様細胞塊を用� ��て疾患を予防または治療すべき動物種と同� ��の動物種、あるいは同一個体の脂肪組織由� ��細胞を用いることがより好ましい。脂肪組� ��は生体内に十分量存在し、比較的容易に得� ��れるため、例えば、死体などの限られた材� ��から肝小葉を得る方法などと比較して、本� ��明は非常に優れている。例えば、自己由来� ��脂肪組織由来細胞を用いて本発明の上記方� ��を行い、得られた肝小葉様細胞塊を自己移� ��することで、拒絶反応を危惧することなく� ��硬変などの肝機能の低下により生じる疾患� ��治療することが可能になる。

 肝小葉様細胞塊とは、生体内の肝小葉、� ��よびそれに類似する機能・形態を有する細� ��塊をいい、例えば、肝細胞、胆管上皮細胞� ��内皮細胞、クッパー細胞、肝星細胞などを� ��む。本発明の肝小葉様細胞塊は、個々の肝� ��胞と比べ、十分な量の分泌タンパク質を産� ��できる点、高い代謝能を有する点、高い解� ��能を有する点などで非常に優れている。ま� ��、細胞塊を形成させることで、例えば、移� ��等の目的に用い易いという利点も有する。

 本発明の、脂肪組織由来細胞から肝小葉� ��細胞塊の取得方法は、重要な工程として、� ��分化細胞から肝小葉様細胞塊を形成させる� ��程を含むことが好ましい。本発明の、脂肪� ��織由来細胞から肝小葉様細胞塊の取得方法� ��、重要な工程として、脂肪組織由来細胞か� ��未分化細胞を得る工程をさらに含むことが� ��ましい。これらの工程は、連続して行われ� ��もよいし、あるいは並行して行われてもよ� ��。

 未分化細胞とは、多種多様な細胞、例え� ��、肝前駆細胞、膵前駆細胞、心筋前駆細胞� ��血管内皮前駆細胞、骨芽細胞、軟骨芽細胞� ��どに分化することのできる細胞をいう。未� ��化細胞を得る工程は、得られた未分化細胞� ��増殖させる工程をさらに含んでいてもよい� ��未分化細胞を増殖させることで、肝小葉様� ��胞塊の形成効率を増大させ、得られる肝小� ��様細胞塊の数を増加させることなどが可能� ��ある。未分化細胞を得る工程は、例えば、� ��ーティング、MACS、ロゼッタ形成法などの抗 原抗体反応による方法、密度勾配法、形態的 に選別する方法、単一細胞クローン化などの 既知の方法を用いて行われてもよいし、脂肪 組織由来細胞を浮遊化させた状態で培養し、 アディポスフェアを形成させることにより行 われてもよい。すでに分化した細胞を死滅さ せ、かつ未分化細胞を生存・増殖させること が可能であるため、脂肪組織由来細胞を浮遊 化させた状態で培養し、アディポスフェアを 形成させることが好ましい。浮遊化状態での 培養については、後述する。ここで、アディ ポスフェアとは、未分化細胞を主成分として 含む球状体であると定義する。アディポスフ ェアの形成と次の肝小葉様細胞塊への分化は 、連続してまたは同時に生じ得るので、アデ ィポスフェアは未分化細胞の他に肝細胞、胆 管上皮細胞、内皮細胞、クッパー細胞、肝星 細胞などを含んでいてもよい。

 肝小葉様細胞塊を得る工程は、未分化細� ��を例えば、線維芽細胞増殖因子、肝細胞増� ��因子、オンコスタチンM、上皮増殖因子、お よびジメチルスルホキシドを含む培地にて培 養することにより行われ、好ましくは、かか る工程は、未分化細胞を浮遊化させた状態で 培養することにより行われる。浮遊化させて 培養することで、生体内の肝小葉に類似した 形態を有する細胞塊をより容易に得ることが できる。未分化細胞の浮遊化状態での培養は 、培養容器との接着を防止あるいは抑制して 遊離した状態に細胞を置いて、培養すること を意味する。細胞の浮遊化は種々の公知の手 段・方法で行うことができる。例えば、細胞 の接着を防止あるいは抑制するように処理さ れた、あるいは細胞の接着を防止あるいは抑 制するような材料で作られた培養容器または 装置を用いて細胞を浮遊化状態においてもよ い。培養容器または装置としては、シリコン 処理された培養容器(例えば、シリコン化フ� �スコ)または低接着性培養ディッシュ(例えば 、ハイドロセル(CellSeed))のごとき低接着性培� ��容器などがある。あるいはハンギング・ド� ��ップ培養法を用いて細胞を浮遊化させた状� ��で培養させてもよい。また、浮遊化の開始� ��点において、あるいは浮遊化を継続させる� ��めに、適宜、公知の手段・方法を併用して� ��よい。かかる手段・方法の例としては、ト� ��プシン/EDTA、コラゲナーゼ、Cell Dissociation  Buffer(GIBCO Invitrogen)などの酵素またはキレー� �剤により細胞を遊離させること、スクレー� �ーなどを用いて物理的に細胞を掻き取るこ� �、あるいは細胞回収用温度応答性培養器材(� ��えば、レプセル(CellSeed))にて細胞を培養後� �例えば、20℃で30分間インキュベーションし� ��細胞を剥離させる方法などがある。未分化� ��胞を浮遊化させた状態で培養することによ� ��、上記肝小葉様細胞塊が形成される。

