Pentopyranosyl-Nucleoside und-Oligomere stellen eine neue Substanzgruppe dar, die erstmals von Eschenmoser et al. (Helv. Chim. Acta 1993,76,2161 ; Helv.

Chim Acta 1995,78,1621 ; Angew. Chem. 1996,108,1619-1623) beschrieben wurde. Im Laufe der Zeit stellte sich heraus, dass die Pentopyranosyl-Nucleoside ein vielversprechendes Hilfsmittel bei der Markierung von Biomolekülen und bei der Adressierung von Biomolekülen auf festen Oberflächen, wie z. B bei der Herstellung von Biochips, darstellen. Diese Entwicklung ist vor allem den Fortschritten bei der Konjugation von Pentopyranosyl-Nucleosiden mit Biomolekülen zu verdanken. Parallel dazu mussten neue Verfahren zur Herstellung von Pentopyranosyl-Nucleosiden und-Oligomeren zur Verfügung gestellt werden, um den Bedarf an diesen Substanzen decken zu können.

Solche Verfahren sind insbesondere aus DE-A-19741715 bekannt, wobei Pentapyranosyl-Nucleoside der Formel I oder 11, deren Herstellung und Verwendung beschrieben werden. Die Herstellung erfolgt dabei ausgehend von einem ungeschützten Pentopyranosid, in das in 2'-, 3'-oder 4-Position Schutzgruppen Sc1 oder Sc2 eingeführt werden, wobei eine vorteilhafte Synthese- und Schutzgruppenstrategie verfolgt wird, die Pentopyranosyl-Nucleoside mit guten Ausbeuten zugänglich macht. Darüber hinaus ist allerdings Entwicklung alternativer Verfahren bzw. die Weiterentwicklung und Verbesserung bereits bestehender Verfahren von großem Interesse, um die Verfügbarkeit der Pentopyranosyl-Nucleoside weiter zu erhöhen.

Die Aufgabe wird von der vorliegenden Erfindung gelöst, die eine signifikante Verbesserung und Vereinfachung des in der vorgenannten DE-A-19741715 beschriebenen Verfahrens zu den Produkten der Formeln I und 11 darstellt. Dabei erfolgt eine Wanderung der 2'-Schutzgruppe von der 2-Position zur 3-Position des Pentopyranosids, wobei ein Katalysator der Formeln IVa und/oder IVb eingesetzt wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Synthese von Pentopyranosyl-Nucleosiden bevorzugt von Pentopyranosyl-Nucleosiden der Formel I oder 11 (II) worin R gleich Wasserstoff,-OH, Brom oder Chlor ist, R2, R3 und R4 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils Wasserstoff, -NR5R6, -OR7, -SR8,=O, CnH2n+1 oder CnH2nNR10R11 bedeuten, R5, R 6, R7 und R8, unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, Wasserstoff, CnH2n+1 oder CnH2n-i bedeuten, R10 und R11 unabhängig voneinander Wasserstoff oder CnH2n+i bedeuten oder zusammen einen Rest der Formel III bilden (111)

worin R12, R13, R14 und R15 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils Wasserstoff,-OR, CnHzn+i oder CnH2n-1, -C (0) R9, worin R7 die oben definierte Bedeutung besitzt und R9 ein linearer oder verzweigter, gegebenenfalls substituierter Alkyl-oder Arylrest ist, X, Y und Z unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils =N-, =C (R16)- oder -N(R17)- mit R16 und R17 gleich oder verschieden, jeweils Wasserstoff, CnH2n+1 oder (CnH2n) NR10R11 mit den oben genannten Bedeutungen, bedeutet, und Sei eine gegebenenfaiis substituierte Acylgruppe bedeutet, und Sc2 Wasserstoff oder eine Schutzgruppe ausgewählt aus einer gegebenenfalls substituierten Acyl-, Trityl-, Silyl-oder Allyloxycarbonylgruppe ist, und n in den obigen Formeln eine ganze Zahl von 1 bis 12 bedeutet, vorzugsweise 1 bis 8 und insbesondere 1 bis 4, R1 eine der für R1 definierten Bedeutungen besitzt, R2, R3' und R4' unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils Wasserstoff, =O, CnH2n+1 oder -O-CnH2n+1 oder -O-CnH2n-1 oder CnH2nNR10'R11' bedeuten, R10' und R11' unabhängig voneinander eine der für R10 und R11 definierten Bedeutungen besitzen, X'eine der für X definierten Bedeutungen besitzt, und Sc1 und Sc2 unabhängig voneinander eine der für Sei und Sc2 definierten Bedeutungen besitzen, umfassend die Umlagerung einer gegebenenfalls substituierten Acyl-Schutzgruppe Sei oder Sc1' vom 2'-O- zum 3'-O-Atom des Pyranosylrestes in Gegenwart eines Katalysators der Formel IVa und/oder der Formel IVb

(IVa) (IVb) worin A-CH2-oder-NR20-darstellt, R20 Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Arylalkyl oder einen Polymerrest, insbesondere einen Rest des Polystyrols, bedeutet, die gegebenenfalls substituiert sind, D eine Gruppe der Formel -CmH2m- ist, und m eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist, R13, R19 und R24 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl oder Arylalkyl bedeuten, die gegebenenfalls substituiert sind, wobei R'8 und R19 auch miteinander verknüpft sein können, wodurch bevorzugt eine Gruppe-CoH2o-oder-CoH2o-2-mit o gleich einer ganze Zahl von 2 bis 4 erhalten wird und R21 eine Gruppe-NR22R23 bedeutet, worin R22 und R23 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl oder Arylalkyl bedeuten, die gegebenenfalls substituiert sind.

