Niedermolekulare Saccharide, beispielsweise Mono- saccharide wie Glucose, und Oligosaccharide, wie Saccharose, finden Anwendung als Substrate für bio- technologische Prozesse beziehungsweise in modifi- zierter Form als Hilfsstoffe für unterschiedliche

Industriezweige. So werden zum Beispiel größere Mengen von Glucose für chemische Synthesen, bei- spielsweise von Sorbit und Glutamat, und für tech- nische Zwecke, unter anderem zur alkoholischen Gä- rung, eingesetzt. Saccharose, die volkswirtschaft- lich bedeutendste Zuckerart, wird hauptsächlich zu Speisezwecken und zur Konservierung verwendet, kann jedoch auch für Kunststoffe, Firnisse, zur Synthese von Eiweiß, Aminosäuren, Antibiotika etc. sowie als Zuschlagsstoff für Hart-PUR-Schäume verwendet wer- den.

Wesentlich häufiger werden Polysaccharide, wie Cel- lulose und Stärke, in nativer beziehungsweise modi- fizierter Form in der Industrie eingesetzt. Stärke ist nicht nur das wichtigste Nahrungsmittel des Menschen. Fabrikmäßig gewonnene Stärke wird auch in der Papierindustrie, unter anderem zur Herstellung von Kartonagen oder als Papierhilfsmittel, bei- spielsweise zum Leimen von Papier, in der Textilin- dustrie, beispielsweise als Schlichte oder zum Ap- pretieren und Beschweren neuer Gewebe oder als Steifungsmittel für. Wäsche, und in der Pharmazie, beispielsweise als Spreng-und Füllmittel für Tab- letten, als Gleit-und Füllmittel für Puder, als Grundlage für Salben etc., eingesetzt. Cellulose ist einer der wichtigsten Rohstoffe für zahlreiche Industriezweige. Die größten Cellulosemengen werden dabei von der Papier-und Textilindustrie ver- braucht, wobei beispielsweise die verbreitesten Textilgewebe aus mehr oder weniger reiner, natürli- cher oder künstlich umgewandelter Cellulose beste- hen. Zunehmende Bedeutung, erlangen Polysaccharide

beziehungsweise Polysaccharid-Derivate auch als Zu- schlagsstoff in der Bauindustrie.

Trotz der zahlreichen bereits etablierten Anwendun- gen besitzen sowohl Cellulose als auch Stärke gra- vierende Nachteile. Beispielsweise erfordert die Herstellung von chemischen Cellulose-Derivaten, al- so von Produkten, die beispielsweise über Ver- esterungs-und/oder Veretherungsreaktionen, Substi- tutionen, Oxidations-oder Vernetzungsreaktionen erzeugt werden, die Verwendung zahlreicher chemi- scher Reagenzien, insbesondere die Verwendung von Lösungsmitteln, deren nachfolgende Entsorgung zum Teil mit erheblichen Kosten verbunden ist. Die Her- stellung von Cellulose-Derivaten ist daher im All- gemeinen wesentlich teurer als die Herstellung von Stärke-Derivaten. Hingegen ist die Herstellung von Stärke-Derivaten mit dem Problem verbunden, dass Stärke eine heterogene Verbindung ist, die aus der linear aufgebauten Amylose und dem stark verzweig- ten Amylopektin besteht. Aufgrund dieser Heteroge- nität ist es nicht oder nur bedingt möglich, eine chemische Stärke-Derivatisierung reproduzierbar und gezielt durchzuführen. Seit Jahren wird daher, al- lerdings mit bislang mäßigem. Erfolg, versucht, Pflanzen zu züchten, die ausschließlich amylosehal- tige Stärke liefern. Kostengünstige, für den groß- technischen Einsatz geeignete Polysaccharide mit vorwiegend linearer Struktur stehen daher zur Zeit auf dem Markt nicht zur Verfügung.

Für Anwendungsfälle, in denen insbesondere eine li- neare Struktur der Kohlenhydrat-Polymere für die gewünschten Eigenschaftsprofile die entscheidende

Voraussetzung ist, stellen daher längerkettige Po- lyfructane eine wichtige Alternative dar. Bei den Polyfructanen handelt es sich um Polysaccharide, bei denen hauptsächlich Fructose-Einheiten mitein- ander verknüpft sind. Polyfructane unterscheiden sich durch die Art der Verknüpfung der Fructose- Einheiten. Beispielsweise liegen die Fructose- Einheiten bei dem wichtigsten Polyfructan Inulin in furanosider Form mit ß-1, 2-Bindung vor. Bei dem Po- lyfructan Levan sind die Fructose-Einheiten über ß- 2,6-Bindungen verknüpft. Polyfructane sind Reserve- Kohlenhydrate, die bei einer Reihe monocotyler und dicotyler Pflanzen, beispielsweise Compositen, Grä- sern und Getreiden, aber auch bei Algen sowie eini-- gen grampositiven und gramnegativen Bakterien zu finden sind.

Inulin ist ein Polyfructan mit vorwiegend linearer Struktur, wobei Fructose-Einheiten über ß-1,2- Bindungen verknüpft sind und wobei die Kette wahr- scheinlich von einer nicht reduzierenden a-D- Glucose-Einheit abgeschlossen wird. Inulin findet sich allein oder zusammen mit Stärke als Reserve- Kohlenhydrat unter anderem in Dahlienknollen, Arti- schocken, Topinamburknollen, Zichorienwurzeln und in den Zellen von Inula und anderen Korbblütlern (Compositae), seltener auch in verwandten Pflanzen- familien (Campanulaceae, Lobeliaceae). Die Inuline aus verschiedenen Pflanzenarten unterscheiden sich im Wesentlichen durch ihren mittleren Polymerisati- onsgrad. Beispielsweise besitzt Inulin aus Topinam- bur einen mittleren Polymerisationsgrad von 5-7, Inulin aus Zichorien einen mittleren Polymerisati- onsgrad von 10-12 und Inulin aus Artischocken einen

mittleren Polymerisationsgrad von etwa 25 (Beck, R.

H. F. und Praznik, W., Inulinhaltige Pflanzen aus Rohstoffquelle. Starch/Stärke, 38 (1986), 391-394).

Aufgrund ihrer linearen Struktur können aus diesen Inulinen relativ problemlos Derivate hergestellt werden, wobei diese Derivate weitestgehend biolo- gisch abbaubar sind. Wegen der relativ kurzen Ket- ten sind derartige Inuline beziehungsweise daraus hergestellte Derivate jedoch für einen Einsatz als polymere Tenside, Emulgatoren und Weichmacher nicht geeignet. Ebenso bekannt ist die Verwendung von I- nulin als"bulking agent"beziehungsweise als Fett- ersatzstoff.

Es ist auch bekannt, Inulin zu Fructooligosacchari- den zu hydrolysieren und diese als präbiotische Le- bensmittelzutaten einzusetzen (Wang, X. und Gibson, G. R., J. Appl. Biochem., 75 (1993), 373-380). Ein gravierender Nachteil dieser Fructooligosaccharide besteht jedoch in ihrem relativ hohen Glucosean- teil. So enthalten Fructooligosaccharide, die aus dem Inulin von Topinambur hergestellt wurden, etwa 40 bis 20 % Glucose, während aus dem Inulin von Zi- chorien hergestellte Fructooligosaccharide etwa 8 bis 10 % Glucose enthalten. Solche Fructooligosac- charide sind nur in beschränktem Maße für die Er- nährung von Diabetikern geeignet.

Aus der EP 657 106 Al ist die Herstellung und Ver- wendung von hydrierten Fructooligosacchariden be- kannt. Auch hier erweist sich der relativ hohe Glu- coseanteil der eingesetzten Fructooligosaccharide als nachteilig.

Von besonderem Interesse sind Difructosedianhydri- de, die ebenfalls aus Inulin hergestellt werden können und die sich als Nahrungsmittelzutaten ver- wenden lassen. Sie zeichnen sich insbesondere da- durch aus, dass sie im Dickdarm eine ausgesprochen präbiotische Wirkung entfalten und dadurch nachhal- tig zu einer gesunden Darmflora und Darmwand bei- tragen. In der Industrie besteht deshalb großes In- teresse an einer kostengünstigen Herstellung von Difructosedianhydriden. Verfahren zur Herstellung von Difructosedianhydriden sind bekannt (Seki, K. et al., Starch/Stärke, 40 (1988), 440-442 ; DE-PS 195 47 059 ; Uchiyama, T., in : Science and Technolo- gy of Fructans (Herausgeber Suzuki, M. und Chatter- ton, N. J.) (1993), CRC Boca Raton, Florida). Al- lerdings ist auch bei den so hergestellten Difruc- tosedianhydriden der hohe Glucosegehalt nachteilig.

Es ist bekannt, dass Polyfructan-enthaltende Pflan- zen ebenso wie eine Anzahl von Mikroorganismen Fructosyltransferase (Ftf)-Proteine exprimieren, die die Polymerisierung linearer oder verzweigter Fructose-Polymere katalysieren. Mikrobielle Fructo- syltransferasen wurden beispielsweise in Strepto- coccus-, Bacillus-, Pseudomonas-, Xanthomonas-, A- cetobacter-, Erwinia-und Actinomyces-Stämmen nach- gewiesen. Bei mikrobiellen Polyfructanen sind die Fructosereste über ß-1,2- und/oder ß-2,6-Bindung verknüpft. Das heißt, bei mikrobiellen Fructo- syltransferasen handelt es sich entweder um Inulin- sucrasen oder um Levansucrasen. Während pflanzliche Polyfructane ein relativ niedriges Molekulargewicht aufweisen, wobei pro Molekül etwa 10 bis 30 Fructo- seeinheiten verknüpft sind, besitzen mikrobielle

Polyfructane ein Molekulargewicht von bis zu 106 bis 108, wobei mehr als 100 000 Fructose-Einheiten verknüpft sein können. Untersuchungen zur Polyfruc- tan-Biosynthese haben zudem gezeigt, dass die Bio- synthese in Bakterien generell wesentlich einfacher verläuft als in Pflanzen. Aus den genannten Gründen besteht ein starkes Interesse, insbesondere bakte- rielle Fructosyltransferasen zur Herstellung von Polyfructanen zu nutzen.