 本発明は、もう1つの態様において、上記 方法により得ることのできる肝小葉様細胞塊 に関するものである。上述の通り、本発明の 肝小葉様細胞塊は肝細胞を含む。例えば、肝 硬変などの肝機能の低下により生じる疾患ま たはその素因を有する対象または該対象と同 種のものの脂肪組織から採取した細胞を用い て上記方法を行い、得られた肝小葉様細胞塊 を該対象に移植することで、肝硬変などの肝 機能の低下により生じる疾患を治療または予 防することなどが可能である。

 本発明は、さらなる態様において、上記� ��法により得ることのできる肝小葉様細胞塊� ��含まれる肝細胞に関するものである。

 本発明は、なおさらなる態様において、� ��記方法により得ることのできる肝小葉様細� ��塊および/またはかかる肝小葉様細胞塊に含 まれる肝細胞を含む、肝機能の低下により生 じる疾患を予防または治療するための医薬組 成物に関するものである。肝機能の低下によ り生じる疾患とは、肝臓の機能の低下のみな らず機能不全により生じる疾患を含み、例え ば、肝炎、肝硬変、肝癌、肝不全、薬剤性肝 障害、アルコール性肝障害、先天性代謝異常 、胆汁うっ滞性肝障害などである。本発明の 医薬組成物において、肝小葉様細胞塊または 肝細胞はPBSのような適当な溶液中に懸濁され ていてもよい。また、本発明の医薬組成物は 、肝小葉様細胞塊または肝細胞の他、それら の肝臓への生着を促進させる物質、肝機能改 善薬、適当な添加剤、賦形剤などを含んでい てもよい。

 本発明はまた、別のさらなる態様におい� ��、肝機能の低下により生じる疾患を予防ま� ��は治療するための医薬品の製造のための、� ��記方法により得ることのできる肝小葉様細� ��塊および/またはかかる肝小葉細胞塊に含ま れる肝細胞の使用に関するものである。

 本発明は、別の態様において、上記培養� ��法により得ることのできる肝小葉様細胞塊� ��よび/またはかかる肝小葉様細胞塊に含まれ る肝細胞を対象に投与することを特徴とする 、肝機能の低下により生じる疾患の治療また は予防方法に関するものである。拒絶反応等 の点から、好ましくは、同一種、あるいは自 己の脂肪組織由来細胞から得ることのできる 肝小葉様細胞塊または肝細胞が本発明におい て用いられる。肝小葉様細胞塊または肝細胞 は、例えば、腎皮膜下、経門脈的に肝臓内、 大網内、腹腔内、脾臓内、皮下などに移植ま たは注射されてもよい。対象は、いずれのも のであってもよく、ヒト対象であってもよい し、ヒト以外の対象、例えば、マウス、サル などの哺乳類であってもよい。肝小葉様細胞 塊または肝細胞の投与量、投与回数などは、 例えば、対象の状態、疾患の重篤度などの種 々の因子に応じて適宜選択される。

 本発明はさらに、肝小葉細胞塊および/ま たはかかる肝小葉様細胞塊に含まれる肝細胞 を投与することを特徴とする、血中ビリルビ ン濃度を低減させる方法に関するものである 。かかる方法は、in vivoおよびin vitroのいず� ��において行われてもよい。

