MéTODO DE PRODUCCIóN DE FITOENO Y/O FITOFLUENO, O MEZCLAS DE CAROTENOIDES CON ALTO CONTENIDO EN LOS

MISMOS

CAMPO DE LA INVENCIóN

La presente invención describe un método biotecno lógico que permite obtener de forma simple, efectiva y a gran escala, preparaciones estabilizadas de fitoeno y/o fitoflueno, o mezclas de carotenoides con alto contenido en los mismos, mediante la utilización de cepas mutadas de Paracoccus sp. superproductoras de fitoeno y/o fitoflueno. Por lo tanto, la presente invención es susceptible de ser aplicada en diversos campos de las ciencias de la vida, como por ejemplo en el campo alimentario, el farmacéutico o el cosmético.

ESTADO DE LA TéCNICA

Los carotenoides son pigmentos de naturaleza isoprenoide sintetizados por ciertas bacterias, hongos y organismos fotosintéticos. Pueden clasificarse en dos tipos:

(i) Carotenos: son hidrocarburos puros entre los que se encuentran compuestos como β-caroteno, α-caroteno, γ-caroteno, licopeno, fitoeno o fitoflueno; y

(ii) Xanto filas: son moléculas que contienen oxígeno en diferentes formas (grupos hidroxi, epoxi, etc.), entre las que se encuentran compuestos como astaxantina, zeaxantina, capsantina, cantaxantina, luteína, etc.

Todos estos compuestos juegan un papel importante en la dieta humana como antioxidantes y como precursores de la vitamina A. Por lo tanto, debido a sus características, los carotenoides son eficaces contra el cáncer y otras enfermedades. Debido a sus efectos beneficiosos para la salud y a sus atractivos colores, los carotenoides poseen una gran importancia comercial como colorantes y aditivos alimentarios [Ninet L. y Renaut J. (1979) En: Peppler HJ., Perlman D. (eds).

Microbial Technology, 2 ^nd . Edn, vol. 1 Academic Press, NY, pp. 529-544].

Diversas investigaciones apoyan la teoría de que el daño oxidativo sobre el ADN, proteínas y lípidos está directamente relacionado con la esperanza de vida, y que los antioxidantes naturales tales como ascorbato, tocoferol y carotenoides son compuestos importantes en la prevención de estas oxidaciones [Stadtman ER (1992) Science 257: 1220-1222; Sohal et al. (1993) Proceedings of the National Academic of Sciences USA 90: 7255-7256]. Particularmente, en el caso del fitoeno han sido descritos efectos beneficiosos para la salud al tratarse de un compuesto con actividad antitumoral [Mathews-Roth MM (1982) Oncology 39: 33-37].

La producción de carotenoides por biosíntesis microbiana es un ejemplo clásico de competencia entre los procesos químicos y los biológicos. Los procesos biotecnológicos muestran, entre otras, la ventaja de permitir obtener de forma simple los carotenoides de estructura más compleja, así como los isómeros conformacionales que sólo existen de forma natural.

A pesar de la diversidad estructural y funcional de los carotenoides y xantofilas, su ruta biosintética es similar en los diferentes organismos, siendo el fitoeno la molécula precursora en todos los casos [Arrach N. et al. (2001) Proceedings of the National Academic of Sciences USA 98: 1687-1692; Velayos A. et al. (2000) European Journal of Biochemistry 267: 5509-5519; Lee & Schmidt-Dannert (2002) Appl. Microbiol. Biotechnol. 60: 1-11; Sandmann G (2003) Chem. Biol. 10: 478-479; Umeno et al. (2005) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 69: 51-78].