Derzeit ist jedoch lediglich eine bakterielle Fruc- tosyltransferase bekannt, nämlich die aus dem gram- positive Bakterium Streptococcus mutans, welche die Bildung von Inulin auf der Basis von Saccharose als Ausgangsmolekül katalysieren kann (Shiroza und Ku- ramitsu, J. Bacteriol., 170 (1988), 810-816) ; Ro- sell, K.-G. und Birkhead, D., Acta Chem. Scand., 28 (1974), 589). Das mit der S. mutans- Fructosyltransferase aus Saccharose hergestellte Inulin weist eine Molmasse von 20-60 x 106 g/mol auf. Damit ist der Glucosegehalt des Inulins ver- nachlässigbar, so dass das Inulin prinzipiell für die Herstellung von Fructooligosacchariden geeignet wäre. Andererseits weist so hergestelltes Inulin jedoch etwa 7 % Verzweigungen auf und ist dadurch für einen Einsatz als Rohstoff zur weiteren chemi- schen Derivatisierung weniger geeignet. Darüber hinaus handelt es sich bei dem Mikroorganismus S. mutans um einen human-pathogenen Keim, so dass sei- ne Verwendung und Vermehrung in industriellem Maß- stab zur Enzymgewinnung mit großen Problemen behaf- tet ist.

Verfahren zur Herstellung von Kohlenhydrat- Polymeren, insbesondere Polyfructanen, in transge- nen Pflanzen unter Verwendung mikrobielle Fructo- syltransferasen codierender ftf-Gene, beispielswei- se des Fructosyltransferase-Gens von S. mutans, sind ebenfalls bekannt.

Die PCT/US89/02729 beschreibt ein Verfahren zur Er- zeugung von Kohlenhydrat-Polymeren, insbesondere Dextran oder Polyfructose, in transgenen Pflanzen.

Zur Erzeugung dieser Pflanzen wird die Verwendung von Levansucrasen oder Dextransucrasen aus ver- schiedenen Mikroorganismen vorgeschlagen.

Die PCT/EP93/02110 offenbart ein Verfahren zur Her- stellung Polyfructose erzeugender transgener Pflan- zen, die das lsc-Gen für eine Levansucrase aus ei- nem gramnegativen Baterium enthalten.

Die PCT/US94/12778 beschreibt Verfahren zur Synthe- se und Akkumulation von Kohlenhydrat-Polymeren in transgenen Pflanzen, wobei unter anderem ein bakte- rielles Fructosyltransferase-Gen verwendet wird, das eine Levansucrase codiert.

Die PCT/NL93/00279 offenbart die Transformation von Pflanzen mit chimären Genen, die das sacB-Gen aus Bacillus subtiles oder das ftf-Gen aus Streptococ- cus mutans enthalten. Im Falle des eine Levansucra- se codierenden sacB-Gens wird zur Erhöhung des Ex- pressionsniveaus in transformierten Pflanzen eine Modifikation des 5'-untranslatierten Bereiches des bakteriellen Gens empfohlen. Für das Fructo- syltransferase-Gen aus Streptococcus mutans werden

keine Sequenzmodifikationen beschrieben, so dass das Expressionsniveau der Fructosyltransferase ver- gleichsweise sehr gering ist.

Die PCT/NL95/00241 beschreibt Verfahren zur Produk- tion von Oligosacchariden in transgenen Pflanzen, wobei das Fructosyltransferase-Gen von Streptococ- cus mutans (Shiroza und Kuramitsu, 1988) verwendet wurde. Darüber hinaus wurden andere Fructosyltrans- ferase-Gene pflanzlichen Ursprungs verwendet. Eben- falls beschrieben ist die Verwendung der in trans- genen Pflanzen erzeugten Oligosaccharide als Zu- ckerersatz, als Nahrungsergänzungsmittel und als bifidogenes Mittel in Nahrungsmitteln sowie als bi- fidogenes Mittel in Tierfutter.

Bei der Verwendung des Fructosyltransferase-Gens von Streptococcus mutans in heterologen Express- onssystemen, das heißt sowohl heterologen bakteri- ellen Expressionssystemen als auch pflanzlichen Systemen, hat sich jedoch herausgestellt, dass das native Protein in äußerst geringen Mengen erzeugt wird und daher auch die Inulin-Produktion nur in sehr beschränktem Maße erfolgt. Diese geringe En- zymproduktion in heterologen Wirtszellen geht ein- her mit schwerwiegenden Wachstumsstörungen der Wirtszellen.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit das techni- sche Problem zugrunde, Verfahren und Mittel, insbe- sondere Verfahren und Mittel auf der Basis des Fructosyltransferase-Gens von Streptococcus mutans, zur Herstellung von hochmolekularen Polyfructanen, insbesondere Inulin, mit ß-1, 2-Bindungen und einer

im wesentlichen linearen Struktur und einem sehr geringen Glucose-Gehalt bereitzustellen, die eine einfache und kostengünstige Erzeugung der Polyfruc- tane in großen Mengen ermöglichen, wobei die vor- stehend beschriebenen Probleme im Stand der Tech- nik, insbesondere die geringe Expression bakteriel- ler Fructosyltransferase-Gene in heterologen Wirts- systemen, überwunden werden.

Die vorliegende Erfindung löst dieses technische Problem insbesondere durch die Bereitstellung eines modifizierten Fructosyltransferase-Gens aus Strep- tococcus mutans mit einer Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 oder einer Nucleinsäuresequenz, die eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 2 codiert, das ein am N-Terminus und/oder am C-Terminus modi- fiziertes Polypeptid mit der Aktivität einer Fruc- tosyltransferase codiert, insbesondere wobei das Polypeptid am N-terminalen und/oder am C-terminalen Ende mindestens eine Deletion aufweist. Insbesonde- re stellt die vorliegende Erfindung ein, vorzugs- weise isoliertes und vollständig gereinigtes, Nuc- leinsäuremolekül gemäß Hauptanspruch bereit, das ein Polypeptid mit der Aktivität einer Fructo- syltransferase (ftf) codiert und welches in einer in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Nucleinsäuresequenz oder in einer die in SEQ ID Nr. 2 angegebene Amino- säuresequenz codierenden Nucleinsäuresequenz min- destens eine Deletion aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus : a) Deletion der Nucleotide 4 bis 222 ; b) Deletion der Nucleotide 1 bis 104 ; und

c) Deletion der Nucleotide 2254 bis 2385.

Durch die Deletion der Nucleotide 4 bis 222 bezie- hungsweise der Nucleotide 1 bis 104 wird die Sig- nalsequenz des nativen Fructosyltransferase-Gens von S. mutans vollständig oder teilweise entfernt, so dass das codierte Signalpeptid der nativen S. mutans-Fructosyltransferase vollständig oder teil- weise entfernt wird. Durch die somit erhaltene in- trazelluläre Enzymproduktion werden die Wachstums- störungen heterologer Wirtszellen, wie beispiels- weise Escherichia coli, die auf die Expression der Fructosyltransferase von S. mutans zurückzuführen sind, beseitigt und das Enzym kann in hohen Volu- menausbeuten aus diesen Zellen gewonnen werden.

Überraschenderweise wurde ebenso festgestellt, dass eine die Nucleotide 2254 bis 2385 umfassende Dele- tion am C-Terminus der Fructosyltransferase zu ei- ner erheblichen Verbesserung des Wachstums hetero- loger Wirtszellen führt. Die Funktion des deletier- ten hydrophoben Bereiches im nativen Protein ist nicht bekannt. Erfindungsgemäß führt auch diese De- letion innerhalb des C-terminalen Bereiches zu ei- ner wesentlichen Verbesserung des Wachstums hetero- loger Wirtszellen und hohen Volumenausbeuten des exprimierten Proteins.

Erfindungsgemäß wurde ferner festgestellt, dass die im 5'-Bereich der Nucleinsäuresequenz des ftf-Gens deletierten Sequenzen durch zumindest einen Se- quenzbereich eines anderen Gens ersetzt werden kön- nen, wobei es sich bei dem anderen Gen vorzugsweise um das lacZa-Gen handelt. Auch eine solche Mutation

bewirkt ein verbessertes Wachstum heterologer Wirtszellen und hohe Volumenausbeuten des expri- mierten Proteins.

Unter Verwendung der vorstehend genannten erfin- dungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle lassen sich daher Vektoren herstellen, die in pro-und/oder eukaryon- tischen Zellen eine hohe Expression eines modifi- zierten Polypeptids mit der Aktivität einer Fructo- syltransferase gewährleisten. Erfindungsgemäß wurde festgestellt, dass eine besonders hohe Volumenaus- beute des exprimierten Proteins in bakteriellen Wirtssystemen erreicht wird, wenn die erfindungsge- mäßen, am 5'-Ende und/oder am 3'-Ende deletierten Nucleinsäuremoleküle beziehungsweise Nucleinsäure- moleküle, bei denen die am 5'-deletierten Sequenzen durch einen Sequenzbereich eines anderen Gens er- setzt sind, in die Expressionskassette des Escheri- chia coli-Vektors pJOE2702 (Volff et al., Mol. Mic- robiol., 21 (1996), 1037-1047 ; Stumpp et al., Bio- spektrum, l (2000), 33-36) integriert werden. Die- ser Vektor ist durch L-Rhamnose induzierbar und wird positiv reguliert.