 本発明は、さらに別の態様において、脂� ��組織を培養して肝小葉様細胞塊を得る際に� ��候補物質を培地に添加することを特徴とし� ��肝小葉様細胞塊の形成が、候補物質不含系� ��おける形成と比較して促進されている場合� ��、該候補物質が肝小葉の形成を促進する物� ��であることを示す、肝小葉の形成を促進す� ��物質をスクリーニングする方法に関するも� ��である。上述の通り、肝小葉様細胞塊には� ��細胞が含まれるので、かかる方法は、肝細� ��への分化を促進する物質のスクリーニング� ��法も包含する。候補物質としては種々のも� ��があり、例えば、塩基性線維芽細胞増殖因� ��、肝細胞増殖因子、またはオンコスタチンM のアナログまたは誘導体などが挙げられるが 、これらに限定されない。脂肪組織から肝小 葉様細胞塊を得る際の候補物質の培地への添 加は、脂肪組織由来細胞から未分化細胞を得 る工程、および未分化細胞から肝小葉様細胞 塊を得る工程のいずれか、あるいは両方で1� �または複数回行われてもよい。

 肝小葉様細胞塊の形成は、例えば、顕微� ��観察により形成された肝小葉様細胞塊の数� ��計測すること、培養上清中に分泌されたα-� ��ェトプロテイン、アルブミンなどを例えば� ��ELISAを用いて定量すること、α-フェトプロ� �イン、アルブミン、CYP1B1、グルタミン合成� �素、ケラチン18、ケラチン19などの遺伝子の� ��現を定量的PCRにより測定すること、あるい� ��肝小葉への分化・形成に伴い発現が減少ま� ��は増加することが分かっているマーカー物� ��、例えば、トランスサイレチン、α1-抗トリ プシン、チロシンアミノトランスフェラーゼ 、グルコース-6-ホスファターゼなどを定量的 PCRまたはELISAなどにより測定することなどに� ��り、調べることができる。

 従って、本発明は、さらなる態様におい� ��、上記スクリーニング方法により得ること� ��できる、肝小葉の形成を促進する物質に関� ��るものである。かかる物質を本発明の脂肪� ��織由来細胞から肝小葉様細胞塊を得る方法� ��用いて、得られる肝小葉様細胞塊の数を増� ��させてもよいし、肝小葉様細胞塊の形成速� ��を増大させてもよい。または、かかる物質� ��、肝機能の低下により生じる疾患の治療ま� ��は予防に用いてもよい。

 本発明のさらに別の態様は、脂肪組織由� ��細胞を培養して肝小葉様細胞塊を得る際に� ��候補物質を培地に添加することを特徴とし� ��肝小葉様細胞塊の形成が、候補物質不含系� ��おける形成と比較して抑制されている場合� ��、該候補物質が肝小葉の形成を抑制する物� ��であることを示す、肝小葉の形成を抑制す� ��物質をスクリーニングする方法に関するも� ��である。上述の通り、肝小葉様細胞塊には� ��細胞が含まれるので、かかる方法は、肝細� ��への分化を抑制する物質のスクリーニング� ��法も包含する。候補物質としては、種々の� ��のがあり、例えば、四塩化炭素、フェノバ� ��ビタールなどの肝毒性を有する薬剤のアナ� ��グまたは誘導体などが挙げられるが、これ� ��に限定されない。かかるスクリーニング方� ��により得ることのできる物質は、肝機能の� ��進により生じる疾患の治療または予防に適� ��ていると考えられる。候補物質の培地への� ��加、肝小葉様細胞塊の形成を調べる手段・� ��法については上述の通りである。

 従って、本発明は、さらなる態様におい� ��、上記スクリーニング方法により得ること� ��できる、肝小葉の形成を抑制する物質に関� ��るものである。

 本発明は、なおさらに別の態様において� ��肝小葉の形成を促進または抑制する物質を� ��クリーニングするための上記方法に用いら� ��るキットに関するものである。本発明のキ� ��トは、脂肪組織からの細胞取得手段、培地� ��培養容器、ならびに肝小葉様細胞塊の形成� ��調べる手段等を含んでいてもよい。通常に� ��、取扱説明書をキットに添付する。かかる� ��ットを用いて、上記スクリーニングを迅速� ��つ容易に行うことができる。

 本発明は、もう1つの態様において、脂肪 組織由来細胞を培養して得られた肝小葉様細 胞塊を候補物質を含む培地中で培養し、肝小 葉様細胞塊の活性が、候補物質不含系におけ る活性と比較して増大している場合に、該候 補物質が肝小葉の活性を上昇させる物質であ ることを示す、肝小葉の活性を上昇させる物 質をスクリーニングする方法に関するもので ある。肝小葉の活性とは、肝小葉の解毒作用 、タンパク質合成能、代謝作用などをいう。