La biosíntesis (Esquema 1) se inicia con la isomerización de isopentenil pirofosfato (IPP, C ₅ ) a dimetilalil pirofosfato (DMAPP, C ₅ ), catalizada por la enzima IPP isomerasa. Seguidamente una molécula de DMAPP se condensa con una molécula de IPP para generar geranil pirofosfato (GPP, Cío), el cual se condensa nuevamente con una molécula de IPP para generar farnesil pirofosfato (FPP, Ci ₅ ); ambas reacciones están catalizadas por la enzima FPP sintasa. Una nueva condensación de una molécula de FPP con una molécula de IPP da lugar a geranilgeranil pirofosfato (GGPP, C20);

esta reacción está catalizada por la enzima GGPP sintasa (codificada por el gen crtE). La condensación de dos moléculas de GGPP catalizada por la enzima fitoeno sintasa (codificada por el gen crtB) genera fitoeno (C ₄₀ ), molécula precursora de la ruta biosintética de carotenoides. La enzima fitoeno desaturasa (codificada por el gen crtl) introduce cuatro dobles enlaces en la molécula de fitoeno para sintetizar consecutivamente fitoflueno, ζ-caroteno, neurosporeno y licopeno (C ₄₀ ). Finalmente, la enzima licopeno ciclasa (codificada por el gen crtY) se encarga de convertir los extremos acíclicos de la molécula de licopeno en anillos β para formar secuencialmente γ-caroteno y β-caroteno (C ₄₀ ).

En el caso de Phycomyces blakesleeanus, el color amarillo de su micelio puede ser modificado mediante mutación dando lugar a cepas con micelio de color rojo, blanco o varias gradaciones de amarillo. Los mutantes rojos acumulan licopeno, mientras que los blancos carecen de producción de carotenoides o acumulan fitoeno [Metha BJ. y Cerda-Olmedo E. (1995) Applied Microbio lo gy and Biotechnology 42: 836-838].

La utilización de Paracoccus sp. para la producción de astaxantina, adonixantina, equinenona, 3-hidroxiequinenona, zeaxantina, β-caroteno, licopeno, o β-criptoxantina está recogida en las patentes EP 635576, EP 1138208, EP 1229126, EP 1676925, o US 5935808.

DESCRIPCIóN DE LA INVENCIóN

Breve descripción de la invención

La presente invención describe un método biotecno lógico, en adelante método de la invención, que permite obtener de forma simple, efectiva y a gran escala preparaciones estabilizadas de fitoeno y/o fitoflueno, o mezclas de carotenoides con alto contenido en los mismos, mediante la utilización de nuevas cepas mutadas de Paracoccus sp. (FAl y FA3) superproductoras de fitoeno y/o fitoflueno.

Así, el problema técnico resuelto por la presente invención es la obtención de forma simple, efectiva y a gran escala de preparaciones estabilizadas de fitoeno y fitoflueno, o mezclas de carotenoides con alto contenido en fitoeno y fitoflueno, las cuales puedan aplicarse directamente en los campos alimentario, farmacéutico y cosmético.

Tal y como se cita en el estado de la técnica, existen varios documentos de patente que describen el uso de Paracoccus sp. para la producción de diversos carotenoides distintos del fitoeno y del fitoflueno. Sin embargo, ninguno de ellos se refiere a la utilización de las cepas de Paracoccus sp. mutadas (FAl y FA3) conseguidas en la presente invención para la producción de fitoeno o fitoflueno. A la luz de los documentos citados en el estado de la técnica, se considera que la presente invención presenta: (i) novedad, ya que ninguno de los documentos del estado de la técnica divulga el uso de las cepas de Paracoccus sp. mutadas (FAl y FA3) para la producción simple, efectiva y a gran escala de preparaciones estabilizadas de fitoeno y/o fitoflueno; y (ii) actividad inventiva, ya que un experto medio en la materia no podría combinar de forma obvia los documentos expuestos en el estado de la técnica y resolver el problema técnico arriba planteado.

Descripción de las figuras

Figura 1. Cromatogramas HPLC de los carotenoides acumulados por la cepa Paracoccus sp. FAl.

A: Izquierda: Cromatograma HPLC que muestra un pico mayoritario con RT 9,46 correspondiente a fitoeno. Derecha: Espectro de absorción obtenido por diodoarray del pico con RT 9,46. El máximo de absorción obtenido (286 nm) es característico del fitoeno (ver Tabla 1).

B: Izquierda: Cromatograma HPLC que muestra un pico mayoritario con RT 8,23 correspondiente a fitoflueno. Derecha: Espectro de absorción obtenido por diodoarray del pico con RT 8,23. El máximo de absorción obtenido (348 nm) es característico del fitoflueno (ver Tabla 1).

Figura 2. Cromatogramas HPLC de los carotenoides acumulados por la cepa Paracoccus sp. FA3.

