<1>本発明の製造法
 本発明の方法は、L-アミノ酸又は核酸の生� �能を有する微生物を攪拌翼を備えた発酵槽� �の液体培地で培養し、必要に応じて種晶を� �地に添加して当該培地中にL-アミノ酸または 核酸の結晶を生成、蓄積させ、培養物からL-� ��ミノ酸又は核酸の結晶を採取するL-アミノ� �又は核酸の製造法において、攪拌翼の動力� �度(単位発酵液当たりの動力)を結晶析出後あ るいは種晶添加後に2.4kW/m ³ 以下に制御することを特徴とする方法である 。

 本発明において、「L-アミノ酸」は、微生� �を用いた発酵法において培地中に析出しな� �ら蓄積させることができるものであれば特� �制限されないが、L-リジン、L-オルニチン、L -アルギニン、L-ヒスチジン、L-シトルリンの� ��うな塩基性アミノ酸、L-イソロイシン、L-ア ラニン、L-バリン、L-ロイシン、L-グリシンの ような脂肪族アミノ酸、L-スレオニン、L-セ� �ンのようなヒドロキシモノアミノカルボン� �であるアミノ酸、L-プロリンのような環式ア ミノ酸、L-フェニルアラニン、L-チロシン、L- トリプトファンのような芳香族アミノ酸、L-� ��ステイン、L-シスチン、L-メチオニンのよう な含硫アミノ酸、L-グルタミン酸、L-アスパ� �ギン酸等のような酸性アミノ酸、及びL-グル タミン、L-アスパラギン等のような側鎖にア� ��ド基を持つアミノ酸が挙げられる。
 好ましくは疎水性アミノ酸、酸性アミノ酸� ��及び側鎖にアミド基を持つアミノ酸が挙げ� ��れる。特に好ましくは、疎水性アミノ酸と� ��ては、脂肪族アミノ酸であるL-バリン、L-ロ イシン、L-イソロイシン、芳香族アミノ酸で� ��るL-トリプトファン、L-フェニルアラニン、 L-チロシンが、酸性アミノ酸としてはL-グル� �ミン酸、L-アスパラギン酸が、側鎖にアミド 基を持つアミノ酸としてはL-グルタミン、L-� �スパラギン等が挙げられる。
 また、本発明のL-アミノ酸には上記アミノ� �を出発物質として得られるL-アミノ酸誘導体 も含まれ、GABA、p-ヒドロキシ-D-フェニルグリ シン、DOPA、コハク酸、リンゴ酸、ピルビン� �が挙げられる。
 本発明により製造されるL-アミノ酸又は核� �は、1種でもよく、2種又はそれ以上であって もよい。

 本発明において、「核酸」は、微生物を� ��いた発酵法において培地中に析出しながら� ��積させることができるものであれば特に制� ��されない。核酸としては、プリンヌクレオ� ��ド、プリンヌクレオチドなどが挙げられる� ��プリンヌクレオシドには、イノシン、キサ� ��トシン、グアノシン、アデノシンなどが含� ��れ、プリンヌクレオチドには、プリンヌク� ��オシドの5’-燐酸エステル、例えばイノシ� �酸(イノシン-5’-リン酸。以下「IMP」ともい� ��)、キサンチル酸(キサントシン-5’-リン酸� �以下「XMP」ともいう)、グアニル酸(グアノシ ン-5’-モノリン酸。以下「GMP」ともいう)、� �デニル酸(アデノシン-5’-モノリン酸。以下� ��AMP」ともいう)などが含まれる。また、本発 明の核酸には、上記核酸を出発物質として得 られる核酸誘導体も含まれ、Ara-U(ウラシルア ラビノシド)、ZVA(Z-バラシクロビル)等が挙げ� ��れる。なお、本発明において上記のL-アミ� �酸、核酸またはそれらの誘導体を「目的物� �」と表現することがある

 攪拌翼とは、発酵槽中の液体培地を攪拌� ��るためのものであり、形状は特に問わない� ��通常は、攪拌翼は軸と、軸に設けられた翼( ブレード)からなるが、翼又はその一部が軸� �構成するものであってもよい。また、通常� �攪拌翼は軸を中心にして回転するが、他の� �式で作動するものであってもよい。翼の形� �としては、タービン形、パドル形、プロペ� �形、アンカー形、リボン形等を用いること� �出来るが、これらに制限されない。また、� �の枚数、各々の翼の配置も、特に制限され� �い。攪拌翼は、モーター等の動力機から軸� �動力が伝えられて作動する。攪拌翼につい� �は、例えば、化学工学便覧 化学工学協会編  改訂四版 1310~1311ページ 丸善株式会社)を� �照できる。

 本発明において、攪拌翼の動力密度とは� ��単位発酵液当たりの攪拌翼の動力である。� ��拌翼の動力は、発酵液を攪拌したときの動� ��機の動力(出力)から、発酵槽が空の状態で� �拌したときの動力機の動力(出力)を差し引く ことにより算出される。動力は、具体的には 例えば、動力機がモータであれば、モータに 流れる電流とモータの効率から算出すること ができる。また、モータに流れる電流と、動 力との関係を示す検量線を作成しておき、そ の検量線を用いて電流から換算することによ っても、動力を測定することができる。さら に、トルクメータ又はトルクセンサ等のトル クを測定する機器を用いて攪拌翼にかかるト ルクを測定し、その値から以下の式によって 動力を算出することができる。

 動力P [kW]=T×2×π×n/1000
  T:トルク[N・m]
  n:攪拌翼の回転数[/s]

 上記のようにして測定される動力値を培� ��液量で割った値が攪拌翼の動力密度である� ��

 本発明において、攪拌翼の動力密度は、結� ��析出後又は種晶添加後に2.4kW/m ³ 以下になるように制御することが好ましい。 攪拌翼の動力密度は、より好ましくは、2.0kW/ m ³ 以下、特に好ましくは、1.5kW/m ³ 以下、最も好ましくは、1.0kW/m ³ 以下に制御することが好ましい。なお、攪拌 翼の動力密度の下限は、微生物の物質生産、 あるいは微生物の生育を低下させない限り特 に制限されないが、0.4 kW/m ³ 以上、好ましくは0.5kW/m ³ 以上、さらに好ましくは0.6kW/m ³ 以上、最も好ましくは0.7kW/m ³ 以上に制御することが好ましい。

 結晶析出後又は種晶添加後に、攪拌翼の� ��力密度は上記範囲となるように制御される� ��、発酵終了まで連続的に制御されることが� ��ましい。また、攪拌翼の動力密度が実質的� ��上記範囲に制御されていれば、一時的に上� ��範囲を超えることがあってもよい。具体的� ��は、結晶析出後又は種晶添加後、発酵終了� ��は目的物質の蓄積が頭打になるまでの期間� ��50%以上、好ましくは70%以上、より好ましく� ��90%以上で、攪拌翼の動力密度が上記範囲を� ��たしていれば、攪拌翼の動力密度は実質的� ��制御されている。

 結晶析出前又は種晶添加前は、攪拌翼の動� ��密度は結晶析出後又は種晶添加前上記範囲� ��りも高いことが好ましく、好ましくは2.6kW/m ³ 以上、より好ましくは2.8kW/m ³ 以上、特に好ましくは3.0kW/m ³ 以上である。尚、攪拌翼の動力密度が実質的 にこの範囲に制御されていれば、一時的に上 記範囲を下回ることがあってもよい。具体的 には、発酵開始、又は後述の目的物質生産期 から結晶析出又は種晶添加までの期間の50%以 上、好ましくは70%以上、より好ましくは90%以 上で、攪拌翼の動力密度が上記範囲を満たし ていれば、攪拌翼の動力密度は実質的に制御 されている。

 本発明において、目的物質の結晶は、目� ��物質の蓄積がその飽和溶解度を超えると、� ��は過飽和の状態を超えると、自然に析出す� ��。したがって、微生物が培地中に飽和溶解� ��を超える量の目的物質を蓄積する能力があ� ��場合には、目的物質を析出させるための操� ��は不要であるが、目的物質の析出を促進す� ��ために、結晶を添加してもよい。種晶とは� ��このような目的で、必要に応じて培地中に� ��加する結晶を意味する。種晶は、結晶の析� ��を促進させる効果があれば、目的物質に限� ��れないが、望ましくは目的物質、例えばL-� �リプトファン発酵であればL-トリプトファン が望ましい。

 添加する種晶の濃度は、目的物質を生産� ��る微生物が、発酵工程で培地内に結晶を析� ��する能力を有する場合には、0.5g/L以上、好� ��しくは1g/L以上、より好ましくは5g/L以上、� �らに好ましくは10g/L以上の種晶を培地中に添 加することが好ましい。

 微生物が、培地中に飽和溶解度を超える� ��の目的物質を蓄積する能力がない場合、目� ��物質の濃度が飽和溶解度以上となるような� ��の目的物質を培地に添加する必要がある。� ��の場合に添加する目的物質は、溶液であっ� ��も、粉体又は結晶であってもよいが、少な� ��とも種晶として結晶を含むことが好ましい� ��その場合、種晶の量は10g/L以上、好ましく� �20g/L、より好ましくは30g/L、さらに好ましく� ��50g/L以上であることが好ましい。尚、本発� �においては、目的物質の析出を促進させる� �めに添加される物質は、前記のように培地� �添加する目的物質が溶液又は粉体であって� �、特記しない限り種晶に含まれる。

 また、いずれの場合も、種晶を添加する� ��度の上限は、微生物の物質生産、あるいは� ��生物の生育を著しく低下させる濃度でなけ� ��ばいずれでもよいが、100g/L以下、好ましく� ��90g/L以下、より好ましくは80g/L以下、特に好 ましくは70g/L以下であることが好適である。

 種晶を添加する時期は、目的物質を生産� ��る能力を有する微生物を培地に接種する前� ��あるいは微生物を培地に接種した後の培養� ��間中のいずれの時期でもよいが、好ましく� ��微生物を培地に接種した後で、培地中の目� ��物質濃度が飽和溶解度に達する前後から培� ��中に目的物質の結晶が析出する前、より好� ��しくは培地中の目的物質濃度が過飽和にあ� ��ときであって、培地中に目的物質の結晶が� ��出する前をあげることが出来る。培養時間� ��示すと培養開始、又は後述の目的物質生産� ��の開始点から5時間後、望ましくは10時間後� ��より望ましくは15時間後、さらに望ましく� �20時間後、最も好ましくは25時間後、又はそ� ��らの近辺に添加することが望ましい。また� ��目的物質の全培養時間、又は目的物質生産� ��から培養終了までの時間を1としたとき、全 体の0.2、好ましくは0.3、さらに好ましくは0.4 経過した時点又はそれらの近辺で種晶を添加 することが好ましい。

 ここで飽和溶解度とは、液体培地が目的物� ��で飽和しているときの液体培地に溶解して� ��る目的物質の濃度を意味する。すなわち目� ��物質の過飽和が解消した時に定常となる目� ��物質の濃度を意味する。
 各L-アミノ酸及び核酸の溶解度は、表1、2の 通りであり、これらの濃度に達する前後に、 種晶を添加することが好ましい。

 本発明において、結晶析出後とは、培養液� ��に目的物質の飽和溶解度を超えて、目的物� ��の結晶が析出した後を意味する。なお、本� ��明においては、結晶析出前、又は種晶添加� ��は、攪拌翼の動力は結晶析出後、又は種晶� ��加後よりも高いことが望ましい。なお、結� ��析出前、又は種晶添加前の攪拌翼の動力は� ��微生物の生育に好適な範囲であればいずれ� ��もよいが、2.4kW/m ³ 以上、好ましくは2.6kW/m ³ 以上、より好ましくは2.8kW/m ³ 以上、さらに好ましくは3.0kW/m ³ 以上、もっとも好ましくは3.2 kW/m ³ 以上に制御することが望ましい。