 肝小葉様細胞塊の活性の上昇は、例えば� ��培養上清中に分泌されたα-フェトプロテイ� ��、アルブミンなどをELISAなどを用いて定量� �、かかるタンパク質量の増減により、ある� �はα-フェトプロテイン、アルブミン、CYP1B1� �グルタミン合成酵素、ケラチン18、ケラチン 19などの遺伝子の発現を定量的PCRにより測定� ��、かかる遺伝子の発現の増減により、調べ� ��ことができる。候補物質としては種々のも� ��があり、例えば、塩基性線維芽細胞増殖因� ��、肝細胞増殖因子、またはオンコスタチンM のアナログまたは誘導体などが挙げられるが 、これらに限定されない。候補物質の培地へ の添加は、1回または複数回行われてもよい� �

 従って、本発明は、さらなる態様におい� ��、上記スクリーニング方法により得ること� ��できる、肝小葉の活性を上昇させる物質に� ��するものである。かかる物質を本発明の脂� ��組織由来細胞から肝小葉様細胞塊を得る方� ��に用いて、得られる肝小葉様細胞塊の活性� ��増大させてもよい。または、かかる物質を� ��肝機能の低下により生じる疾患の治療また� ��予防に用いてもよい。

 本発明は、別の態様において、脂肪組織� ��来細胞を培養して得られた肝小葉様細胞塊� ��候補物質を含む培地中で培養し、肝小葉様� ��胞塊の活性が、候補物質不含系における活� ��と比較して低減している場合に、該候補物� ��が肝小葉の活性を低減させる物質であるこ� ��を示す、肝小葉の活性を低減させる物質を� ��クリーニングする方法に関するものである� ��候補物質としては種々のものがあり、例え� ��、四塩化炭素、フェノバルビタールなどが� ��げられるが、これらに限定されない。候補� ��質の培地への添加、肝小葉様細胞塊の活性� ��調べる手段・方法については上述の通りで� ��る。

 従って、本発明は、さらなる態様におい� ��、上記スクリーニング方法により得ること� ��できる、肝小葉の活性を低減させる物質に� ��するものである。

 本発明は、なおさらに別の態様において� ��肝小葉の活性を上昇または低減させる物質� ��スクリーニングするための上記方法に用い� ��れるキットに関するものである。本発明の� ��ットは、脂肪組織からの細胞取得手段、培� ��、培養容器、ならびに肝小葉様細胞塊の活� ��を調べる手段等を含んでいてもよい。通常� ��は、取扱説明書をキットに添付する。かか� ��キットを用いて、上記スクリーニングを迅� ��かつ容易に行うことができる。

 本発明は、1の態様において、脂肪組織由 来多系統前駆細胞を含む細胞集団に関するも のである。脂肪組織由来多系統前駆細胞は、 内胚葉、中胚葉、外胚葉などの種々の細胞系 列に分化することができる細胞であって、未 分化マーカーであるIslet-1を発現する細胞を� �う。脂肪組織由来多系統前駆細胞は、脂肪� �織の他、胚性幹細胞などから分化させて得� �ことができる。脂肪組織由来多系統前駆細� �が由来する動物種は特に限定されず、好ま� �くは、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウ� �ギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、サルなどを� �む哺乳類、より好ましくは、ヒトである。� �るいは、かかる細胞集団を用いた再生医療� �より治療されるべき対象と同種または同一� �ものが好ましい。

 本発明の細胞集団は、非所望な夾雑物、� ��えば、赤血球、血管内皮細胞などの脂肪組� ��由来多系統前駆細胞以外の細胞の割合が低� ��ので、培養の容易さ、高い分化効率などの� ��点を有する。かかる夾雑物を除去する手段� ��しては、脂肪組織由来多系統前駆細胞の比� ��との差を利用した手段・方法、例えば、比� ��法、脂肪組織由来多系統前駆細胞の付着性� ��の差を利用した手段・方法、例えば、EDTAの ようなキレート剤、トリプシンのような酵素 を用いた方法、ソーティング、MACSなどの抗� �抗体法、形態的に選別する方法、単一細胞� �ローン化、溶血法などが挙げられる。細胞� �団における夾雑物の低減は、例えば、夾雑� �が有するマーカーをRT-PCR、ELISAなどの方法を 用いて定量することにより、顕微鏡下で視覚 的に、あるいはフローサイトメトリー、免疫 組織染色により確認され得る。