A: Izquierda: Cromatograma HPLC que muestra un pico mayoritario con RT 9,52 correspondiente a fitoeno. Derecha: Espectro de absorción obtenido por diodoarray del pico con RT 9,52. El máximo de absorción obtenido (286 nm) es característico del fitoeno (ver Tabla 1).

B: Izquierda: Cromatograma HPLC que muestra un pico mayoritario con RT 8,29 correspondiente a fitoflueno. Derecha: Espectro de absorción obtenido por diodoarray del pico con RT 8,29. El máximo de absorción obtenido (348 nm) es característico del fitoflueno (ver Tabla 1).

Figura 3.

A: Producción de fitoeno y fitoflueno mediante fermentación en matraz de la cepa Paracoccus sp. FAl. Ordenadas: fitoeno (4) y fitoflueno (D) (mg/L). Abscisas: tiempo de fermentación (h). Los datos se representan en la Tabla 5.

B: Producción de fitoeno y fitoflueno mediante fermentación en matraz de la cepa Paracoccus sp. FA3. Ordenadas: fitoeno (4) y fitoflueno (D) (mg/L). Abscisas: tiempo de fermentación (h). Los datos se representan en la Tabla 6.

Figura 4.

A: Producción de fitoeno y fitoflueno mediante fermentación en tanque fermentador de la cepa Paracoccus sp. FAl. Ordenadas: fitoeno (4) y fitoflueno (D) (mg/L). Abscisas: tiempo de fermentación (h). Los datos se representan en la Tabla 7.

B: Producción de fitoeno y fitoflueno mediante fermentación en tanque fermentador de la cepa Paracoccus sp. FA3. Ordenadas: fitoeno (4) y fitoflueno (D) (mg/L). Abscisas: tiempo de fermentación (h). Los datos se representan en la Tabla 8.

Descripción detallada de la invención

Tal y como se ha comentado anteriormente, el método de la invención permite obtener de forma simple, efectiva y a gran escala preparaciones estabilizadas de fitoeno y/o fitoflueno, o mezclas de carotenoides con alto contenido en los mismos, mediante la utilización de cepas mutadas de Paracoccus sp. superproductoras de fitoeno y/o fitoflueno (FAl y FA3).

El método de la invención comprende:

(i) obtención y selección de mutantes superproductores de fitoeno y fitoflueno a partir de una cepa de Paracoccus sp. productora de xantofilas;

(ii) desarrollo de condiciones mejoradas de fermentación para conseguir una máxima producción de fitoeno y/o fitoflueno, y

(iii) extracción y purificación del fitoeno y del fitoflueno producido.

OBTENCIóN Y SELECCIóN DE MUTANTES DE Paracoccus sp.

Obtención:

En primer lugar y con la finalidad de obtener cepas de Paracoccus sp. superproductoras de fitoeno y fitoflueno, se desarrolló un procedimiento mutagénico de Paracoccus sp. utilizando los agentes mutagénicos etilmetanosulfonato (EMS) y N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG). Las suspensiones de células a mutar se obtuvieron a partir de cultivo en medio líquido, lavando con solución salina para eliminar restos del medio. El procedimiento de mutación con EMS consistió en la incubación de aproximadamente 10 ¹¹ células/mL en una solución de EMS al 3% en tampón fosfato sódico 0,1 M pH 7,0 a temperatura ambiente durante 30 a 180 minutos, consiguiendo tasas de mortalidad de entre el 90 y el 99,9%. Las células mutadas se lavaron tres veces con solución salina. El procedimiento de mutación con NTG consistió en la incubación de aproximadamente 10 ¹¹ células/mL en una solución que contenía 250 μg/mL de NTG y tampón fosfato sódico 0,1 M pH 7,0 a temperatura

ambiente durante 90 minutos, consiguiendo tasas de mortalidad de alrededor del 99%. Las células mutadas se lavaron tres veces con solución salina. Con las células mutadas se sembraron placas Petri con medio sólido y se incubaron a 28 ⁰ C durante 4 días para obtener colonias aisladas.

