Verfahren zur Herstellung von magnetischen Kieselsäurepartikeln

In den letzten Jahren haben magnetische Partikel zunehmend Anwendung in Verfahren zur Aufreinigung, Trennung und Analyse verschiedener Biomoleküle gefunden. Solche magnetische Partikel umfassen in der Regel ein anorganisches magnetisches oder magnetisierbares Material, das in eine Glas- oder Polymermatrix eingebunden ist. Die Oberfläche der Partikel ist so gestaltet, dass spezifische Biomoleküle in einer Probe, z. B. einem Zelllysat, selektiv an die Oberfläche gebunden werden können. Durch das Anlegen eines äußeren magnetischen Feldes an die Probe können die magnetische Partikel mit den daran gebundenen Biomolekülen einfach aus der Probe entfernt werden. Anschließend können die Biomoleküle durch eine entsprechende Behandlung der magnetischen Partikel eluiert und so in reiner Form oder im angereicherten Zustand gewonnen werden.

Magnetische Partikel mit einer äußeren Glasoberfläche, die im Wesentlichen porenfrei ist oder Poren eines Durchmessers von weniger als 10 nm aufweist, sind beispielsweise in der deutschen Offenlegungsschrift DE 195 20 398 Al beschrieben. Durch In-Kontakt-Bringen dieser Partikel mit einer Probe, die biologisches Material in einer Flüssigkeit enthält, können biologische Materialien, insbesondere Nukleinsäuren, an die Oberfläche der Partikel gebunden werden und anschließend unter Anlegung eines Magnetfeldes aus der Flüssigkeit abgetrennt werden. Die magnetischen Partikel werden durch ein Sol-Gel- Verfahren mit anschließenden Sprühtrocknungsschritt und abschließender Sinterung hergestellt.

In der internationalen Patentanmeldung WO 01/71732 A2 werden poröse, ferro- oder ferrimagnetische Glaspartikel für die Isolierung von Biomolekülen, insbesondere Nukleinsäuren, beschrieben. Diese Partikel werden aus einer Suspension von ferro- oder ferrimagnetischen Eisenoxidpartikeln gewonnen, der ein Tetraalkoxysilan zugegeben wird, das anschließend hydrolysiert wird, wodurch Quarzglas auf den Eisenoxidpartikeln unter Ausbildung der magnetischen Glaspartikel abgeschieden wird. Diese magnetischen Glaspartikel werden anschließend aus der Suspension abgetrennt, gewaschen und bei einer Temperatur unterhalb der Curie-Temperatur getrocknet.

Die Verwendung von magnetischen Glaspartikeln zur Isolierung von Biomolekülen hat sich bewährt. Allerdings weisen die zur Zeit erhältlichen Materialien oftmals noch eine relativ geringe Bindekapazität gegenüber einer zu isolierenden Biomolekül-Spezies auf, so dass verhältnismäßig große Mengen der magnetischen Partikel verwendet werden müssen bzw. eine relativ große Probenmenge, aus der das Biomolekül abgetrennt werden soll, vorhanden sein muss. Die Verwendung verhältnismäßig großer Mengen der magnetischen Partikel verteuert dieses Isolierungsverfahren. Auch sind die Herstellungsverfahren, insbesondere für magnetische Glaspartikel mit der relativ hoher Bindekapazität, verhältnismäßig aufwändig und teuer, so dass weiterhin ein Bedarf an der Bereitstellung eines Herstellungsverfahrens besteht, mit dem magnetische Partikel mit möglichst hoher Bindekapazität verhältnismäßig einfach und kostengünstig hergestellt werden können.

Die vorliegende Erfindung stellt sich die Aufgabe, die oben erläuterten Nachteile aus dem Stand der Technik zu beseitigen bzw. zumindest teilweise zu mindern. Diese Aufgabe löst die vorliegende Erfindung mit den magnetischen Kieselsäurepartikeln gemäß den unabhängigen Ansprüchen 1 und 2, den gemäß dieser Verfahren erhältlichen magnetischen Kieselsäurepartikeln gemäß dem unabhängigen Anspruch 38 sowie dem Verfahren zur Isolierung und/oder Analyse zumindest einer Spezies aus einer Biomoleküle enthaltenden Probe gemäß dem unabhängigen Anspruch 41. Weitere Ausführungsformen, Aspekte, Details und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen sowie der nachfolgenden Beschreibung.

In einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von magnetischen Kieselsäurepartikeln bereit, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Bereitstellen einer flüssigen Reaktionsmischung enthaltend: a.l) ein flüssiges, wässriges Reaktionsmedium, a.2) in der Mischung suspendierte magnetische Partikel, a.3) zumindest eine als Kieselsäurequelle dienende Verbindung, b) Zugabe eines pH-Wert-Modifikators, und c) anschließend Sprühtrocknen der in Schritt b) erhaltenen Reaktionsmischung, wobei der Reaktionsmischung während oder nach Schritt a) oder b), jedoch vor Schritt c) ein organischer Porenbildner zugegeben wird.

In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von porösen magnetischen Kieselsäurepartikeln, das Verfahren umfassend die Schritte: a) Bereitstellen einer flüssigen Reaktionsmischung enthaltend: a.l) ein flüssiges, wässriges Reaktionsmedium, a.2) in der Mischung suspendierte, magnetische Partikel, a.3) zumindest eine als Kieselsäurequelle dienende Verbindung und a.4) organische und/oder anorganische Kernpartikel b) Zugabe eines pH-Wert-Modifikators, und c) anschließend Sprühtrocknen der in Schritt b) erhaltenen Reaktionsmischung, wobei die so hergestellten Partikel Poren mit einem Durchmesser von größer als 10 nm aufweisen.

Unter dem Begriff „magnetische Kieselsäurepartikel" werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Partikel verstanden, die eine Kieselsäurematrix aufweisen, in die magnetische Partikel und gegebenenfalls zusätzliche Partikel, wie z.B. so genannte Kernpartikel, auf denen die Kieselsäurematrix abgeschieden werden kann, eingeschlossen sind. Vorzugsweise umschließt die Kieselsäurematrix die magnetischen Partikel im Wesentlichen vollständig, so dass die äußere Oberfläche der magnetischen Kieselsäurepartikel keine oder nur in unwesentlichen Umfang Bereiche aufweist, die durch magnetische Partikel gebildet werden. Weiterhin ist es bevorzugt, dass gegebenenfalls verwendete Kernpartikel ebenfalls im Wesentlichen vollständig von der Kieselsäurematrix eingeschlossen werden.