 本発明の細胞集団は、好ましくは、少な� ��とも20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%� ��90%、93%、96%、または99%の脂肪組織由来多系� ��前駆細胞を含む。脂肪組織由来多系統前駆� ��胞がかかる割合含まれることにより、本発� ��の細胞集団は、脂肪組織由来多系統前駆細� ��の維持が容易であること、分化させたとき� ��効率が高いことなどの利点を有する。本発� ��の細胞集団は、脂肪組織由来多系統前駆細� ��以外の他、フィーダー細胞のような脂肪組� ��由来多系統前駆細胞の維持または分化に有� ��な細胞、血管内皮細胞、線維芽細胞などを� ��んでいてもよい。かかる細胞を含むことに� ��り、上記利点が増強され得る。

 本発明は、別の態様において、脂肪組織� ��ら脂肪組織由来多系統前駆細胞を得る方法� ��あって、(a)脂肪組織由来細胞集団から赤血� ��を除去し、前脂肪組織由来多系統前駆細胞� ��団を得て;次に、(b)該前脂肪組織由来多系統 前駆細胞集団から脂肪組織由来多系統前駆細 胞以外の細胞を除去し、脂肪組織由来多系統 前駆細胞を得る、工程を含む方法に関するも のである。本発明により、脂肪組織由来の脂 肪組織由来多系統前駆細胞以外の細胞を低減 させ、脂肪組織由来多系統前駆細胞を高収率 かつ高純度で得ることができる。本発明にお いて、上記工程は、連続して行われてもよい し、あるいは並行して行われてもよい。本発 明のこの態様に用いられる脂肪組織は、生体 内の皮下脂肪組織および内臓脂肪組織のいず れであってもよい。脂肪組織が由来する動物 種は特に限定されず、好ましくは、例えば、 ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ 、ウシ、ウマ、サルなどを含む哺乳類、より 好ましくは、ヒトである。あるいは、本発明 の方法により得ることのできる脂肪組織由来 多系統前駆細胞を用いた再生医療により治療 されるべき対象と同種または同一のものが好 ましい。

 本明細書において用いられる脂肪組織由� ��細胞集団は、少なくとも脂肪組織由来多系� ��前駆細胞を含む細胞集団をいう。脂肪組織� ��来細胞集団は、脂肪組織由来多系統前駆細� ��の他に、赤血球、血管内皮細胞、線維芽細� ��などを含んでいてもよい。脂肪組織由来細� ��集団は、例えば、脂肪組織をコラゲナーゼ� ��どの酵素により、あるいは物理的手段・方� ��により処理し、および/または脂質などを例 えば、遠心分離、フィルター処理により除去 して得られる。

 赤血球は脂肪組織由来多系統前駆細胞を� ��着する性質を有し、これにより、脂肪組織� ��来多系統前駆細胞の収率を低下させ得る。� ��って、脂肪組織由来細胞集団から赤血球を� ��去することが必要になる。脂肪組織由来細� ��集団からの赤血球の除去は、いずれの手段� ��方法により行われてもよく、例えば、赤血� ��とそれ以外の細胞の付着性の差に基づくも� ��以外の手段・方法で行われるものであって� ��よい。好ましくは、かかる除去は、比重法� ��溶血法、フィルター法により、より好まし� ��は、比重法により行われる。比重法は、適� ��な比重の比重液、例えば、Lymphoprepなどの市 販の比重液を用いて行われ得る。用いられる 比重液の比重は、赤血球とそれ以外の細胞の 比重の間のものであればよく、好ましくは、 1.063~1.119、より好ましくは、1.070~1.110、最も� �ましくは、1.077である。

 本明細書において用いられる前脂肪組織� ��来多系統前駆細胞集団は、少なくとも脂肪� ��織由来多系統前駆細胞を含む細胞集団をい� ��。前脂肪組織由来多系統前駆細胞集団は、� ��肪組織由来多系統前駆細胞の他に、血管内� ��細胞、線維芽細胞などを含んでいてもよい� ��上述の通り、前脂肪組織由来多系統前駆細� ��集団は、実質上、赤血球を含まない。赤血� ��を除去して、前脂肪組織由来多系統前駆細� ��集団を形成させることで、続く脂肪組織由� ��多系統前駆細胞以外の細胞の除去が容易か� ��効率よく行われ得る。