Selección:

La estrategia utilizada para la selección de cepas superproductoras de fitoeno y fitoflueno a partir de una cepa de Paracoccus sp. productora de xantofilas se basó en el color de la colonia. Para ello, las células mutadas de Paracoccus sp. se sembraron en placas Petri y, una vez crecidas a 28 ⁰ C, se seleccionaron aquellas colonias que poseían color crema (la cepa parental posee color naranja). Tras analizar alrededor de 100.000 colonias se aislaron 2 colonias con color crema denominadas FAl y FA3 productoras de fitoeno y fitoflueno.

DESARROLLO DE CONDICIONES MEJORADAS DE FERMENTACIóN

Las cepas Paracoccus sp. FAl y Paracoccus sp. FA3 se fermentaron en matraz con la finalidad de determinar el nivel de producción de fitoeno y fitoflueno en medio líquido. El análisis de fitoeno y fitoflueno se determinó mediante cromatografía líquida HPLC en fase reversa, demostrándose que con ambas cepas es posible producir fitoeno y fitoflueno junto con una mezcla de carotenoides en la que el fitoeno es el carotenoide mayoritario. Asimismo, las cepas Paracoccus sp. FAl y Paracoccus sp. FA3 se fermentaron en fermentadores pre-industriales con la finalidad de determinar el nivel de producción de fitoeno y fitoflueno. En este caso se desarrollaron dos condiciones de fermentación diferentes: una basada en la utilización de glucosa como fuente de carbono y otra basada en la utilización de glicerol como fuente de carbono. En ambos casos se demuestra que las cepas FAl y FA3 producen fitoeno y fitoflueno junto con una mezcla de carotenoides en la que el fitoeno es el carotenoide mayoritario.

EXTRACCIóN Y PURIFICACIóN DE FITOENO Y FITOFLUENO

La extracción y purificación de fitoeno y fitoflueno se realizó mediante la centrifugación del caldo de fermentación para obtener una biomasa húmeda, la cual se extrajo con alcohol isopropílico. El extracto obtenido se concentró y se purificó mediante dos separaciones cromatográficas sucesivas en gel de sílice.

DEPóSITO DE MICROORGANISMOS

Tal y como se ha expuesto anteriormente, en la presente invención se han obtenido y seleccionado los mutantes FAl y FA3 de la cepa de Paracoccus sp., útiles para la obtención de preparaciones estabilizadas de fitoeno y/o fitoflueno de forma simple, efectiva y a gran escala. Los datos relativos al depósito de material biológico son los siguientes:

Autoridad Internacional de Depósito: Colección Española de Cultivos Tipo (CECT).

Dirección de la Autoridad Internacional de Depósito: Universidad de Valencia; Edificio de investigación; Campus de Burjassot; 46100 Burjassot (Valencia).

Número y fecha de depósito de la cepa Paracoccus sp. FAl : CECT 7383; depositada en la fecha 4 de Marzo de 2008.

Número y fecha de depósito de la cepa Paracoccus sp. FA3: CECT 7384; depositada en la fecha 4 de Marzo de 2008.

A continuación se disponen los Ejemplos de realización, los cuales tienen el objetivo de ilustrar la presente invención sin limitar la misma.

Ejemplo 1: Obtención de mutantes de Paracoccus sp.

En primer lugar se desarrolló un procedimiento mutagénico de una cepa de Paracoccus sp. productora de xantofilas, para lo cual se analizaron: (i) diferentes tipos

de agentes mutagénicos, (ii) concentración del mutágeno, (iii) concentración de células, (iv) pH de incubación y (v) tiempo de tratamiento. De esta forma se seleccionaron como agentes mutagénicos etilmetanosulfonato (EMS) y N-metil-N'- nitro-N-nitrosoguanidina (NTG).

Las suspensiones de células a mutar se obtuvieron a partir de cultivos en un medio líquido, descrito en EP 1229126, cuya composición es la siguiente: corn steep liquor 30,0 g/L, sacarosa 30,0 g/L, KH ₂ PO ₄ 0,54 g/L, K ₂ HPO ₄ 2,78 g/L, MgSO ₄ VH ₂ O 12,0 g/L, CaCl ₂ -2H ₂ O 0,1 g/L, y FeSO ₄ -7H ₂ O 0,3 g/L, ajustado a un pH final de 7,2 con NaOH. Una vez crecidas las células se lavaron dos veces en solución salina (NaCl 9 g/L) y se ajustó la concentración de células en la suspensión a aproximadamente 10 ¹¹ células/mL.