 また、本発明の方法は、目的物質生産能を� ��つ微生物を増殖させる段階(増殖期)と、目� �物質を産生させる段階(目的物質生産期)を含 んでいてもよい。その場合、増殖期に微生物 を十分に生育させて、目的物質生産期に目的 物質を最大限蓄積させることが好ましい。ま た、目的物質の析出、又は種晶の添加の時期 は、増殖期の最終段階、又は目的物質生産期 であることが好ましい。種晶の添加は、一度 に行ってもよく、2回又は3回以上に分けて添� ��してもよく、さらには連続的に行ってもよ� ��。
 本発明における「増殖期」とは、炭素源が� ��に菌体生育に使用されている時期、すなわ� ��微生物が対数的に増殖している時期を意味� ��、本発明における「目的物質生産期」とは� ��培養開始から10時間以降、好ましくは15時間 以降、特に好ましくは20時間以降炭素源が主� ��L-アミノ酸生産に用いられている時期を意� �する。
 増殖期の攪拌翼の動力は、微生物の生育に� ��適な範囲であれば特に制限されず、具体的� ��は、前記した結晶析出前、又は種晶添加前� ��攪拌翼の動力と同様である。

 本発明で用いられる培地は、栄養源として� ��素源、窒素源とを含んでいればいずれでも� ��い。また、本発明の方法は、回分培養(batch� �culture)、流加培養(Fed-batch culture)、連続培養� ��(continuous culture)のいずれも用いることがで� ��る。
 ここで本発明において、上記流加培養とは� ��培養中の容器に培地を連続的又は間欠的に� ��加し、培養終了時までその培地を容器から� ��き取らない培養方法をいう。また、連続培� ��とは、培養中の容器に培地を連続的又は間� ��的に流加するとともに、容器から培地(通常 、流加する培地と当量)を抜き取る方法をい� �。また、「初発培地」とは、流加培養又は� �続培養において流加培地を流加させる前の� �分培養(batch培養)に用いる培地のことを意味� ��、「流加培地」とは、流加培養又は連続培� ��を行う際に発酵槽に供給する培地のことを� ��味する。流加培地は、微生物の生育に必要� ��成分の全てを含んでいてもよいが、一部の� ��を含むものであってもよい。また、本発明� ��おいて「発酵培地」とは、発酵槽中の培地� ��意味し、この発酵培地から目的物質が回収� ��れる。また、本発明において、「発酵槽」� ��は、目的物質生産を行う器を意味し、その� ��状は問わず、例えば発酵タンクを用いても� ��ャーファーメンターを用いてもよい。また� ��その容量は目的物質を生成・回収できる容� ��であればいずれでもよい。

 本発明に用いられる培地に含まれる炭素� ��としては、グルコース、グリセロール、フ� ��クトース、スクロース、マルトース、マン� ��ース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖� ��等の糖類が使用でき、特にグルコース、ス� ��ロースが好ましい。その他、酢酸、クエン� ��等の有機酸、エタノール、メタノール等の� ��ルコール類も単独あるいは他の炭素源と併� ��して用いることができる。また、炭素源と� ��る原料としては、ケインモラセス、ビート� ��ラセス、ハイテストモラセス、シトラスモ� ��セス、転化糖を用いてもよいし、セルロー� ��、デンプン、コーン、シリアル、タピオカ� ��の天然原料の加水分解物を用いてもよい。� ��た培養液中に溶存した二酸化炭素も炭素源� ��して使用出来る。これらの炭素源が初発培� ��にも流加培地にも用いることができる。培� ��中にこれらの炭素源を1種のみ含んでいても よいし、2種以上含んでいてもよい。また、� �発培地、流加培地とも、同じ炭素源を用い� �もよいし、流加培地の炭素源を初発培地と� �更してもよい。例えば、初発培地の炭素源� �グルコースとし、流加培地の炭素源をスク� �ースとする場合である。

 本発明の培地中に含まれる窒素源としては� ��アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アン� ��ニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモ� ��ウム、酢酸アンモニウム、ウレア等のアン� ��ニウム塩または硝酸塩等が使用することが� ��き、pH調整に用いられるアンモニアガス、� �ンモニア水も窒素源として利用できる。ま� �、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽� �キス、コーンスティープリカー、大豆加水� �解物等も利用出来る。培地中にこれらの窒� �源を1種のみ含んでいてもよいし、2種以上含 んでいてもよい。これらの窒素源は、初発培 地にも流加培地にも用いることができる。ま た、初発培地、流加培地とも、同じ窒素源を 用いてもよいし、流加培地の窒素源を初発培 地と変更してもよい。
 また本発明の培地には、炭素源、窒素源の� ��にリン酸源を含んでいることが好ましい。� ��ン酸源としては、リン酸2水素カリウム、リ ン酸水素2カリウム、ピロリン酸などのリン� �ポリマー等が利用出来る。

 また本発明の培地には、炭素源、窒素源� ��他に、増殖促進因子(増殖促進効果を持つ栄 養素)を含んでいてもよい。増殖促進因子と� �、微量金属類、アミノ酸、ビタミン、脂肪� �、核酸、更にこれらのものを含有するペプ� �ン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白� �解物等が使用できる。特に芳香族アミノ酸� �分岐鎖アミノ酸の場合、生合成系が共通し� �いるので、微生物が後述のように、目的ア� �ノ酸以外の生合成が弱化されている場合が� �る。このような場合、生合成系が弱化され� �アミノ酸を培地中に添加することが好まし� �。例えば目的アミノ酸がL-トリプトファンの 場合、L-フェニルアラニン及び/またはチロシ ン、目的アミノ酸がL-フェニルアラニンの場� ��、L-トリプトファン及び/またはL-チロシン� �添加することが望ましい(WO2003048374号パンフ� ��ット)。

 微量金属類としては、鉄、マンガン、マ� ��ネシウム、カルシウム等が挙げられ、ビタ� ��ンとしては、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタ ミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビ� ��ミンB12、ピリドキシン、パントテン酸等が� ��げられる。これらの増殖促進因子は初発培� ��に含まれていてもよいし、流加培地に含ま� ��ていてもよい。

 また本発明の培地には、生育にアミノ酸� ��どを要求する栄養要求性変異株を使用する� ��合には要求される栄養素を補添することが� ��ましい。特に本発明に用いることができるL -アミノ酸生産菌は、後述のようにL-アミノ酸 生合成経路が強化されており、L-アミノ酸分� ��能が弱化されているものが多いので、L-リ� �ン、L-ホモセリン、L-イソロイシン、L-メチ� �ニンから選ばれる1種又は2種以上を添加する ことが望ましい。核酸生産菌についても同様 に、必要な物質を培地に添加することが好ま しい。

 初発培地と流加培地は、培地組成が同じ� ��あってもよく、異なっていてもよい。さら� ��は、流加培地の流加が多段階で行われる場� ��、各々の流加培地の組成は同じであっても� ��く、異なっていてもよい。

 培養は、発酵温度20~45℃、特に好ましくは30 ~42℃で通気培養を行うことが好ましい。発酵 槽に供給する気体としては、空気の他に高濃 度酸素を空気と同時に供給し、供給気体中の 酸素濃度を上げることもできる(特公平05-04811 7号公報、特公平5-39594号公報参照)。
 酸素供給量は、培地中の酸素濃度が2~4ppmに� ��るような量で良く、酸素濃度40%~100%の高濃� �酸素と、空気との混合ガスを1/10~1.5/1VVM供給� ��ることが好ましい。高濃度酸素は、酸素濃� ��器を用いて調製することができる。ここで� ��酸素濃縮器としては、PSA式、酸素富化膜式� ��あり、液体酸素を蒸発器で気化させ、若し� ��は直接発酵槽に供給する方法を用いること� ��出来る。

 また、pHを5~9に制御し、通気培養を行う� �培養中にpHが下がる場合には、例えば、炭酸 カルシウムを加えるか、アンモニアガス、ア ンモニア水等のアルカリで中和する。尚、目 的アミノ酸が酸性アミノ酸、例えばL-グルタ� ��ン酸の場合には、pHは3~9、好ましくは3~5で� �うことが望ましい。このような条件下で、� �ましくは10時間~120時間程度培養することに� �り、培養液中に著量の目的物質が蓄積され� �。蓄積される目的物質の濃度は野生株より� �く、培地中から採取・回収できる濃度であ� �ばいずれでもよいが、L-アミノ酸の場合は、 50g/L以上、好ましくは75g/L以上、さらに好ま� �くは100g/L以上、核酸の場合は50g/L以上、好ま しくは75g/L以上、さらに好ましくは100g/L以上� ��あることが好ましい。

 培養終了後の培養液から目的物質を採取� ��る方法は、公知の回収方法に従って行えば� ��い。例えば、培地中に析出した目的物質は� ��遠心分離又は濾過等により回収することが� ��きる。また、培地中に析出した目的物質は� ��培地中に溶解している目的物質を晶析した� ��に、併せて単離してもよい。

 本発明においては、目的物質蓄積を一定� ��上に保つために、微生物の培養を種培養と� ��培養とに分けて行ってもよく、例えば種培� ��をフラスコ等を用いたしんとう培養、又は� ��分培養で行い、本培養を流加培養、回分培� ��又は連続培養で行ってもよく、種培養、本� ��養ともに回分培養で行ってもよい。また、� ��培養及び本培養に先立って、1回、2回又は� �れ以上の前培養を行い、順次スケールアッ� �してもよい。

 これらの培養法の場合、予定した目的物� ��濃度に到達したときに、目的物質を一部引� ��抜いて、新たに培地を添加して繰り返し培� ��を行ってもよい。新たに添加する培地とは� ��炭素源及び増殖促進効果を持つ栄養素(増殖 促進因子)を含む培地が好ましい。炭素源と� �ては、グルコース、スクロース、フルクト� �ス、増殖促進因子としては、窒素源、リン� �、アミノ酸等が好ましい。窒素源としては� �アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アン� �ニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモ� �ウム、酢酸アンモニウム、ウレア等のアン� �ニウム塩または硝酸塩等が使用することが� �きる。またリン酸源としては、リン酸2水素� ��リウム、リン酸水素2カリウムが使用でき、 アミノ酸としては、栄養要求性変異株を使用 する場合には要求される栄養素を補添するこ とが好ましい。

 本発明において、流加培養あるいは、連� ��培養を行う際には、一時的に糖や栄養源の� ��給が停止するように間欠的に流加培地を流� ��してもよい。また、流加を行う時間の最大� ��30%以下、望ましくは20%以下、特に望ましく� ��10%以下で流加培地の供給を停止することが� ��ましい。流加培養液を間欠的に流加させる� ��合には、流加培地を一定時間添加し、2回目 以降の添加はある添加期に先行する添加停止 期において発酵培地中の炭素源が枯渇すると きのpH上昇または溶存酸素濃度の上昇がコン� ��ューターで検出されるときに開始するよう� ��制御を行い、培養槽内の基質濃度を常に自� ��的に低レベルに維持してもよい(米国特許5,9 12,113号明細書)。

 炭素源としては、グルコース、スクロー� ��、フルクトース、増殖促進因子としては、� ��素源、リン酸、アミノ酸等が好ましい。窒� ��源としては、アンモニア、硫酸アンモニウ� ��、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、� ��ン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、ウ� ��ア等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使� ��することができる。またリン酸源としては� ��リン酸2水素カリウム、リン酸水素2カリウ� �が使用でき、アミノ酸としては、栄養要求� �変異株を使用する場合には要求される栄養� �を補添することが好ましい。また、流加培� �は1種でもよく、2種以上の培地を混合しても よい。2種以上の流加培地を用いる場合、そ� �らの培地は混合して1つのフィード缶により� ��加させてもよいし、複数のフィード缶で流� ��させてもよい。