 本明細書において用いられる脂肪組織由� ��多系統前駆細胞以外の細胞は、血管内皮細� ��、線維芽細胞などの付着細胞などをいう。� ��脂肪組織由来多系統前駆細胞集団からの脂� ��組織由来多系統前駆細胞以外の細胞の除去� ��、いずれの手段・方法により行われてもよ� ��が、好ましくは、トリプシン以外の物質、� ��り好ましくは、EDTA、EGTAなどのキレート剤� �最も好ましくは、EDTAを用いて行われる。好� ��しくは、かかる除去は、脂肪組織由来多系� ��前駆細胞とそれ以外の細胞との付着性の差� ��基づき、行われるものである。上記の他、� ��えば、フィルター濾過などにより、脂肪組� ��由来多系統前駆細胞以外の細胞を除去する� ��とができる。これらの細胞を除去すること� ��、得られる脂肪組織由来多系統前駆細胞集� ��の純度、および収率が上昇する。

 本発明は、別の態様において、上記脂肪� ��織から脂肪組織由来多系統前駆細胞を得る� ��法により得ることのできる脂肪組織由来多� ��統前駆細胞に関するものである。かかる脂� ��組織由来多系統前駆細胞は、上述の通りIsle t-1を発現する。

 本発明は、さらなる態様において、上記� ��肪組織から脂肪組織由来多系統前駆細胞を� ��る方法により得ることのできる脂肪組織由� ��多系統前駆細胞を含む細胞集団に関するも� ��である。かかる細胞集団は、赤血球、血管� ��皮細胞などの不所望な脂肪組織由来の細胞� ��実質上含まないが、フィーダー細胞などの� ��肪組織由来多系統前駆細胞の維持・分化な� ��に有効な細胞を含んでいてもよい。

 さらに、本発明により、シートを構成す� ��のに十分な量の心筋芽細胞が提供される。� ��って、本発明は、1の態様において、心筋芽 細胞を含むシートを提供するものである。本 明細書において、心筋芽細胞とは、心筋細胞 に分化するよう方向付けられた細胞であって 、α-cardiac actin(α-CA)およびMyosin Light Chain(MLC )を発現している細胞をいう。心筋芽細胞が� �来する動物種は特に限定されず、好ましく� �、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ� �イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、サルなどを含む� �乳類、より好ましくは、ヒトである。ある� �は、かかる心筋芽細胞を含むシートが適用� �れる対象と同種、または同一のものが好ま� �い。例えば、対象と同種または同一動物由� �の心筋芽細胞を含むシートを対象に移植す� �ことで、拒絶反応を危惧することなく重症� �不全を治療することなどが可能となる。

 心筋芽細胞を含むシートとは、心筋芽細� ��を必須構成成分として含む細胞塊をいう。� ��ートにおいて、心筋芽細胞は単層または重� ��のいずれの形態で含まれていてもよい。シ� ��ト形態を有することにより、移植等に用い� ��際の取扱が容易になる。シートの心筋芽細� ��以外の構成成分は、いずれのものであって� ��よく、例えば、脂肪組織由来幹細胞、心筋� ��胞、細胞用のスキャホールド、血管内皮、� ��トリクスなどが挙げられる。シートの大き� ��および厚さは、適用される傷害領域の大き� ��など種々の条件に応じて適宜選択され得る� ��

 シートに含まれる心筋芽細胞の割合は、� ��に限定されず、例えば、かかるシートが適� ��される対象の状態など種々の条件に応じて� ��宜選択され得る。該割合は、例えば、5%、10 %、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、10 0%などである。心筋芽細胞の割合は、当業者� ��既知の手段、例えば、定量的RT-PCRを用いて� ��筋芽細胞マーカー遺伝子であるα-CAまたはML Cを定量することにより、決定され得る。

 本発明のシートの機能は、公知の方法、� ��えば、シートを対象に移植して、移植され� ��対象の心機能を心エコーにより、あるいは� ��張末期径(LVDd)、収縮末期径(LVDs)、左室駆出� ��(%EF)または左室内径短縮率(%FS)などを計測す ることにより評価して、調べることができる 。

 本発明は、もう1つの態様において、脂肪 組織由来幹細胞を培養することを特徴とする 、心筋芽細胞を得る方法を提供する。該方法 により、脂肪組織由来幹細胞から心筋芽細胞 を大量に得ることが可能となる。該方法は、 脂肪組織由来細胞から脂肪組織由来幹細胞を 得る工程を含んでいてもよい。脂肪組織由来 幹細胞とは、内胚葉、中胚葉、外胚葉などの 種々の細胞系列に分化することができる細胞 をいい、未分化マーカーであるIslet-1を発現� �ている脂肪組織由来多系統前駆細胞(ADMPC)を� ��む。脂肪組織由来幹細胞が由来する動物種� ��特に限定されず、好ましくは、例えば、ヒ� ��、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、� ��シ、ウマ、サルなどを含む哺乳類、より好� ��しくは、ヒトである。あるいは、かかる脂� ��組織由来幹細胞から得られた心筋芽細胞を� ��いて治療されるべき対象と同種または同一� ��ものが好ましい。