El procedimiento de mutación con EMS consistió en la incubación de aproximadamente 10 ¹¹ células/mL en una solución de EMS al 3% en tampón fosfato sódico 0,1 M pH 7,0 a temperatura ambiente durante 30 a 180 minutos, consiguiendo tasas de mortalidad de alrededor del 90-99,9%. Las células mutadas se lavaron tres veces con solución salina, centrifugando a 3.000 r.p.m. y 15 ⁰ C durante 5 minutos.

El procedimiento de mutación con NTG consistió en la incubación de aproximadamente 10 ¹¹ células/mL en una solución que contenía 250 μg/mL de NTG y tampón fosfato sódico 0,1 M pH 7,0 a temperatura ambiente durante 90 minutos, consiguiendo tasas de mortalidad de alrededor del 99%. Las células mutadas se lavaron tres veces con solución salina, centrifugando a 3.000 r.p.m. y 15 ⁰ C durante 5 minutos.

Con las células mutadas se sembraron placas Petri que contenían un medio sólido con la siguiente composición por litro: corn steep liquor 30,0 g/L, sacarosa 30,0 g/L, KH ₂ PO ₄ 0,54 g/L, K ₂ HPO ₄ 2,78 g/L, MgSO ₄ -7H ₂ O 12,0 g/L, CaCl ₂ -2H ₂ O 0,1 g/L, FeSO ₄ -7H ₂ O 0,3 g/L, y agar 15 g/L, ajustado a un pH final de 7,2 con NaOH. Las placas sembradas se incubaron a 28 ⁰ C durante 4 días para obtener colonias aisladas.

Ejemplo 2: Selección de mutantes de Paracoccus sp. productores de fitoeno y ωtoflueno a partir de una cepa de Paracoccus sp. productora de xantofilas

La estrategia de selección de cepas de Paracoccus sp. productoras de fitoeno y fitoflueno a partir de una cepa de Paracoccus sp. productora de xantofilas se basó en el color de la colonia. La selección de los citados mutantes se realizó a partir de células mutadas con EMS y NTG tal y como se describe en el Ejemplo 1. Las células mutadas se sembraron en el medio sólido descrito en el Ejemplo 1 y se incubaron a 28 ⁰ C durante 5 días. Transcurrido este tiempo se seleccionaron aquellas colonias que poseían color crema en lugar del color naranja típico de la cepa parental Paracoccus sp. productora de xantofilas. De esta forma, a partir de aproximadamente 100.000 colonias analizadas se aislaron 12 colonias con color crema, las cuales podrían ser productoras de fitoeno y fitoflueno. Con la finalidad de determinar los carotenoides producidos por estos mutantes se realizó una extracción de la biomasa obtenida directamente del medio sólido con una mezcla de tetrahidrofurano metano l:hexano (20:1 :40) (v/v) y el extracto se analizó mediante cromatografía líquida HPLC con los siguientes métodos: (I) Para el análisis de β-caroteno, licopeno, fitoeno y fitoflueno se empleó una columna Hypersil ODS 5 μm (100 x 4,6 mm) con una fase móvil de metano l:acetonitrilo: cloro formo (47:47:6) (v/v) a un flujo de 1 mL/min. (II) Para el análisis de xantofilas se empleó una columna nucleosil 100 NH2 5 μm (250 x 4,6 mm) con una fase móvil de hexano: acetato de etilo (1:1) (v/v) a un flujo de 1 mL/min. Se utilizó un detector de diodoarray para adaptarse a las longitudes de onda de máxima absorción de los distintos carotenoides, las cuales se muestran en la Tabla 1.

De los 12 mutantes inicialmente aislados se seleccionaron 2, denominados FAl y FA3, los cuales acumulaban fitoeno y fitoflueno, siendo fitoeno el carotenoide principal. Las Figuras 1 y 2 muestran los cromatogramas HPLC de los carotenoides acumulados por ambas cepas. El nivel de producción de fitoeno y fitoflueno de las cepas FAl y FA3 se analizó posteriormente en medio líquido tal y como se describe en los Ejemplos 3, 4 y 5.