Als flüssiges Reaktionsmedium kann Wasser oder ein Gemisch von Wasser mit einem oder mehreren Lösemitteln, insbesondere protische Lösemittel wie Methanol, Ethanol etc. verwendet werden. In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren bei der Silikat verwendet wird, muss die Menge des Wassers in dem Lösemittelgemisch so gewählt werden, dass eine Protonierung der HO-Gruppen des Silikats in der Lösung erfolgen kann. In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren bei der Alkoxysilane als Kieselsäurequelle verwendet werden, muss die Menge des Wassers in dem Lösemittelgemisch so gewählt werden, dass eine Hydrolyse der Alkoxysilane und somit eine Kondensation der Kieselsäurequelle in der Reaktionsmischung ermöglicht wird. Vorzugsweise wird als Reaktionsmedium Wasser verwendet.

Die magnetischen Partikel werden in dem Reaktionsmedium suspendiert, um eine möglichst gleichmäßige Verteilung dieser Partikel in dem Reaktionsmedium zu gewährleisten, so dass

in den nachfolgenden Verfahrensschritten möglichst einheitliche Bedingungen in dem Reaktionsmedium vorliegen, und die magnetischen Partikel im Zuge der Kieselsäurepartikelbildung möglichst gleichmäßig in die Partikel integriert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens beinhaltet das Bereitstellen des Reaktionsgemisches in Schritt a) ein Mahlen oder Desagglomerieren der magnetischen Partikel. Dazu können beispielsweise entsprechende Rührer, gegebenenfalls mit Dispergierwerkzeug, beispielsweise ein von der Firma IKA ^® Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Deutschland, erhältlicher Rührer vom Typ IKA Ultra Turrax, oder unterschiedliche Ultraschalltechniken eingesetzt werden. Das magnetische Pigment kann auch in einer entsprechenden Mühle, beispielsweise einer Kugelmühle, gemahlen werden.

Als magnetische Partikel können im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorzugsweise Partikel verwendet werden, die ausgesucht sind aus der Gruppe bestehend aus ferromagnetischen, ferrimagnetischen und/oder superparamagnetischen Partikeln. Insbesondere können ferromagnetische und/oder superparamagnetische Metalle, insbesondere Eisen oder Cobalt, und Legierungen, vorzugsweise in Form von binären oder ternären Verbindungen, insbesondere Eisen-Cobalt-, Eisen-Platin-, Aluminium-Nickel-Cobalt-, Eisen- Neodym-Bor- oder Samarium-Cobalt- Verbindungen, verwendet werden. Weiterhin können ferro-, ferri-, oder superparamagnetischen Verbindungen verwendet werden, die vorzugsweise ausgesucht sind aus der Gruppe bestehend aus Eisenoxiden, Y-Fe ₂ O ₃ , Fe ₃ O ₄ , Chromdioxid, und Ferriten, insbesondere Ferriten der allgemeinen Formel (M ²⁺ O)Fe ₂ O ₃ , wobei M ²⁺ ein divalentes übergangsmetallkation darstellt. Des Weiteren können Mischungen aus den vorgenannten magnetischen Partikeln verwendet werden.

Beispiele geeigneter, kommerziell erhältlicher ferro- oder ferrimagnetischer Partikel sind ferromagnetische Partikel auf der Basis von γ-Fe ₂ O ₃ wie Bayoxide E AB 21 (Lanxess AG, Leverkusen, Deutschland), ferrimagnetisches Magnetit, erhältlich von der Lanxess AG, Leverkusen, Deutschland, als Typ Bayoxide E 8706, E 8707, E 8710 und E 8713H sowie von der BASF AG, Ludwigshafen, Deutschland, als Magnetpigment 340, und Magnetpigment 345.

Die magnetischen Partikel verleihen den Kieselsäurepartikeln ihre magnetischen Eigenschaften. Die Kieselsäure kann direkt auf den magnetischen Partikeln abgeschieden werden, wodurch die magnetischen Partikel in die sich abscheidende Kieselsäurematrix eingebettet bzw. einschlössen werden.

Als Kieselsäurequelle können im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorzugsweise Silikate, insbesondere Metallsilikate wie beispielsweise Alkalisilikate oder Erdalkalisilikate, insbesondere Natrium- oder Kaliumsilikat verwendet werden. Des weiteren geeignet sind auch Silane oder Silicium-Organische Verbindungen, insbesondere Silicium-Organische Verbindungen der allgemeinen Formel R _n SiX ₄ - _D worin n = 0 oder eine ganze Zahl 1, 2, oder 3; R ein C ₁ -C ₆ - Alkyl, ein C ₃ -C ₆ - Alkenyl, ein C ₆ -C _1O - Aryl oder ein Heteroaryl und X = Wasserstoff, Halogen, -OH, -O- Alkyl, -O-CO- Alkyl, -NH ₂ , NHR ¹ oder NR ¹ R ² , wobei R ¹ und R ² unabhängig voneinander Alkyl, Alkenyl, Aryl oder Aralkyl, -NH-Si-R ³ R ⁴ R ⁵ und wobei R ³ , R ⁴ , R ⁵ unabhängig voneinander Wasserstoff oder Alkyl bedeuten können. In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren ist die Kieselsäurequelle ausgesucht aus der Gruppe der Kieselsäureester, bevorzugt aus der Gruppe der Alkoxysilane und besonders bevorzugt Tetraethoxysilan (TEOS) oder Tetramethoxysilan (TMOS).

In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren enthält die Reaktionsmischung als weitere Komponente a.4.) organische und/oder anorganische Kernpartikel, auf dem die Kieselsäure abgeschieden werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren werden die Kernpartikel kolloidal in dem Reaktionsmedium gelöst. Dies setzt voraus, dass für die Kernpartikel ein Material verwendet wird, das eine solche kolloidale Lösung ermöglicht. Ist dies nicht möglich, so können die Kernpartikel ebenfalls in dem Reaktionsmedium suspendiert werden. Die kolloidale Lösung in dem Reaktionsmedium ermöglicht eine besonders gleichmäßige Verteilung der Kernpartikel in dem Reaktionsgemisch und somit eine besonders gleichmäßige und/oder kontrollierte Partikelbildung.