 また、流加培養を行う際に、糖の量が、� ��加培養液あるいは発酵培地全体の炭素源量� ��して、30g/Lを超えない程度で流加させるこ� �が好ましく、20g/L以下、10g/L以下で制御する� ��とが好ましい。特に、微生物の対数増終了� ��以降に、糖濃度が前記濃度範囲となるよう� ��制御することが好ましい。炭素源の流加速� ��は、米国特許5,912,113号明細書記載の方法を� ��いて制御することが出来る。また、糖とリ� ��酸が菌体生育の制限因子となる濃度で糖と� ��ン酸を流加することが好ましく、流加培養� ��に含まれるリン酸の量としては、P/C ratioで 2以下、好ましくは1.5以下、さらに好ましく� �1以下である(米国特許5,763,230号明細書参照)� �

 本発明で連続培養法を用いる場合には、� ��き抜きは流加と同時に行ってもよいし、一� ��引き抜いたあとで流加を行ってもよい。ま� ��培養液を目的物質と細胞を含んだまま引き� ��いて、細胞だけ発酵槽に戻す菌体を再利用� ��る連続培養法でもよい(フランス特許2669935� �明細書参照)。連続的あるいは間欠的に栄養� ��を流加する方法は流加培養と同様の方法が� ��いられる。

 ここで、培養液を間欠的に引き抜く場合� ��は、予定した目的物質濃度に到達したとき� ��、目的物質を一部引き抜いて、新たに培地� ��流加して培養を行う。また、添加する培地� ��量は、最終的に引き抜く前の培養液量と同� ��になるように培養することが好ましい。こ� ��で同量とは、引き抜く前の培養液量と93~107% 程度の量を意味する。

 培養液を連続的に引き抜く場合には、栄� ��培地を流加させると同時に、あるいは流加� ��せたあとに開始することが望ましく、例え� ��開始時間としては最大で流加を始めた5時間 後、望ましくは3時間後、さらに望ましくは� �大で1時間後である。また引き抜く培養液量� ��しては、流加させる量と同量で引き抜くこ� ��が好ましい。

 菌体を再利用する連続培養法とは、予定� ��た目的物質濃度に達したときに、発酵培地� ��間欠的にあるいは連続して引き抜き、目的� ��質のみを取り出し、菌体を含むろ過残留物� ��しくは遠心上澄み液を発酵槽中に再循環さ� ��る方法であり、例えばフランス特許2669935号 明細書を参照して実施することができる。

 また、本発明の晶析方法で析出した結晶� ��、培養途中で発酵槽から引き抜いてもよい� ��具体的には、発酵槽で本発明の方法を用い� ��、晶析発酵を行い、目的物質、菌体を含む� ��酵液を発酵液から引抜き、目的物質の結晶� ��遠心処理・濃縮し、結晶を取り出し、発酵� ��を発酵槽に戻す方法により、生産性を高め� ��方法を用いることが出来る。例えば、図1に 記載の装置で、目的物質、菌体を含む発酵液 をラインAから循環させ、目的物質の結晶を� �心処理Bで濃縮しラインCより引抜き、発酵液 をラインDより発酵槽に戻す方法を用いるこ� �が出来る。この際、菌体は発酵槽に戻して� �、戻さなくてもよい。結晶の遠心分離処理� �は、液体サイクロン(特開平5-92944)を用いる� �好適である。

 さらに、核酸の製造法においては、本発� ��の方法により製造されたイノシン又はグア� ��シンに、プリンヌクレオシドホスホリラー� ��およびホスホリボシルトランスフェラーゼ� ��作用させることにより、5’-イノシン酸あ� �いは5’-グアニル酸が得られる。

 また、本発明の微生物を用いて生産され� ��プリンヌクレオシドに、ホスホトランスフ� ��ラーゼを作用させることによってリン酸化� ��、プリンヌクレオチド(ヌクレオシド-5’-燐 酸エステル)を生産することも可能である。(� ��開2000-295996)例えば、エシェリヒア・コリの� ��ノシングアノシンキナーゼをコードする遺� ��子を導入したエシェリヒア属細菌を用いる� ��リンヌクレオチドの製造法(WO91/08286号パン� �レット)、エキシグオバクテリウム・アセチ� ��カム(Exiguobacterium acetylicum)のイノシングア� �シンキナーゼをコードする遺伝子を導入し� �コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Cory nebacterium ammnoniagenes)を用いたプリンヌクレオ チドの製造法(WO96/30501号パンフレット)を採用 することができる。

 また、本発明の微生物を用いて生産され� ��プリンヌクレオシドに、ポリ燐酸、フェニ� ��燐酸、カルバミル燐酸からなる群より選択� ��れた燐酸供与体と、ヌクレオシド-5’-燐酸� ��ステルを生成する能力を有する微生物や、� ��性フォスファターゼ(EC 3.1.3.2)を作用させる ことによって、プリンヌクレオチド(ヌクレ� �シド-5’-燐酸エステル)を生産することも可� ��である。ヌクレオシド-5’-燐酸エステルを� ��成する能力を有する微生物は、プリンヌク� ��オシドをプリンヌクレオチドに変換する能� ��を有するものであれば特に制限されないが� ��例えば、国際公開パンフレットWO9637603号に� ��載されたような微生物が挙げられる。

 また、特開平07-231793に開示されているよ� ��なエシェリヒア・ブラッタエ(Escherichia blatt ae)JCM 1650、セラチア・フィカリア(Serratia fica ria)ATCC 33105、クレブシエラ・プランティコラ (Klebsiella planticola)IFO 14939 (ATCC 33531)、クレ� �シエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)IFO  3318 (ATCC 8724)、クレブシエラ・テリゲナ(Klebs iella terrigena)IFO 14941(ATCC 33257)、モルガネラ� �モルガニ(Morganella morganii)IFO 3168、エンテロ� ��クター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)IFO  12010、エンテロバクター・アエロゲネス IFO  13534 (ATCC 13048)、クロモバクテリウム・フ� �ヴィアティレ(Chromobacterium fluviatile)IAM 13652� �クロモバクテリウム・ヴィオラセウム(Chromob acterium violaceum)IFO 12614、セデセア・ラパゲイ (Cedecea lapagei)JCM 1684、セデセア・ダヴィシエ (Cedecea davisiae)JCM 1685、セデセア・ネテリ(Cede cea neteri)JCM 5909などを用いることもできる。

 酸性フォスファターゼとしては、例えば� ��特開2002-000289に開示されているようなもの� �用いることができ、より好ましくはヌクレ� �シドに対する親和性が上昇した酸性フォス� �ァターゼ(特開平10-201481参照)やヌクレオチダ ーゼ活性が低下した変異型酸性フォスファタ ーゼ(WO9637603参照)、燐酸エステル加水分解活� ��が低下した変異型酸性フォスファターゼ(特 開2001-245676)などを用いることができる。

 本発明の微生物を用いて生産されたプリ� ��ヌクレオシドを化学的にリン酸化すること� ��より、プリンヌクレオチドを得ることも可� ��である(Bulletin of the Chemical Society of Japan� �42,3505)。また、微生物が有しているATP再生系 を利用して、本発明のXMP生産能を有する微生 物とXMPアミナーゼ活性を共役させることによ ってGMPを得る方法、イノシンキナーゼを共役 させることによってIMPを得る方法も採用でき る(Biosci.Biotech.Biochem.,51,840(1997)、特開昭63-23009 4)。

 上記プリンヌクレオチドの製造に用いる、� ��発明の方法により製造されたイノシン又は� ��アノシン、又はプリンヌクレオシドは、精� ��されたものであってもよいが、プリンヌク� ��オシドの発酵液又はプリンヌクレオシドを� ��む粗精製物であってもよい。
<2>本発明に用いることが出来る微生物

 本発明に用いる微生物は、L-アミノ酸又� �核酸生産能を有し、液体培地で培養したと� �に培地にL-アミノ酸又は核酸を蓄積させるこ とができる微生物であれば、特に制限されな い。蓄積するL-アミノ酸又は核酸の量は、培� ��から回収できる程度に蓄積できればいずれ� ��もよいが、目的物質を培地中に晶析できる� ��力を有することが好ましく、例えば前記表1 、2に記載された以上の濃度の目的物質を蓄� �できることが望ましい。

 例えば、L-グルタミン酸を含む水溶液のpH を低下させると、L-グルタミン酸はγ-カルボ� ��シル基のpKa(4.25)付近で溶解度は著しく減少� ��、等電点(pH3.2)で溶解度は最も低くなる。培 地組成によっても異なるが、通常には、L-グ� ��タミン酸は約30℃においては、pH3.2では10~20g /L、pH4.0では30~40g/L、pH4.7では50~60g/L溶解する� �

 本発明に用いる微生物又はそれを育種す� ��ための親株としては、エシェリヒア属細菌� ��パントエア属細菌を代表とする腸内細菌科� ��属する微生物や、コリネ型細菌等を用いる� ��とができる。また、メタノールからL-アミ� �酸を生産できる、メチロフィラス属細菌、� �チロバチルス属細菌などのメタノール資化� �細菌を用いてもよい。その他の腸内細菌科� �属する微生物としては、エンテロバクター(E nterobacter)属、、クレブシエラ(Klebsiella)属、セ ラチア(Serratia)属、エルビニア(Erwinia)属、サ� �モネラ(Salmonella)属、モルガネラ(Morganella)属� �どのγ-プロテオバクテリアに属する腸内細� �が挙げられ、またその他の微生物としては� �アリサイクロバチルス(Alicyclobacillus)属細菌� �バチルス(Bacillus)属細菌、サッカロマイセス� ��やキャンディダ属等に属する酵母などが挙� ��られる。

 エシェリヒア属細菌としては、ナイトハ� ��トらの著書(Neidhardt,F.C.et.al., Escherichia coli  and Salmonella Typhimurium, American Society for Micro biology, Washington D.C.,1208, table 1)に挙げられ� �もの、例えばエシェリヒア・コリ等が利用� �きる。エシェリヒア・コリの野生株として� �、例えばK12株又はその誘導体、エシェリヒ� �・コリ MG1655株(ATCC No.47076)、及びW3110株(ATCC� �No.27325)等が挙げられる。これらを入手する� �は、例えばアメリカン・タイプ・カルチャ� �・コレクション(ATCC)より分譲を受けること� �できる(住所 ATCC, Address: P.O. Box 1549, Manass as, VA 20108, 1,United States of America)。すなわ� ��、菌株毎に対応する登録番号が付与されて� ��り、この登録番号を利用して分譲を受ける� ��とができる。各菌株に対応する登録番号は� ��メリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ� ��ンのカタログに記載されている(http://www.atcc .org/参照)。

 また、エンテロバクター属細菌としては� ��エンテロバクター・アグロメランス(Enterobac ter agglomerans)、エンテロバクター・アエロゲ� ��ス(Enterobacter aerogenes)等、パントエア属細菌 としてはパントエア・アナナティス(Pantoea an anatis)が挙げられる。尚、近年、エンテロバ� �ター・アグロメランスは、16S rRNAの塩基配� �解析などにより、パントエア・アグロメラ� �ス(Pantoea agglomerans)又はパントエア・アナナ� ��ィス(Pantoea ananatis)、パントエア・スチュー アルティ(Pantoea stewartii)等に再分類されてい� ��ものがある。本発明においては、腸内細菌� ��に分類されるものであれば、エンテロバク� ��ー属又はパントエア属のいずれに属するも� ��であってもよい。パントエア・アナナティ� ��を遺伝子工学的手法を用いて育種する場合� ��は、パントエア・アナナティスAJ13355株(FERM� �BP-6614)、AJ13356株(FERM BP-6615)、AJ13601株(FERM BP- 7207)及びそれらの誘導体を用いることができ� ��。これらの株は、分離された当時はエンテ� ��バクター・アグロメランスと同定され、エ� ��テロバクター・アグロメランスとして寄託� ��れたが、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列� ��析などにより、パントエア・アナナティス� ��再分類されている。