Ejemplo 3: Procedimiento de producción de fitoeno y fitoflueno mediante fermentación en matraz de las cepas Paracoccus sp. FAl y Paracoccus sp. FA3

Las cepas Paracoccus sp. FAl y Paracoccus sp. FA3, seleccionadas tal y como se describe en los Ejemplos 1 y 2, se fermentaron en matraz con la finalidad de determinar el nivel de producción de fitoeno y fitoflueno en medio líquido. Para ello, se preparó un medio de inoculo, descrito en EP 1229126, con la siguiente composición por litro: corn steep liquor 30,0 g/L, sacarosa 30,0 g/L, KH ₂ PO ₄ 0,54 g/L, K ₂ HPO ₄ 2,78 g/L, MgSO ₄ VH ₂ O 12,0 g/L, CaCl ₂ -2H ₂ O 0,1 g/L, y FeSO ₄ VH ₂ O 0,3 g/L, ajustado a un pH final de 7,2 con NaOH. Cada matraz de inoculo de 250 mL con 50 mL de medio se sembró con 100 μl del cultivo congelado y se incubó a 28 ⁰ C, 250 r.p.m. y 5 cm de excentricidad durante 48 horas.

El medio de fermentación, descrito en EP 1229126, posee la siguiente composición por litro: corn steep liquor 30,0 g/L, glucosa 30,0 g/L, KH ₂ PO ₄ 1,5 g/L, Na ₂ HPO ₄ - 12H ₂ O 3,8 g/L, MgSO ₄ VH ₂ O 3,0 g/L, CaCl ₂ -2H ₂ O 0,2 g/L, y FeSO ₄ VH ₂ O 1,0 g/L, ajustado a un pH final de 7,2 con NaOH. El medio se repartió en matraces Erlenmeyer de 250 mL a razón de 20 mL por matraz. Los matraces con el medio de fermentación se sembraron con el inoculo anteriormente descrito y se incubaron a 28 ⁰ C y 250 r.p.m. Una vez concluida la fermentación (5-6 días), se preparó una mezcla de caldo de fermentación y alcohol isopropíllico (1/1). La concentración y pureza de fitoeno y fitoflueno se determinó mediante el uso de cromatografía líquida HPLC en fase reversa.

Los niveles de producción de fitoeno, fitoflueno y otros carotenoides obtenidos con las cepas FAl y FA3 se muestran en las Tablas 2, 5 y 6. En la Figura 3 se muestra la evolución de la producción de fitoeno y fitoflueno a lo largo de la fermentación en matraz.

Este Ejemplo demuestra con claridad que con ambas cepas y el procedimiento descrito es posible producir fitoeno y fitoflueno junto con una mezcla de carotenoides en la que fitoeno es el carotenoide mayoritario.

Ejemplo 4. Procedimiento de producción de fitoeno y fitoflueno mediante fermentación en tanque fermentador de las cepas Paracoccus sp. FAl y Paracoccus sp. FA3 utilizando un programa específico de adición de glucosa

Las cepas Paracoccus sp. FAl y Paracoccus sp. FA3, seleccionadas tal y como se describe en los Ejemplos 1, 2, y 3, se cultivaron en fermentadores pre-industriales con la finalidad de determinar el nivel de producción de fitoeno y fitoflueno. Para ello, se preparó un medio de pre-inóculo con la composición descrita en el Ejemplo 3 para el medio de inoculo. Los pre-inóculos se sembraron en matraces de 500 mL con 100 mL de medio y se incubaron a 28 ⁰ C y 250 r.p.m. con 5 cm de excentricidad durante 48 horas. Posteriormente se sembraron inóculos en matraces de 500 mL con 100 mL de medio de inoculo (Ejemplo 3) con el cultivo de pre-inóculo, y se incubaron a 28 ⁰ C y 250 r.p.m. con 5 cm de excentricidad durante 30 horas.