Als Materialien für die Kernpartikel können vorzugsweise Materialien wie Siliciumdioxid, vorzugsweise stabilisiertes Siliciumdioxid, Metalloxide, insbesondere übergangsmetalloxide wie beispielsweise Titandioxid, Zirkoniumoxid, Aluminiumoxid und Eisenoxid oder Erdalkalioxide wie beispielsweise Magnesiumoxid, Metalle oder Legierungen, wie beispielsweise Eisen, Aluminium oder Platin, sowie Carbide, Boride oder Nitride, organischen Polymere, insbesondere Polystyrole, Poly(alkyl)acrylate, insbesondere Poly(meth)acrylate, vinylische Polymere und Copolymere, Polyurethane, sowie polymere Verbindungen auf Epoxidbasis, d.h. Polymere, die vollständig oder nur zum Teil aus Epoxid-

Monomeren oder Monomeren mit einer Epoxid- Teilstruktur hergestellt wurden, sowie Mischungen aus zwei oder mehreren dieser Materialien verwendet werden. Vorzugweise wird Siliciumdioxid als Kernpartikelmaterial verwendet, da sich hier die Abscheidung der Kieselsäure auf den Kernpartikeln besonders einfach gestaltet. Beispiele geeigneter, kommerziell erhältlicher Kernpartikel sind kolloidal stabilisiertes Siliciumdioxid wie Ludox (Grace Davison, Columbia, USA) oder Levasil (Lanxess AG, Leverkusen, Deutschland), kleine Siliciumdioxidpartikel wie Aerosil (Degussa AG, Düsseldorf, Deutschland) oder Silfam (Nippon Chemical Industrial Co. Ltd., Tokyo, Japan). Die magnetischen Partikel werden, vermutlich im Wege der Co-Präzipitation, in die sich auf den Kernpartikeln abscheidende Kieselsäurematrix eingebettet oder von dieser umschlossen.

Vorzugsweise weisen die magnetischen Partikel und/oder die Kernpartikel einen Partikeldurchmesser von 1 bis 5000 nm, vorzugsweise von 3 bis 500 nm, insbesondere bevorzugt von 4 bis 350 nm auf, wobei die ferromagnetischen Partikel vorzugsweise einen Partikeldurchmesser von 100 bis 350 nm, die superparamagnetischen Partikel vorzugsweise einen Partikeldurchmesser von 4 bis 100 nm, und die Kernpartikel vorzugsweise einen Partikeldurchmesser von 5 bis 250 nm aufweisen. Diese Teilchengrößen sind besonders geeignet, um in den hergestellten magnetischen Kieselsäurepartikeln Poren mit einem Porendurchmesser von 10 bis 300 nm , bevorzugt Poren mit einem Porendurchmesser von 15 bis 200 nm , besonders bevorzugt 20-150 nm zu erzeugen.

In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren wird als pH-Wert- Modifikator eine Verbindung ausgesucht aus der Gruppe bestehend aus den organischen und anorganischen Säuren, Basen, insbesondere Ammoniak, Aminen, Carbonaten, Estern, und Amiden, insbesondere Formamid, Paraformamid, Polyamiden, sowie Methylformiat, Methylacetat, Glyoxal, Amidosulfonsäure, Aldehyden und Ketonen, Harnstoff oder Ammoniumformiat sowie deren Mischungen verwendet. Vorzugsweise werden Formamid, Ammoniumformiat oder Harnstoff, insbesondere Formamid, verwendet. Allgemein gilt, dass jede Verbindung als pH-Wert-Modifikator verwendet werden kann, die in dem Reaktionsgemisch eine pH- Wert-Erniedrigung oder pH- Wert Erhöhung bewirken kann. Der pH-Wert-Modifikator sollte möglichst keinen nachteiligen Einfluss auf die Siliciumdioxid- Abscheidung ausüben.

Vorzugsweise werden pH-Wert-Modifikatoren verwendet, die eine puffernde Wirkung auf das Reaktionsgemisch ausüben, beispielsweise Formamid. Es wird angenommen, dass Formamid in der alkalischen Reaktionsmischung unter Bildung von Ammoniumformiat hydrolysiert wird, das dann als Puffer wirken kann. Vorzugsweise sollte die Anpassung des pH- Wertes durch den pH-Wert-Modifikator so eingestellt werden, dass die bei dem sich ändernden pH- Wert einsetzende oder verstärkt ablaufende Kondensation der Kieselsäurequelle in einer Geschwindigkeit abläuft, die eine anschließende Sprühtrocknung noch erlaubt. Wird beispielsweise bei der Verwendung eines Silikats als Kieselsäurequelle der pH- Wert zu weit erniedrigt, läuft die Gelbildung unter Kondensation des Silikats zu schnell ab und die Reaktionsmischung ist so stark geliert, dass eine Sprühtrocknung nicht mehr möglich ist, da sich die Sprühdüsen sofort zusetzen würden.

Vorzugsweise wird der pH- Wert der Silikat enthaltenden Reaktionsmischung, die vor der Zugabe des Modifikators in der Regel einen pH- Wert von größer als 12 aufweist, durch die Zugabe des pH-Wert-Modifikators auf einen Wert in dem Bereich von 8 bis 12, vorzugsweise von 9 bis 11,5 insbesondere in den Bereich von 9,5 bis 11 gebracht.

In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren können in der wässrigen Reaktionsmischung des weiteren organische Lösungsmittel, insbesondere Alkohole verwendet werden um eine Kondensation der Kieselsäurequelle zu bewirken. Ebenfalls geeignet sind wässrige Mischungen aus Alkoholen mit Salzen.

Während und nach der Zugabe des pH-Wert-Modifikators wird die Reaktionsmischung vorzugsweise gerührt. Die Reaktionsmischung kann beispielsweise durch mechanische Rührung homogenisiert werden.

Der organische Porenbildner, der der Reaktionsmischung während oder nach Schritt a) oder b) zugegeben wird, kann jede hydrophile oder hydrophobe organische Verbindung sein, die geeignet ist, während der Gelierung Poren in dem entstehenden Gel auszubilden. Vorzugsweise ist der Porenbildner ausgesucht aus der Gruppe bestehend aus aliphatischen, verzweigten oder un verzweigten Alkoholen mit 1 bis 20-C- Atomen, bevorzugt 2 bis 16-C- Atomen und besonders bevorzugt 2 bis 8-C- Atomen, mit einer oder mehreren Hydroxygruppen, insbesondere 1-3 Hydroxygruppen. Geeignete Alkohole sind beispielsweise die aliphatischen Monoalkohole oder aber Polyole wie z.B. Ethylenglykol oder Glycerin.

Ferner eignen sich Kohlenhydrate wie beispielsweise Glukose. Zudem kann der Porenbildner auch ausgesucht sein aus polymeren Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyalkylidenglykolderivaten, insbesondere Polyethylenglykolen und Polypropylenglykolen, insbesondere Polyethylenglykolen mit der allgemeinen Formel HO(CH ₂ -CH ₂ O) _n CH ₂ - CH ₂ OH, wobei n=2 bis 200.000, unverzweigten und verzweigten Polyethyleniminen, Polyallylaminen, Polyvinylpyrolidonen, Polystyrolen und deren Copolymeren (insbesondere Ethylen, Propylen, Divinylbenzol etc), Polylysinen sowie (Alkyl)acrylaten, insbesondere Methacrylaten, sowie Mischungen aus zwei oder mehreren der vorgenannten Verbindungen. Beispiele geeigneter Porenbildner sind Ethylenglykol, Glycerin und Polyethylenglykol (Mw: 200-10000 g/mol).