 メチロフィラス属細菌として具体的には� ��メチロフィラス・メチロトロファスが挙げ� ��れ、代表的な株としてはAS1株(NCIMB10515)等が� ��げられる。メチロフィラス・メチロトロフ� ��スAS1株はナショナル・コレクション・オブ� ��インダストゥリアル・アンド・マリン・バ� ��テリア(National Collections of Industrial and Mari ne Bacteria、住所 NCIMB Lts., Torry Research Statio n 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom) から入手可能である。

 メチロバチラス属細菌として具体的には� ��メチロバチラス・グリコゲネス(Methylobacillus  glycogenes)、メチロバチラス・フラゲラタム(M ethylobacillu flagellatum)等が挙げられる。メチロ バチラス・グリコゲネスとしては、T-11株(NCIM B 11375)、ATCC 21276株、 ATCC 21371株、ATR80株(App l. Microbiol. Biotechnol., (1994)、42巻, p67-72に記� ��)、A513株(Appl. Microbiol. Biotechnol., (1994)、42� �, p67-72に記載)等が挙げられる。メチロバチ� ��ス・グリコゲネスNCIMB 11375株は、ナショナ� ��・コレクション・オブ・インダストゥリア� ��・アンド・マリン・バクテリア(National Colle ctions of Industrial and Marine Bacteria、住所 NCIM B Lts., Torry Research Station 135, Abbey Road, Aber deen AB9 8DG, United Kingdom)から入手可能である 。また、メチロバチラス・フラゲラタムとし ては、KT株(Arch. Microbiol., (1988), 149巻、p441-44 6に記載)等が挙げられる。

 コリネ型細菌としては、バージーズ・マ� ��ュアル・オブ・デターミネイティブ・バク� ��リオロジー(Bergey's Manual of Determinative Bacte riology)第8版599頁(1974)に定義されている一群の 微生物であり、好気性,グラム陽性,非抗酸性, 胞子形成能を有しない桿菌に分類される微生 物が利用できる。なお、コリネ型細菌は、従 来ブレビバクテリウム属に分類されていたが 現在はコリネバクテリウム属細菌として統合 された細菌(Int.J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1991) )、及びコリネバクテリウム属と非常に近縁� �ブレビバクテリウム属細菌及びミクロバテ� �ウム属細菌を含む。

 このようなコリネ型細菌の例として以下の� ��のが挙げられる。
 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラ� ��
 コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
 コリネバクテリウム・アルカノリティカム
 コリネバクテリウム・カルナエ
 コリネバクテリウム・グルタミカム
 コリネバクテリウム・リリウム
 コリネバクテリウム・メラセコーラ
 コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス( コリネバクテリウム・エフィシェンス)
 コリネバクテリウム・ハーキュリス
 ブレビバクテリウム・ディバリカタム
 ブレビバクテリウム・フラバム
 ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ� ��
 ブレビバクテリウム・ロゼウム
 ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
 コリネバクテリウム・アンモニアゲネス
 ブレビバクテリウム・アルバム
 ブレビバクテリウム・セリヌム
 ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム

 具体的には、下記のような菌株を例示する� ��とができる。
 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラ� �� ATCC13870
 コリネバクテリウム・アセトグルタミカム� �ATCC15806
 コリネバクテリウム・アルカノリティカム� �ATCC21511
 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991
 コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC1302 0, ATCC13032, ATCC13060
 コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990
 コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC1796 5
 コリネバクテリウム・エッフィシエンス AJ 12340(FERM BP-1539)
 コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC1386 8
 ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC1 4020
 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826, AT CC14067, AJ12418(FERM BP-2205)
 ブレビバクテリウム・インマリオフィラム� �ATCC14068
 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ� �� ATCC13869(コリネバクテリウム・グルタミカ� ��ATCC13869)
 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825
 ブレビバクテリウム・サッカロリティカム� �ATCC14066
 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC1 9240
 コリネバクテリウム・アンモニアゲネス AT CC6871、ATCC6872
 ブレビバクテリウム・アルバム ATCC15111
 ブレビバクテリウム・セリヌム ATCC15112
 ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム� �ATCC15354

 これらを入手するには、例えばアメリカ� ��・タイプ・カルチャー・コレクション(住所  P.O. Box 1549, Manassas, VA 2010812301 Parklawn Dri ve, Rockville, Maryland 20852, United States of Ameri ca)より分譲を受けることができる。また、AJ1 2340株は、1987年10月27日付けで通商産業省工業 技術院生命工学工業技術研究所(現独立行政� �人産業技術総合研究所 特許生物寄託センタ ー)(〒305-8566 日本国茨城県つくば市東1丁目1� ��地1 中央第6)にFERM BP-1539の受託番号でブダ� ��スト条約に基づいて寄託されている。また� ��AJ12418株は、1989年1月5日付けで通商産業省工 業技術院生命工学工業技術研究所にFERM BP-220 5の受託番号でブダペスト条約に基づいて寄� �されている。

 バチルス属細菌を用いるときは、バチルス� ��細菌としては、バチルス・ズブチリス、バ� ��ルス・アミロリケファシエンス、バチルス� ��プミルス等が挙げられる。
 バチルス・ズブチリスとしては、バチルス� ��ズブチリス168 Marburg(ATCC6051)、バチルス・ズ ブチリスPY79(Plasmid, 1984, 12, 1-9)等が、バチ� �ス・アミロリケファシエンスとしては、バ� �ルス・アミロリケファシエンスT(ATCC23842)、� �びバチルス・アミロリケファシエンスN(ATCC23 845)等が挙げられる。また、バチルス・プミ� �スとしては、バチルス・プミルス Gottheil No .3218(ATCC No.21005)(米国特許第3,616,206号)等が挙� ��られる。

 以下、上述したような親株にL-アミノ酸� �は核酸生産能を付与する方法について述べ� �。

 L-アミノ酸又は核酸生産能を付与するに� �、栄養要求性変異株、アナログ耐性株又は� �謝制御変異株の取得や、L-アミノ酸又は核酸 の生合成系酵素の発現が増強された組換え株 の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリ ヒア属細菌等の育種に採用されてきた方法を 適用することができる(アミノ酸発酵、(株)学 会出版センター、1986年5月30日初版発行、第77 ~100頁参照)。ここで、L-アミノ酸生産菌の育� �において、付与される栄養要求性、アナロ� �耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でも� �く、2種又は3種以上であってもよい。また、 発現が増強されるL-アミノ酸生合成系酵素も� ��単独であっても、2種又は3種以上であって� �よい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性� �代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系� �素の増強が組み合わされてもよい。

 L-アミノ酸又は核酸生産能を有する栄養� �求性変異株、L-アミノ酸又は核酸のアナログ 耐性株、又は代謝制御変異株を取得するには 、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわ ちX線や紫外線の照射、またはN-メチル-N'-ニ� �ロ-N-ニトロソグアニジン等の変異剤処理な� �によって処理し、得られた変異株の中から� �栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御� �異を示し、かつL-アミノ酸生産能を有するも のを選択することによって得ることができる 。

 L-アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異� �、L-アミノ酸のアナログ耐性株、又は代謝制 御変異株は、親株又は野生株を通常の変異処 理、すなわちX線や紫外線の照射、またはN-メ チル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)、エ チルメタンスルフォネート(EMS)等の変異剤処� ��などによって処理し、得られた変異株の中� ��ら、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝� ��御変異を示し、かつL-アミノ酸生産能を有� �るものを選択することによって得ることが� �きる。
 以下、具体的にL-アミノ酸生産能を付与す� �方法とアミノ酸生産菌について例示する。

 L-トリプトファン、L-フェニルアラニン、L-� ��ロシンは共に芳香族アミノ酸で生合成系が� ��通しており、芳香族アミノ酸の生合成系酵� ��をコードする遺伝子としては、デオキシア� ��ビノ-ヘプツロン酸リン酸シンターゼ(aroG)、 3-デヒドロキネートシンターゼ(aroB)、シキミ� ��デヒドロゲナーゼ(aroE)、シキミ酸キナーゼ( aroL)、5-エノール酸ピルビンシキミ酸3-リン酸 シンターゼ(aroA)、コリスミ酸シンターゼ(aroC) が挙げられる(欧州出願公開763127号明細書)。� ��た、これらの遺伝子はチロシンリプレッサ� ��(tyrR)によって制御されることが知られてお� ��、tyrR遺伝子を欠損させることによって、芳 香族アミノ酸の生合成系酵素活性を上昇して もよい(欧州特許763127号明細書参照)。尚、酵� ��名の後のカッコ内は、遺伝子名である(以下 の記載においても同様)。
 また、それぞれのアミノ酸生産能を強化す� ��場合、目的とする芳香族アミノ酸以外の生� ��成系を弱化させてもよい。例えば、目的ア� ��ノ酸がL-トリプトファンの場合、L-フェニル アラニン生合成系、L-チロシン生合成系を弱� ��させてもよい(US4,371,614)。

 また、3-デオキシ-D-アラビノヘプツロン� �-7-リン酸シンターゼ(aroF、aroG)は、芳香族ア� ��ノ酸によるフィードバック阻害を受けるの� ��、フィードバック阻害を受けないように改� ��してもよい。例えば、aroFの場合、N末端よ� �147位のL-アスパラギン酸または181位のL-セリ� ��が他のアミノ酸残基に、aroGの場合、N末端� �り146位のL-アスパラギン酸、147位のL-メチオ� ��ン、150位のL-プロリンもしくは202位のL-アラ ニンの1アミノ酸残基、または157位のL-メチオ ニン及び219位のL-アラニンの2アミノ酸残基を 他のアミノ酸に置換した変異型aroF、aroG遺伝� ��を宿主に導入することによって、芳香族生� ��アミノ酸生産菌を得ることができる(EP0488424 )。

 また、分岐鎖アミノ酸の合成に関与する� ��伝子として、ilvGMEDAオペロンが挙げられる� �、同オペロンは、L-バリン及び/又はL-イソロ イシン及び/又はL-ロイシンによるオペロンの 発現調節(アテニュエーション)を受けるので� ��アテニュエーションに必要な領域が除去又� ��変異されたilvGMEDAオペロンを微生物に保持� �せることによって、これらのL-アミノ酸の生 産性を向上させることができる。

 芳香族アミノ酸、分岐鎖アミノ酸はそれぞ� ��生合成系が共通しており、目的とするL-ア� �ノ酸以外の芳香族アミノ酸、分岐鎖アミノ� �に固有の生合成系を弱化した株を用いるこ� �が好ましい。例えば、目的アミノ酸がL-トリ プトファンの場合、L-フェニルアラニン、L-� �ロシン固有の生合成系を弱化すること、目� �アミノ酸がL-フェニルアラニンの場合、L-ト� ��プトファン、L-チロシン固有の生合成系を� �化すること、目的アミノ酸がL-バリンの場合 、L-ロイシン、L-イソロイシン固有の生合成� �を弱化すること、目的アミノ酸がL-イソロイ シンの場合、L-バリン、L-ロイシン固有の生� �成系を弱化すること、目的アミノ酸がL-ロイ シンの場合、L-バリン、L-イソロイシン固有� �生合成系を弱化することによって、目的L-ア ミノ酸を効率よく生産する菌株を得ることが できる。生合成系を弱化することは、それぞ れその生合成系の酵素をコードする遺伝子に 変異を導入すること、また合成培地中で弱化 したい生合成系により合成されるL-アミノ酸� ��要求する株を、同L-アミノ酸を含有する合� �培地を用いて取得することにより達成でき� �。
 以下に、L-アミノ酸生産能を付与する方法� �び本発明で使用することのできるL-アミノ酸 生産能が付与された微生物を例示する。