Con el cultivo de inoculo se sembraron fermentadores de 30 L con 16 litros de un medio de fermentación con la siguiente composición por litro: corn steep liquor 30,0 g/L, glucosa 30,0 g/L, KH ₂ PO ₄ 1,5 g/L, Na ₂ HPO ₄ - 12H ₂ O 3,8 g/L, MgSO ₄ VH ₂ O 3,0 g/L, CaCl ₂ -2H ₂ O 0,2 g/L, FeSO ₄ -7H ₂ O 1,0 g/L, y antiespumante PPG 1 mL/L. El pH se ajustó a 7,2 con amoniaco. La fermentación se incubó durante 96-144 horas a una temperatura de 28 ⁰ C con agitación variable entre 150 y 500 r.p.m. y una aireación de 0,25-1 v/v/m.

Desde las 20 horas hasta las 90 horas se mantuvo una adición de glucosa al 70% para mantener un rango de 10 a 30 g/L de glucosa en el caldo de fermentación.

La valoración de la concentración y pureza de fitoeno y fitoflueno al final de la fermentación se realizó tal y como se describe en el Ejemplo 2. Los niveles de producción de fitoeno, fitoflueno y otros carotenoides se muestran en la Tabla 3.

Este Ejemplo demuestra con claridad que con ambas cepas y el procedimiento descrito es posible producir fitoeno y fitoflueno junto con una mezcla de carotenoides en la que fitoeno es el carotenoide mayoritario.

Ejemplo 5. Procedimiento de producción de fitoeno y fitoflueno mediante fermentación en tanque fermentador de las cepas Paracoccus sp. FAl y Paracoccus sp. FA3 utilizando un programa específico de adición de glicerol

Las cepas Paracoccus sp. FAl y Paracoccus sp. FA3, seleccionadas tal y como se describe en los Ejemplos 1, 2, y 3, se cultivaron en fermentadores pre-industriales con la finalidad de determinar el nivel de producción de fitoeno y fitoflueno. Para ello, se preparó un medio de pre-inóculo con la composición descrita en el Ejemplo 3 para el medio de inoculo. Los pre-inóculos se sembraron en matraces de 500 mL con 100 mL de medio y se incubaron a 28 ⁰ C y 250 r.p.m. con 5 cm de excentricidad durante 48 horas. Posteriormente se sembraron inóculos en matraces de 500 mL con 100 mL de medio de inoculo (Ejemplo 3) con el cultivo de pre-inóculo, y se incubaron a 28 ⁰ C y 250 r.p.m. con 5 cm de excentricidad durante 30 horas.

Con el cultivo de inoculo se sembraron fermentadores de 30 L con 16 litros de un medio de fermentación con la siguiente composición por litro: corn steep liquor 30 g/L, glicerol 30 g/L, KH ₂ PO ₄ 1,5 g/L, Na ₂ HPO ₄ - 12H ₂ O 3,8 g/L, MgSO ₄ VH ₂ O 3,0 g/L, CaCl ₂ -2H ₂ O 0,2 g/L, FeSO ₄ VH ₂ O 1,0 g/L, y antiespumante PPG 1 mL/L. El pH se ajustó a 7,2 con amoniaco. La fermentación se incubó durante 96-144 horas a una temperatura de 28 ⁰ C con agitación variable entre 150 y 500 r.p.m. y una aireación de 0,25-1 v/v/m.

Desde las 20 horas hasta las 90 horas se mantuvo una adición de glicerol al 66% para mantener un rango de 10 a 30 g/L de glicerol en el caldo de fermentación.

La valoración de la concentración y pureza de fitoeno y fitoflueno al final de la fermentación se realizó tal y como se describe en el Ejemplo 2. Los niveles de producción de fitoeno, fitoflueno y otros carotenoides obtenidos se muestran en la Tabla 4.

Este Ejemplo demuestra con claridad que con ambas cepas y el procedimiento descrito es posible producir fitoeno y fitoflueno junto con una mezcla de carotenoides en la que fitoeno es el carotenoide mayoritario.