Vorzugsweise wird das Sprühtrocknen in dem erfindungsgemäßen Verfahren innerhalb eines Zeitraumes von 30 min bis 24 h nach der Zugabe des pH-Wert-Modifikators durchgeführt. Die Frage, wie lange der Zeitraum zu bemessen ist, hängt von den in der Reaktionsmischung verwendeten Verbindungen, deren Konzentrationen sowie den herrschenden Reaktionsbedingungen ab.

Das Sprühtrocknen in Schritt c) der erfindungsgemäßen Verfahren wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 9O ⁰ C oder höher, insbesondere vorzugsweise bei einer Temperatur im Bereich von 100 ⁰ C bis 400 ⁰ C durchgeführt. Die Reaktionsmischung wird dabei im Einlass der Sprühtrocknung s Vorrichtung, die beispielsweise eine Temperatur von 100 ⁰ C bis 200 ⁰ C aufweist, erhitzt.

Für das Sprühtrocknen können herkömmliche Verfahren und kommerziell erhältliche Vorrichtungen verwendet werden. Sprühtrocknungsverfahren anorganischer Partikel sind beispielsweise in dem US-Patent 3,284,369 und der internationalen Patentanmeldung WO 99/51335 beschrieben.

In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung der magnetischen Kieselsäurepartikel werden die nach dem Sprühtrocknen erhaltenen magnetischen Partikel in einem Schritt d) bei einer Temperatur von maximal 300 ⁰ C, besonders bevorzugt in einem Temperaturbereich von 100 ⁰ C bis 25O ⁰ C, ganz besonders bevorzugt in einem Temperaturbereich von 140 bis 16O ⁰ C, getrocknet.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt das Trocknen in Gegenwart von Sauerstoff oder unter Schutzgas, besonders bevorzugt unter einer N ₂ - Atmosphäre.

Eine Sinterung der durch Sprühtrocknung erhaltenen magnetischen Kieselsäurepartikel bei höheren Temperaturen ist in dem vorliegenden Verfahren nicht notwendig und würde sich aufgrund der mit der Sinterung einhergehenden Verringerung der Gesamtporosität sowie der Oberflächenveränderung des Kieselsäurematerials nachteilig auf die Bindungskapazität der Partikel auswirken. Damit kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auf eine zeitaufwendige und energieintensive Sinterung verzichtet werden, wodurch das erfindungsgemäße Verfahren weiter vereinfacht und kostengünstiger gestaltet werden kann. Vorzugsweise werden die nach der Sprühtrocknung erhaltenen magnetischen Kieselsäurepartikel vor dem Trocknungsschritt d) mit einem oder mehreren Lösemitteln gewaschen. Das Waschen kann dabei in mehreren Schritten mit unterschiedlichen Lösemitteln oder Lösemittelgemischen erfolgen. Als Lösemittel zum Waschen wird vorzugsweise sterilfiltriertes, destilliertes oder entsalztes Wasser verwendet. Ferner können als Lösemittel zum Waschen auch andere gängige Lösemittel wie Alkohole, insbesondere Ethanol oder Isopropanol, Ketone und/oder verdünnte Salzlösungen verwendet werden. Des Weiteren kann eine wässrige Lösung einer Säure, beispielsweise Essigsäure, in einem Zwischenwaschschritt verwendet werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren werden

1-30 Gew.-%, bevorzugt 1-10 Gew.-% einer Kieselsäurequelle, insbesondere Silicat;

1-15 Gew.-%, bevorzugt 2-8 Gew.-% magnetische Partikel,

0-30 Gew.-%, bevorzugt 1-10 Gew.-% organische oder anorganische Kernpartikel,

0-15 Gew.-%, bevorzugt 1-6 Gew.-% Porenbildner und

0,01-25 Gew.-%, bevorzugt 1-10 Gew.-% pH-Wert Modifikator verwendet.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren werden

1-50 Gew.-%, bevorzugt 2-20 Gew.-% einer Kieselsäurequelle, insbesondere Silan;

1-50 Gew.-%, bevorzugt 2-15 Gew.-% magnetische Partikel

0-98 Gew.-%, bevorzugt 0-50 Gew.-% organische Lösemittel

0-98 Gew.-%, bevorzugt 0-80 Gew.-% Wasser; und

0,25-30 Gew.-%, bevorzugt 1-5 Gew.-% pH- Wert Modifikator verwendet.

In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung magnetische Kieselsäurepartikel, die nach dem vorhergehend beschriebenen, erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren erhältlich sind.

Die erfindungsgemäßen magnetischen Kieselsäurepartikel enthalten in einer bevorzugten Ausführungsform 1-98 Gew.-%, bevorzugt 25-75 Gew.-% Silica und 2-99 Gew.-%, bevorzugt 25-75 Gew.-% Eisenoxid.

In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Isolierung und/oder Analyse zumindest einer Spezies eines Biomoleküls aus einer Probe, das Verfahren umfassend die Schritte: a) Bereitstellen einer zumindest eine Spezies Biomolekül enthaltende Probe, b) In-Kontakt-Bringen der Probe mit magnetischen Kieselsäurepartikeln, die gemäß der oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, unter Bedingungen, bei denen die zumindest eine Spezies Biomolekül an den magnetischen Kieselsäurepartikel immobilisiert wird, und c) Abtrennung der magnetischen Partikel mit den immobilisierten Biomolekülen unter Verwendung zumindest eines Magnetfeldes.

In einer Ausführungsform dieses Verfahrens schließt sich als weiterer Schritt d) das Eluieren der zumindest einen Spezies Biomolekül von den magnetischen Kieselsäurepartikeln ein.

Die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten magnetischen Kieselsäurepartikel können somit in der molekularbiologischen Forschung oder der klinischen Diagnostik für die Immobilisierung, bzw. Bindung oder Adsorption von Biomolekülen verwendet werden. Dabei kann die Spezies Biomolekül, die an den magnetischen Partikel immobilisiert wird, ausgesucht sein aus der Gruppe bestehend aus Nukleinsäuren, Oligonukleotiden Proteinen, Polypeptiden, Peptiden, Kohlenhydraten, Lipiden, sowie deren Kombinationen. Insbesondere können Nukleinsäuren und Oligonukleotide, vorzugsweise Plasmid-DNA, genomische DNA, c-DNA, aus PCR gewonnene DNA, lineare DNA, RNA, Ribozyme, Aptamere, und chemisch synthetisierte oder modifizierte Nukleinsäure oder Oligonukleotide an die magnetischen Partikel gebunden werden. Unter „immobilisiert" ist hier allgemein zu verstehen, dass das Biomolekül eine so starke Wechselwirkung mit dem magnetischen Kieselsäurepartikel ausbildet, dass es zusammen diesem unter dem Einfluss

eines Magnetfeldes aus einer Probe entfernt werden kann. Diese Wechselwirkungen können verschiedener Natur sein. Beispielsweise können die Wechselwirkungen auf der Ausbildung kovalenter Bindungen und/oder Wasserstoffbrücken-Bindungen und/oder van-der-Waals Kräften beruhen.