L-トリプトファン生産菌
 L-トリプトファン生産菌又はそれを誘導す� �ための親株の例としては、変異trpS遺伝子に� ��りコードされるトリプトファニル-tRNAシン� �ターゼが欠損したE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122 )及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345� �)、セリンによるフィードバック阻害を受け� ��いフォスフォグリセリレートデヒドロゲナ� ��ゼをコードするserAアレル及びトリプトファ ンによるフィードバック阻害を受けないアン トラニレートシンターゼをコードするtrpEア� �ルを有するE. coli SV164 (pGH5) (米国特許第6,1 80,373号)、トリプトファナーゼが欠損したE. c oli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP ( NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、フォスフ ォエノールピルビン酸生産能が増大したE. co li AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,31 9,696号)などのエシェリヒア属に属する株が挙 げられるが、これらに限定されない。yedA遺� �子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク� ��の活性が増大したエシェリヒア属に属するL -トリプトファン生産菌も使用できる(米国特� ��出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1)。

 L-トリプトファン生産菌又はそれを誘導� �るための親株の例としては、アントラニレ� �トシンターゼ(trpE)、フォスフォグリセレー� �デヒドロゲナーゼ(serA)、及び、トリプトフ� �ンシンターゼ(trpAB)から選ばれる酵素の活性� ��一種以上が増大した株も挙げられる。アン� ��ラニレートシンターゼ及びフォスフォグリ� ��レートデヒドロゲナーゼは共にL-トリプト� �ァン及びL-セリンによるフィードバック阻害 を受けるので、フィードバック阻害を解除す る変異をこれらの酵素に導入してもよい。こ のような変異を有する株の具体例としては、 脱感作型アントラニレートシンターゼを保持 するE. coli SV164、及び、フィードバック阻害 が解除されたフォスフォグリセレートデヒド ロゲナーゼをコードする変異serA遺伝子を含� �プラスミドpGH5 (WO 94/08031)をE. coli SV164に導 入することにより得られた形質転換株が挙げ られる。

 また、L-トリプトファン生産菌又はそれ� �誘導するための親株の例として、3-フォスフ ォセリンフォスファターゼ(serB)活性を増大し た株(US4,371,614)、フォスフォエノールピルビ� �酸カルボキシキナーゼ(pckA)を増大した株(WO20 04/090125)、マレートシンターゼ・イソシトレ� �トリアーゼ・イソシトレートデヒドロゲナ� �ゼキナーゼ/フォスファターゼオペロン(aceオ ペロン)が構成的に発現するか、又は同オペ� �ンの発現が強化された株(WO2005/103275)が挙げ� �れる。

 L-トリプトファン生産菌又はそれを誘導� �るための親株の例としては、阻害解除型ア� �トラニレートシンターゼをコードする遺伝� �を含むトリプトファンオペロンが導入され� �株(特開昭57-71397号, 特開昭62-244382号, 米国� �許第4,371,614号)も挙げられる。さらに、トリ� ��トファンオペロン(trpBA)中のトリプトファン シンターゼをコードする遺伝子の発現を増大 させることによりL-トリプトファン生産能を� ��与してもよい。トリプトファンシンターゼ� ��、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によりコード� �れるα及びβサブユニットからなる。さらに� ��イソシトレートリアーゼ-マレートシンター ゼオペロンの発現を増大させることによりL-� ��リプトファン生産能を改良してもよい(WO2005 /103275)。

 コリネ型細菌としてはサルフアグアニジ� ��に耐性株であるコリネバクテリウム・グル� ��ミクムAJ12118(FERM BP-478  特許01681002号)、ト� ��プトファンオペロンが導入されたコリネ型� ��菌(特開S63240794号公報)、コリネ型細菌由来� �シキミ酸キナ-ゼをコ-ドする遺伝子を導入し たコリネ型細菌(特開01994749号公報)を用いる� �とができる。

L-フェニルアラニン生産菌
 L-フェニルアラニン生産菌又はそれを誘導� �るための親株の例としては、E.coli AJ12739 (ty rA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)、変異型pheA34遺伝子� ��保持するE.coli HW1089 (ATCC 55371) (米国特許� � 5,354,672号)、E. coli MWEC101-b (KR8903681)、E.coli  NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B -12147 (米国特許第4,407,952号)などのエシェリ� �ア属に属する株が挙げられるが、これらに� �定されない。また、親株として、E. coli K-12  [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [ W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E. coli K-12 [W3 110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)及びAJ 12604と命 名されたE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMA B] (FERM BP-3579)も使用できる(EP 488424 B1)。さ� ��に、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードさ� �るタンパク質の活性が増大したエシェリヒ� �属に属するL-フェニルアラニン生産菌も使用 できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003 /0157667 A1)。

 コリネ型細菌のフェニルアラニン生産菌� ��しては、ホスホエノールピルビン酸カルボ� ��シラーゼまたはピルビン酸キナーゼ活性が� ��下したCornebacterium glutamicum BPS-13株 (FERM BP- 1777, K77 (FERM BP-2062) 及び K78 (FERM BP-2063)(� �州特許公開公報331145号 JP 02303495)、チロシ� �要求性株(JP 05049489)等を使用することができ る。

 また、フェニルアラニン生産菌としては� ��副生物を細胞内に取り込むように改変する� ��と、例えば、L-トリプトファンの取り込み� �伝子tnaB,mtrや、L-チロシンの取り込み遺伝子� ��あるtyrPの発現量を向上させることによって も、効率よくL-フェニルアラニンを生産する� ��株を取得することができる(EP1484410)。

L-チロシン生産菌
 チロシン生産菌としては、チロシンによる� ��害を受けない脱感作型のプレフェン酸デヒ� ��ラターゼ遺伝子(tyrA)を有するエシェリヒア� ��細菌(欧州特許出願公開1616940号公報)が挙げ� ��れる。

L-バリン生産菌
 L-バリン生産菌又はそれを誘導するための� �株の例としては、ilvGMEDAオペロンを過剰発現 するように改変された株(米国特許第5,998,178� �)が挙げられるが、これらに限定されない。i lvGMEDAオペロンのアテニュエーションに必要� �領域を除去し、生産されるL-バリンによりオ ペロンの発現が減衰しないようにすることが 好ましい。さらに、オペロンのilvA遺伝子が� �壊され、スレオニンデアミナーゼ活性が減� �することが好ましい。

 本発明のL-バリン生産菌を誘導するための� �株の例としては、アミノアシルt-RNAシンテタ ーゼに変異を有する変異株(米国特許第5,658,76 6号)も挙げられる。例えば、イソロイシンtRNA シンテターゼをコードするileS 遺伝子に変異 を有するE. coli VL1970が使用できる。E. coli V L1970は、1988年6月24日、ルシアン・ナショナル ・コレクション・オブ・インダストリアル・ マイクロオルガニズムズ(VKPM) (Russia, 117545 M oscow, 1st Dorozhny proezd, 1)に、受託番号VKPM B- 4411で寄託されている。
 さらに、生育にリポ酸を要求する、及び/ま たは、H ⁺ -ATPaseを欠失している変異株(WO96/06926)を親株� �して用いることができる。

 コリネ型細菌のL-バリン生産菌としては� �例えば、L-バリン酸生合成に関与する酵素を コードする遺伝子の発現が増強するように改 変した菌株を挙げることができる。L-バリン� ��生合成に関与する酵素としては、例えば、i lvBNCオペロンによりコードされる酵素、すな� ��ちilvBNによりコードされるアセトヒドロキ� �酸シンターゼやivlCによりコードされるイソ� ��ロリダクターゼ(国際公開パンフレットWO00/5 0624号)が挙げられる。尚、ilvBNCオペロンは、L -バリン及び/又はL-イソロイシン及び/又はL-� �イシンによるオペロンの発現調節を受ける� �で、生成するL-バリンによる発現抑制を解除 するためにアテニュエーションを解除するこ とが望ましい。

 L-バリン生産能を有するコリネ型細菌と� �ては、L-バリン産生を減少させる物質代謝経 路に関与する、少なくとも1種の酵素の活性� �低下あるいは欠損させることにより行って� �よい。例えば、L-ロイシン合成に関与するス レオニンデヒドラターゼやD-パントセナート� ��成に関与する酵素の活性を低下させること� ��考えられる(国際公開パンフレットWO0050624号 )。

 L-バリン生産能を付与する別の方法として� �アミノ酸アナログなどへの耐性を付与する� �法も挙げられる。
 例えば、L-イソロイシンおよびL-メチオニン 要求性,ならびにD-リボ-ス,プリンリボヌクレ� ��シドまたはピリミジンリボヌクレオシドに� ��性を有し,かつL-バリン生産能を有する変異� ��(FERM P-1841、FERM P-29、特公昭53-025034) や、� �リケトイド類に耐性を有する変異株(FERM P-17 63、FERM P-1764、特公平06-065314) 、更には酢酸� ��唯一の炭素源とする培地でL-バリン耐性を� �し、且つグルコースを唯一の炭素源とする� �地でピルビン酸アナログ(-フルオロピルビン 酸等)に感受性を有する変異株(FERM BP-3006、FER M BP-3007、特許3006929号)が挙げられる。

L-イソロイシン生産菌
 L-イソロイシン生産菌又はそれを誘導する� �めの親株の例としては、6-ジメチルアミノプ リンに耐性を有する変異株(特開平5-304969号)� �チアイソロイシン、イソロイシンヒドロキ� �メートなどのイソロイシンアナログに耐性� �有する変異株、さらにDL-エチオニン及び/ま� ��はアルギニンヒドロキサメートに耐性を有� ��る変異株(特開平5-130882号).が挙げられるが� �これらに限定されない。さらに、スレオニ� �デアミナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンタ� �ゼなどのL-イソロイシン生合成に関与するタ ンパク質をコードする遺伝子で形質転換され た組換え株もまた親株として使用できる(特� �平2-458号, FR 0356739, 及び米国特許第5,998,178� ��)。

 コリネ型細菌のL-イソロイシン生産菌と� �ては、分岐鎖アミノ酸排出タンパク質をコ� �ドするbrnE遺伝子を増幅したコリネ型細菌(特 開2001-169788)、L-リジン生産菌とのプロトプラ� ��ト融合によりL-イソロイシン生産能を付与� �たコリネ型細菌(特開昭62-74293)、ホモセリン� ��ヒドロゲナーゼを強化したコリネ型細菌(特 開昭62-91193)、スレオニンハイドロキサメート 耐性株(特開昭62-195293)、α-ケトマロン耐性株( 特開昭61-15695)、メチルリジン耐性株(特開昭61 -15696)が挙げられる。

L-ロイシン生産菌
 L-ロイシン生産菌又はそれを誘導するため� �親株の例としては、ロイシン耐性のE. coil株  (例えば、57株 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,1 21号))またはβ-2-チエニルアラニン、3-ヒドロ� ��シロイシン、4-アザロイシン、5,5,5-トリフ� �オロロイシンなどのロイシンアナログ耐性� �E. coli株(特公昭62-34397号及び特開平8-70879号)� ��WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法で得 られたE. coli株、E. coli H-9068 (特開平8-70879� �)などのエシェリヒア属に属する株が挙げら� ��るが、これらに限定されない。

 本発明の細菌は、L-ロイシン生合成に関� �する遺伝子の1種以上の発現が増大されるこ� ��により改良されていてもよい。このような� ��伝子の例としては、好ましくはL-ロイシン� �よるフィードバック阻害が解除されたイソ� �ロピルマレートシンターゼをコードする変� �leuA遺伝子(米国特許第6,403,342号)に代表され� �、leuABCDオペロンの遺伝子が挙げられる。さ� ��に、本発明の細菌は、細菌の細胞からL-ア� �ノ酸を排出するタンパク質をコードする遺� �子の1種以上の発現が増大されることにより� ��良されていてもよい。このような遺伝子の� ��としては、b2682遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺 伝子) (EP 1239041 A2)が挙げられる。