Bevorzugte Reste R18 bis R20 und R22 bis R24 können bis zu 12, insbesondere bis zu 8 Kohlenstoffatome enthalten. Besonders bevorzugte Arylreste oder Cycloalkylreste enthalten 5 bis 7 Kohlenstoffatome und besonders bevorzugte Alkyl-bis zu 6 Kohlenstoffatome.

Eine Acyl-Schutzgruppe weist die allgemeine Formel- (O) C-R25 auf, worin R25 einen gegebenenfalls substituierten organischen Rest, wie einen Alkyl-, Cycloalkyl, Aryl-oder Arylalkylrest, darstellt. Arylreste können carbocyclisch-

aromatisch oder heterocyclisch aromatisch sein. Vorzugsweise handelt es sich bei R25 um Alkyl mit ein bis sechs Kohlenstoffatomen, Phenyl oder Benzyl.

Eine Trityl-Schutzgruppe weist die allgemeine Formel-C-(R26) 3 auf, worin R26 ein gegebenenfalls substituierter Arylrest, insbesondere ein gegebenenfalls substituierter Phenylrest ist. Wobei bevorzugte Substituenten denen des Restes R entsprechen.

Eine Silyl-Schutzgruppe weist die allgemeine Formel-Si (R25) 3 auf, worin R25 die oben aufgeführte Bedeutung hat.

Eine Allyloxycarbonyl-Schutzgruppe weist die allgemeine Formel-(O) C-O-CH2- CR27=CH2 auf, worin R27 einen gegebenenfalls substituierten organischen Rest, wie einen Alkyl-, Cycloalkyl, Aryl-oder Aralkylrest, darstellt, insbesondere jedoch einen Alkylrest mit ein bis sechs Kohlenstoffatomen.

Die definierten Schutzgruppen enthalten bevorzugt bis zu 12 Kohlenstoffatome, wobei bis zu 4 Kohlenstoffatome durch Heteroatome, insbesondere aus der Gruppe N, O, S und P, ersetzt sein können.

In einer Ausgestaltung umfasst das erfindungsgemäße Verfahren die Schritte : a) Vorlage eines ungeschützten Pentopyranosids b) Schützen der 2'-Position des Pyranosylrestes mit einer gegebenenfalls substituierten Acyl-Schutzgruppe sowie gegebenenfalls Schützen weiterer freier Positionen mit Schutzgruppen, insbesondere gegebenenfalls Schützen der 4'-Position des Pyranosylrestes mit einer Schutzgruppe Sc2 oder Sc2', c) Abspalten einer sich gegebenenfalls in 3'-Position des Pyranosylrestes befindenden Schutzgruppe und d) Umlagerung der gegebenenfalls substituierten Acyl-Schutzgruppe von der 2'-Position in die 3-Position unter Einsatz eines Katalysators der oben definierten Formel IVa und/oder IVb.

In einer besonderen Ausgestaltung umfasst das erfindungsgemäße Verfahren in Schritt b) den Schutz der 2'-und 4'-Positionen und gegebenenfalls der 3'- Position gleichzeitig oder in verschiedener Reihenfolge mit einer Schutzgruppe, die Abspaltung einer sich gegebenenfalls in 3-Position des Pyranosylrestes befindenden Schutzgruppe und sodann eine Umlagerung der Schutzgruppe Sei oder Sei von der 2-Position in die ungeschützte 3-Position unter Einsatz eines Katalysators der Formel IVa und/oder IVb.

Bevorzugt werden Katalysatoren der Formeln IVa bzw. IVb eingesetzt, worin R18, R19 und R24 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, Wasserstoff oder Alkyl mit ein bis sechs, vorzugsweise ein bis vier Kohlenstoffatomen bedeutet oder R18 und R19 zusammen eine Gruppe- (CH2) p- darstellen, wobei p eine ganze Zahl von 2 bis 4 ist.

Weitere bevorzugt eingesetzte Katalysatoren der Formeln IVa bzw. IVb sind Verbindungen, worin R20 Wasserstoff oder Alkyl mit ein bis sechs, bevorzugt ein bis vier Kohlenstoffatomen bedeutet.

Besonders bevorzugte Gruppen A sind-CH2-,-NH-,-N (CH3)-,-N (C2H5)-,- N(C3H7)-und-N (C4Hg)-.

Besonders bevorzugte Reste R21 sind-N (CH3) 2,-N (C2Hs) 2,-N (C3H7) 2 oder N(C4H9)2.

Besonders bevorzugte Reste R'8 sind Wasserstoff, CH3, C2H5, C3H7 oder C4H9.

Besonders bevorzugte Reste Rlg sind Wasserstoff, CH3, C2H5, C3H7 oder C4H9.

Besonders bevorzugte Reste R24 sind Wasserstoff, CH3, C2H5, C3H7 oder C4Hg.

Ergänzen sich R18 und R19 in den Formeln IVa bzw. IVb zu einem penta-, hexa- oder heptacyclischen Ring, so kann es sich dabei um ein gesättigte Alkyl-oder ein oder mehrfach ungesättigte Alkylengruppen handeln.

