Es hat sich gezeigt, dass durch die Kopplung von hydrophilen Polymeren an pharmazeutische Wirkstoffe, die parenteral appliziert werden, deren Nebenwirkungen reduziert werden können. Insbesondere können durch Vergrößerung des Molekulargewichts dieser Wirkstoffe renale Nebenwirkungen reduziert oder sogar vermieden werden, wenn die Molekülgröße der Kopplungsprodukte über der Ausschlussgrenze der Niere, die wie ein Filter wirkt, liegt. Die Molekülgröße des Kopplungsprodukts wird dabei durch das passend ausgewählte Molekulargewicht des Polymers eingestellt.

Ein weiterer Vorteil eines Kopplungsprodukts aus hydrophilem Polymer und pharmazeutischem Wirkstoff ist, dass die Antigenizität von therapeutischen Proteinen herabgesetzt wird, und dadurch die diesbezüglichen Nebenwirkungen reduziert oder vermieden werden können.

Ebenso können durch solche Kopplungsprodukte die pharmakokinetischen Halbwertszeiten und damit die Verweilzeiten der pharmazeutischen Wirkstoffe im Serum des Patienten erheblich verlängert werden. Dies ermöglicht eine erhebliche Ausdehnung der Therapieintervalle bei der parenteralen Applikation.

Polymere, die sich zur oben beschriebenen Kopplung an pharmazeutische Wirkstoffe eignen, sind vor allem Polyethylenglykole [Herman, S. et. al., Poly (Ethylene Glycol) with Reactive Endgroups : I. Modification of Proteins, Journal of Bioactive and Compatible Polymers, 10. (1995) 145-187] oder auch Polysaccharide, beispielsweise Stärkederivate und. Dextrane. Nach entsprechender Aktivierung erfolgt die Kopplung an die Wirkstoffe.

Die Wirkstoffe werden dabei nach an sich bekannten chemischen Verfahren, die schon aus der Technik der Immobilisierung von Liganden an Festphasen oder aus der Chemie der Proteinkopplung bzw. Vernetzung bekannt sind, an die Trägermoleküle gekoppelt. Entsprechende Verfahren sind in G. T. Hermanson et. al., Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press Inc. (1992) bzw. in S. S. Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press LLC (1993) und C. P. Stowell et. al., Neoglycoproteins, the preparation and application of synthetic Glycoprotein, In : Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, Vol. 37 (1980), 225-281, beschrieben.

Nachteile der Polyethylenglykole gegenüber den Stärkederivaten ist dabei, dass diese im Körper nicht ohne weiteres metabolisierbar sind, während die Stärkederivate durch körpereigene Serum-a-Amylase abbaubar sind. Durch geeignete Substitution der Stärkederivate, z. B. mit Hydroxyethylgruppen, kann der Abbau im Körper gezielt verzögert werden, woraus eine maßgeschneiderte Kinetik der parenteral applizierbaren Wirkstoffkonjugate erreicht werden kann [K.

Sommermeyer et. al., Krankenhauspharmazie, 8. Jahrgang Nr. 8, (1987)].

Nachteilig an der Derivatisierung von Stärke mit Hydroxygruppen ist jedoch, dass herstellungsbedingt die Verteilung der Hydroxyethylgruppen entlang der Kette uneinheitlich ist, wodurch sich aufgrund der regional hohen Substitutionsgrade an bestimmten Stellen der Kohlehydratkette beim Abbau im Körper Fragmente bilden, die durch Körperenzyme nicht weiter abgebaut werden können. Diese Fralctionen bilden die sogenannten Speicherfraktionen [P. Lawin, et. al., Hydoxyethylstärke, Eine aktuelle Übersicht, Georg Thieme Verlag (1989)].

In DE 102 17 994 werden hyperverzweigte Polysacharide zur Kopplung an pharmakologische Wirkstoffe beschrieben. Diese offenbarten, hyperverzweigten Amylopelctine weisen eine dem körpereigene Glykogen ähnliche Struktur auf und sind daher äußerst verträglich und im Körper vollständig abbaubar. Durch Einstellung der Verzweigungsgrade lässt sich die Abbaukinetik der hyperverzweigten Amylopektine so einstellen, dass auch ohne weitere Derivatisierung die gewünschten Verweilzeiten im Serum erreicht werden können.