Die erfindungsgemäß hergestellten pro-und eukary- ontischen Wirtszellen können in Verfahren zur Her- stellung von Polyfructanen mit ß-1, 2-Bindungen ver- wendet werden, wobei nach der Kultivierung und Ver- mehrung : dieser Wirtszellen aus den Zellen ein Pro- tein mit der Aktivität einer Fructosyltransferase isoliert wird und das isolierte Protein in vitro zur Behandlung einer Saccharoselösung eingesetzt wird. Anschließend kann das enzymatisch gebildete Polyfructan aus dem Reaktionsansatz isoliert und

aufgereinigt werden. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann ein Polyfructan direkt aus Wirtszellen, die eines der erfindungsgemäßen Nuc- leinsäuremoleküle enthalten, oder aus einer trans- genen Pflanze, die eines der erfindungsgemäßen Nuc- leinsäuremoleküle enthält, isoliert werden. Bei dem so hergestellten Polyfructan handelt es sich vor- zugsweise um Inulin mit einem Polymerisationsgrad von >100 und einem Verzweigungsgrad von zu 8 %, vor- zugsweise < 3 %.

Das erfindungsgemäß hergestellte Inulin wird in weiteren bevorzugten Ausführungsformen der Erfin- dung zur Herstellung von Fructooligosacchariden be- ziehungsweise Difructosedianhydriden verwendet. Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Fructoo-- ligosacchariden sieht vor, dass das erfindungsgemäß hergestellte Inulin mit einer Endo-Inulinase behan- delt wird und anschließend die erzeugten Fructooli- gosaccharide aus dem Reaktionsansatz isoliert wer- den. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass eine Saccharose-Lösung gleich- zeitig mit einer erfindungsgemäßen Fructosyltrans- ferase und einer Endo-Inulinase behandelt wird und anschließend die enzymatisch erzeugten Fructooligo- saccharide aus dem Reaktionsansatz isoliert und aufgereinigt werden.

Weitere bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung betreffen Verfahren zur Herstellung von Difructose- dianhydriden. In einer Ausgestaltung wird erfin- dungsgemäß hergestelltes Inulin mit einer Endo- Inulinase und Zellen von Arthrobacter globiformis oder Arthrobacter ureafaciens behandelt. In einer

weiteren bevorzugten Ausführungsform ist vorgese- hen, dass eine Saccharoselösung mit einer erfin- dungsgemäßen Fructosyltransferase und einer Endo- Inulinase und Zellen von A. globiformis oder A. ureafaciens behandelt wird und anschließend die er- zeugten Difructosedianhydride aus dem Reaktionsan- satz isoliert und aufgereinigt werden.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den übrigen Unteransprüchen.

Erfindungsgemäß wird also in bevorzugter Ausfüh- rungsform ein, vorzugsweise isoliertes und gerei- nigtes Nucleinsäuremolekül bereitgestellt, das ein bakterielles Fructosyltransferase (ftf)-Gen ist und ein Polypeptid mit der Aktivität einer Fructo- syltransferase codiert und am 5'-Ende und/oder am 3'-Ende mindestens eine Deletion enthält.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem bakteriellen Fructosyltransferase-Gen oder einem Nucleinsäuremolekül, das ein bakteriel- les Polypeptid mit der Aktivität einer Fructo- syltransferase codiert, die codierende DNA-Sequenz eines Genes verstanden, dessen Genprodukt die Akti- vität einer Saccharose : 2,1-ß-D-fructosyltrans- ferase (EC 2.4.1.9) aufweist und das ursprünglich aus einem Bakterium, vorzugsweise aus Streptococcus mutans, stammt. Im Zusammenhang mit der vorliegen- den Erfindung bedeutet der Begriff"Fructosyl- <BR> <BR> <BR> transferase"oder"ß-D-Fructosyltransferase"ein Polypeptid oder ein Protein, das die Synthese. eines hochmolekularen, aus sich wiederholenden Fructose- Einheiten bestehenden Kohlenhydrat-Polymers kataly-

sieren kann, wobei Saccharose als Ausgangssubstrat für die weitere Polymerisation dient. In dem so synthetisierten polymeren Produkt sind die sich wiederholenden Fructose-Einheiten über ß-1, 2- Bindungen miteinander verknüpft, so dass die Fruc- tosyltransferase, die die Synthese dieses Produktes katalysiert, auch als Inulinsucrase bezeichnet wer- den kann. Das synthetisierte, aus sich wiederholen- den Fructose-Einheiten bestehende hochmolekulare Polymer weist vorzugsweise eine lineare Struktur auf, kann einen terminalen, von einem Saccharose- Molekül stammenden Glucose-Rest enthalten und um- fasst mindestens zwei Fructose-Reste. Im Zusammen- hang mit der Erfindung wird dieses Kohlenhydrat als Polyfructan bezeichnet. Vorzugsweise handelt es sich bei dem synthetisierten Polyfructan um Inulin.

Die Nucleinsäure kann eine DNA-Sequenz, zum Bei- spiel Teil einer genomischen DNA-Sequenz, oder eine RNA-Sequenz, zum Beispiel eine mRNA-Sequenz oder ein Teil davon, sein. Die Nucleinsäure kann sowohl natürlichen Ursprungs sein, das heißt, sie kann beispielsweise aus Streptococcus mutans-Zellen iso- liert werden, als auch synthetischen Ursprungs sein.

Das erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül weist in der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Nucleinsäuresequenz, die die in SEQ ID Nr. 2 gezeigte Aminosäuresequenz codiert, mindestens eine Deletion ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) den Nucleotiden 4 bis 222, b) den Nucleotiden 1 bis 104 und c) den Nucle- otiden 2254 bis 2385 auf. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff"De-.

letion"eine Mutation verstanden, bei dem ein Teil der im Wildtyp-Gen vorhandenen Nucleinsäuresequenz fehlt. Deletionen können beispielsweise in vitro unter Verwendung von Restriktionsenzymen erzeugt werden, wenn der zu deletierende Bereich von geeig- neten Restriktions-Schnittstellen flankiert wird.

Deletionsmutationen lassen sich auch mit Hilfe be- stimmter Endonucleasen, beispielsweise unter Ver- wendung des Enzyms BAL-31, einführen. Derartige En- zyme bauen die Enden ab, die durch Restriktionsen- zym-Spaltung erzeugt wurden. Eine Deletionsmutage- nese kann aber auch unter Verwendung eines mutier- ten Primers in einer PCR-Reaktion erreicht werden.

Die Sequenz eines solchen Primers überspannt dabei den Bereich, der deletiert werden soll, wobei der Primer an zwei Bereiche einer Zielregion bindet, die den zu deletierende Bereich flankieren. Bei der Amplifikation wird also der vom Primer überspannte Bereich nicht erfaßt und somit nicht ämplifiziert.

Die erfindungsgemäßen Deletionen des Fructo- syltransferasegens betreffen vorzugsweise den 5'- Bereich. und den 3'-Bereich des nativen Fructo- syltransferase-Gens von Streptococcus mutans.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform mit einer Deletion im 5'-Bereich, die die Nucleotide 4 bis 222 umfasst, ist das Nucleinsäuremolekül mit der in SEQ ID Nr. 3 gezeigten Nucleinsäuresequenz, das ein Protein mit der in SEQ ID Nr. 4 gezeigten Aminosäu- resequenz codiert. Im Ursprungsorganismus S. mutans vermittelt eine Signalsequenz die Sekretion des En- zyms aus dem Cytoplasma, wobei die Signalsequenz während des Sekretionsvorgangs durch eine Signal-

peptidase abgespalten wird. Der Signalpeptid- abhängige Proteinexport, der bei grampositiven und gramnegativen Bakterien in ähnlicher Weise abläuft, ist ein komplexer energieabhängiger Prozeß, an dem eine Vielzahl löslicher und membrangebundener Pro- teine beteiligt sind (Schatz und Beckwith, Annu.

Rev. Genet., 24 (1990), 215). Bei einer angestreb- ten Überproduktion des Fructosyltransferase- Proteins in einem heterologen Wirtsorganismus könn- te die Signalsequenz insofern zu einer Beeinträch- tigung des Wachstums des Wirtes und somit zur Ver- ri'ngerung der Produktausbeute führen, wenn die Sig- nalsequenz auch im heterologen Wirt funktionell ist und die produzierte Proteinmenge die Kapazität des Sekretionsmechanismus übersteigt und/oder wenn an- dere physiologische intra-oder extrazelluläre Pro- zesse im Bereich der Zellmembran durch das rekombi- nante Protein selbst oder durch die Sekretion des . rekombinanten Proteins gestört werden.

Eine vollständige Entfernung der das Signalpeptid codierenden Nucleinsäuresequenzen in dem Nuclein- säuremolekül mit der SEQ ID Nr. 3 führt zu einer vollständigen Entfernung des Signalpeptids, so dass die Expression des modifizierten Fructosyltransfe- rase-Proteins in einem heterologen Wirt zur intra- zellulären Produktion des Genprodukts führt. Durch die intrazelluläre Produktion der Fructosyltransfe- rase werden die Wachstumsstörungen, die bei Wirts- systemen, die das native Fructosyltransferase- Protein exprimieren, nahezu vollständig beseitigt und das gewünschte Proteinprodukt kann in hohen Vo- lumenausbeuten gewonnen werden.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform für eine Deletion im 3'-Bereich des nativen Fructosyltranbs- ferasegens ist das Nucleinsäuremolekül mit der in SEQ ID Nr. 7 gezeigten Nucleinsäuresequenz, das ein Polypeptid mit der in SEQ ID Nr. 8 gezeigten Amino- säuresequenz codiert. Bei diesem Nucleinsäuremole- kül sind die Nucleotide 2254 bis 2385 deletiert.