Sind in den obigen Formeln irgendwelche Reste substituiert, so handelt es sich dabei um Substituenten, die unter den jeweiligen Reaktionsbedingungen inert sind. Bevorzugte Beispiele dafür sind organische Reste, wie Alkyl, Cycloalkyl, Aryl oder Aralkyl, bevorzugt mit bis zu 12 Kohlenstoffatomen, insbesondere Alkyl mit ein bis sechs Kohlenstoffatomen, Phenyl oder Benzyl. Die Reste können dabei ein oder mehrfach substituiert sein, wobei ein bis vierfachsubstituierte Reste bevorzugt sind.

Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren näher erläutert : Im Schlüsselschritt des in der DE-A-19741715 beschriebenen Syntheseverfahrens zu den Produkten der Formeln I und 11 wird eine Wanderung der 2'-Schutzgruppe von der 2'-Position zur 3-Position des Pentopyranosids, dort auch als Wanderungsreaktion bezeichnet, durchgeführt. Im Zuge dieser Reaktion wird selektiv die 2'-Hydroxylgruppe freigesetzt zu R1 gleich OH [vergl. Formel I] bzw. zu R1 gleich OH [vergl. Formel II], die nun ihrerseits für weitere Umsetzungen zur Verfügung steht. Beispielsweise lassen sich so durch Phosphitylierung die reaktiven Pentopyranosyl-Phosporamidite gewinnen, die zur Synthese der oligomeren Pentopyranosyl-Nucleoside benötigt werden.

Das folgende Schema illustriert diese Wanderungsreaktion bzw. Umlagerung am Beispiel eines ß-D-Ribopyranosyl-nucleosids. Gezeigt wird die Wanderung eines Acylrestes (z. B. einer Benzoylgruppe) von der 2'-Position zur 3'-Position eines in 4-Stellung mit der Schutzgruppe SG (z. B. einer Tritylgruppe) versehenen ß-D- Ribo-pyranosyl-nucleosids (Nucleobase B).

Besonders bevorzugt wird in dem in der DE-A-19741715 beschriebenen Verfahren eine Benzoylgruppe als die wandernde Acylgruppe eingesetzt (Schema 1) : Schema 1 Nach der DE-A-19741715 wird diese Reaktion in einer besonderen Ausführungsform in Gegenwart einer Base, insbesondere in Gegenwart von N- Ethyldiisopropylamin und/oder Triethylamin erreicht. Dabei kann die Reaktion vorteilhaft auch im gleichen Reaktionsgefäß als Ein-Topf-Reaktion durchgeführt werden.

Ferner ist es nach der DE-A-19741715 auch vorteilhaft, wenn nach der Acylierung (d. h. nach der Einführung der Acylgruppe in der 2'-Position) und/oder nach der gegebenenfalls erfolgten Wanderung von der 2'-zu der 3-Position die Reaktionsprodukte chromatographisch gereinigt werden. Eine Reinigung nach der Tritylierung ist gemäß dem Verfahren in der DE-A-19741715 nicht notwendig, was besonders vorteilhaft ist.

Die aus diesem Stand der Technik bekannten Synthesen verlangen den Einsatz relativ großer Mengen an Chemikalien. Ferner sind die notwendigen Reaktionszeiten in der Regel noch sehr lang und die Ausbeuten an Endprodukt sind noch verbesserungsbedürftig.

Als Vergleich können die Beispiele 1 bis 4 aus DE-A-19741715 herangezogen werden. In Beispiel 1, das eine Synthese von 1- {3'-O-Benzoyl-4'-0- [ (4, 4'- dimethoxytriphenyl)-methyl]-ß-D-ribo-pyranosyl}-thymin beschriebt, wurde

zunächst die freie 4'-Position trityliert und dann in der 2'-Position benzoyliert. Für die Wanderungsreaktion wurden dann relativ große Mengan an folgenden Chemikalien eingesetzt : Pyridin (29,7 Äquivalente), n-Propanol (56,0 Äquivalente), p-Nitrophenol (1,58 Äquivalente), Dimethylaminopyridin (0,9 Äquivalente DMAP), N- Ethyldiisopropylamin (4,0 Äquivalente) Die Reaktion dieser Mischung erfolgte über 48 Stunden bei 61-63°C und für weitere 60 Stunden bei Raumtemperatur, zusammen also 4,5 Tage. Nachfolgend wurde wäßrig aufgearbeitet. Sodann mußte der Ansatz zur Vorreinigung und zur Nachreinigung noch zweimal an Kieselgel chromatographiert werden. Aus diversen Fraktionen wurden zusammen 48% Produktausbeute erhalten.

Analoge Vorgehensweisen und Ergebnisse wurden in den Beispielen 2 bis 4 der DE-A-19741715 beschrieben (Synthese von N4-Benzoyl-1- {3'-O-benzoyl-4'-O- [ (4, 4'-dimethoxytriphenyl)-methyl]-ß-D-ribo-pyranosyl}-cytosin bzw. von N6- Benzoyl-9- {3-O-benzoyl-4'-0- [ (4, 4'-dimethoxytriphenyl)-methyl]-ß-D-ribo- pyranosyl}-adenin bzw. von N9- 3'-O-Benzoyl-4'-0- [ (4, 4'-dimethoxytriphenyl)- methyl]-ß-D-ribo-pyranosyl}-2-0-allyl-2N-isobutyroyl-guanin ).

In analoger Weise ist das im folgenden dargestellte 3-Phthalimidylethyl-1- [3'-0- benzoyl-4'-0- (4, 4'-dimethoxytrityl)-ß-D-ribopyranosyl]-indol erhältlich.