Die Proben, in denen die zumindest eine Biomolekül-Spezies enthalten ist, können relativ komplexe Proben sein wie Blut, Gewebe, Zellen, pflanzlichen Materialien und ähnliches. Andere Proben sind Lösungen, die im Zuge eines Aufreinigungs-, Amplifikations-, oder Analyseverfahrens erhalten werden, beispielsweise PCR-Lösungen.

Weitere Verfahren in denen die erfindungsgemäßen magnetischen Partikel eingesetzt werden können, sind Nukleinsäure-Nachweise mittels Hybridisierung, die Bindung von Antikörpern oder organischen Makromolekülen. Weiterhin können die erfindungsgemäßen magnetischen Partikel zur Plasmid-Reinigung in bakteriellen Zellen, der Aufreinigung von PCR-Produkten und der Bindung von viralen Nukleinsäuren verwendet werden. Allgemein können die magnetischen Partikel zur Immobilisierung, dem Nachweis und der Aufreinigung von Biomolekülen oder Zellen verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung vereint die Vorteile eines Sprühtrocknungsverfahrens, das eine kostengünstige, kontinuierliche Herstellung von Partikeln ohne zeitaufwändige Entfernung von Reaktanden und Lösemitteln ermöglicht, mit der Bereitstellung von Partikeln mit hoher Oberfläche, wodurch die magnetischen Kieselsäurepartikel vergleichsweise hohe Mengen an Biomolekülen binden können und somit hohe Bindungskapazitäten aufweisen. Des Weiteren können Biomoleküle in hohen Konzentrationen von den magnetischen Kieselsäurepartikeln eruiert werden, wodurch eine effektive Verwendung dieser Eluate in nachgelagerten Anwendungen wie RT-PCR, quantitative RT-PCR, Sequenzierungen, Northern Blot- und Microarray- Analysen ermöglicht wird. Die derart gewonnenen Eluate sind vorteilhafterweise sehr hoch konzentriert, so dass sie direkt - d. h. ohne gängige Aufkonzentrierung s schritte etc., in den oben genannten nachgelagerten Assays Anwendung finden können.

In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit zur Aufreinigung von zumindest einer Spezies Biomolekül aus einer dieses Biomolekül enthaltende Probe, insbesondere Nukleinsäuren aus Nukleinsäure enthaltenden Gemische, enthaltend die gemäß erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren hergestellten porösen, magnetischen Kieselsäurepartikel. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Aufreinigungskit

zusätzlich ein geeignetes Elutionsmittel, beispielsweise Wasser oder wässrige Salzlösungen in niedriger Konzentration.

Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung anhand verschiedener Beispiele weiter beschrieben. Diese Beispiele dienen lediglich der Erläuterung und sind nicht als einschränkend für die vorliegende Erfindung zu verstehen.

Beispiel 1:

Synthese von superparamagnetischen Silicapartikel durch Sprühtrocknung

323 ml einer 1 M FeCl ₃ -Lösung in H ₂ O werden mit 81 ml einer 2 M FeCl ₂ Lösung in 2 M HCl vermischt. Das Gemisch wird sofort unter heftigem Rühren in eine Lösung von 5000 ml 0,7 M NH ₃ -Lösung eingetragen. Nach weiteren 30 Minuten Rühren wird das Gemisch in Zentrifugationsgefäße überführt und dann mehrfach mit vollentsalztem Wasser (VE-Wasser) gewaschen. Dann werden die überstände mittels magnetischer Separation abgetrennt. Anschließend wird der Feststoff in absolutes Ethanol überführt. Die den Feststoff enthaltenden Zentrifugationsgefäße werden anschließend im Vakuumtrockenschrank getrocknet. Dabei erhält man 40 g superparamagnetisches Eisenoxid. Je 40 ml einer Kaliumsilicatlösung (Kaliumsilicat 28/30, Cognis AG, Düsseldorf, Deutschland) werden in ein 125 ml Reaktionsgefäß gegeben (vorzugsweise in ein Plastikgefäß, wie z. B. eine Nalgene Flasche von Nalge Nunc, Rochester, NY, USA). Die Flasche wird an einen Homogenisator angesetzt und 12,5 g superparamagnetisches Eisenoxid werden vorsichtig zugesetzt. Dann wird 60 Sekunden homogenisiert und das Gemisch zu einer Lösung von 10 g Aerosil OX 50 (Degussa AG, Düsseldorf, Deutschland) und 288 ml VE- Wasser sowie einer Mischung 1: 12,5 g Glycerin, und einer Mischung 2: 12,5 g PEG 600, in einen 500 ml Reaktionsgefäß unter Homogenisieren (60 Sekunden) zugegeben. Dann werden 20 ml Formamid zugegeben, und die Mischung anschließend für ca. drei Stunden langsam bei RT mit einem Roller (Mixer SRT von Stuart Scientific, distributed by Reallabware, Watford Herts, UK) gerührt. Der Sprühtrockner (Spray Dryer 280, Büchi AG, Buchs, CH) wird 30 Minuten vorlaufen gelassen. Anschließend wird der Zerschlagrührer (Turbinenrührer, mit einem Durchmesser von 50 mm, VWR, Darmstadt, DE) für 1 Minute auf 1.000 U/min gestellt, dann auf 750 U/min. Dann wird der Sprühtrocknungsvorgang mit folgenden Parametern begonnen: Inlet- Temperatur 200 ⁰ C, Aspirator 100%, Druckluftfluss 50 mm, Nozzle Cleaner 6 (Düsen- bzw. Auslassreiniger). Die zum Sprühtrockner gehörende

Pumpe wird mit 20% Leistung betrieben und eine Sammelzeit von ca. 10 Minuten eingehalten. Die so erhaltenen Produkte werden erst 10 Minuten lang in VE- Wasser, dann in 10%ige Essigsäure getaucht und nach Entgasen in einem Kunststoff- Röhrchen (beispielsweise einem Falcon-Tube, einem 50 ml Polypropylene Tube, von Beckton- Dickinson Biosciences, Heidelberg, DE) über Nacht am End-over-End-Schüttler geschwenkt oder nach 1 h Schütteln gelagert. Dann wird magnetisch separiert und die erhaltenen Partikel dreimal mit VE- Wasser und dreimal mit abs. Ethanol gewaschen. Die auf drei Portionen aufgeteilten Proben werden bei 15O ⁰ C getrocknet.