 コリネ型細菌のL-ロイシン生産菌として� �、2-チアゾールアラニンかつβ-ハイドロキシ ロイシン耐性株(特開平8-266295)、バリンアナ� �グ耐性株(特開昭63-248392)、バリン要求性株(� �公昭38-4395)、S-(2-アミノエチル)-L-システイン (AEC)耐性株(特公昭51-37347)、フェニルアラニン 、バリン、イソロイシン要求性株(特公昭54-36 233)が挙げられる。

L-グルタミン酸生産菌
 L-グルタミン酸生産菌として好適な菌株は� �例えば、L-グルタミン酸生合成に関与する酵 素をコードする遺伝子の発現が増強するよう に改変する方法を挙げることができる。L-グ� ��タミン酸生合成に関与する酵素としては、� ��かる遺伝子の例としては、グルタメートデ� ��ドロゲナーゼ(gdhA)、グルタミンシンテター� ��(glnA)、グルタメートシンテターゼ(gltAB)、イ ソシトレートデヒドロゲナーゼ(icdA)、アコニ テートヒドラターゼ(acnA, acnB)、シトレート� �ンターゼ(gltA)、フォスフォエノールピルベ� �トカルボシラーゼ(ppc)、ピルベートデヒドロ ゲナーゼ(aceEF, lpdA)、ピルベートキナーゼ(pyk A, pykF)、フォスフォエノールピルベートシン ターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、フォスフォグ� ��セロムターゼ(pgmA, pgmI)、フォスフォグリセ レートキナーゼ(pgk)、グリセルアルデヒド-3-� ��ォスフェートデヒドロゲナーゼ(gapA)、トリ� ��ースフォスフェートイソメラーゼ(tpiA)、フ� ��クトースビスフォスフェートアルドラーゼ( fbp)、フォスフォフルクトキナーゼ(pfkA, pfkB)� ��グルコースフォスフェートイソメラーゼ(pgi )、メチルクエン酸シンターゼ(prpC)などが挙� �られるがこれらに限定されない。

 シトレートシンテターゼ遺伝子、フォス� ��ォエノールピルベートカルボキシラーゼ遺� ��子、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、ピル� ��ートデヒドロゲナーゼ及び/またはグルタメ ートデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増大す るように改変された株の例としては、EP1078989 A、EP955368A及びEP952221A、EP1033407Aに開示された� ��のが挙げられる。

 L-グルタミン酸生産能を付与するための� �変は、L-グルタミン酸の生合成経路から分岐 して他の化合物を生成する反応を触媒する酵 素の活性を低下または欠損させることにより 行ってもよい。L-グルタミン酸の生合成経路� ��ら分岐してL-グルタミン酸以外の化合物を� �成する反応を触媒する酵素としては、イソ� �エン酸リアーゼ(aceA)、α-ケトグルタル酸デ� �ドロゲナーゼ(sucA)、アセトヒドロキシ酸シ� �ターゼ(ilvG)、アセト乳酸シンターゼ(ilvI)、� �酸アセチルトランスフェラーゼ(pfl)、乳酸デ ヒドロゲナーゼ(ldh)、グルタミン酸デカルボ� ��シラーゼ(gadAB)、1-ピロリン5-カルボキシレ� �トデヒドロゲナーゼ(putA)などが挙げられる� �

 例えば、α-ケトグルタル酸デヒドロゲナー� ��活性を低下させるには該酵素のE1oサブユニ� ��トをコードするsucA(odhA)遺伝子を用いて改変 すればよい。α-ケトグルタル酸デヒドロゲナ ーゼ活性が低下した株として、例えば、以下 の株が挙げられる。
 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ� ��δS株(国際公開95/34672号パンフレット)
 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ� ��AJ12821(FERMBP-4172;フランス特許公報9401748号明� ��書参照)
 ブレビバクテリウム・フラバムAJ12822 (FERMBP -4173;フランス特許公報9401748号明細書参照)
 コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12823(FE RMBP-4174;フランス特許公報9401748号明細書参照)
 パントエア・アナナティスAJ13601 (FERM BP-720 7)
 クレブシエラ・プランティコーラAJ13410株(FE RM BP-6617)
 パントエア・アナナティスAJ13355 (FERM BP-661 4)
が挙げられる。
 ここで、パントエア・アナナティスAJ13356は 、αKGDH-E1サブユニット遺伝子(sucA)の破壊によ りα-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性 が欠損している。この株は、単離された時に は、エンテロバクター・アグロメランスと同 定され、エンテロバクター・アグロメランス AJ13356として寄託された。しかし、16S rRNAの� �基配列などに基づき、パントエア・アナナ� �ィスに再分類された。AJ13356は、上記寄託機� ��にエンテロバクター・アグロメランスとし� ��寄託されているが、本明細書では、パント� ��ア・アナナティスとして記載する。

 さらにコリネ型細菌にL-グルタミン酸生� �能を付与する方法として、yggB遺伝子(NCgl 122 1;NP_600492. Reports small-conductance.[gi:19552490];WO200 6/070944)を増幅する方法、コード領域内に変異 を導入した変異型yggB遺伝子を導入する方法� �用いることも可能である。

 本発明の製造法に使用する微生物は、D-キ� �ロース5-リン酸-ホスホケトラーゼ及び/又は� ��ルクトース6-リン酸ホスホケトラーゼ活性� �増強するように改変された微生物でもよい� �
 D-キシロース5-リン酸-ホスホケトラーゼ活� �及びフルクトース6-リン酸ホスホケトラーゼ 活性はいずれか一方を活性化してもよいし、 両方を活性化してもよい。

 L-グルタミン酸生産能を付与または増強� �る別の方法として、有機酸アナログや呼吸� �害剤などへの耐性を付与する方法や細胞壁� �成阻害剤に対する感受性を付与する方法も� �げられる。例えば、モノフルオロ酢酸耐性� �付与する方法(特開昭50-113209)、アデニン耐性 またはチミン耐性を付与する方法(特開昭57-06 5198)、ウレアーゼを弱化させる方法(特開昭52- 038088)、マロン酸耐性を付与する方法(特開昭5 2-038088)、ベンゾピロンまたはナフトキノン類 への耐性を付与する方法(特開昭56-1889)、HOQNO� ��性を付与する方法(特開昭56-140895)、α-ケト� �ロン酸耐性を付与する方法(特開昭57-2689)、� �アニジン耐性を付与する方法(特開昭56-35981)� ��ペニシリンに対する感受性を付与する方法( 特開平4-88994)などが挙げられる。

 このような耐性菌の具体例としては、下記� ��ような菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバムAJ3949(FERM BP-26 32;特開昭50-113209参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11628 (FE RM P-5736;特開昭57-065198参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11355(FERM P-50 07;特開昭56-1889号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11368(FERM  P-5020;特開昭56-1889号公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11217(FERM P-43 18;特開昭57-2689号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11218(FERM  P-4319;特開昭57-2689号公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11564(FERM P-54 72;特開昭56-140895公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11439(FERM P-51 36;特開昭56-35981号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムH7684(FERM  BP-3004;特開平04-88994号公報参照)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ11426(FERM P-5123;特開平56-048890号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11440(FERM  P-5137;特開平56-048890号公報参照)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ11796(FERM P-6402;特開平58-158192号公報参照)

L-スレオニン生産菌
 本発明に用いられるL-スレオニン生産菌と� �て好ましいものとしては、L-スレオニン生合 成系酵素を強化した腸内細菌科に属する細菌 が挙げられる。L-スレオニン生合成系酵素を� ��ードする遺伝子としては、アスパルトキナ� ��ゼIII遺伝子(lysC)、アスパラギン酸セミアル� ��ヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子(asd)、thrオペ� �ンにコードされるアスパルトキナーゼI遺伝� ��(thrA)、ホモセリンキナーゼ遺伝子(thrB)、ス� ��オニンシンターゼ遺伝子(thrC)が挙げられる� ��これらの遺伝子は2種類以上導入してもよい 。L-スレオニン生合成系遺伝子は、スレオニ� ��分解が抑制された腸内細菌科に属する細菌� ��導入してもよい。スレオニン分解が抑制さ� ��たエシェリヒア属細菌としては、例えば、� ��レオニンデヒドロゲナーゼ活性が欠損したT DH-6株(特開2001-346578号)等が挙げられる。

 L-スレオニン生合成系酵素は、最終産物� �L-スレオニンによって酵素活性が抑制される 。従って、L-スレオニン生産菌を構築するた� ��には、L-スレオニンによるフィードバック� �害を受けないようにL-スレオニン生合成系遺 伝子を改変することが望ましい。また、上記 thrA、thrB、thrC遺伝子は、スレオニンオペロン を構成しているが、スレオニンオペロンは、 アテニュエーター構造を形成しており、スレ オニンオペロンの発現は、培養液中のイソロ イシン、スレオニンにより阻害を受け、また 、アテニュエーションにより発現が抑制され る。このアテニュエーションの解除又は低減 は、アテニュエーション領域のリーダー配列 あるいは、アテニュエーターを除去すること により達成出来る(Lynn, S. P., Burton, W. S., D onohue, T. J., Gould, R. M., Gumport, R. I., and G ardner, J. F. J. Mol. Biol. 194:59-69 (1987); 国際 公開第02/26993号パンフレット; 国際公開第2005 /049808号パンフレット参照)。

 スレオニンオペロンの上流には、固有の� ��ロモーターが存在するが、非固有(non-native)� ��プロモーターに置換してもよいし(WO98/04715� �パンフレット参照)、スレオニン生合成関与� ��伝子の発現がラムダファージのリプレッサ� ��およびプロモーターにより支配されるよう� ��スレオニンオペロンを構築してもよい(欧州 特許第0593792号明細書参照)。また、L-スレオ� �ンによるフィ-ドバック阻害を受けないよう� ��エシェリヒア属細菌を改変するために、α-� ��ミノ-β-ヒドロキシ吉草酸(AHV)に耐性な菌株� ��選抜することによっても得られる。

 このようにL-スレオニンによるフィ-ドバ� ��ク阻害を受けないように改変されたスレオ� ��ンオペロンは、宿主内でコピー数が上昇し� ��いるか、あるいは強力なプロモーターに連� ��し、発現量が増大していることが好ましい� ��コピー数の上昇は、プラスミドによる増幅� ��他、トランスポゾン、Mu-ファージ等でゲノ� ��上にスレオニンオペロンを転移させること� ��よっても達成出来る。

 また、アスパルトキナ-ゼIII遺伝子(lysC)は 、L-リジンによるフィ-ドバック阻害を受けな いように改変した遺伝子を用いることが望ま しい。このようなフィ-ドバック阻害を受け� �いように改変したlysC遺伝子は、米国特許5,93 2,453号明細書に記載の方法により取得できる� ��

 L-スレオニン生合成系酵素以外にも、解� �系、TCA回路、呼吸鎖に関する遺伝子や遺伝� �の発現を制御する遺伝子、糖の取り込み遺� �子を強化することも好適である。これらのL- スレオニン生産に効果がある遺伝子としては 、トランスヒドロナーゼ遺伝子(pntAB)(欧州特� ��733712号明細書)、ホスホエノールピルビン酸 カルボキシラーゼ遺伝子(pepC)(国際公開95/06114 号パンフレット)、ホスホエノールピルビン� �シンターゼ遺伝子(pps)(欧州特許877090号明細� �)、コリネ型細菌あるいはバチルス属細菌の� ��ルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子(国際公開 99/18228号パンフレット、欧州出願公開1092776号 明細書)が挙げられる。