Die in der DE-A-19741715 beschriebenen Verfahren, und hier insbesondere der Verfahrensschritt der Umlagerung der jeweiligen Schutzgruppe von der 2'-0 zur 3'-0-Gruppe der Pentopyranosyl-Nucleoside, sind im Hinblick auf eine industrielle Anwendung noch zu verbessern.

Die gewünschten Verfahrensverbesserungen zielen vor allem auf die Verringerung des ökonomisch und ökologisch unzweckmäßigen Einsatzes großer Mengen an"Ballastchemikalien", deren aufwendige Entfernung mittels Säulenchromatographie bei der Produktisolierung, die Verbesserung der Produktausbeuten sowie die Verkürzung langer Reaktionszeiten unter Erhitzen der Reaktionsmischungen. Letztere Prozedur ist vor allem bei empfindlichen Edukten bzw. Produkten von Nachteil oder eventuell auch prohibitiv. Mit der vorliegenden Erfindung werden diese Mängel nun auf überraschend einfache Weise behoben.

Es wurde gefunden, dass die nach der Lehre der DE-A-19741715 aufgeführten Überschüsse diverser Chemikalien, wie Pyridin, N-Ethyl-diisopropylamin oder Triethylamin, Dimethylaminopyridin (DMAP), n-Propanol und p-Nitrophenol, nicht benötigt werden, da sich die kritische Wanderungsreaktion der 2'-0-geschützten Verbindungen, wie der Acylverbindungen, zu den 3'-0-geschützten Verbindungen, wie den 3'-0-Acylverbindungen, auch ohne Erhitzen unter wesentlich milderen Bedingungen, stark verkürzter Reaktionszeit, höherer Ausbeute und vielfach ohne chromatographische Reinigung durchführen läßt, indem man einen Katalysator der oben definierten Formeln IVa und/oder IVb verwendet.

In Figur 1 werden einige typische Beispiele für Katalysatoren der Formel IVa bzw.

IVb aufgeführt (dort als Verbindungen Va bis Vf bezeichnet), die kommerziell erhältlich sind und die sich im erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhaft einsetzen lassen. Auch polymer-gebundene Varianten können verwendet werden, wie z. B. polymergebundenes TBD (Vc, von Aldrich Nummer 35,875-4).

Polymergebundene Katalysatoren lassen sich einfach durch Filtration abtrennen.

Die meisten anderen hoch wirksamen Katalysatoren, wie z. B. Va-d und Vf, können durch Waschen der organischen Reaktionslösung mit Wasser einfach entfernt werden, sofern ein nicht mit Wasser mischbares Lösemittel verwendet wurde bzw. nachdem das wasserlösliche Lösemittel durch ein solches ersetzt wurde.

Der Katalysator der Formel IVa bzw. IVb kann bei Raumtemperatur in Mengen von 0,01 bis 20 Moläquivalenten, bevorzugt in Mengen von 0,05 bis 10 Moläquivalenten, besonders bevorzugt in Mengen von 0,1 bis 0,99 Moläquivalenten, bezogen auf die Menge an ungeschützter Ausgangsverbindung, eingesetzt werden. Äquimolare oder überstöchiometrische Mengen, beispielsweise 2-10 Moläquivalente, können ebenfalls verwendet werden, insbesondere bei billigen Katalysatoren, falls eine sehr rasche Umsetzung gewünscht wird.

Die Reaktion wird üblicherweise in einem inerten organischen Lösemittel oder in geeigneten Lösemittelgemischen durchgeführt, beispielsweise in Tetrahydrofuran, Essigsäuremethyl-oder-ethylester, N, N-Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Diethylether, Dioxan, Acetonitril, Ethylenglycol-dimethylether, Benzol, Toluol, Dichlormethan oder Dichlorethan, bevorzugt in einem inerten, niedrigsiedenden Lösemittel, in dem sich die Reaktionskomponenten bei Raumtemperatur oder bei mildem Erwärmen leicht auflösen lassen.

Die Reaktionstemperatur liegt üblicherweise bei 0°C bis zur Siedetemperatur des Lösemittels, bevorzugt bei 15°C bis 40°C, besonders bevorzugt bei Raumtemperatur um 20°C.

Die Reaktionszeiten liegen im Bereich einer bis weniger Minuten, bei Einsatz äquimolarer oder überstöchiometrischer Mengen des Katalysators IVa bzw. IVb bis zu ca. 6-12 Stunden bei Einsatz von 0,01 bis 0,99 Moläquivalenten.

Besonders bevorzugt lassen sich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren folgende Verbindungen herstellen :

N9- {3'-O-Benzoyl-4'-0- [ (4, 4'-dimethoxytriphenyl)-methyl]-ß-D-ribo-pyranosyl}-2- O-allyl-2N-isobutyroyl-guanin, <BR> <BR> <BR> <BR> N6-Benzoyl-9- {3'-O-benzoyl-4'-0- [ (4, 4'-dimethoxytriphenyl)-methyl]-ß-D-ribo-<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> pyranosyl}-adenin, 1- {3'-O-Benzoyl-4'-0- [ (4, 4'-dimethoxytriphenyl)-methyl]-ß-D-ribo-pyranosyl}- thymin, N4-Benzoyl-1- {3'-O-benzoyl-4'-0- [ (4, 4'-dimethoxytriphenyl)-methyl]-ß-D-ribo- pyranosyl}-cytosin und <BR> <BR> <BR> <BR> 3-Phthalimidylethyl-1- [3'-O-benzoyl-4'-0- (4, 4'-dimethoxytrityl)-ß-D-ribopyra<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> nosyl]-indol.