Beispiel 2:

Synthese von porösem ferrimagnetischen Silicapartikel durch Sprühtrocknung

25 ml einer Kaliumsilicatlösung (Kaliumsilicat 28/30, Cognis AG, Düsseldorf, Deutschland) werden in ein 50 ml Kunststoffgefäß gegeben und dieses dann an einen Homogenisator angeschlossen. Dann werden vorsichtig 6,25 g BASF Eisenoxid 345 zugesetzt. Das Gemisch wird 60 Sekunden bei voller Rührerleistung homogenisiert. Dieses Gemisch wird einer Lösung von 10 ml Ludox AS 40 (Grace Davison, WR Grace & Co, Columbia, USA) und 6,25 g Polyethylenglykol, MW 600, in 124 ml VE- Wasser in einer 250 ml Nalgene-Flasche unter Homogenisieren für 60 Sekunden auf höchster Rührerstufe an einem IKA Homogenisator T 25 zugesetzt. Dann werden 10 ml Formamid zugegeben und das Gemisch für ca. drei Stunden langsam bei RT mit einem Roller gerührt. Der Sprühtrockner wird 30 Minuten vorlaufen gelassen. Nach drei Stunden Gelierung szeit wird der Zerschlagrührer auf 750 U/min gestellt und der Sprühtrocknungsvorgang wird mit den folgenden Parametern begonnen: Inlet- Temperatur 200 ⁰ C, Aspirator 100%, Druckluftfluss 50 mm. Die zum Sprühtrockner gehörende Pumpe wird mit 20% Leistung betrieben, Sammelzeit der Partikel ca. 7 Minuten. Die so erhaltenen Partikel werden erst 10 Minuten lang in VE- Wasser, dann in 10%ige Essigsäure getaucht und nach Entgasen in einem FalconTube über Nacht am End-over-End- Schüttler geschwenkt oder nach 1 h Schütteln gelagert. Dann wird magnetisch separiert und anschließend dreimal mit VE- Wasser und dreimal mit abs. Ethanol gewaschen. Die Partikel werden auf drei Proben aufgeteilt und bei 15O ⁰ C getrocknet.

Beispiel 3:

Synthese von porösen ferrimagnetischen Silicapartikeln mit Titandioxidkern durch

Sprühtrocknung

Je 25 ml einer Kaliumsilicatlösung (Kaliumsilicat 28/30, Cognis AG, Düsseldorf, Deutschland) werden in ein 50 ml Kunststoffgefäß gegeben. Anschließend wird das Reaktionsgefäß an einen Homogenisator angeschlossen und es werden vorsichtig 6,25 g BASF Eisenoxid 345 zugesetzt. Das Gemisch wird 60 Sekunden bei voller Rührerleistung homogenisiert. Dann wird das Gemisch einer Lösung von 5 g Titandioxid P 25 (Degussa AG, Hanau, Deutschland) und 6,25 g Polyethylenglykol, MW 600 in 124 ml VE- Wasser in einer 250 ml Nalgene-Flasche unter Homogenisieren für 60 Sekunden auf höchster Stufe an einem IKA Homogenisator T 25 zugesetzt. Anschließend werden 10 ml Formamid zugegeben und ca. drei Stunden langsam bei RT mit einem Roller gerührt. Der Sprühtrockner wird 30 Minuten vorlaufen gelassen. Nach drei Stunden Gelierung szeit wird der Zerschlagrührer auf 750 U/min gestellt und der Sprühtrocknungsvorgang mit den folgenden Parametern begonnen: Inlet- Temperatur 200 ⁰ C, Aspirator 100%, Druckluftfluss 50 mm. Die zum Sprühtrockner gehörende Pumpe wird mit 20% betrieben und eine Sammelzeit der Partikel von ca. 15 Minuten eingehalten. Die so erhaltenen Partikel werden erst 10 Minuten lang in VE- Wasser, dann in 10%ige Essigsäure getaucht und nach Entgasen in einem Falcon-Tube über Nacht am End-over-End-Schüttler geschwenkt oder nach 1 h Schütteln gelagert. Dann separiert wird magnetisch separiert und die Partikel dreimal mit VE- Wasser und dreimal mit abs. Ethanol gewaschen. Anschließend werden die die auf drei Portionen aufgeteilten Proben bei 15O ⁰ C getrocknet.

Beispiel 4:

Synthese von porösem ferromagnetischen Silica durch Sprühtrocknung

Es werden je 25 ml einer Kaliumsilicatlösung (Kaliumsilicat 28/30, Cognis AG, Düsseldorf, Deutschland) in ein 50 ml Kunststoffgefäß gegeben. Anschließend wird das Reaktionsgefäß an einen Homogenisator angeschlossen und vorsichtig 6,25 g BASF Eisenoxid 345, das zuvor durch 24 Stunden Erhitzen auf 400 ⁰ C zu Fe ₂ O ₃ oxidiert wurde, zugesetzt. Dann wird für 60 Sekunden bei voller Leistung homogenisiert. Das Gemisch wird anschließend einer Lösung von 10 ml Ludox AS 40 und 6,25 g Polyethylenglykol, MW 600 in 124 ml VE- Wasser in einer 250 ml Nalgene-Flasche unter Homogenisieren für 60 Sekunden auf höchster Stufe an

einem IKA Homogenisator T 25 zugesetzt. Dann werden 10 ml Formamid zugegeben und ca. drei Stunden langsam bei RT mit einem Roller gerührt. Der Sprühtrockner wird 30 Minuten vorlaufen gelassen. Nach drei Stunden Gelierung szeit wird der Zerschlagrührer auf 750 U/min gestellt und der Sprühtrocknungsvorgang mit den folgenden Parametern begonnen: Inlet- Temperatur 200 ⁰ C, Aspirator 100%, Druckluftfluss 50 mm. Die zum Sprühtrockner gehörende Pumpe wird mit 20% Leistung betrieben, Sammelzeit der Partikel ca. 7 Minuten. Die so erhaltenen Partikel werden erst 10 Minuten lang in VE- Wasser, dann in 10%ige Essigsäure getaucht und nach Entgasen in einem Falcon-Tube über Nacht am End-over-End- Schüttler geschwenkt oder nach 1 h Schütteln gelagert. Dann wird magnetisch separiert und anschließend dreimal mit VE- Wasser und dreimal mit abs. Ethanol gewaschen. Die auf drei Portionen aufgeteilten Proben werden dann bei 15O ⁰ C getrocknet.

Verwendungsbeispiele der magnetischen Kieselsäurepartikel

Beispiel 5:

Als Vergleich zu den erfindungsgemäßen, durch Sprühtrocknung synthetisierten Kieselsäurepartikeln werden kommerziell erhältliche, glasartige Beads der Firma Roche Diagnostics, die wahrscheinlich auch durch Sprühtrocknung hergestellt wurden, verwendet. Diese Beads wurden aus dem Kit MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I, Best. Nr. 3 003 990, entnommen, mit VE Wasser und Ethanol gewaschen und getrocknet. Diese Beads werden in den gleichen Mengen und Konzentrationen wie die erfindungsgemäßen Partikel eingesetzt.