Dieser Bereich weist einen hohen Hydropathie-Index auf, wie mittels des Verfahrens von Kyte und Doo- little (J. Mol. Biol., 157 (1982), 105-142) gezeigt wurde. Obwohl diesem hydrophoben Bereich keine di- rekte Funktion zugeordnet werden kann, zeigen hete- rologe Wirtssysteme bei der Expression eines sol- chen modifizierten Fructosyltransferase-Proteins gegenüber Wirtszellen, die das native Fructo- syltransferase-Protein exprimieren, ein erheblich verbessertes Wachstumsverhalten. Das modifizierte Protein kann ebenfalls in hohen Volumenausbeuten isoliert werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die im 5'-Bereich des Fructosyltransferasegens de- letierten Sequenzen durch den Sequenzbereich eines anderen Gens ersetzt. In einer besonders bevorzug- ten Ausführungsform handelt es sich bei dem anderen Gen um das lacZa-Gen. Im Zusammenhang mit der vor- liegenden Erfindung bedeutet der Begriff"Erset- zen", dass die das Signalpeptid codierenden ftf- Sequenzen vollständig oder teilweise durch äquivalente Sequenzen eines anderen Gens ersetzt werden können. Bei Verwendung des lacZa-Gens werden also äquivalente Sequenzen dieses Gens mit dem am 5'-Ende deletierten Fructosyltransferasegen fusio- niert. Ein besonders bevorzugtes Beispiel dafür ist

das Nucleinsäuremolekül mit der in SEQ ID Nr. 5 ge- zeigten Nucleinsäuresequenz, das eine in SEQ ID Nr.

6 dargestellte Aminosäuresequenz codiert. Bei die- ser ftf-Genvariante wurden die Nucleotide 1 bis 104 der nativen Fructosyltransferase-Nucleinsäure- sequenz gegen die Nucleotide 1 bis 83 des lacZa-Gen ausgetauscht. Das Nucleinsäuremolekül weist daher gegenüber der nativen ftf-Sequenz eine Deletion der Nucleotide 1 bis 104 auf. Der Austausch am 5'-Ende führt bei einer Expression des Fusionsproteins in heterologen Wirtssystemen zur einer Lokalisation des Genproduktes im periplasmatischen Raum. Mit ei- nem solchen Plasmid transformierte Wirtszellen zei- gen daher gegenüber das Wildtyp-ftf-Gen enthalten- den heterologen Wirtszellen ein deutlich verbesser- tes Wachstum und das Fusionsprotein kann ebenfalls in hohen Volumenausbeuten gewonnen werden.

Weitere bevorzugte Ausführungsformen sind das Nuc- leinsäuremolekül mit der in SEQ ID Nr. 9 gezeigten Nucleinsäuremolekül, das eine in SEQ ID Nr. 10 dar- gestellte Aminosäuresequenz codiert, und das Nuc- leinsäuremolekül mit der in SEQ ID Nr. 11 gezeigten Nucleinsäuresequenz, das eine in SEQ ID Nr. 12 dar- gestellte Aminosäuresequenz codiert. Das Nuclein- säuremolekül mit der SEQ ID Nr. 9 weist am 5'-Ende eine Deletion der Nucleotide 4 bis 222 auf und am 3'-Ende eine Deletion der Nucleotide 2254 bis 2385.

Bei dem Nucleinsäuremolekül mit der SEQ ID Nr. 11 sind die Nucleotide 1 bis 104 durch die Nucleotide 1 bis 83 des lacZa-Gen ersetzt worden und das 3'- Ende weist ebenfalls eine Deletion der Nucleotide 2254 bis 2385 auf. Beide ftf-Genvarianten führen bei Expression der entsprechenden Genprodukte in

heterologen Wirtssystemen zu einer deutlichen Ver- besserung des Wachstums, wobei die entsprechenden Genprodukte in hohen Volumenausbeuten gewonnen wer- den können.

Die Erfindung umfasst ebenfalls modifizierte Nuc- leinsäuremoleküle, die beispielsweise durch Substi- tution, Addition, Inversion und/oder Deletion einer oder mehrerer Basen eines erfindungsgemäßen Nuc- leinsäuremoleküls erhältlich sind, das heißt also auch Nucleinsäuremoleküle, die als Mutanten, Deri- vate und funktionelle Äquivalente, also struktur- verschiedene aber funktionsidentische oder funkti- onsähnliche Abwandlungen eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls bezeichnet werden können. Die Sequenz von Nucleinsäuremolekülen kann beispiels- weise weiter gezielt modifiziert werden, um inner- halb der Nucleotidsequenz geeignete Restriktions- schnittstellen zu erzeugen öder nicht erforderliche Sequenzteile zu entfernen. Die Modifikationen der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle können mit Hilfe von Standardverfahren der Mikrobiolo- gie/Molekularbiologie erfolgen. Dazu werden die entsprechenden Nucleinsäuren in Plasmiden inseriert und Mutagenese-Verfahren oder einer Sequenzverände- rung durch Rekombination unterworfen. Zur Erzeugung von Insertionen, Deletionen. oder Substitutionen, wie Transitionen oder Transversionen, eignen sich beispielsweise Verfahren zur in vitro-Mutagenese, "Primer repair"-Verfahren sowie Restriktions- und/oder Ligationsverfahren (vergleiche Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manuel, 2. Auflage (1989), Cold Spring Harber Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA). Weitere Sequenzverän-

derungen lassen sich auch durch Anlagerung natürli- cher oder synthetischer Nucleinsäuresequenzen er- reichen.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Vektoren, die die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle ent- halten. Bei den Vektoren handelt es sich vorzugs- weise um Plasmide, Cosmide, Viren, Liposomen, Bak- teriophagen, Shuttle-Vektoren und andere in der Gentechnik üblicherweise verwendete Vektoren. Die erfindungsgemäßen Vektoren können weitere funktio- nelle Elemente. enthalten, die eine Stabilisierung und/oder Replikation des Vektors in einer Wirtszel- le bewirken oder zumindest dazu beitragen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform um- fasst die vorliegende Erfindung Vektoren, bei denen mindestens ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremole- kül unter der funktionellen Kontrolle von mindes- tens einem regulatorischen Element steht. Erfin- dungsgemäß werden unter dem Begriff"regulatori- sches Element"solche Elemente verstanden, welche die Transkription und/oder Translation von Nuclein- säuremolekülen in prokaryontischen und/oder eukary- ontischen Wirtszellen gewährleisten, so dass ein Polypeptid oder Protein exprimiert wird. Bei regu- latorischen Elementen kann es sich um Promotoren, Enhancer, Silencer und/oder Transkriptionstermina- tionssignale handeln. Regulatorische Elemente, die mit einer erfindungsgemäßen Nucleotidsequenz, ins- besondere den Protein-codierenden Abschnitten die- ser Nucleotidsequenz, funktionell verbunden sind, können Nucleotidsequenzen sein, die aus anderen Or- ganismen oder anderen Genen stammen als die Prote-

in-codierende Nucleotidsequenz selbst. Beispiele davon sind : T7, T3, SP6 und weitere gebräuchliche Regulationselemente zur in vitro-Transkription ; PLAC, PLtet und weitere gebräuchliche Regulationsele- mente zur Expression in E. coli ; GAL1-10, MET25, CUP1, ADH1, AFH1, GDH1, TEF1, PMA1 und andere Regu- lationselemente zur Expression in der Bäckerhefe S. cerevisiae ; Polyhedrin zur Expression in Baculovi- rus-Systemen ; Pc PSV40 und weitere gebräuchliche Regulationselemente zur Expression in Säugerzellen ; gewebe-oder organspezifische-insbesondere spei- cherorganspezifische Promotoren, wie der Vicillin- Promotor aus Pisum sativum, der Arabidopsis- Promotor AtAAP1 oder der Patatin-B33-Promotor, zur Expression in pflanzlichen Systemen.

In einer weiteren Ausführungsform sieht die Erfin- dung vor, dass die erfindungsgemäßen Nucleinsäure- moleküle mit einer Signalsequenz fusioniert sind, welche ein Signalpeptid zur Aufnahme ins endoplas- matische Retikulum'einer Pflanzenzelle und zur Wei- terleitung in die Vakuole codiert. Eine vakuoläre Lokalisation der Genprodukte ist besonders vorteil- haft. Erfindungsgemäß können beispielsweise Signal- peptide zur vakuolären Lokalisation von Lektin aus Gerste, Signalsequenzen aus einem Patatin-Gen der Kartoffel oder Signalsequenzen von reifem Phytohä- maglutinin der Bohne verwendet werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgese- hen, dass die regulatorischen Elemente vom L- Rhamnose-Operon von Escherichia. coli stammen. In besonders bevorzugter Ausführungsform wird ein er- findungsgemäßes Nucleinsäuremolekül in die Expres-

sionskassette des Vektors pJOE2702 (Volff et al., 1996 ; Stumppet al., 2000) integriert. Die Expressi- onskassette umfaßt den Promotor rhap, der aus dem zweistufig regulierten L-Rhamnose-Operon rhaBAD von Escherichia coli stammt (Egan und Schleif, J. Mol.

Biol., 243 (1994), 821-829). Bei dem Vektor pJOE2702 handelt es sich also um einen über zwei Stufen positiv regulierbaren, L-Rhamnose- induzierbaren Expressionsvektor, der im Wirtsbakte- rium Escherichia coli in hoher Kopiezahl vorhanden ist. Die Transkriptionstermination und die Transla- tionsinitiation der Transkripte erfolgen ebenfalls über Sequenzen der im Vektor enthaltenen Expressi- onskassette. Gegenüber den meisten kommerziell er- hältlichen E. coli-Expressionsvektoren besitzt pJOE2702 zwei entscheidende Vorteile. Erstens führt der Vektor im nicht-induzierten Zustand zu einer sehr niedrigen Basisexpression des zu exprimieren- den Polypeptids. Zweitens wird die Transkription der Expressionskassette verzögert induziert. Der Vektor eignet sich daher insbesondere zur Clonie- rung und Produktion von Proteinen, die die Vitali- tät und die Wachstumseigenschaften der Wirtszelle negativ beeinflussen, wie beispielsweise von bakte- riellen Fructosyltransferasen. Obwohl Escherichia coli-Zellen, die den Vektor pJOE2702 mit dem voll- ständigen S. mutans-Fructosyltransferase-Gen ent- halten, nach Induktion eine vollständige Wachstums- hemmung zeigen, eignet sich der Vektor in besonde- rem Maße zur Expression der erfindungsgemäßen Nuc- leinsäuremoleküle, die am 5'-Ende und am 3'-Ende mindestens eine der erfindungsgemäßen Deletionen enthalten.