Bezüglich der Herstellung dieser hyperverzweigten Amylopektine verweist DE 102 17 994 auf EP 1369 432. EP 1369 432 offenbart lösliche, hyperverzweigte Glucosepolymere mit einem Anteil der a-1, 6-glycosidischen Bindungen > 10 %, vorzugsweise zwischen 12 und 30 % und einem Molekulargewicht zwischen 35.000 und 200.000 Dalton. Nach EP 1 369 432 werden diese Polymere hergestellt, indem eine wässrige Stärkesuspension oder Stärkelösung zur Erhöhung des Verzweigungsgrads mit einem Verzweigungsenzym behandelt wird und anschließend mit einem Enzym, ausgewählt aus der Gruppe aus a-Amylase, ß-Amylase, Anhydroglucosidase und a-Transglucosidase hydrolysiert wird. Das dazu nötige Verzweigungsenzym wird aus Organismen und/oder Mikroorganismen extrahiert und ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Glycogenverzweigungsenzymen, Stärkeverzweigungsenzymen und Mischungen dieser Enzyme.

Nachteilig an dem in EP 1 369 432 beschriebenen Verfahren ist, dass es aufwendig und teuer ist. Insbesondere der Einsatz von zurzeit nicht kommerziell erhältlichen Verzweigungsenzymen bedeutet, dass diese jeweils extra aus Organismen und/oder Mikroorganismen isoliert werden müssen.

Somit ist es Aufgaben der Erfindung, ein einfaches und kostengünstiges Verfahren zur Herstellung von hyperverzweigten Polysacchariden zu liefern, die als Trägermolelcüle für pharmazeutische Wirkstoffe verwendet werden können.

Überraschenderweise wurde gefunden, dass ein Verfahren nach Anspruch 1 diese Aufgabe löst. Dabei werden in einem ersten Hydrolyseschritt pflanzliche Amylopektine oder amylopektinreicher Stärken durch a-Amylase oder Säurehydrolyse auf Molelculargewichte kleiner gleich 60.000 Dalton abbaut, und einen zweiten Hydrolyseschritt das Molekulargewicht des Abbauprodukts aus dem ersten Schritt durch einen ß-Amylase-Abbau weiter abgebaut.

Weiter wurde gefunden, dass durch die Säurehydrolyse von Amylopektin oder amylopektinreicher Stärken auf gewichtsgemittelte Molekulargewichte kleiner gleich 60.000 eine deutliche Erhöhung des Verzweigungsgrads erhalten werden konnte.

Ein solches hyperverzweigtes Amylopektin entsprechend der gegenwärtigen Erfindung hat vorzugsweise ein gewichtsgemitteltes Molelculargewicht > 2.000 Dalton sowie einen Verzweigungsgrad > 10 %. Besonders bevorzugt ist ein gewichtsgemitteltes Molekulargewicht > 2. 000 Dalton und < 29.000 Dalton und ein Verzweigungsgrad > 10 % und < 20 %.

Unter Amylopelctinen versteht man dabei zunächst ganz allgemein verzweigte Stärken oder Stärkeprodulcte mit a- (1-4)-und a- (1-6)-Bindungen zwischen den Anhydroglucoseeinheiten. Die Verzweigungen der Ketten erfolgen dabei über die a- (1-6)-Bindungen. Diese Verzweigungsstellen sind bei natürlich vorkommenden Amylopektinen etwa alle 15 bis 30 Glucoseelemente unregelmäßig vorhanden.

Das Molekulargewicht von natürlichen Amylopektin liegt sehr hoch im Bereich von 107 bis 2 x 108 Dalton. Man geht davon aus, dass auch Amylopektin in gewissen Grenzen Helices bildet.