 また、L-スレオニンに耐性を付与する遺� �子、及び/又はL-ホモセリンに耐性を付与す� �遺伝子の発現を強化することや、宿主にL-ス レオニン耐性、及び/又はL-ホモセリン耐性を 付与することも好適である。耐性を付与する 遺伝子としては、rhtA遺伝子(Res. Microbiol. 154: 123-135 (2003))、rhtB遺伝子(欧州特許出願公開第 0994190号明細書)、rhtC遺伝子(欧州特許出願公� �第1013765号明細書)、yfiK、yeaS遺伝子(欧州特許 出願公開第1016710号明細書)が挙げられる。ま� ��宿主にL-スレオニン耐性を付与する方法は� �欧州特許出願公開第0994190号明細書や、国際� ��開第90/04636号パンフレット記載の方法を参� �出来る。

 L-スレオニン生産菌として、エシェリヒ� �・コリVKPM B-3996株(米国特許第5,175,107号明細� ��参照)を例示することが出来る。このVKPM B-3 996株は、1987年11月19日にルシアン・ナショナ� ��・コレクション・オブ・インダストリアル� ��マイクロオルガニズムス(Russian National Colle ction of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Geneti ka)(住所:Russia, 117545 Moscow, 1st Dorozhny proezd,� �1)に登録番号VKPM B-3996のもとに寄託されてい る。また、このVKPM B-3996株は、ストレプトマ イシン耐性マーカーを有する広域ベクタープ ラスミドpAYC32(Chistorerdov, A. Y., and Tsygankov,  Y. D. Plasmid, 16, 161-167 (1986)を参照のこと)に スレオニン生合成系遺伝子(スレオニンオペ� �ン:thrABC)を挿入して得られたプラスミドpVIC40 (国際公開第90/04636号パンフレット)を保持し� �いる。このpVIC40においては、スレオニンオ� �ロン中のthrAがコードするアスパルトキナー� ��I-ホモセリンデヒドロゲナーゼIの、L-スレ� �ニンによるフィードバック阻害が解除され� �いる。

 また、エシェリヒア・コリVKPM B-5318株(欧 州特許第0593792号明細書参照)も好適なL-スレ� �ニン生産菌として例示することができる。VK PM B-5318株は、1990年5月3日にルシアン・ナシ� �ナル・コレクション・オブ・インダストリ� �ル・マイクロオルガニズムス(Russian National  Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII G enetika )(Russia, 117545 Moscow, 1st Dorozhny proezd,� �1)に登録番号VKPM B-5318のもとに寄託されてい る。またこのVKPM B-5318株は、イソロイシン非 要求性菌株であり、ラムダファージの温度感 受性C1リプレッサー、PRプロモーターおよびCr oタンパク質のN末端部分の下流に、本来持つ� ��写調節領域であるアテニュエーター領域を� ��失したスレオニンオペロンすなわちスレオ� ��ン生合成関与遺伝子が位置し、スレオニン� ��合成関与遺伝子の発現がラムダファージの� ��プレッサーおよびプロモーターにより支配� ��れるように構築された組換えプラスミドDNA� ��保持している。

L-グルタミン生産菌
 育種によってL-グルタミン生産能を付与す� �ための方法としては、例えば、L-グルタミン 生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の 発現が増強するように改変する方法を挙げる ことができる。例えば、L-グルタミン酸生合� ��に関与する酵素としては、グルタミンシン� ��ターゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼが� ��げられる(特開2002-300887)。

 L-グルタミン生産能を付与するための改� �は、L-グルタミンの生合成経路から分岐して 他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の 活性を低下または欠損させることにより行っ てもよい。例えば、細胞内のグルタミナーゼ 活性を低下させることが考えられる(特開2004- 187684)。

 育種によってL-グルタミン生産能を付与� �たは増強するには、アミノ酸アナログなど� �の耐性を付与する方法も挙げられる。6-ジア ゾ-5-オキソ-ノルロイシン耐性を付与する方� �(特開平3-232497)、プリンアナログ耐性および/ またはメチオニンスルホキサイド耐性を付与 する方法(特開昭61-202694)、α-ケトマロン酸耐� ��を付与する方法(特開昭56-151495)、グルタミ� �酸を含有するペプチドに耐性を付与する方� �(特開平2-186994)などが挙げられる。

 L-グルタミン生産能を有するコリネ型細菌� �具体例としては、下記のような菌株が挙げ� �れる。
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11573(FERM P-54 92特開昭56-151495公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ12210(FERM P-81 23;特開昭61-202694公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ12212(FERM P-81 23;特開昭61-202694公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ12418(FERM BP-2 205;特開平2-186994公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムDH18(FERM P-11116 ;特開平3-232497公報参照)
コリネバクテリウム・メラセコラDH344(FERM P-1 1117;特開平3-232497公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11574(FERM  P-5493;特開昭56-151495公報参照)

L-システイン生産菌
 L-システイン生産菌の例としては、フィー� �バック阻害耐性のセリンアセチルトランス� �ェラーゼをコードする異なるcysEアレルで形� ��転換されたE. coli JM15(米国特許第6,218,168号� ��ロシア特許出願第2003121601号)、細胞に毒性� �物質を排出するのに適したタンパク質をコ� �ドする過剰発現遺伝子を有するE. coli W3110  (米国特許第5,972,663号)、システインデスルフ� ��ヒドラーゼ活性が低下したE. coli株 (JP111555 71A2)、cysB遺伝子によりコードされる正のシス テインレギュロンの転写制御因子の活性が上 昇したE. coli W3110 (WO0127307A1)などのエシェリ ヒア属に属する株が挙げられるが、これらに 限定されない。

 また、本発明に用いるL-アミノ酸生産菌� �、固有の生合成系酵素をコードする遺伝子� �外に、糖の取り込み、糖代謝(解糖系)、エネ ルギー代謝に関与する遺伝子が増幅されてい てもよい。

 糖代謝に関与する遺伝子としては、解糖� ��酵素をコードする遺伝子や糖の取り込み遺� ��子が挙げられ、グルコース6-リン酸イソメ� �ーゼ遺伝子(pgi;国際公開第01/02542号パンフレ� ��ト)、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ 遺伝子(pps;欧州出願公開877090号明細書)、ホス ホグルコムターゼ遺伝子(pgm;国際公開03/04598� �パンフレット)、フルクトース二リン酸アル� ��ラーゼ遺伝子(fbp;国際公開03/04664号パンフレ ット)、ピルビン酸キナーゼ遺伝子(pykF;国際� �開03/008609号パンフレット)、トランスアルド� ��ーゼ遺伝子(talB;国際公開03/008611号パンフレ� ��ト)、フマラーゼ遺伝子(fum;国際公開01/02545� �パンフレット)、ホスホエノールピルビン酸� ��ンターゼ遺伝子(pps;欧州出願公開877090号パ� �フレット)、non-PTSシュクロース取り込み遺伝 子遺伝子(csc;欧州出願公開149911号パンフレッ� ��)、シュクロース資化性遺伝子(scrABオペロン ;国際公開第90/04636号パンフレット)が挙げら� �る。

 エネルギー代謝に関与する遺伝子として� ��、トランスヒドロゲナーゼ遺伝子(pntAB;米国 特許 5,830,716号明細書)、チトクロムbo型オキ� ��ダーゼ(cytochrome bo type oxidase)遺伝子(cyoB; � ��州特許出願公開1070376号明細書)が挙げられ� �。

 次に、微生物に核酸生産能を付与する方法� ��核酸生産菌について例示する。
 核酸生産能を有する細菌微生物は、上記の� ��うな細菌微生物に、例えば、プリンヌクレ� ��シド要求性、又はさらにプリンアナログ等� ��薬剤に対する耐性を付与することにより、� ��得することが出来る(特公昭38-23099、特公昭5 4-17033、特公昭55-45199、特公昭57-14160、特公昭5 7-41915、特公昭59-42895参照)。例えば、栄養要� �性及び薬剤耐性を持つバチルス属細菌は、N- メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)� ��またはEMS(エタンメタンスルフォネート)等� �通常の変異処理に用いられている変異剤に� �る処理によって取得することが出来る。

 プリンヌクレオシドを生産するバチルス属� ��菌としては、以下のものが挙げられる。
 バチルス属に属するイノシン生産株の具体� ��として、バチルス・ズブチリスKMBS16株を使� ��することができる。同菌株は、プリンオペ� ��ンリプレッサーをコードするpurR遺伝子の欠 損(purR::spc)、スクシニル-AMPシンターゼをコー ドするpurA遺伝子の欠損(purA::erm)、およびプリ ンヌクレオシドホスホリラーゼをコードする deoD遺伝子の欠損(deoD::kan)が導入された、既知 のバチルス・ズブチリスtrpC2株(168 Marburg)の� �導体である(特開2004-242610、US2004166575A1)。ま� �、バチルス・ズブチリス菌株AJ3772(FERM P-2555) (特開昭62-014794)等を使用することもできる。

 グアノシン生産能を有するバチルス属細� ��としては、IMP脱水素酵素の活性が上昇した� ��チルス属細菌(特開平3-58787)、プリンアナロ� ��耐性又はデコイニン耐性遺伝子が組み込ま� ��ているベクターをアデニン要求性変異株に� ��入したバチルス属細菌(特公平4-28357)等が挙� ��られる。

 またプリンヌクレオチドを生産するバチル� ��属細菌としては、以下のものが挙げられる� ��
 イノシン酸生産菌としては、バチルス・ズ� ��チリスのフォスファターゼ活性が弱化した� ��ノシン生産株が報告されている(Uchida, K. et  al., Agr. Biol. Chem., 1961, 25, 804-805、Fujimoto,  M. Uchida, K., Agr. Biol. Chem., 1965, 29, 249-259 )。グアニル酸生産菌としては、アデニン要� �性を有しさらにデコイニンまたはメチオニ� �スルフォキシドに耐性を有し、かつ5’-グア ニル酸(グアノシン-5’-モノリン酸、以下「GM P」ともいう)生産能を有するバチルス属の変� ��株が挙げられる(特公昭56-12438号公報)。

 また、キサンチル酸生産菌は、コリネバ� ��テリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium a mmmoniagenes)を中心とするコリネ型細菌の育種� �用いたられる方法を使用して構築すること� �できる。例えば、PRPP amidotransferaseを強化株( 特開平8-168383)、脂肪族アミノ酸耐性株(特開� �4-262790)、デヒドロプロリン耐性株(韓国特許� ��開公報2003-56490)を取得することによって、� �サンチル酸生産菌を構築することができる� �

 また、プリン系物質生産能を有するバチ� ��ス属細菌を育種する方法として、以下の方� ��が挙げられる。プリンヌクレオシド及びプ� ��ンヌクレオチドに共通のプリン生合成に関� ��する酵素、すなわちプリン生合成酵素の細� ��内での活性を上昇させる方法が挙げられる� ��該酵素の細胞内での活性は、バチルス属細� ��の非改変株、例えば野生型のバチルス属細� ��よりも上昇させることが好ましい。「活性� ��上昇する」とは、例えば、細胞当たりの酵� ��分子の数が増加した場合や、酵素分子当た� ��の比活性が上昇した場合などが該当する。� ��えば、前記酵素の遺伝子の発現量を上昇さ� ��ることにより活性を上昇させることができ� ��。前記プリン生合成に関与する酵素として� ��、たとえばホスホリボシルピロリン酸アミ� ��トランスフェラーゼ、ホスホリボシルピロ� ��ン酸シンセターゼ(PRPP synthetase  [EC:2.7.6.1]) などが挙げられる

 ペントースリン酸系に取り込まれたグル� ��ースなどの糖源が代謝により生成したカタ� ��ライトの一部は、リブロース-5-リン酸を経� ��して、リボース-5-リン酸となる。生合成さ� ��たリボース-5-リン酸より、プリンヌクレオ� ��ド、ヒスチジン、およびトリプトファン生� ��成の不可欠な前駆物質であるホスホリボシ� ��ピロリン酸(PRPP)が生成される。具体的には� ��リボース-5-リン酸は、ホスホリボシルピロ� ��ン酸シンセターゼによりPRPPに転換される。 したがって、ホスホリボシルピロリン酸シン セターゼの活性が上昇するように改変するこ とにより、バチルス属細菌にプリン系物質生 産能を付与又は増強することができる。