Die vorliegende Erfindung umfasst selbstverständ- lich auch Vektoren, die nicht nur eines, sondern mehrere der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle enthalten. Dabei können die Nucleotidsequenzen so angeordnet sein, dass gegebenenfalls ein, zwei oder mehrere der erfindungsgemäßen Nucleotidsequenzen, insbesondere der in SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 9 oder SEQ ID Nr. 11 beschrie- benen Sequenzen, von einem einzigen Satz regulato- rischer Elemente kontrolliert werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Wirtszellen, die eines oder mehrere der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle oder einen oder mehrere der erfindungsgemäßen Vek- toren umfassen, und die fähig sind, die von den Nucleinsäuremolekülen codierten Polypeptide mit der Aktivität einer Fructosyltransferase zu exprimie- ren. Bei den erfindungsgemäßen Wirtszellen kann es sich sowohl um prokaryontische als auch um eukary- ontische Zellen handeln. Bevorzugte Beispiele für prokaryotische Zellen sind Bakterien, wie zum Bei- spiel Escherichia coli oder Bacillus subtilis. Er- findungsgemäß bevorzugte Beispiele für eukaryonti- sche Wirtszellen umfassen Hefezellen, Insektenzel- len und Pflanzenzellen. Die erfindungsgemäße Wirts- zelle kann dadurch gekennzeichnet sein, dass die eingeführte erfindungsgemäße Nucleotidsequenz in Bezug auf die transformierte Zelle heterolog ist, das heißt, dass die eingeführte erfindungsgemäße Nucleotidsequenz natürlicherweise nicht in diesen Zellen vorkommt oder aber an einem anderen Ort in diesen Zellen oder aber in einer anderen Kopiezahl oder Orientierung im Genom dieser Zellen lokali-

siert ist als die entsprechende natürlicherweise auftretende Sequenz.

In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Wirtszelle um eine gramnegative Zelle, insbesondere um eine Escherichia coli-Zelle. In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung kann es sich aber auch um eine grampositive Zelle, beispielsweise um eine Bacillus-subtilis-Zelle handeln.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform han- delt es sich bei der erfindungsgemäßen Wirtszelle um eine eukaryontische Wirtszelle. In einer beson- ders bevorzugten Ausführungsform kann es sich bei der erfindungsgemäßen Wirtszelle um eine Hefezelle, zum Beispiel eine Saccharomyces cerevisiae-Zelle, handeln. Weitere bevorzugte Zellen Insektenzellen, beispielsweise die Insektenzelllinie IPLB-Sf21. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Wirtszelle um eine Pflanzenzelle, insbesondere um eine Zelle solcher Pflanzen, die natürlicherweise Polyfructane, insbesondere Inulin, erzeugen, wie beispielsweise eine Topinambur-, Ar- tischocken-oder Zichorienzelle, oder um Zellen von landwirtschaftlich bedeutsamen Pflanzen, die natür- licherweise andere Monosaccharide, Oligosaccharide und/oder Polysaccharide erzeugen, wie beispielswei- se eine Kartoffel-, Maniok-oder Zuckerrüben-Zelle.

Die Erfindung betrifft auch Zellkulturen, die min- destens eine der erfindungsgemäßen Wirtszellen auf- weisen, wobei eine erfindungsgemäße Zelllinie die Fähigkeit aufweist, ein Polypeptid oder Protein mit

der Aktivität einer Fructosyltransferase oder ein Fragment davon zu produzieren.

Die Erfindung betrifft auch Pflanzen, die in min- destens einer ihrer Zellen mindestens ein erfin- dungsgemäßes Nucleinsäuremolekül oder mindestens einen erfindungsgemäßen Vektor enthalten oder aber die mindestens eine, vorzugsweise jedoch eine Viel- zahl von Wirtszellen enthalten, die das erfindungs- gemäße Fructosyltransferasegen oder dieses enthal- tende Vektoren oder Plasmide aufweisen, und die in- folge dessen hochmolekulare Polyfructane, insbeson- dere hochmolekulares Inulin, erzeugen können. Die Erfindung ermöglicht also auch die Bereitstellung von Pflanzen der verschiedensten Arten, Gattungen, Familien, Ordnungen und Klassen, die aufgrund der eingeführten erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in der Lage sind, hochmolekulares Inulin zu erzeu- gen. Gegenüber den wenigen Pflanzen, die natürli- cherweise Inulin erzeugen können, ergibt sich der Vorteil, dass eine gezielte Lokalisierung des ge- bildeten Inulins möglich ist und dass zudem eine Erhöhung der Expressionsrate und damit der Menge an gebildeten Inulin erreicht wird. Zudem weist das in diesen transgenen Pflanzen erzeugte Inulin ein hö- heres Molekulargewicht auf als natürlicherweise ge- bildetes pflanzliches Inulin. Während natürlicher- weise erzeugtes pflanzliches Inulin durchschnitt- lich 10 bis 30 Fructoseeinheit pro Molekül auf- weist, kann das in transgenen Pflanzen gebildete Polyfructan mehr als 100 000 Fructoseeinheiten auf- weisen.

Die Erfindung betrifft auch ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül enthaltendes transgenes Ernte- und Vermehrungsmaterial der Pflanze sowie Teile oder Kalli einer erfindungsgemäßen Pflanze, zum Beispiel Speicherorgane, Früchte, Knollen, Rüben, Samen, Blätter, Blüten oder ähnliches.

Die Erfindung sieht insbesondere vor, dass die zu transformierende Pflanze entweder eine Pflanze ist, die natürlicherweise ein Polyfructan, insbesondere Inulin, erzeugen kann, vorzugsweise eine Topinam- bur-, Artischocken-oder Zichorien-Pflanze, oder eine landwirtschaftlich bedeutsame Nutzpflanze, die natürlicherweise Monosaccharide, Oligosaccharide oder Polysaccharide erzeugen kann, vorzugsweise ei- ne Kartoffel-, Maniok-oder Zuckerrüben-Pflanze.

Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstel- lung der vorgenannten Pflanzen, umfassend die Transformation einer oder mehrerer Pflanzenzellen mit einem Vektor der Erfindung, die Integration des in diesem Vektor enthaltenen Nucleinsäuremoleküls in das Genom der Pflanzenzelle (n) und die Regenera- tion der Pflanzenzelle (n) zu intakten, transfor- mierten Pflanzen, die ein hochmolekulares Polyfruc- tan, insbesondere Inulin erzeugen können.

Die Erfindung betrifft ebenfalls ein modifiziertes Polypeptid oder Protein mit der Aktivität einer Fructosyltransferase, das die Umwandlung von Sac- charose in ein Polyfructan, insbesondere. Inulin, mit furanosiden ß-1, 2-Bindungen katalysieren kann.

Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein, vorzugsweise isoliertes und vollständig gerei-

nigtes, Protein, das durch Expression eines erfin- dungsgemäßen Nucleinsäuremoleküles oder eines Frag- mentes davon in einer erfindungsgemäßen Wirtszelle oder einer erfindungsgemäßen Pflanze erhältlich ist und die vorgenannte biologische Aktivität aufweist.

Vorzugsweise besitzt das Protein die gleichen Ei- genschaften, insbesondere die gleiche Aktivität ei- ner Fructosyltransferase wie das Protein, das von einem Nucleinsäuremolekül mit der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Nucleotidsequenz codiert wird und dessen Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr. 2 gezeigt ist.

Vorliegende Erfindung umfasst auch isolierte und vollständig gereinigte monoclonale oder polyclonale Antikörper oder deren Fragmente, die mit einem er- findungsgemäßen Polypeptid oder Protein so spezi- fisch und mit einer solchen Affinität reagieren, dass unter Verwendung dieser monoclonalen oder po- lyclonalen Antikörper oder deren Fragmente mit Hil- fe üblicher immunologischer Verfahren beispielswei- se ein Nachweis eines erfindungsgemäßen Proteins möglich ist. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfasst daher monoclonale und polyclonale Antikörper, die spezifisch eine Struktur eines er- findungsgemäßen Polypeptids oder Proteins mit der Aktivität einer Fructosyltransferase identifizieren und/oder daran binden können. Bei einer solchen Struktur kann es sich um ein Protein, Peptid, Koh- lenhydrat, Proteoglycan und/oder einen Lipidkomplex handeln, das/der ein Teil des erfindungsgemäßen Proteins ist oder mit diesem in spezifischer Bezie- hung steht. Die Erfindung umfasst auch Antikörper, die gegen Strukturen gerichtet sind, die im Ergeb-