Man kann für Amylopektine eine Verzweigungsgrad definieren. Das Maß für die Verzweigung ist das Verhältnis der Zahl von Anhydroglucoseeinheiten, die Verzweigungspunkte [a- (l-6)-Bindungen] tragen, zur Gesamtzahl der Anhydroglucoseeinheiten des Amylopektins. Dieses Verhältnis wird in mol-% ausgedrückt. In der Natur auftretendes Amylopektin weist Verzweigungsgrade von ca. 4 mol-% auf. Hyperverzweigte Amylopektine weisen eine gegenüber den in der Natur vorkommenden Verzweigungsgraden deutlich erhöhte Verzweigungsgrade auf. Dabei handelt es sich beim Verzweigungsgrad in jedem Fall um einen Mittelwert (mittlerer Verzweigungsgrad), da Amylopelctine polydisperse Substanzen sind.

Im Rahmen dieser Erfindung soll unter hyperverzweigten Amylopektinen Amylopektine mit einem mittleren Verzweigungsgrad von größer gleich 10 mol % verstanden werden.

Baut man pflanzliche Amylopektine oder amylopektinreiche Stärken mit a-Amylase oder Säurehydrolyse ab, erhält man, in Abhängigkeit des jeweiligen Hydrolysegrades der Hydrolyseprodukte, Amylopektine mit einem jeweils ähnlichen Verzweigungsgrad. Dabei ist der säurehydrolytische Abbau gegenüber den enzymatischen Abbau mit a-Amylase einfacher durchzuführen und billiger.

Weiter ist es bei der Säurehydrolyse möglich, den Hydrolysegrad während des Hydrolyseprozesses durch Inprozess-HPGPC zu verfolgen und den Hydrolysegrad gezielt einzustellen. Somit ist der säurehydrolytische Abbau gegenüber dem Abbau mit a-Amylase besonders bevorzugt.

Durch der Behandlung der im ersten Hydrolyseschritt erhaltenen Produkte mit ß-Arnylase werden diese selelctiv an den a-1, 4-glykosydischen Anhydroglucoseeinheiten abgebaut. Bei diesem Abbau werden die Maltoseeinheiten an den äußeren, nicht reduzierenden Kettenenden abgespalten, ohne dass die a-1, 6-glycosidischen Verzweigungen selbst gelöst werden. Der Abbau erfolgt dabei vom äußeren Kettenende bis auf etwa 2 Glucoseeinheiten vor der ersten auftretenden Verzweigungsstelle. Dadurch werden die sogenannten ß-Genzdextrine erhalten, worin die 1,6-glycosidischen Bindungen des Amylopektins angereichert sind und dadurch der Verzweigungsgrad erhöht ist.

Im Rahmen der gegenwärtigen Erfindung können alle amylopelctinhaltigen Stärken als Ausgangsmaterial verwendet werden. Besonders bevorzugt sind dabei Wachsmaisstärke und Tapiokastärke.

Aufgrund des hohen Verzweigungsgrades werden die ß-Genzdextrine im Serum entsprechend langsam abgebaut, da dort zum Abbau von Polysacchariden die a-Amylase vorherrscht. Die Produkte aus dem erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich daher für die Kopplung mit pharmazeutischen Wirkstoffen.

Die Parameter Verzweigungsgrad und Molekulargewicht des Amylopektins gestatten eine zielgerichtete Beeinflussung und somit Einstellung einer gewünschten Pharmakokinetik, insbesondere das Erreichen eines gewünschten a- Amylase-Abbaus. Dem Verzweigungsgrad des Amylopektins kommt hierbei eine Schlüsselfunktion zu, aber auch das Molekulargewicht hat einen Einfluss auf die angesprochene Kinetik. Daneben kann es auch durch die Verteilung der Verzweigungsprodukte gelingen, die Kinetik des Abbaus des Amylopektins in eine gewünschte Richtung zu beeinflussen.

Vorzugsweise werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nach dem ersten Hydrolyseschritt und/oder nach den zweiten Hydrolyseschritt niedermolekulare Verunreinigungen mit einem absoluten Molekulargewicht < 5.000 Dalton, vorzugsweise < 1.000 abgetrennt. Diese Abtrennung erfolgt vorzugsweise durch Ultrafiltration, wobei Membranen mit einen cut off von 5.000 Dalton bzw. 1. 000 Dalton verwendet werden. Bei den abgetrennten Verunreinigungen handelt es sich hauptsächlich um niedermolekulare Abbauprodukte des Amylopektins bzw. der Stärke sowie um Salzsäure.