5.1 Plasmidaufreinigung („Cleanup")

Zu 190 μl Puffer „RLT" (QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland, Kat. # 79216) werden 10 μl einer 1 μg/μl Lösung von Plasmid pUC21 in Wasser zugesetzt. Anschließend vortext man 5 Sekunden und setzt 10 μl einer 50 mg/ml Suspension von porösen magnetischen Kieselsäurepartikeln in VE- Wasser, hergestellt nach Beispiel 2 (SDP-014-2) und/oder nach Beispiel 4 (SDP-015-4) zu. Man vortext erneut 5 Sekunden. Dann werden 225 μl Ethanol zugesetzt, die Probe in einen Thermomixer gestellt und fünf Minuten bei Raumtemperatur und 1100 U/min inkubiert. Dann wird magnetisch separiert und der überstand durch Abpipettieren entfernt. Anschließend werden 225 μl 70%igen Ethanol zugesetzt, für zehn Sekunden gevortext und der überstand durch magnetische Sedimentation entfernt. Der

Waschschritt wird mit absolutem Ethanol wiederholt und dann das magnetische Pellet durch Umkehren des Separators an der Luft zehn Minuten lang getrocknet, um Ethanolreste zu entfernen. Dann werden 50 μl eines 10 mM Tris-Puffers, pH 8,5 zugesetzt und die Proben werden zwei Minuten lang im Thermomixer bei 700 U/min inkubiert. Danach wird magnetisch separiert und das Eluat photometrisch und ggf. per PAGE (Polyacrylamide gel electrophoresis) auf DNA-Gehalt untersucht.

In gleicher Weise wird die oben beschriebene Plasmidaufreinigung mit den Vergleichspartikel der Firma Roche Diagnostics ( Roche-Beads) durchgeführt. Die Ergebnisse werden in der nachfolgenden Tabelle 1 zusammengefasst.

Tabelle 1

*Proben 1 - 4: Vergleichspartikel

Roche-Beads: Silika-Partikel der Fa. Roche Diagnostics

*Proben 5 - 12: Erfindungsgemaße Partikel

SDP014-2: Spray-Dry-Partikel hergestellt nach Beispiel 2 SDP015-4: Spray-Dry-Partikel hergestellt nach Beispiel 4

In Tabelle 1 zeigen die Proben 5 bis 12 gegenüber den Vergleichsproben 1 bis 4 einen deutlich gesteigerten DNA-Gehalt, was auf eine höhere Bindungskapazität der erfindungsgemäßen magnetischen Kieselsäurepartikel gegenüber den kommerziell erhältlichen Vergleichspartikeln hinweist. Auch weisen die höheren A[260/280] -Werte bei

Verwendung der erfindungsgemäßen Partikel auf eine verringerte Verunreinigung der eruierten DNA durch Proteine hin.

5.2 DNA- Aufreinigung nach QIAquick® PCR Purification

Vorbereitung:

Die magnetischen Kieselgele nach einem der Beispiele 2 (SDP-014-2) und/oder 4 (SDP-015- 4) sowie die Vergleichspartikel der Fa. Roche Diagnostics (Roche-Beads) werden mit einer Suspensionsdichte von 50 mg/ml in dem kommerziell erhältlichen Puffer „PB" (QIAGEN GmbH, Hilden, DE) suspendiert. Es wird Plasmid DNA des Typs pTZ19R verwendet, dass in einer Menge von 25 μg DNA für 100 μl Pufferlösung eingesetzt wird. Dazu werden zunächst sämtliche Mengen für den Ansatz berechnet, dann wird die an 100 μl fehlende Menge Wasser vorgelegt, die DNA zugesetzt, dann der zur Enzymlösung passende Enzympuffer (1 μl pro 10 μl Gesamtlösung). Dann werden pro μg DNA 3 u Restriktionsenzym (Hinf I, New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, Deutschland, Kat. Nr. RO 155S) zugesetzt (meist entsprechen 75 u 7,5 μl Enzymlösung). Es sollte darauf geachtet werden, dass das Enzym nur kurz aus dem Kühlschrank genommen wird und auf Eis transportiert wird. Das Gemisch wird 90 Minuten bei 37 ⁰ C im Wasserbad oder einem Heizblock inkubiert. Dann wird kurz durch Zentrifugieren bei 6.000 U/min die Flüssigkeit am Boden gesammelt und anschließend die Proben bei -2O ⁰ C eingefroren. Diese durch Restriktion zerlegte DNA wird als Testsystem für kurze Nukleinsäuren verwendet.

Durchführung:

Pro Probe werden 8 μl der PCR-Lösung (entspricht 2 μg DNA) vorgelegt und dann mit 92 μl Tris-Puffer aufgefüllt. Dann werden 25 μl der magnetischen Kieselgelsuspensionen zugegeben und 10 Sekunden gevortext. Die Proben werden jeweils mit 500 μl Puffer „PB" versetzt und gemischt. Unter gleichzeitigem Vortexen wird 2 Minuten inkubiert. Dann wird der überstand nach magnetischer Separierung verworfen und die magnetischen Partikel zweimal mit 750 μl Puffer „PE" (QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland, Kat. Nr. 19065) gewaschen. Anschließend werden die Kieselsäurepartikel 15 Minuten getrocknet, dann wird erst mit 50 μl, dann mit 30 μl 10 mM Tris/HCl, pH 8,5, eruiert. Die Eluate werden vereinigt

und anschließend evtl. entstandene Kieselgelverunreinigungen aus der Probe abgetrennt. Dann werden die Proben jeweils auf ihren DNA-Gehalt hin untersucht.

Analytik: l%iges TAE-Agarosegel, inkl. Ethidiumbromid, mit Ursprungslösung für die Eichreihe.

Eichreihe: 1:8-Verd*. der PCR-Lösung; 100%: 16,0 μl Verd., 2μl AP, 4,0 μl H ₂ O

80%: 12,8 μl Verd., 2 μl AP, 7,2 μl H ₂ O 60%: 9,6 μl Verd., 2 μl AP, 8,4 μl H ₂ O 40%: 6,4 μl Verd., 2 μl AP, 11,6 μl H ₂ O 20%: 3,2 μl Verd., 2 μl AP, 14,8 μl H ₂ O

(*Verd. = Verdünnung)

Proben: 100% sollen etwa 500 ng DNA entsprechen; daher werden 20 μl Eluat + 2 μl

Auftragspuffer eingesetzt.

Auswertung:

Die Ergebnisse werden in der nachfolgenden Tabelle 2 zusammengefasst.