nis posttranslationaler Modifikationen des erfin- dungsgemäßen Proteines entstanden sind. Die Erfin- dung umfasst auch Fragmente derartiger Antikörper, wie beispielsweise Fc-oder F (ab') 2- beziehungswei- se Fab-Fragmente.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Antikör- per, die gegen einen erfindungsgemäßen Antikörper gerichtet sind, das heißt einen erfindungsgemäßen Antikörper identifizieren und daran binden können, so dass ein spezifischer Nachweis der erfindungsge- mäßen Antikörper möglich ist.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung von längerkettigen Polyfructanen mit linearer Struktur, wobei die Fructose-Einheiten in der Kette durch ß-1, 2-Bindungen verknüpft sind, und mit einem Polymerisationsgrad von mehr als 100 und einem Verzweigungsgrad von weniger als 3 %. In einer vorteilhaften Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Polyfructan aus erfindungsgemäß transfor- mierten transgenen Pflanzen, insbesondere aus deren Vakuolen, isoliert und aufgereinigt wird. Besonders bevorzugt ist die Isolierung und Gewinnung von Po- lyfructanen aus den Speicherorganen von Kartoffel-, Topinambur-, Artischocken-, Zichorien-, Maniok- oder Zuckerrüben-Pflanzen. Das Verfahren umfasst die mechanische Zerkleinerung größerer pflanzlicher Zellmasse mit Hilfe eines Turbinenmischers, bei- spielsweise eines Waring Blender, wobei das Zer- kleinern vorzugsweise in einem großen Volumen wäss- rigen Mediums bei tiefen Temperaturen, beispiels- weise +4°C, erfolgt. Der weitere Aufschluss kann mit Hilfe physikalischer Aufschlussverfahren, bei-

spielsweise mittels Ultraschall, einer"French press"-Vorrichtung, Mühlen oder Pressen, mit Hilfe chemischer Aufschlussverfahren, beispielsweise ei- ner Lyophilisation oder unter Verwendung von Deter- genzien oder unter Anwendung osmotischer Druckände- rung, oder mit Hilfe biologischer Aufschlussverfah- ren, beispielsweise unter Verwendung von die Zell- wand angreifenden Enzymen oder mittels einer Säure- /Lauge-Behandlung, erfolgen. In einer besonders be- vorzugten Ausführungsform erfolgt die Gewinnung des hochmolekularen Polyfructans durch Herstellung ei- nes wässrigen Extraktes, insbesondere der Speicher- organe, und anschließendes Fällen mit Alkohol.

Eine weitere vorteilhafte Ausführungsform des Ver- fahrens zur Herstellung von Polyfructanen sieht vor, dass erfindungsgemäße Wirtszellen, beispiels- weise pflanzliche Wirtszellen oder mikrobieile Wirtszellen, beispielsweise Escherichia coli- Zellen, in einem geeigneten Nährmedium und unter geeigneten Kulturbedingungen kultiviert und ver- mehrt werden. Anschließend wird das erzeugte Zell- material mit Hilfe geeigneter physikalischer, che- mischer und/oder enzymatischer Verfahren aufge- schlossen und die Proteine mit der Aktivität einer Fructosyltransferase werden aus dem Aufschlussmate- rial aufgereinigt. Die weitere Aufreinigung der en- zymatischen Aktivität erfolgt mit Hilfe üblicher auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren. Zur Gewin- nung eines Rohextraktes wird die Aufschlusslösung beispielsweise mit Hilfe von Extraktionsverfahren, Zentrifugationsverfahren und Filtrationsverfahren behandelt. Die Fällung der Proteine aus dem Rohex- trakt sowie Ultrafiltrationsverfahren sind effi-

ziente Verfahren zur Konzentrierung von Proteinen aus einer größeren Flüssigkeitsmenge. Als Fällungs- mittel kommen unter anderem anorganische Salze, beispielsweise Natrium-und Amoniumsulfat, organi- sche Lösungsmittel, beispielsweise Alkohole, und Polymere, beispielsweise Polyethylenglycol, zur An- wendung. Zur Abtrennung der verwendeten Fällung- mittel kann anschließend ein Dialyse-Verfahren durchgeführt werden. Eine weitere Feinreinigung kann mit Hilfe chromatographischer Verfahren und Verteilungsverfahren, beispielsweise unter Verwen- dung wässriger Phasensysteme, erfolgen. Zu diesen Verfahren zählen unter anderem Adsorptionschroma- tographie, Ionenaustauschchromatographie, Gel- Chromatographie und Affinitäts-Chromatographie.

Gegebenenfalls kann die isolierte Fructosyltransfe- rase auch mittels Adsorption an einem inerten oder an einem elektrisch geladenen, anorganischen oder organischen Trägermaterial immobilisiert werden.

Als Trägermaterial kommen anorganische Materialien, wie poröse Gläser, Silikagel, Aluminiumoxid, Hydro- xylapatit oder verschiedene Metalloxide, natürliche Polymere, beispielsweise Cellulose, Stärke, Algina- te, Agarose oder Collagen, oder synthetische Poly- mere, wie Polyacrylamid, Polyvinylalkohol, Methy- lacrylat, Nylon oder Oxirane zur Anwendung. Die Im- mobilisierung erfolgt dabei durch physikalische Bindungskräfte wie beispielsweise Van-der-Waals- Kräfte, hydrophobe Wechselwirkungen und ionische Bindungen. Die Immobilisierung der Fructosylferase kann auch mittels kovalenter Bindung an Trägermate- rialien erfolgen. Die Träger müssen dazu reaktive Gruppen aufweisen, die mit Aminosäure-Seitenketten

homöopolare Bindungen eingehen können. Geeignete Gruppen sind beispielsweise Carboxy-, Hydroxy-und Sulfidgruppen. Die Oberfläche von porösen Gläsern kann beispielsweise durch Behandlung mit Silanen aktiviert und anschließend mit Proteinen umgesetzt werden. Hydroxy-Gruppen natürlicher Polymere können mit Bromcyan und Carboxy-Gruppen mit Thionylchlorid aktiviert und anschließend mit Enzymen gekoppelt werden. Eine weitere Möglichkeit der Immobilisie- rung von Fructosyltransferasen besteht im Ein- schlussin dre. ldimensionalen Netzwerken. Ein Vor- teil dabei ist, dass die Enzyme innerhalb des Netz- werkes in freier, nicht gebundener Form vorliegen.

Poren der umgebenden Matrix müssen dabei klein ge- nug sein, um das Enzym zurückzuhalten.

Nach der Gewinnung der Fructosyltransferase aus den erfindungsgemäßen Wirtszellen, entweder als Rohex- trakt, in hoch aufgereinigter Form und/oder in im- mobilisierter Form an einem festen Träger wird eine Saccharoselösung unter geeigneten Bedingungen mit dem isolierten Enzym behandelt, wobei in vitro ein Polyfructan gebildet wird. Geeignete Bedingungen umfassen dabei eine geeignete Temperatur, vorzugs- weise 30°C, einen geeigneten pH-Wert, einen geeig- neten Puffer und geeignete Substratkonzentrationen.

Anschließend wird das gebildete Polyfructan aus dem Reaktionsansatz isoliert und aufgereinigt.

Die Erfindung betrifft ebenfalls das mit Hilfe der vorstehend genannten Verfahren hergestellte hochmo- lekulare Polyfructan. Das so hergestellte Polyfruc- tan ist durch eine vorwiegend lineare Struktur ge- kennzeichnet, wobei innerhalb der Kette Fructose-

Einheiten durch-1, 2-Bindungen verknüpft sind und wobei die Kette als Abschluss eine nicht- reduzierende a-D-Glucose-Einheit trägt. Das Po- lyfructan zeichnet sich durch einen sehr hohen Po- lymerisationsgrad von >100 und einen sehr niedrigen Verzweigungsgrad von <3 % aus. Aufgrund der gerin- gen Verzweigung enthält das so hergestellte Po- lyfructan nur sehr wenige endständige Glucose- Einheiten. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Po- lyfructan um Inulin, das durch ein hohes Molekular- gewicht von mehr als 1,5 Mio. Dalton gekennzeichnet ist.

Aufgrund des geringen Glucose-Gehaltes kann das er- findungsgemäß hergestellte Polyfructan, insbesonde- re Inulin, zur Herstellung von Fructooligosacchari- den verwendet werden, die sich als diätisches Le- bensmittel eignen.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung be- trifft daher auch Verfahren zur Herstellung von Fructooligosacchariden. In einer besonders bevor- zugten Ausführungsform der Erfindung wird das er- findungsgemäß hergestellte Inulin unter geeigneten Bedingungen mit einer immobilisierten oder nicht- immobilisierten geeigneten Endo-Inulinase behandelt und anschließend werden die erzeugten Fructooligo- saccharide aus dem Reaktionsansatz isoliert und aufgereinigt. Erfindungsgemäß wird unter einer"En- do-Inulinase"eine 2,1-ß-D-Fructan-Fructanhydrolase verstanden, das den Abbau von Inulin zu Fructooli- gosacchariden katalysiert, wobei die enzymatische Wirkung insbesondere. innerhalb der Polymerkette er- folgt. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfin-

dung werden unter Fructooligosacchariden Saccharide verstanden, die aus 2 bis 10 Fructoseeinheiten be- stehen, die ß-glycosidisch miteinander verbunden sind. Die verwendete Endo-Inulinase kann dabei in immobilisierter oder nicht-immobilisierter Form vorliegen. Die Immobilisierung der Endo-Inulinase kann dabei so erfolgen, wie vorstehend für die er- findungsgemäße Fructosyltransferase beschrieben.

Geeignete Bedingungen umfassen dabei eine geeignete Temperatur, vorzugsweise 30°C, einen geeigneten pH- Wert, einen geeigneten Puffer und geeignete Sub- stratkonzentrationen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Herstellung von Fructooligosacchari- den ist vorgesehen, dass eine Saccharoselösung in vitro unter geeigneten Bedingungen gleichzeitig mit einer erfindungsgemäß hergestellten immobilisierten oder nicht-immobilisierten Fructosyltransferase und einer immobilisierten oder nicht-immobilisierten Endo-Inulinase behandelt wird und anschließend die erzeugten Fructooligosaccharide aus dem in vitro Reaktionsansatz isoliert und aufgereinigt werden.