Die Isolierung des erfindungsgemäß abgebauten Produkts erfolgt vorzugsweise durch Gefriertroclcnung. a-und ß-Amylase sind kommerziell erhältliche, kostengünstige Enzyme. Daher ist eine hydrolyse mit diesen Molekülen einfach und kostengünstig durchzuführen. Gleiches gilt für die Säurehydrolyse. Auch die Aufarbeitung durch Ultrafiltration und Gefriertrocknung ist einfach und nicht teuer. Daher sind die erfindungsgemäßen Produkte einfach und kostengünstig herzustellen.

Vorzugsweise wird das Hydrolyseprodulct des zweiten Hydrolyseschritts mit einem pharmazeutischen Wirkstoff gekoppelt. Bei dem pharmazeutischen Wirkstoff handelt es sich vorzugsweise um ein Protein oder ein Polypeptid.

Die Kopplung des erfindungsgemäß hergestellten hyperverzweigten Amylopektins an den pharmazeutischen Wirkstoff kann dabei auf jede bekannte Art erfolgen. Solche Kopplungen eines pharmazeutischen Wirkstoffs an ein Polysaccharid sind beispielsweise in WO 02/08 0979, PCT/EP 02/06 764, WO 03/07 4088, WO 03/07 4087, PCT/EP 03/13 622, DE 102 54 754.9 und PCT/EP 04/00 488 beschrieben.

Vorzugsweise erfolgt die Kopplung von Seiten des pharmazeutischen Wirkstoffs über eine freie Aminofunktion an die Anhydroglucose-Einheiten des reduzierenden Kettenendes des hyperverzweigten Amylopektins. Besonders bevorzugt wird dazu das reduzierende Ende des hyperverzweigten Amylopektins aktiviert. Besonders bevorzugt ist es dabei, das reduzierende Enden des hyperverzweigten Amylopelctins zur Aldonsäure zu oxidieren, die Aldonsäuregruppe zur Aldonsäure-Estergruppe zu aktivieren und den pharmazeutischen Wirkstoff über die Aldonsäure-Estergruppe an das hyperverzweigte Amylopektin zu koppeln. Ebenso ist es bevorzugt, das erfindungsgemäß hergestellte Produkt in wasserfreiem Medium mit einem Kohlensäurediester zu einem Kohlensäurediester des hyperverzweigten Amylopektins umzusetzen und diesen an den Wirkstoff zu koppeln.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen und Vergleichsbeispielen genauer erläutert, ohne dass die Erfindung auf diese Beispiele beschränkt werden soll.

Messverfahren Das Molekulargewicht und das gewichtsgemittelte Molekulargewicht wurde mit üblichen Verfahren bestimmt. Hierzu gehören beispielweise wässrige GPC, HPGPC, HPLC, Lichtstreuung und der gleichen.

Der Verzweigungsgrad wurde anhand von'H NMR bestimmt.

Beispiel 1 55 g dünnkochende Wachsmaisstärke wurde in 1. 000 ml entionisiertem Wasser suspendiert und die Suspension unter Rückfluss zum Sieden gebracht. Dabei löste sich die Wachsmaisstärke vollständig auf. Nach dem Lösen wurde der pH-Wert mit 1 N HC1 auf einen pH-Wert von 2,0 gebracht und der Ansatz eine Stunde unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde mit einer Membran von einem nominellen cut off von 5.000 Dalton gegen entionisiertes Wasser ultrafiltriert. Die so gereinigte Substanz wurde durch Gefriertrocknung isoliert. Die Ausbeute betrug 60 %. Die Charakterisierung der Substanz ergab ein gewichtsgemitteltes Molekulargewicht von 42.000 Dalton (gemessen mit HPGPC) sowie einen Verzweigungsgrad von 7 mol % (gemessen mit'H NMR).