 好ましくは、本発明の心筋芽細胞を得る� ��法は、脂肪組織由来幹細胞をDMSOまたはOP9培 養上清の存在下で培養する工程を含むもので ある。かかる条件下で脂肪組織由来幹細胞を 培養することにより、該細胞が心筋芽細胞に 分化および/または誘導され得る。かかる培� �に用いられる培地は、適宜選択され得る。� �かる培地は、例えば、レチノイン酸、BMP2、B MP4、TGFβ2、HGF、bFGF、チロキシン、オキシト� �ンまたは脂肪酸濃縮液などの種々の因子を� �むものであってもよい。心筋芽細胞への分� �は、例えば、α-CAまたはMLCなどの心筋芽細胞 マーカーの発現をRT-PCRによって測定すること により、調べることができる。

 従って、本発明は、さらなる態様におい� ��、上記心筋芽細胞を得る方法により得るこ� ��のできる心筋芽細胞を提供するものである� ��かかる心筋芽細胞を心筋梗塞、心筋症など� ��心疾患の治療に用いることもできるし、あ� ��いは心筋芽細胞を含むシートの材料として� ��いることもできる。

 本発明は、別の態様において、心筋芽細� ��を含むシートを得る方法であって、下記工� ��:(a)脂肪組織由来幹細胞を心筋芽細胞に分化 させ、次に、(b)心筋芽細胞を含むシートを形 成させる、を含む方法を提供するものである 。これらの工程は、連続して行われてもよい し、あるいは並行して行われてもよい。かか る方法により、心筋芽細胞を含むシートを容 易かつ効率的に得ることができる。脂肪組織 由来幹細胞を心筋芽細胞に分化させる工程は 、上述の通りである。

 心筋芽細胞から心筋芽細胞を含むシートを� ��成させる工程は、当業者に既知の手段また� ��方法により達成され得る。好ましくは、該� ��程は、心筋芽細胞を付着した状態で増殖さ� ��て細胞塊を形成させ、次に、形成された細� ��塊を剥離することにより達成され得る。用� ��られる心筋芽細胞の数、および培養時間は� ��得られるシートの大きさ、シートに含まれ� ��心筋芽細胞の数など種々の条件に応じて適� ��選択され得る。例えば、心筋芽細胞10 ⁵ ~10 ⁶ 個を24~72時間培養することにより、シートを� ��てもよい。細胞塊の剥離は、種々の手段、� ��えば、物理的刺激により行われ得る。ある� ��は、心筋芽細胞を温度感受性培養皿にて培� ��し、例えば、20℃以下にてインキュベーシ� �ンすることにより、細胞塊を剥離してもよ� �。

 従って、本発明は、さらなる態様におい� ��、上記心筋芽細胞を含むシートを得る方法� ��より得ることのできる、心筋芽細胞を含む� ��ートに関するものである。かかる心筋芽細� ��を含むシートを、心筋梗塞、心筋症などの� ��疾患の治療に用いることができる。

 本発明は、別の態様において、心筋芽細� ��を含むシートまたは心筋芽細胞を対象に移� ��することを特徴とする、心筋の機能低下に� ��り生じる疾患を治療および/または予防する 方法に関するものである。心筋の機能低下に より生じる疾患とは、例えば、急性心筋梗塞 、陳旧性心筋梗塞、虚血性心筋梗塞、拡張型 心筋症、先天性心疾患などである。対象への 移植は、当業者に既知の方法により行われ得 る。例えば、心筋芽細胞を含むシートを、心 筋の機能が低下した領域に移植することによ り、あるいは心筋芽細胞を冠動脈経由で移植 することにより、行われ得る。移植するシー トの大きさおよび厚さ、シートに含まれる心 筋芽細胞の数、および心筋芽細胞数は、対象 の状態、傷害領域の大きさなど種々の条件に 応じて適宜選択され得る。

 従って、本発明は、さらなる態様におい� ��、心機能の低下により生じる疾患を治療お� ��び/または予防するための、心筋芽細胞を含 むシートまたは心筋芽細胞を含む組成物を提 供するものである。かかる組成物は、該シー トまたは心筋芽細胞以外に、例えば、PBS、培 地、生着を促進させる物質、心機能改善薬、 成長因子、増殖因子などを含んでいてもよい 。