 「ホスホリボシルピロリン酸シンセター� ��の活性が上昇する」とは、ホスホリボシル� ��ロリン酸シンセターゼの活性が野生株又は� ��株等の非改変株に対して増加していること� ��いう。ホスホリボシルピロリン酸シンセタ� ��ゼの活性は例えば、Switzer等の方法(Methods En zymol., 1978, 51, 3-11)、Roth等の方法(Methods Enzym ol., 1978, 51, 12-17)により、測定することがで きる。ホスホリボシルピロリン酸シンセター ゼの活性が上昇したバチルス属細菌は、例え ば、特開2004-242610号公報に記載の方法と同様� ��して、プラスミドを用いる方法や染色体上� ��組込む方法などにより、ホスホリボシルピ� ��リン酸シンセターゼをコードする遺伝子を� ��チルス属細菌で高発現させることにより作� ��することができる。

 一方、プリンヌクレオシド、ヒスチジン� ��およびトリプトファン生合成に不可欠な前� ��物質であるPRPPが生成されると、その一部は 、プリン生合成に関与する酵素群によりプリ ンヌクレオチド、プリンヌクレオシドへと変 換される。そのような酵素群をコードする遺 伝子としては、バチルス・ズブチリスのプリ ンオペロン、具体的にはpurEKB-purC(orf)QLF-purMNH( J)-purDオペロンの遺伝子(Ebbole DJ and Zalkin H,� �J. Biol. Chem., 1987, 262, 17, 8274-87)(現在では� ��purEKBCSQLFMNHDとも呼ばれる:Bacillus subtilis and� �Its Closest Relatives, Editor in Chief: A.L. Sonensh ein, ASM Press, Washington D.C., 2002。Genbank Access ion No.NC_000964)、およびエシェリヒア・コリの purレギュロンの遺伝子(Escherichia and Salmonella,  Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, AS M Press, Washington D.C., 1996)が例示される。

 したがって、これらの遺伝子の発現を増� ��することにより、プリン系物質生産能を付� ��又は増強することもできる。なお、本発明� ��用いることが出来るプリンオペロン遺伝子� ��これらのものには限定されず、他の微生物� ��動植物由来の遺伝子も利用することも出来� ��。

 プリンオペロンの発現量を増大させる方� ��としては、プラスミドを用いる方法や染色� ��上に組込む方法などにより、プリンオペロ� ��遺伝子をバチルス属細菌で高発現させる方� ��が挙げられる。

 プリンオペロンの発現量を増大させる第2 の方法として、プリンオペロン固有のプロモ ーターをより強力なプロモーターに置換する ことや、固有のプロモーターの-35、-10領域を コンセンサス配列に置換することが挙げられ る。

 例えば、バチルス・ズブチリス(B. subtilis  168 Marburg株; ATCC6051)では、プリンオペロン� ��-35配列はコンセンサス配列(TTGACA)であるが� �-10配列はTAAGATであり、コンセンサス配列TATAA Tとは異なっている(Ebbole, D. J. and H. Zalikn,� �J. Biol. Chem., 1987, 262, 8274-8287)。したがっ� �、-10配列(TAAGAT)をコンセンサス配列にするこ と、あるいはコンセンサス配列に近づけ、TAT AAT、またはTATGAT、もしくはTAAAATとなるように 改変することで、プリンオペロンの転写活性 を上昇させることができる。なお、プロモー ター配列の置換は、下記の遺伝子置換と同様 の方法で行うことが出来る。

 プリンオペロンの発現量を増大させる第3 の方法として、プリンオペロンのリプレッサ ーの発現量を低下させる方法も挙げられる(US P6,284,495号)。「プリンオペロンのリプレッサ� ��の発現」とは、プリンオペロン遺伝子の転� ��、及び転写産物の翻訳の両方を含む。また� ��「発現量を低下させる」とは、発現量が、� ��改変株、例えば野生型のバチルス属細菌に� ��ける発現量よりも低いこと、及び、発現が� ��質的に消失していることを含む。

 プリンペオペロンのリプレッサー(プリン リプレッサー)の発現量を低下させるために� �、例えば、バチルス属細菌を紫外線照射ま� �はNTGもしくはEMS等の通常変異処理に用いら� �ている変異剤によって処理し、プリンリプ� �ッサーの発現量が低下した変異株を選択す� �方法を採用することができる。

 また、プリンリプレッサーの発現量が低� ��したバチルス属細菌は、変異処理の他に、� ��えば、遺伝子組換え法を用いた相同組換え� ��(Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harb or Laboratory press (1972); Matsuyama, S. and Mizushi ma, S., J. Bacteriol., 1985, 162, 1196-1202)により� ��染色体上のプリンリプレッサーをコードす� ��遺伝子(purR;GenBank Accession NC_000964(コード領� ��は塩基番号54439~55293)を、正常に機能しない� ��伝子(以下、「破壊型遺伝子」ということが ある)で置換することによって得ることがで� �る。

 さらに、プリン系物質の細胞内への取り� ��みを弱化することによっても、プリン系物� ��生産能を強化することができる。例えば、� ��リンヌクレオシドの細胞内へ取り込みは、� ��リンヌクレオシドの細胞内への取り込みに� ��与する反応を遮断することによって弱化す� ��ことができる。上記プリンヌクレオシドの� ��胞内への取り込みに関与する反応は、たと� ��ばヌクレオシドパーミアーゼに触媒される� ��応である。

 さらに、プリンヌクレオシドを製造する� ��合には、プリンヌクレオシド生産能を増強� ��せるためにプリン系物質を分解する酵素の� ��性を低下させてもよい。このような酵素と� ��て、例えば、プリンヌクレオシドホスホリ� ��ーゼが挙げられる。

 PRPPから、プリン生合成に関与する酵素群 により生合成されたプリンヌクレオチドは、 脱リン酸化されて、プリンヌクレオシドに変 換される。プリンヌクレオシドを効率的に蓄 積せしめるためには、プリンヌクレオシドを 更に分解してヒポキサンチン等とするプリン ヌクレオシドホスホリラーゼの活性を低下さ せることが好ましい。すなわち、イノシンを はじめとするプリンヌクレオシドを基質とす るプリンヌクレオシドホスホリラーゼを弱化 、あるいは欠損させるように改変することが 望ましい。

 プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性� ��低下は、具体的には、バチルス属細菌でプ� ��ンヌクレオシドホスホリラーゼをコードす� ��deoD遺伝子とpupG遺伝子を破壊することによ� �て達成することができる。本発明のバチル� �属細菌は、上記のようなdeoD遺伝子とpupG遺伝 子を単独、または同時に破壊するように改変 されたものであってもよい。deoD遺伝子、pupG� ��伝子は、例えばバチルス属由来の遺伝子(deo D;Genbank Accession No. NC_000964(コード領域は21346 72-2135370), pupG;Genbank Accession No. NC_000964(コー ド領域は2445610-2446422)が利用できる。

 また、プリン系物質生産能を増強させる� ��めに、サクシニル-AMPシンターゼの活性を低 下させてもよい。サクシニル-AMPシンターゼ� �コードする遺伝子としては、purA遺伝子が挙� ��られる。purA遺伝子としては、例えば、GenBan k Accession No. NC_000964(コード領域は相補鎖の� ��基番号4153460-4155749)で登録されている塩基配 列を有するものが挙げられる。

 さらに、プリン系物質生産能を増強させ� ��ために、イノシンモノリン酸(IMP)脱水素酵� �の活性を低下させてもよい。IMP脱水素酵素� �コードする遺伝子としては、guaB遺伝子が挙� ��られる。guaB遺伝子としては、例えば、GenBan k Accession No.NC_000964(コード領域は15913-17376)で 登録されている塩基配列を有するものが挙げ られる。

 また、プリン系物質生産能を増強させる� ��法として、プリン系物質を排出する活性を� ��するタンパク質をコードする遺伝子を増幅� ��ることが考えられる。このような遺伝子が� ��幅された細菌としては、例えば、rhtA遺伝子 を増幅したバチルス属細菌が挙げられる(特� �2003-219876)。

 遺伝子組換えによる微生物に育種におい� ��使用する遺伝子は、上述した遺伝子情報を� ��つ遺伝子や、公知の配列を有する遺伝子に� ��られず、コードされるタンパク質の機能が� ��なわれない限り、その遺伝子のホモログや� ��為的な改変体等、保存的変異を有する遺伝� ��も使用することができる。すなわち、公知� ��タンパク質のアミノ酸配列において、1若し くは数個の位置での1若しくは数個のアミノ� �の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列� �有するタンパク質をコードする遺伝子であ� �もよい。

 ここで、「1若しくは数個」とは、アミノ 酸残基のタンパク質の立体構造における位置 やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、 具体的には好ましくは1~20個、より好ましく� �1~10個、さらに好ましくは1~5個を意味する。� ��た、保存的変異とは、置換部位が芳香族ア� ��ノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置� ��部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu� ��Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には� ��Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合に� ��、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場� ��には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つ� ��ミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互い� ��置換する変異である。保存的変異の代表的� ��ものは、保存的置換であり、保存的置換と� ��なされる置換としては、具体的には、Alaか� ��Ser又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへ� ��置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置� ��、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer� ��はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp� ��はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はA spへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、L ys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、V al又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPhe� ��の置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの� ��換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、Phe� ��らTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからT hr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換� ��TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又� ��Trpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへ� ��置換が挙げられる。また、上記のようなア� ��ノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆� ��等には、遺伝子が由来する微生物の個体差� ��種の違いに基づく場合などの天然に生じる� ��異(mutant又はvariant)によって生じるものも含� ��れる。このような遺伝子は、例えば、部位� ��異的変異法によって、コードされるタンパ� ��質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠� ��、挿入または付加を含むように公知の遺伝� ��の塩基配列を改変することによって取得す� ��ことができる。

 さらに、上記のような保存的変異を有する� ��伝子は、コードされるアミノ酸配列全体に� ��して、野生型タンパク質と80%以上、好まし� ��は90%以上、より好ましくは95%以上、特に好� ��しくは97%以上の相同性を有し、かつ、野生� ��タンパク質と同等の機能を有するタンパク� ��をコードする遺伝子であってもよい。
 また、遺伝子の配列におけるそれぞれのコ� ��ンは、遺伝子が導入される宿主で使用しや� ��いコドンに置換したものでもよい。

 保存的変異を有する遺伝子は、変異剤処� ��等、通常変異処理に用いられる方法によっ� ��取得されたものであってもよい。

 また、遺伝子は、公知の遺伝子配列の相� ��配列又はその相補配列から調製され得るプ� ��ーブとストリンジェントな条件下でハイブ� ��ダイズし、公知の遺伝子産物と同等の機能� ��有するタンパク質をコードするDNAであって� ��よい。ここで、「ストリンジェントな条件� ��とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形� ��され、非特異的なハイブリッドが形成され� ��い条件をいう。一例を示せば、相同性が高� ��DNA同士、例えば80%以上、好ましくは90%以上� ��より好ましくは95%以上、特に好ましくは97%� ��上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイ� ��し、それより相同性が低いDNA同士がハイブ� ��ダイズしない条件、あるいは通常のサザン� ��イブリダイゼーションの洗いの条件である6 0℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1 % SDS、さらに好ましくは、68℃、0.1×SSC、0.1%� �SDSに相当する塩濃度、温度で、1回、より好� ��しくは2~3回洗浄する条件が挙げられる。

 プローブとしては、遺伝子の相補配列の� ��部を用いることもできる。そのようなプロ� ��ブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製し� ��オリゴヌクレオチドをプライマーとし、こ� ��らの塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCR� ��よって作製することができる。例えば、プ� ��ーブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用 いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗 いの条件は、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられ� ��。