Die folgenden Figuren und Beispiele sollen die Erfindung näher beschreiben, ohne sie zu beschränken : Beispiel 1 : Synthese von 1- {3'-O-Benzoyl-4'-0- [ (4, 4'-dimethoxytriphenyl)-methyl]-ß-D-ribo- pyranosyl}-thymin (Schema 2) : Schema 2 : Bz = Benzoyl, DMT = Dimethoxytrityl Die Ausgangsverbindung 1- {2'-O-Benzoyl-4'-0- [ (4, 4'-dimethoxytriphenyl)-methyl]- ß-D-ribo-pyranosyl}-thymin wurde durch Benzoylierung von 1- {4'-0- [ (4, 4'- dimethoxy-triphenyl]-methyl)-ß-D-ribo-pyranosyl}-thymin mit Benzoylchlorid in Pyridin nach Standardverfahren hergestellt [1H NMR (CDCl3), 400 MHz, ppm) : 7.95 (m, 1H, 2-benzoyl), 6.19 (d, 1H, H-1'), 4.82 (dd, 1 H, H-2'), 3.37 (m, 1H, H- 5a')]. 33.0 mg (50 µmol) und 7.0 pl (49.5 µmol) DBU (Va) in 2 ml Dichlormethan

reagierten 12 h bei 20°C. DBU wurde mit Wasser ausgewaschen, die org. Phase getrocknet und eingeengt.

Ausbeute : 33 mg (100%) Laut NMR und HPLC enthielt dieses Produkt noch 17.5% noch nicht umgelagertes Edukt. Die korrigierte HPLC-Ausbeute betrug demnach 82.5%. [1H NMR (CDC13, 400 MHz, ppm) : 8.18 (m, 1H, 2'-Benzoyl), 5.92 (m, 1 H, H-3'), 5.88 (d, 9.4 Hz, 1H, H-1'), 2.61 (dd, 1H, H-5a)]. Das Wanderungsprodukt wurde ferner nach HPLC mit einer authentischen Probe gemäß dem Verfahren der DE-A-19741715 verglichen und für identisch befunden.

HPLC-Bedingungen : Säule Merck Lichrosphere 100,5, um, 4x250 mm ; Flußrate 1 ml/min ; UV-Detektion 210 nm ; Laufmittel isochratisch 41 Vol-% Wasser, 59 Vol-% Acetonitril Retentionszeiten : Edukt 0-2-Benzoat : 13,4 min ; Produkt 0-3'-Benzoat : 12,7 min Fig. 2 beschreibt den zeitlichen Umsatz der Wanderungsreaktion nach HPLC- Bestimmung. Dabei wird die Umsetzung von 1- {2'-O-Benzoyl-4'-0- [ (4, 4'- dimethoxytriphenyl)-methyl)-ß-D-ribo-pyranosyl}-thymin zum 1- {3'-0-Benzoyl-4'- 0- [ (4, 4'-dimethoxytriphenyl)-methyl)-ß-D-ribo-pyranosyl}-thymin mit 10% eines Katalysators der Formel (IV) bei 22°C in Essigsäureethylester durchgeführt. Es wurde die Aktivität verschiedener Katalysatoren, wie in Figur 2 dargestellt, untersucht.

Die Effizienz der untersuchten Katalysatoren ist verschieden. Doch lassen sich mit entsprechend größeren Mengen an (IV) raschere Umsetzungen erreichen. So lässt sich z. B. anstelle des teureren TBD (Vc) für präparative Zwecke auch das billigere DBU (Va) oder DBN (Vb) in etwas größeren Mengen mit Erfolg einsetzen.

Beispiel 2 : Synthese von N4-Benzoyl-1- {3'-O-benzoyl-4'-0- [ (4, 4'-dimethoxytriphenyl)- methyl]-ß-D-ribo-pyranosyl}-cytosin (Schema 3) : Schema 3 :

Bz = Benzoyl, DMT = Dimethoxytrityl Die Ausgangsverbindung für die Wanderungsreaktion, das N4-Benzoyl-1-{2-O- <BR> <BR> <BR> benzoyl-4'-0-[(4, 4-dimethoxytriphenyl)-methyl]-ß-D-ribo-pyranosyl}-cytosin läßt sich entweder nach DE-A-19741715 (dort Beispiel 2) in 51% Ausbeute gewinnen, oder besser unter gänzlicher Vermeidung der aufwendigen Säulenchromatographie als kristallines Reinprodukt in 46% Gesamtausbeute wie folgt : 199 g (0,57 mol) N4-Benzoyl-1-ß-D-ribo-pyranosyl-cytosin, 230 mi (132,4 mmol ; 2,3 Äquiv.) Anisaldehyd-dimethylacetal und 2,5 g (13,1 mmol) p-Toluolsulfonsäure wurden in 2000 ml N, N-Dimethylformamid suspendiert. 200 ml Lösemittel wurden im Vakuum abdestilliert. Nach 1 Stunde Rühren bei 70°C Badtemperatur (70 mbar) gab man weitere 2,5 g (13,1 mmol) p-Toluolsulfonsäure hinzu und rührte noch 1 Stunde bei 70°C Badtemperatur und 70mbar. Das Lösemittel wurde im Vakuum abdestilliert, der Rückstand in 650 ml Pyridin aufgenommen und mit 100 ml (0,82 mol ; 1,4 Äquiv.) Benzoylchlorid versetzt. Nach Rühren über 12 h bei Raumtemperatur wurde das Lösemittel im Vakuum abdestilliert und der Rückstand mit Dichlormethan über Kieselgel filtriert. Nach Einengen erhielt man 428 g eines Rohproduktes, das wie folgt weiter verarbeitet wurde : Davon wurden 190,0 g (theoretisch maximal 253 mmol) in 2396 ml Methanol gelöst und im Eisbad 218,4 ml (2835 mmol, 8,50 Äquiv.) Trifluoressigsäure schnell zugetropft.