Die Erfindung betrifft daher ebenfalls Fructooligo- saccharide, die nach einem der vorstehend genannten Verfahren hergestellt wurden. Die mit Hilfe des er- findungsgemäßen Verfahrens hergestellten Fructooli- gosaccharide zeichnen sich insbesondere durch einen sehr niedrigen Glucose-Gehalt aus und sind daher in besonderem Maße als diätisches Lebensmittel, insbe- sondere für Diabetiker, geeignet. Während Fructoo- ligosaccharide, die aus Inulin von Topinambur her- gestellt wurden, einen Glucosegehalt von etwa 14

bis 20 % aufweisen und Fructooligosaccharide, die aus Inulin von Zichorien hergestellt wurden, einen Glucosegehalt von etwa 10 % enthalten, besitzen die erfindungsgemäß hergestellten Fructooligosaccharide einen Glucosegehalt von weniger als 3 %, vorzugs- weise von weniger als 1 %.

Die erfindungsgemäß hergestellten Fructooligosac- charide können darüber hinaus einer Hydrierung un- terworfen werden, wobei hydrierte Fructooligosac- charide hergestellt werden, die sich ebenfalls in besonderem Maße als diätisches Lebensmittel eignen.

Die Hydrierung der erfindungsgemäß hergestellten Fructooligosaccharide kann beispielsweise unter An- wendung höherer Drücke und Verwendung von Katalysa- toren erfolgen.

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung Ver- fahren zur Herstellung von Difruktosedianhydriden.

Difructosedianhydride sind als Nahrungsmittelzusatz von besonderem Interesse, da sie im Dünndarm unver- daulich sind und im Dickdarm eine ausgesprochen präbiotische Wirkung entfalten und dadurch nachhal- tig zu einer gesunden Darmflora und Darmwand bei- tragen.

In einer Ausführungsform der Erfindung ist vorgese- hen, dass erfindungsgemäß hergestelltes Inulin un- ter geeigneten Bedingungen gleichzeitig mit einer immobilisierten oder nicht-immobilisierten Endo- Inulinase und immobilsierten oder nicht- immobilisierten Zellen von Arthrobacter globiformis oder Arthrobacter ureafaciens behandelt wird. Dabei katalysiert die Endo-Inulinase, wie vorstehend aus-

geführt, die Umwandlung von Inulin in Fructooli, go- saccharide. Diese werden anschließend durch die Inulinfructotransferase von A. globiformis oder A. ureafaciens (Seki et al., Starch/Stärke, 40 (1988), 440-442) umgewandelt. Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung liegen die Zellen von A. globiformis oder A. ureafaciens in immobilisierter Form vor.

Zur Immobilisierung der Mikroorganismen können kul- tivierte inaktivierte Zellen nach geeigneter Copo- lymerisation, beispielsweise unter Zugabe eines neutralen Proteins und Vernetzung mit Glutardialde- hyd, direkt als Biokatalysatoren verwendet werden.

Ebenso ist es möglich, vitale Mikroorganismen in Polymere, zum Beispiel Carrageen, einzuschließen und anschließend eine Inkubation in einem geeigne- ten Nährmedium durchzuführen. Die Polymerpartikel können dann für den eigentlichen Prozess eingesetzt und gegebenenfalls durch erneute Inkubation auch wieder regeneriert werden. Ebenso besteht die Mög- lichkeit, Mikroorganismen in Form photovernetzter Polymere zu verwenden, wobei eine Mikroorganismen- Suspension mit den löslichen Präpolymeren in dünner Schicht durch Bestrahlung mit beispielsweise einer Tageslichtlampe polymerisiert wird.

Geeignete Bedingungen zur Herstellung von Difructo- sedianhydriden umfassen dabei eine geeignete Tempe- ratur, vorzugsweise 30°C, einen geeigneten pH-Wert, einen geeigneten Puffer und geeignete Substratkon- zentrationen.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des Verfah- rens zur Herstellung von Difructosedianhydriden sieht vor, dass eine Saccharoselösung gleichzeitig

mit einer immobilisierten oder nicht- immobilisierten erfindungsgemäßen Fructosyltransfe- rase, einer immobilisierten oder nicht- immobilisierten Endo-Inulinase und immobilisierten oder nicht-immobilisierten Zellen von Arthrobacter globiformis oder Arthrobacter ureafaciens behandelt wird und anschließend die erzeugten Difructosedian- hydride aus dem Reaktionsansatz isoliert und aufge- . reinigt werden.

In weiteren Ausführungsformen der Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäß hergestellten Inu- lins in verschiedenen Non-Food-Anwendungen vorgese- hen. Dabei wird das erfindungsgemäß hergestellte Inulin entsprechenden Derivatisierungs-Reaktionen unterworfen, wobei Inulinether und Inulinester her- gestellt werden. Die so hergestellten Inulinether und Inulinester können beispielsweise als polymere Tenside, Weichmacher oder Emulgatoren eingesetzt werden.

Die vorliegende Erfindung sieht ferner die Verwen- dung der erfindungsgemäß hergestellten Fructooligo- saccharide, der erfindungsgemäß hergestellten hyd- rierten Fructooligosaccharide und der erfindungsge- mäß hergestellten Difructosedianhydride als Lebens- mittelzusatz, diätisches Lebensmittel und als Tier- futterzusatz vor.

Die folgenden Figuren und Beispiele sollen die vor- liegende Erfindung näher erläutern, sollen jedoch nicht den Schutzumfang der Erfindung beschränken.

Figur 1 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmides pDHE113, dass das vollständige Fructosyltransferase (ftf)-Gen aus Streptococcus mutans DSM20523 mit der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Nucleinsäuresequenz im L- Rhamnose-induzierbaren Escherichia coli- Expressionsvektor pJOE2702 enthält.

Figur 2 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmides pDHE225, dass das modifizierte Fructosyltransfera- se-Gen aus Streptococcus mutans DSM20523 ftf (A4o222) mit der in SEQ ID Nr. 3 gezeigten Nuc- leinsäuresequenz, das am 5'-Ende um 219 Nucleotide verkürzt ist, im Expressionsvektor pJOE2702 ent- hält.

Figur 3 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmides pDH171, dass das Fusionsgen lacZa (1483) : : ftf (105 42388) mit der in SEQ ID NR. 5 gezeigten Nuclein- säuresequenz im Expressionsvektor pJOE2702 enthält, wobei das Fusionsgen 83 Nucleotide des lacZa-Gens vom Vektor pBluescript II KS+ und ein modifizier- tes, am 5'-Ende um 104 Nucleotide verkürztes Fruc- tosyltransferasegen aus Streptococcus mutans DSM20523 umfasst.

Figur 4 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmides pDH132, dass das modifizierte Fructosyltransferase- gen aus Streptococcus mutans DSM20523 ftf (A2254-+ 2385) mit der in SEQ ID Nr. 7 dargestellten Nuc- leinsäuresequenz im Expressionsvektor pJOE2702 ent- hält, wobei das Fructosyltransferasegen eine Dele- tion der Nucleotide 2254 bis 2385 aufweist.

Figur 5 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmides pDHE172, dass das modifizierte Fructosyltransfera- segen ftf (#4#222, A2254->2385) mit der in SEQ ID Nr. 9 dargestellten Nucleinsäuresequenz im Expres- sionsvektor pJOE2702 enthält, wobei das Fructo- syltransferasegen eine Deletion der Nucleotide 4 bis 222 sowie der Nucleotide 2254 bis 2385 auf- weist.

Figur 6 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmides pDHE143, dass das Fusionsgen lacZa (1-83) : : ftf (105->2388, A2254->2385) mit der in SEQ ID Nr. 11 dargestellten Nucleinsäuresequenz im Expressions- vektor pJOE2702 enthält, wobei das Fructosyltrans- ferasegen eine Deletion der Nucleotide 1 bis 104 und der Nucleotide 2254 bis 2385 aufweist und wobei der deletierte 5'-Bereich an 83 Nucleotide des lacZa-Gens fusioniert ist.

Das zu der erfindungsgemäßen Lehre gehörende Se- quenzprotokoll umfasst : SEQ ID Nr. 1 zeigt die 2388 Nucleotide umfassende DNA-Sequenz des ftf-Gens aus Streptococcus mutans DSM20523.

SEQ ID Nr. 2 zeigt die von SEQ ID Nr. 1 abgeleitete 795 Aminosäuren umfassende Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Fructosyltransferase-Proteins.

SEQ ID Nr. 3 zeigt die 2169 Nucleotide umfassende DNA-Sequenz des modifizierten Fructosyltransferase- Gens ftf (#4#222).

SEQ ID Nr. 4 zeigt die von SEQ ID Nr. 3 abgeleitete 722 Aminosäuren umfassende Aminosäuresequenz eines modifizierten Fructosyltransferase-Proteins.

SEQ ID Nr. 5 zeigt die 2367 Nucleotide umfassende DNA-Sequenz des Fusionsgens lacZa (1--83) : : ftf (105-->2388).

SEQ ID Nr. 6 zeigt die von SEQ ID Nr. 5 abgeleitete 788 Aminosäuren umfassende Aminosäuresequenz eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins.

SEQ ID Nr. 7 zeigt die 2256 Nucleotide umfassende DNA-Sequenz des modifizierten Fructosyltransferase- gens. ftf (A2254->2385).

SEQ ID Nr. 8 zeigt die aus SEQ ID Nr. 7 abgeleitete 751 Aminosäuren umfassende Aminosäuresequenz eines erfindungsgemäß modifizierten Fructosyltransferase- Proteins.

SEQ ID Nr. 9 zeigt die 2037 Nucleotide umfassende DNA-Sequenz des erfindungsgemäßen modifizierten Fructosyltransferasegens ftf (A4o222, A2254o2385).

SEQ ID Nr. 10 zeigt die aus SEQ ID Nr. 9 abgeleite- te 678 Aminosäuren umfassende Aminosäuresequenz ei- nes erfindungsgemäß modifizierten Fructosyltransfe- rase-Proteins.