Ejemplo 6: Procedimiento de recuperación y purificación de fitoeno y fitoflueno de los caldos de fermentación de Paracoccus sp. FAl y Paracoccus sp. FA3

El caldo de fermentación obtenido tal y como se describe en los Ejemplos 3, 4 y 5 se centrifugó, recuperando la biomasa húmeda, la cual se extrajo con al menos 2 volúmenes por peso de alcohol isopropílico, preferentemente 6 volúmenes por peso. La mezcla se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente y seguidamente se filtró a través de un embudo Büchner. El líquido obtenido se concentró bajo vacío a sequedad, obteniendo un extracto que se analizó espectrofotométricamente a 286 nm [Britton G., Liaaen-Jensen S. and Pfander H. (1995) Carotenoids. Volume IB: Spectroscopy, pag. 60, Birkhauser, Basel] mostrando la presencia de 15-25% fitoeno y 0.5-1% fitoflueno.

Seguidamente se realizó la primera purificación cromatográfica en gel de sílice utilizando al menos 5 gramos por cada gramo de extracto a purificar, preferentemente 10 gramos por cada gramo. La preparación de la columna se realizó mezclando gel de sílice y dicloro metano. El extracto concentrado, obtenido tal y como se describe anteriormente, se disolvió en diclorometano y se cargó en la columna. Las fracciones eluidas tras el proceso cromato gráfico se analizaron espectrofotométricamente y aquellas que presentaban el espectro UV/visible coincidente con la presencia de fitoeno y fitoflueno se evaporaron a sequedad. El producto pre-purificado obtenido se analizó espectrofotométricamente mostrando la presencia de 70-80% fitoeno y 1.0- 2.0% fitoflueno. El citado producto pre-purificado debe ser almacenado a -2O ⁰ C en atmósfera inerte para evitar degradación química.

Por último se realizó la segunda purificación cromatográfica en gel de sílice utilizando al menos 10 gramos de gel de sílice por cada gramo de producto pre-purificado, preferentemente 20 gramos por cada gramo. La preparación de la columna se realizó

mezclando gel de sílice y ciclo hexano o n-hexano. El producto pre-purificado, obtenido tal y como se describe anteriormente, se disolvió en ciclohexano o n-hexano y se cargó en la columna. Al final de la cromatografía es necesario incrementar la polaridad adicionando etil acetato, eluyendo con mezclas de polaridad creciente ciclohexano o n-hexano:etil acetato 98:2, 97:3, ó 96:4.

Las fracciones eluidas tras el proceso cromatográfico se analizaron espectrofotométricamente y aquellas que presentaban el espectro UV/visible coincidente con la presencia de fitoeno y fitoflueno se evaporaron a sequedad. El producto obtenido se analizó espectrofotométricamente mostrando la presencia de 80- 90% fitoeno y 0.5-1.5% fitoflueno.

Esquema 1. Ruta biosintética de carotenoides y xantofilas.

Mevalonato

I

(crtB) (crtl)

(crtY)

Tabla 1. Longitudes de onda de máxima absorción de los distintos carotenoides.

Tabla 2. Producción de fitoeno, fitoflueno y otros carotenoides de las cepas FAl y FA3 en matraz a las 120 horas de fermentación. Los valores de producción de cada carotenoide se expresan como porcentaje del total de carotenoides producidos.

Tabla 3. Producción de fitoeno, fitoflueno y otros carotenoides de las cepas FAl y FA3 en fermentador de 30 L con adición de glucosa a las 96 horas de fermentación. Los valores de producción de cada carotenoide se expresan como porcentaje del total de carotenoides producidos.

Tabla 4. Producción de fitoeno, fitoflueno y otros carotenoides de las cepas FAl y FA3 en fermentador de 30 L con adición de glicerol a las 96 horas de fermentación. Los valores de producción de cada carotenoide se expresan como porcentaje del total de carotenoides producidos.

Tabla 5. Valores (mg/L) de producción de fitoeno y fitoflueno obtenidos por la cepa FAl en matraz. Estos valores están representados en la Figura 3A.

Tabla 6. Valores (mg/L) de producción de fitoeno y fitoflueno obtenidos por la cepa FA3 en matraz. Estos valores están representados en la Figura 3B.

Tabla 7. Valores (mg/L) de producción de fitoeno y fitoflueno obtenidos por la cepa FAl en tanque fermentador con glucosa. Estos valores están representados en la Figura 4A.

Tabla 8. Valores (mg/L) de producción de fitoeno y fitoflueno obtenidos por la cepa FA3 en tanque fermentador con glucosa. Estos valores están representados en la Figura 4B.