Nach 10 min wurde das Eisbad entfernt. Nach weiteren 80 min versetzte man vorsichtig mit 238,2 g (2835 mmol, 8,5 Äquiv.) festem Natriumhydrogencarbonat.

Nach 5 min Rühren wurde die neutralisierte Lösung mit 2000 ml Wasser versetzt und mit 2000 ml Dichlormethan extrahiert. Die Wasserphase wurde noch 2mal mit je 1300 ml Dichlormethan extrahiert, die gesammelten organischen Phasen rasch mit Natriumsulfat getrocknet und bis auf ca. 1 Liter eingeengt. Im Kühlschrank kristallisierten erst 27,8 g und aus der Mutterlauge (nach Waschen mit Wasser und Trocknen) weitere 24,7 g Produkt. Gesamtausbeute an N4-Benzoyl-1-[(2-O- benzoyl)-ß-D-ribo-pyranosyl]-cytosin : 52.5 g (116,3 mmol ; 46 % bezogen auf eingesetztes N4-Benzoyl-1-ß-D-ribo-pyranosyl-cytosin).

Tritylierung und Wanderungsreaktion nach vorliegendem erfindungsgemäßen Verfahren wurden nicht wie in DE-A-19741715 (dort Beispiel 2) empfohlen als Eintopfreaktion durchgeführt, da sich das gewünschte Endprodukt zweckmäßiger ohne Säulenchromatographie rein isolieren läßt. Das gilt vor allem deshalb, weil nach der praktisch quantitativ verlaufenden Tritylierung durch einfaches Ausfällen des Zwischenproduktes bereits alle Überschußreagenzien abtrennbar waren und somit auch nach der Wanderungsreaktion keine Chromatographie mehr erforderlich war : Zu 52,00 g (115,1 mmol) N4-Benzoyl-1-[(2-O-benzoyl)-ß-D-ribo-pyranosyl]- cytosin, 572 ml trockenem Dichlormethan, 270 ml trockenem Pyridin, 78,06 g (230,3 mmol, 2,0 Äquiv.) Dimethoxytritylchlorid und 1,56 g (11,5 mmol, 0,1 Äquiv.) DMAP tropfte man unter Argon und Rühren 39,44 ml (230,3 mmol, 2,0 Äquiv.) N- Ethyl-diisopropylamin. Nach 4 h wurde mit gesättigter NaHC03-Lösung versetzt, 5 min gerührt, die organische Phase abgetrennt, die Wasserphase noch 2mal mit Dichlormethan ausgeschüttelt und die vereinigten organischen Phasen über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Einengen mit Toluol (Entfernung von Pyridin) erhielt man 140 g gelbes Öl, das in wenig Dichlormethan gelöst und unter Rühren in 5 L iso-Hexan getropft wurde. Das gelbe Produkt wurde abgesaugt, mit iso- Hexan gewaschen und bei 45°C im Vakuum getrocknet.

Ausbeute : 90 g (100%) N4-Benzoyl-1- {2-O-benzoyl-4'-0- [ (4, 4'- dimethoxytriphenyl)-methyl)]-ß-D-ribo-pyranosyl}-cytosin, die in 900 ml

Essigsäure-ethylester gelöst und mit 224 ml (0,10 mol, 0,87 Äquiv. DBU (Va) versetzt wurden. Dabei verfärbte sich die Lösung sofort violett. Nach 3 h Rühren bei Raumtemperatur war die Reaktion laut HPLC-Analyse beendet. Wie in Beispiel 2 gezeigt, ist die eingesetzte Überschußmenge an (Va) nicht erforderlich, die Reaktion kann auch ebenso gut mit 10 mol% Reagenz über Nacht stehen gelassen werden. Mit dem hier eingesetzten Überschuß und wegen der einfachen Abtrennung von (Va) ließ sich jedoch die Reaktionszeit stark verkürzen. Die Aufarbeitung des Reaktionsansatzes erfolgte durch neutral waschen der Lösung mit 5mal je 200 mi Wasser, anschließend wurde mit Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde in 180 ml Dichlormethan bei 80°C gelöst und langsam mit 900 ml tert.-Butylmethylether versetzt bis die klare Lösung langsam trüb wurde. Nach Erkalten wurde das kristalline Rohprodukt abgesaugt und in 270 mi Dichlormethan wieder gelöst. Nach Zugabe von 270 mi tert.-Butylmethylether erhielt man in der Kälte rasch Kristalle, die absaugt und bei 40°C im Vakuum getrocknet wurden.