Beispiel 2 10 g der Wachsmaisstärke Abbaufraktion aus Beispiel 1 wurden in 1.000 ml 0,15 molarem Acetatpuffer, pH 4,2, gelöst und mit 10 Einheiten/ml (3-Amylase (Firma Sigma ; ß-Amylase Typ I-B from sweet potato, Art. -Nr. A7005) versetzt. Der Ansatz wurde bei 25 °C 12 Stunden reagieren lassen. Anschließend wurde das Enzym durch 10 minütiges Kochen des Ansatzes bei 100 °C inalctiviert. Nach dem Abkühlen wurden der Reaktionsmischung ca. 2 Gew. % Aktivkohle (bezogen auf das Substrat) zugegeben und abfiltriert. Anschließend wurde zur Entfernung der Maltose und des Puffers das Reaktionsprodukt unter Verwendung einer Membran mit einem cut off von 1. 000 Dalton ultrafiltriert und das ß-Genzdextrin durch Gefriertroclcnung isoliert. Die Ausbeute betrug 60 %. Die Charakterisierung ergab einen Verzweigungsgrad von 14 mol % (gemessen mit 'H NMR) sowie ein gewichtsgemitteltes Molekulargewicht von 28. 000 Dalton.

Beispiel 3 Beispiel 3 wurde analog zu Beispiel 1 durchgeführt, wobei die Hydrolysezeit auf 4 Stunden verlängert wurde. Dabei wurde das Hydrolyseverfahren durch Inprozess-HPGPC verfolgt, um ein Produkt mit einem gewichtsgemittelten Molelculargewicht < 15.000 Dalton zu erhalten. Die Reinigung mittels Ultrafiltration folgte im Gegensatz zu Beispiel 1 mit Hilfe einer Membran mit einem nominellen cut off von 1.000 Dalton. Die Ausbeute betrug 25 %. Die Charakterisierung der Substanz ergab ein gewichtsgemitteltes Molekulargewicht von 10.000 Dalton sowie einen Verzweigungsgrad von 10, 3 mol %.

Beispiel 4 Die Herstellung des ß-Genzdextrins erfolgte analog zu Beispiel 2, wobei das Hydrolyseprodukt aus Beispiel 3 verwendet wurde. Die Ausbeute betrug 60 %.

Die Charakterisierung der Substanz ergab ein gewichtsgemitteltes Molekulargewicht von 7.000 Dalton sowie einen Verzweigungsgrad von 15 mol %.

Beispiel 5 55 g native Tapioka-Stärke wurden in 1. 000 ml entionisierten Wasser unter Rückfluss in der Hitze verkleistert. Danach wurden 11 ml 1 N HC1 zum Einstellen eines pH-Werts von ca. 1,9 zugegeben. Nach 30 Minuten wurde das Gel dünnflüssig und der Ansatz wurde weitere 7 Stunden unter Rückfluss erhitzt.

Nach dem Abkühlen wurde vom Niederschlag und der Trübung abfiltriert und gegen entionisiertes Wasser mit einer Membran mit nominellen cut off von 1. 000 Dalton ultrafiltriert. Die Ausbeute betrug 24,4 %. Die Charakterisierung der Substanz ergab ein gewichtsgemitteltes Molekulargewicht von 10.000 Dalton und einen Verzweigungsgrad von 9,6 mol %.

Beispiel 6 Die Herstellung des ß-Genzdextrins erfolgte analog zu Beispiel 2, mit dem Unterschied, dass die Hydrolysesubstanz aus Beispiel 5 eingesetzt wurde. Die Ausbeute betrug 55 %. Die Charakterisierung der Substanz ergab ein gewichtsgemitteltes Molekulargewicht von 5.000 Dalton sowie einen Verzweigungsgrad von 16 mol %.

Beispiel 7 Die Wachsmaisstärkeabbaufraktion aus Beispiel 2 wurde in isotonem Phosphatpuffer pH 7,2 gelöst, so dass eine 1 Gew. % Lösung erhalten wurde. Die Lösung wurde auf 37, 0 ° C erwärmt und 0,5 I. E. /ml a-Amylase aus<BR> Schweinepancreas (Firma Roche ; AS, Art. -Nr. 102 814) zugegeben. Nach jeweils 1 und 3 Stunden wurden Proben entnommen, das Enzym durch Hitze inaktiviert und das Molekulargewicht der verbleibenden höhermolekularen Fraktion durch HPGPC bestimmt. Dabei betrug das gewichtsgemitteltes Ausgangsmolekulargewicht 28.000 Dalton, das gewichtsgemitteltes Molelculargewicht nach 1 Stunde Hydrolyse 11.000 Dalton und das gewichtsgemitteltes Molekulargewicht nach 3 Stunden Hydrolyse 7.000 Dalton.