Tabelle 2

*Proben 1 - 4: Vergleichspartikel

Roche-Beads: Silika-Partikel der Fa. Roche Diagnostics *Proben 5 - 12: Erfindungsgemaße Partikel

SDP014-2: Spray-Dry-Partikel hergestellt nach Beispiel 2

SDP015-4: Spray-Dry-Partikel hergestellt nach Beispiel 4

Aus Tabelle 2 ist ersichtlich, dass die Ausbeute an DNA bei der Verwendung der erfindungsgemäßen magnetischen Kieselsäurepartikel (Proben 5 - 12)im Vergleich zu den kommerziell erhältlichen, glasartigen Roche-Beads (Proben 1 - 4) wesentlich höhere ist. Dies zeigt erneut, dass die erfindungsgemäß hergestellten Partikel gegenüber den kommerziell erhältlichen Partikeln eine erhöhte Bindungskapazität aufweisen. Erneut weisen die erhöhten A[ ₂₆ o _/28O ]-Werte auf einen geringeren Verunreinigungsgrad der DNA durch Proteine hin.

5.3 Aufreinigung von gDNA Gewebe (gDNA Tissue)

Vorbereitung:

• Zu der lyophilisierten Proteinase K (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland, Kat. Nr. P 2308) werden 1,4 ml VE- Wasser zugesetzt. Die so erhaltene Lösung kann 2-3 Monate bei 4 ⁰ C aufbewahrt werden.

• Der Puffer „ATL" (QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland, Kat. Nr. 19076) wird auf Trübung bzw. Niederschläge überprüft. Ist ein Niederschlag vorhanden, wird der Puffer für 2 Minuten auf 55 ⁰ C erwärmt.

• Zu dem Puffer „AW1" (QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland, Kat. Nr. 19081) wird die passende Menge 100% Ethanol zugesetzt, bevor der Puffer zum ersten Mal eingesetzt wird. Der Puffer „AW1" ist zumindest ein Jahr bei Raumtemperatur haltbar.

• RNase A (QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland, Kat. Nr. 19101) wird mit VE-Wasser versetzt (20 mg/ml).

• Die zu untersuchenden magnetischen Partikel, hergestellt nach einem der Beispiele 2 (SDP-014-2) und/oder 4 (SDP-015-4) sowie die Vergleichspartikel Der Fa. Roche Diagnostics (Roche-Beads) werden in Puffer „AL" (QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland, Kat. Nr. 19075) suspendiert. Die hier verwendeten magnetischen Partikel werden in einer Konzentration von 50 mg/ml angesetzt.

Durchführung:

• Die Anzahl der Aliquots wird bei der Versuchsdurchführung großzügig ausgelegt, damit beim Aliquotieren keine Engpässe entstehen. (Beispiel: bei 24 Proben berechnet man den Ansatz bis zum Aliquotieren auf 28-30 Proben).

• Pro Aliquot werden 25 mg in kleine Stücke zerteiltes und abgewogenes Gewebe (Mausleber) in ein 15 ml Falcon-Tube gegeben; anschließend werden pro Aliquot 180 μl Puffer „ATL" (QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland, Kat. Nr. 19076) und 20 μl der angesetzten Proteinase K- Lösung zugesetzt, dann wird 15 Sekunden gevortext.

• Anschließend wird über Nacht bei 55 ⁰ C inkubiert (Schüttelwasserbad, sonst Heizblock).

• Pro Aliquot werden 20 μl angesetzten RNase A-Lösung zugegeben, dann werden die Proben kurz gevortext und 2 Minuten bei RT inkubiert.

• Anschließend wird in einer Untertischzentrifuge 5 Minuten lang bei 5.000 bis 6.000 U/min zentrifugiert und dann das Zentrifugat vom Rückstand abpippetiert.

• Dann wird das Probengemisch in einzelne Aliquots aufgeteilt und pro Aliquot 200 μl Puffer „AL" (QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland, Kat. Nr. 19075) zugesetzt, gründlich durch Vortexen gemischt und 10 Minuten bei 7O ⁰ C inkubiert.

• 25 μl der magnetischen Suspension (50 mg / ml Puffer „AL") werden pro Aliquot hinzupipettiert; dann wird 2x15 Sekunden gevortext und anschließend werden die Proben 1 Minute bei RT inkubiert.

• Dann werden 300 μl Isopropanol zugesetzt, 2x 10 Sekunden gevortext und die Proben 2 Minuten bei RT inkubiert.

• Dann werden die magnetischen Partikel magnetisch separiert und der überstand wird verworfen.

• Die so erhaltenen magnetischen Partikel werden jeweils 2x mit je 500 μl Puffer „AW1" (QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland, Kat. Nr. 19081) gewaschen, dann magnetisch separiert. Dazu lässt man jedes Mal die Partikel sich absetzen und verwirft dann den überstand.

• Die einzelnen Chargen der magnetischen Partikel werden je einmal mit 750 μl Puffer „AW2" (QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland, Kat. Nr. 19072 gewaschen, dann magnetisch separiert. Auch hier lässt man dazu jedes Mal die Partikel sich absetzen und verwirft dann den überstand.

• Dann werden die Partikel im Magnetscheider 15 Minuten getrocknet, wobei das Ethanol verdunstet.

• nschließend werden 200 μl des auf 7O ⁰ C erhitzten Puffer „AE" (QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland, Kat. Nr. 19077) zugesetzt und 15 Sekunden gevortext. Dann lässt man den Puffer noch 1 Minute einwirken und separiert dann magnetisch.

• Die Elution wird wiederholt und die Eluate gemeinsam gesammelt. Anschließend werden eventuell die Eluate im 0,8% TAE-Agarosegel vermessen (20 μl Eluat, 2 μl

Auftrag spuf f er ) .

• Die Eluate werden 10 Minuten lang bei 10.000 U/min zentrifugiert. Anschließend werden die Eluate photometrisch untersucht (Gesamtmenge DNA, 260/280, Wavelength Scan; 50 μl Eluat und 100 μl Puffer „AE", Blindprobe („Blank"): 150 μl Puffer „AE").

Auswertung:

Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 zusammengefasst.

Tabelle 3

*Proben 1 - 4: Vergleichspartikel

Roche-Beads: Silika-Partikel der Fa. Roche Diagnostics

*Proben 5 - 12: Erfindungsgemaße Partikel

SDP014-2: Spray-Dry-Partikel hergestellt nach Beispiel 2 SDP015-4: Spray-Dry-Partikel hergestellt nach Beispiel 4

Die Auswertung in Tabelle 3 zeigt im Vergleich mit den kommerziell erhältlichen, glasartigen Beads (Proben 1-4) erneut einen wesentlich höheren DNA-Gehalt in den unter Verwendung der erfindungsgemäßen magnetischen Kieselsäurepartikel (Proben 5-12) erhaltenen Eluaten. Dies zeigt erneut, dass die erfindungsgemäß hergestellten Partikel gegenüber den kommerziell erhältlichen Partikeln eine erhöhte Bindungskapazität aufweisen.