Ausbeute an reinem N4-Benzoyl-1- {3'-O-benzoyl-4'-0- [ (4, 4'-dimethoxytriphenyl)- methyl]-ß-D-ribo-pyranosyl}-cytosin (Reinheit HPLC <99%) : 55,3 g (73,4 mmol) farblose Kristalle. Die Mutterlauge wurde mit Diethylether ausgerührt und der unlösliche Teil nochmals analog wie oben beschrieben umgesetzt und aufgearbeitet. Dadurch ließen sich 5,5 g einer weiteren Produktfraktionen gewinnen. Dies entspricht einer Gesamtausbeute von 60,8 g (81,4 mmol, 70,5% über 2 Stufen).

Zum Vergleich mit dem Stand der Technik : Entsprechend Beispiel 2 der DE-A- 19741715 konnten in vergleichbarem Maßstab lediglich 51% Produktausbeute nach mehrtägigem Kochen und Chromatographie über eine große Säule (50x10 cm) gewonnen werden. 1H NMR (CDC13, 400 MHz, ppm) : 8,85 (brm, 1H, NH), 6,03 (d, 9,8 Hz, 1H, H-1'), 5,88 (m, 1 H, H-3'), 4,14 (br, 1h, OH), 3,92 (ddd, 1H, H- 4'), 3,76,3,77 (2s, 6H, OMe), 3,66-3,76 (m, 2H, H-2', H-5a'), 2,72 (dd, 11 Hz, 5Hz, 1H, H-5b'). 13C NMR (DEPT, CDCI3, ppm) : 55,26 (OMe), 66,00 (C-5'), 67,90 C-4'), 71,18 (C-3), 73,96 (C-2'), 82,26 (C-1'), 87,30 (Trityl-C). Die Struktur

des Wanderungsproduktes war auch nach HPLC mit einer authentischen Probe gemäß Beispiel 2 der DE-A-19741715 identisch.

Beispiel 3 : Reaktionsverlauf bei der Synthese von N4-Benzoyl-1- {3'-O-benzoyl-4'-0- [ (4, 4- dimethoxytriphenyl)-methyl)-ß-D-ribo-pyranosyl}-cytosin mit Katalysatoren der Formel (IV).

Analog wie in Beispiel 1 beschrieben wurden unterschiedliche Umsatz/Zeit- Verläufe ermittelt. Dabei konnte z. B. gezeigt werden, dass mit 10% DBU (Va), TBD (Vc) oder DBN (Vb) die Reaktion nach weniger als acht Stunden bei Raumtemperatur nahezu abgeschlossen ist.

HPLC-Bedingungen : Säule Merck Lichrosphere 100,5IJm, 4x250 mm ; Flußrate 1 ml/min ; UV-Detektion 210 nm ; Gradient in 13 min von 70% B auf 82% B, wobei Laufmittel A : 95 Vol-% Wasser, 5 Vol-% Acetonitril und Laufmittel B : 95 Vol-% Acetonitril, 5 Vol-% Wasser.

Retentionszeiten : Edukt 0-2'-Benzoat : 8,9 min ; Produkt 0-3'-Benzoat : 8,3 min.

Fig. 3 zeigt die Ergebnisse der Umsetzung von 1- {2'-O-Benzoyl-4'-0- [ (4, 4'- dimethoxytriphenyl)-methyl)-ß-D-ribo-pyranosyl}-cytosin zum 1- {3'-0-Benzoyl-4'- 0- [ (4, 4'-dimethoxytriphenyl)-methyl)-ß-D-ribo-pyranosyl}-cytosin mit 10% eines Katalysators der Formel (IV) bei 22°C in Essigsäureethylester.

Beispiel 4 : Umsetzung N6-Dibenzoyl-9- {2'-O-benzoyl-4'-0- [ (4, 4'-dimethoxy-triphenyl)- methyl]-ß-D-ribo-pyranosyl}-adenin mit DBU (Illa) zum N6-Dibenzoyl-9- {3'-0- benzoyl-4'-0-[(4, 4-dimethoxytriphenyl)-methyl]-ß-D-ribo-pyranosyl}-adenin (Schema 4) Schema 4 :

Bz = Benzoyl, DMT = Dimethoxytrityl Die Umsetzung erfolgt analog zu Beispiel 1.

HPLC-Bedingungen : Säule Merck Lichrosphere 100,5, um, 4x250 mm ; Flußrate 1 ml/min ; UV-Detektion 210 nm ; Gradient in 13 min von 70% B auf 82% B, wobei Laufmittel A : 95 Vol-% Wasser, 5 Vol-% Acetonitril und Laufmittel B : 95 Vol-% Acetonitril, 5 Vol-% Wasser.

Retentionszeiten : Edukt O-2'-Benzoat : 13,0 min ; Produkt 0-3'-Benzoat : 13,6 min. <BR> <BR> <BR> <P>N6-Dibenzoyl-9- {2'-O-benzoyl-4'-0- [ (4, 4'-dimethoxy-triphenyl)-methyl]-ß-D-ribo- pyranosyl}-adenin (authentische Probe gemäß DE-A-19741715) und 1 Mol- äquivalent DBU (Va) wurden bei 22°C in Essigsäureethylester umgesetzt. HPLC- Analyse nach 1 h ergab Umsatz zu 89% 3'-0-Benzoat und 11% verbliebenem 2'- 0-Benzoat.