Beispiel 8 Das Verfahren aus Beispiel 7 wurde wiederholt, wobei die Abbaufraktion aus Beispiel 4 eingesetzt wurde. Dabei betrug das Gewichtsmittel des Ausgangsmolelculargewicht 7.000 Dalton, das gewichtsgemittelte Molekulargewicht nach 1 Stunde Hydrolyse 5.500 Dalton und das gewichtsgemitteltes Molekulargewicht nach 3 Stunden Hydrolyse 4.600 Dalton.

Vergleichsversuch 1 Vergleichsversuch 1 wurde analog zu Beispiel 7 durchgeführt, wobei anstelle der Abbaufralction aus Beispiel 2 handelsübliche Hydroxyethylstärke (130/0,4, Handelsname"Voluven") eingesetzt wurde. Das Gewichtsmittel des Ausgangsmolelculargewicht betrug 140.200 Dalton, das gewichtsgemitteltes Molekulargewicht nach 1 Stunde betrug 54.700 Dalton. Das gewichtsgemitteltes Molekulargewicht nach 3 Stunden Hydrolyse betrug 33.700 Dalton.

Damit ist die Abbaugeschwindigkeit des handelsüblichen Plasmaexpanders auf Basis von Hydroxyethylstärke mit a-Amylase aus Vergleichsversuch 1 vergleichbar mit der Abbaugeschwindigkeit der hyperverzweigten Amylopelctinfraktion aus Beispiel 7.

Beispiel 9 Oxidation der hyperverzweigten Amylopektinfralction aus Beispiel 4 an der reduzierenden Endgruppe zur Aldonsäure.

Aus der nach Beispiel 4 hergestellten, hyperverzweigten Abbaufraktion wurde eine 25 Gew. %-ige Lösung in entionisiertem Wasser hergestellt. Zu dieser Lösung wurde ein 3, 5-facher, molarer Überschuss, bezogen auf die reduzierende Endgruppe, einer 0,05 molaren Iodlösung portionsweise langsam zugegeben und jeweils mit 0,1 N NaOH (3-fache molare Menge, bezogen auf Iod) portionsweise entfernt. Nach Zugabe wurde über Nacht bei Raumtemperatur weiter reagieren lassen und die erhaltene Lösung anschließend mit einer Membran mit nominellen cut off von 1.000 Dalton dialysiert, wobei der pH überwacht wurde. Nach Erreichens eines pH-Werts im Dialysat von etwa 6 und Überprüfung auf Iodidfreiheit durch zusetzen von Natriumiodat und Ansäuern wurde der Ansatz mit 0,1 N HCl auf pH 2,5 eingestellt und solange weiter dialysiert, bis das Ultrafiltrat einen pH von 5 aufwies. Das Produkt wurde durch Gefriertrocknung isoliert. Die Ausbeute betrug 80 % der theoretischen Ausbeute. Der Oxidationsgrad betrug > 90 % und wurde über die reduzierende Endgruppe bestimmt.

Beispiel 10 66 mg Aldonsäure aus Beispiel 9 wurden in 0,5 ml trockenem DMF gelöst und mit 3,4 mg NN'-Disuccinimidylcarbonat versetzt und 2 Stunden bei Raumtemperatur reagieren lassen. 0,5 ml einer 1 Gew. %-igen Lösung von bovinem Serumalbumin (BSA) wurden mit 180 ml einer 1 molaren Bicarbonatlösung versetzt und anschließend wurden 2 Portionen von jeweils 100 al der aktivierten Aldonsäure tropfenweise zur BSA-Lösung zugefügt und jeweils eine halbe Stunde ausreagieren lassen. Danach wurde der Ansatz mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt. Die Untersuchung der Reaktionslösung mittels HPGPC ergab eine Ausbeute an Kopplungsprodukt von > 95 % des eingesetzten BSA's.