 本発明は、別の態様において、心筋芽細胞� ��の分化を促進する物質をスクリーニングす� ��方法であって、下記工程:
(a)脂肪組織由来幹細胞を候補物質を含む培地 にて心筋芽細胞に分化させ;
(b)脂肪組織由来幹細胞の心筋芽細胞への分化 を調べる、
を含み、該分化が、候補物質不含培地にて脂 肪組織由来幹細胞を培養した場合の分化と比 較して促進されている場合に、該候補物質が 心筋芽細胞への分化を促進する物質であるこ とを示す方法に関するものである。候補物質 としては種々のものがあり、例えば、レチノ イン酸、BMP2、BMP4、TGFβ2、HGF、bFGF、チロキシ ン、またはオキシトンのアナログおよび誘導 体などが挙げられるが、これらに限定されな い。脂肪組織由来幹細胞の心筋芽細胞への分 化は上述の通りである。心筋芽細胞への分化 は、種々の方法、例えば、α-CAまたはMLCなど� ��心筋芽細胞マーカーの発現をRT-PCRによって� ��定することにより、調べることができる。

 従って、本発明は、さらなる態様におい� ��、上記心筋芽細胞への分化を促進する物質� ��スクリーニング方法により得ることのでき� ��、心筋芽細胞への分化を促進する物質に関� ��るものである。該物質を、上述の心筋芽細� ��および心筋芽細胞を含むシートの製造方法� ��用いて、得られる心筋芽細胞およびシート� ��数を増大させてもよい。または、かかる物� ��を心機能の低下により生じる疾患の治療ま� ��は予防に用いてもよい。

 本発明は、別の態様において、心筋芽細胞� ��の分化を抑制する物質をスクリーニングす� ��方法であって、下記工程:
(a)脂肪組織由来幹細胞を候補物質を含む培地 にて心筋芽細胞に分化させ;
(b)脂肪組織由来幹細胞の心筋芽細胞への分化 を調べる、
を含み、該分化が、候補物質不含培地にて脂 肪組織由来幹細胞を培養した場合の分化と比 較して抑制されている場合に、該候補物質が 心筋芽細胞への分化を抑制する物質であるこ とを示す、方法に関するものである。候補物 質としては種々のものがあり、例えば、ノギ ンのアナログおよび誘導体などが挙げられる が、これらに限定されない。

 従って、本発明は、さらなる態様におい� ��、上記心筋芽細胞への分化を抑制する物質� ��スクリーニング方法により得ることのでき� ��、心筋芽細胞への分化を抑制する物質に関� ��るものである。該物質を心機能の上昇によ� ��生じる疾患の治療または予防に用いてもよ� ��。

 さらに、本発明は、心筋芽細胞への分化� ��促進または抑制する物質をスクリーニング� ��るためのキットに関するものである。本発� ��のキットは、脂肪組織由来幹細胞、培地、� ��養容器、ならびに心筋芽細胞への分化を調� ��る手段等を含んでいてもよい。通常には、� ��扱説明書をキットに添付する。かかるキッ� ��を用いて、上記スクリーニングを迅速かつ� ��易に行うことができる。

 本発明は、別の態様において、心筋芽細胞� ��含むシートの形成を促進または抑制する物� ��をスクリーニングする方法であって、下記� ��程:
(a)脂肪組織由来幹細胞を候補物質を含む培地 にて心筋芽細胞に分化させ;または
(b)候補物質存在下にて心筋芽細胞を含むシー トを形成させ;
(c)心筋芽細胞を含むシートの形成を調べる、
を含む、該形成が、候補物質不含系にて形成 させたものと比較して促進または抑制されて いる場合に、該候補物質が心筋芽細胞を含む シートの形成を促進または抑制する物質であ ることを示す方法に関するものである。シー トの形成を調べる方法は、上述の通りである 。候補物質の添加は、上記工程(a)および(b)の 両方において行われてもよいし、一方にて行 われてもよい。

 従って、本発明は、さらなる態様におい� ��、上記心筋芽細胞を含むシートの形成を促� ��または抑制する物質のスクリーニング方法� ��より得ることのできる、心筋芽細胞を含む� ��ートの形成を促進または抑制する物質に関� ��るものである。

 さらに、本発明は、上記心筋芽細胞を含� ��シートの形成を促進または抑制する物質を� ��クリーニングするためのキットに関するも� ��である。

 以下に実施例を示して本発明を詳細かつ� ��体的に説明するが、実施例は本発明を限定� ��るものではない。