Beispiel 5 : Synthese von 9-{3'-0-Benzoyl-4'-0-[(4, 4'-dimethoxytriphenyl)-methyl]-ß-D-ribo- pyranosyl}-2-0-allyl-2-N-isobutyroyl-guanin (Schema 5) Schema 5 :

Bz = Benzoyl, DMT = Dimethoxytrityl Die Synthese der Vorstufe 9- {2'-O-Benzoyl-4'-0- [ (4, 4'-dimethoxytriphenyl)- methyl]-ß-D-ribo-pyranosyl}-2-O-allyl-2-N-isobutyroyl-guani n erfolgte nach einer verbesserten Methode analog zu der in Beispiel 2 für den Cytosin-Baustein beschriebenen Verfahren.

So wurden 0,200 g (0,246 mmol) rohes, laut DC und HPLC noch verunreinigtes 9- {2'-O-Benzoyl-4'-0-[(4, 4-dimethoxytriphenyl)-methyl]-ß-D-ribo-pyranosyl}-2-O- allyl-2-N-isobutyroyl-guanin [C46H47N509 ; 813, 91 und 0,64 ml (3,09 mmol) DBU (Va) bei 22°C in Essigsäureethylester (2 ml) gelöst. Laut HPLC und DC (Dichlormethan/Essigsäure-ethylester 5 : 1) lagen Produkt und Edukt praktisch sofort nach Lösung der Komponenten im Verhältnis ca. 90 : 10 vor. Die Lösung wurde 5 mal mit Wasser gewaschen bis der pH-Wert neutral war, getrocknet, eingeengt und das Produkt über Kieselgel gereinigt (Dichlormethan/Essigsäure- ethylester 10 : 1 bis 6 : 1 mit 1% Triethylamin). Man erhielt so 0,110 mg (55%, bezogen auf das verunreinigte Edukt) 9- {3'-O-Benzoyl-4'-0- [ (4, 4'-dimethoxy- triphenyl)-methyl]-ß-D-ribo-pyranosyl}-2-O-allyl-2-N-isobut yroyl-guanin und ca. 90 mg der schon im Edukt vorhandenen Verunreinigungen, die bei höherem RF-Wert eluierte. Das Edukt war nach der Chromatographie kaum noch nachweisbar, so daß die Ausbeute zwischen 55% und 100% bezogen auf das effektiv eingesetzte Edukt war.

Die Reaktion ließ sich auch mit katalytischen Mengen an DBU (Va) durchführen.

So ergab der entsprechende Ansatz mit 14.68 pl (0,098 mmol), d. h. 0,4

Moläquivalenten DBU (Va), nach 75 min Reaktionszeit dasselbe Ergebnis. Bei einem weiteren Versuch mit nur 0,02 Moläquivalenten DBU (Va) wurde mittels HPLC ein Umsatz von 50% nach 2 Stunden bestimmt.

1 H NMR (CDC13, 400 MHz, ppm) : 2,62,2,64 (2d, 6H, 2 Me), 3,77,3,78 (2s, 6H, 2 OMe), 5,66, (d, 9.5 Hz, 1 H, H-1).

Beispiel 6 : Vergleichsversuche Umsetzung von 1-{2'-O-Benzoyl-4'-0-[(4, 4'-dimethoxytriphenyl)-methyl)-R-D-ribo- pyranosyl}-cytosin zum 1- {3'-O-Benzoyl-4'-0- [ (4, 4'-dimethoxytriphenyl)-methyl)-ß- D-ribo-pyranosyl}-cytosin mit den in DE-A-19741715 in der bevorzugten Ausführungsform verwendeten Chemikalien unter den Reaktionsbedingungen der vorliegenden Erfindung, d. h. insbesondere bei Raumtemperatur und kürzeren Reaktionszeiten.

Umsetzung von 1- {2'-O-Benzoyl-4'-0- [ (4,4'-dimethoxytriphenyl)-methyl)-ß-D-ribo- pyranosyl}-cytosin, 0,25 g (0,332 mmol) mit a) - N-Ethyl-diisopropylamin 5,68 ul (0,033 mmol, 0,1 Äquivalente) in 2,5 ml Essigsäureethylester. b) - Triethylamin 4,62 ul (0, 033 mmol, 0,1 Äquivalente) in 2,5 ml Essigsäure- ethylester. c) - N-Ethyl-diisopropylamin 5,68 ul (0, 033 mmol, 0,1 Äquivalente) in 2,5 ml Essigsäureethylester.

- Triethylamin 4,62 ul (0,033 mmol, 0,1 Äquivalente) d) mit sämtlichen der in DE-A-19741715, Beispiel 2, aufgeführten Reaktionskomponenten in entsprechenden Mengenverhältnissen - Pyridin (2,7 ml) - Dimethylaminopyridin 40,52 mg (DMAP, 0,332 mmol, 1 Äquivalent) - Triethylamin 138,5 ut (0,995 mmol, 3 Äquivalente) - p-Nitrophenol 92,27 mg (0,663 mmol, 2 Äquivalente)

--n-Propanol 498,3 pl (6,633 mmol, 20 Äquivalente) Ergebnis : In allen Versuchen a-c wurde nach Rühren über 24 h bei Raumtemperatur mittels HPLC kein Umsatz zum gewünschten 3'-O-Benzoat gefunden. Beim Versuch war der Umsatz <3% Daraus folgt, daß sich die gewünschte Wanderungsreaktion des 2'-O-Benzoates in das 3'-O-Benzoat weder durch die Einzelkomponenten noch durch die Gesamtmischung der in DE-A- 19741715 besonders bevorzugten Ausführungsform unter den vergleichbar milden Reaktionsbedingungen und hohen Umsätzen wie in der vorliegenden Erfindung erreichen läßt.