SEQ ID Nr. 11 zeigt die 2235. Nucleotide umfassende DNA-Sequenz des erfindungsgemäßen Fusionsgens lacZa (1#83) : : ftf (105#2388, #2254#2385).

SEQ ID Nr. 12 zeigt die aus SEQ ID Nr. 11 abgelei- tete 744 Aminosäuren umfassende Aminosäuresequenz eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins.

SEQ ID Nr. 13 zeigt die Sequenz des Primers ftfl (upper).

SEQ ID Nr. 14 zeigt die Sequenz des Primers ftf2 (lower).

SEQ ID Nr. 15 zeigt die Sequenz des Primers ftf3 (upper).

SEQ ID Nr. 16 zeigt die Sequenz des Primers ftf4 (upper).

SEQ ID Nr. 17 zeigt die Sequenz des Primers ftf5 (upper).

SEQ ID Nr. 18 zeigt die Sequenz des Primers ftf6 (lower).

Beispiel 1 Clonierung des ftf-Gens aus Streptococcus mutans DSM20523 Zur Clonierung des Fructosyltransferase-Gens aus S. mutans DSM20523 wurde eine Polymerase- Kettenreaktion (PCR) durchgeführt, wobei der Primer ftfl (upper) mit der Sequenz : 5'- TATATATCATATGGAAACTAAAGTTAG-3'und der Primer ftf2 (lower) mit der Sequenz : 5'-

TAGGATCCTTATTTAAAACCAATGCT-3'verwendet wurden. Der Primer ftfl (upper) enthielt dabei eine NdeI- Restriktions-Schnittstelle und der Primer ftf2 (lower) enthielt eine BamHI-Restriktions- Schnittstelle. Chromosomale DNA aus S. mutans DSM20523, die mit Hilfe eines kommerziell erhältli- chen Reinigungs-Kits isoliert worden war, diente in der PCR-Reaktion als Template. Die PCR-Reaktion wurde in 40 ul Reaktionsvolumen mit je 8 pmol Pri- mer, 50 ng DNA-Template und 2,5 Einheiten Pwo- Polymerase in 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,85,25 mM KC1, 5 mM (NH4) SO4, 2 mM MgS04, 5% Dimethylsulfoxid, 0, 2 mM dATP, 0,2 mM dTTP, 0, 2 mM dGTP und 0,2 mM dCTP durchgeführt. Die PCR-Reakt-ion umfasste dabei die folgenden Schritte : 5-minütige Denaturierung bei 96°C, 5 Zyklen, umfassend jeweils eine 1- minütige Denaturierung bei 63°C, eine 30 Sekunden dauernde Primeranlagerung bei 40°C und eine 2 Minu- ten, 30 Sekunden dauernde Polymerisation bei 68°C, 25 weitere Zyklen, umfassend jeweils eine 1 Minute, 30 Sekunden dauernde Denaturierung bei 92°C, eine 1 Minute, 30 Sekunden dauernde Primeranlagerung bei 49°C und eine 2 Minuten, 30 Sekunden dauernde Po- lymerisation bei. 68°C, sowie eine 5-minütige Ab- schluss-Polymerisationsreaktion bei 68°C. Mit Hilfe der PCR-Reaktion wurde ein etwa 2, 4 kb großes Frag- ment amplifiziert. Das isolierte Fragment wurde mit den Restriktasen NdeI und BamHI gespalten und mit dem Vektor pJOE2702 (Volff et al., Mol. Microbiol., 21 (1996) 1037-1047 ; Stumpp et al., Biospectrum, 1 (2000) 33-36) ligiert, der mit den gleichen Restriktasen gespalten worden war. Die codierende Sequenz des ftf-Gens wurde somit im korrekten Le- seraster in die im Vektor enthaltene, L-Rhamnose-

induzierbare Expressionskassette cloniert, so dass die Transkription der insertierten Nucleinsäure un- ter der Kontrolle des in dem Vektor pJOE2702 ent- haltenen Promoters rhap steht. Die Transkripti- onstermination des ftf-Gens und die Translationsi- nitiation der Transkripte erfolgen ebenfalls über Sequenzen des Vektors. Anschließend wurde der E. coli-Stamm JM109 mit dem aus der Ligierung resul- tierenden Plasmid pDHE113 transformiert. Transfor- manten wurden dabei über Ampicillin-Resistenz se- lektiert.

Beispiel 2 Modifikationen des clonierten ftf-Gens aus Strepto- coccus mutans DSM20523 Zur Modifizierung des ftf-Genproduktes im Bereich des N-terminalen Signalpeptides wurden am 5'-OH- Ende des ftf-Gens Deletionen eingeführt oder Se- quenzbereiche ausgetauscht.

Zur Erzeugung des modifizierten Fructosyltransfera- se-Gens ftf (A4-222) wurde eine PCR-Reaktion mit dem Primer ftf3 (upper) mit der Sequenz : 5'- TATATATCATATGGAAACTCCATCAACAAATCCCG-3'und dem Pri- mer ftf2 (lower) durchgeführt. Der Primer ftf3 (up- per) enthält eine NdeI-Schnittstelle. Als Template wurde gereinigte DNA des Plasmides pDHE113, dass das clonierte vollständige ftf-Gen aus S. mutans DSM20523 enthält, verwendet. Die PCR-Reaktion wurde in 40 ul Reaktionsvolumen mit je 8 pmol Primer, 100 ng Plasmid-DNA-Template und 2,5 Einheiten Pwo- Polymerase in 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,85,25 mM

KC1, 5 mM (NH4) S04, 2 mM MgS04, 0,2 mM dATP, 0,2 mM dTTP, 0,2 mM dGTP und 0,2 mM dCTP durchgeführt. Die PCR-Reaktion umfasste die folgenden Schritte : eine 2-minütige Denaturierung bei 94°C, 25 Zyklen, um- fassend jeweils eine 1-minütige Denaturierung bei 93°C, eine Primeranlagerung für 1 Minute 30 Sekun- den bei 55°C und eine Polymerisation für 2 Minuten 20 Sekunden bei 68°C, und eine 5-minütige Ab- schlusspolymerisation bei 68°C. Das erhaltene, etwa 2,2 kb-PCR-Produkt wurde isoliert, mit NdeI und BamHI gespalten und in den Vektor pJOE2702 ligiert, der mit den gleichen Restriktionsenzymen gespalten worden war. Anschließend wurde der E. coli-Stamm JM109 mit dem aus der Ligierung resultierenden Plasmid pDHE225 transformiert. Das Genprodukt der Variante ftf (Al->222) ist gegenüber der Wildtyp- Sequenz am N-Terminus um 73 Aminosäuren verkürzt.

Zur Erzeugung des modifizierten Fusionsgens lacZa (1->83) : : ftf (105->2388) wurde eine PCR- Reaktion mit dem Primer ftf4 (upper) mit der Se- quenz : 5'-ATATATGTCGACGGCAGATGAAGCCAATTCAAC-3'und dem Primer ftf2 (lower) durchgeführt. Der Primer ftf4 (upper) enthält eine SalI-Schnittstelle. Als Template wurde eine gereinigte DNA des Plasmides pDHE113 verwendet, das eine Insertion des vollstän- digen ftf-Gens aus S. mutans DSM20523 enthält. Die PCR-Reaktion wurde durchgeführt, wie vorstehend be- schrieben. Das erhaltene, etwa 2,3 kb große PCR- Produkt wurde isoliert, mit den Restriktasen SalI und BamHI gespalten und in den Vektor pBluescript II KS+ cloniert, wobei der verkürzte ftf-Leserahmen am 5'-Ende mit dem Anfangsbereich des im Vektor enthaltenen lacZa-Leserahmens fusioniert wurde. An-

schließend wurde der E. coli-Stamm JM109 mit dem resultierenden Plasmid pDHE166 transformiert. In einem zweiten PCR-Schritt wurde das in dem Vektor pDHE166 enthaltene Fusionsgen lacZa (1983) : : ftf (105o2388) in den Expressionsvektor pJOE2702 um- cloniert. Dazu wurde eine PCR-Reaktion mit dem Pri- mer ftf5 (upper) mit der Sequenz : 5'- TATATATCATATGACCATGATTACGCCAAGC-3'und dem Primer ftf2 (lower) durchgeführt. Der Primer ftf5 (upper) enthält eine Schnittstelle für die Restriktase NdeI. Als Template wurde eine gereinigte DNA des Plasmides pDHE166 verwendet. Die PCR-Reaktion wurde durchgeführt, wie zuvor beschrieben. Das erhaltene etwa 2,4 kb große PCR-Produkt wurde isoliert, mit den Restriktasen NdeI und BamHI gespalten und in den Vektor pJOE2702 ligiert, der mit den gleichen Restriktasen gespalten worden war. Anschließend wurde der E. coli-Stamm JM109 mit dem aus der Li- gierung resultierenden Plasmid pDHE171 transfor- miert.

Zur Herstellung des modifizierten Fructosyltransfe- rase-Gens ftf (A225492385) wurde der PCR-Primer ftf6 (lower) mit der Sequenz : 5'- <BR> <BR> <BR> TTGGATCCTTATTTTTGAGAAGGTTTGACAG-3'in Kombination mit anderen der vorstehend beschriebenen Primer eingesetzt. Der Primer ftf6 (lower) enthält eine Schnittstelle für die Restriktase BamHI. Als Template wurde die gereinigte DNA des Plasmides pDHE113 verwendet. Die PCR-Reaktion wurde durchge- führt, wie vorstehend beschrieben. Danach wurde das Amplifikationsprodukt isoliert, mit den Restrikta- sen NdeI und BamHI gespalten und in den Vektor pJOE2702 ligiert, der zuvor mit den gleichen

Restriktasen gespalten worden war. Unter Verwendung der Primerkombination ftfl (upper/ftf6 (lower) wurde so das Plasmid pDHE132 erhalten, das das vorstehend beschriebene modifizierte ftf-Gen enthält.

Zur Erzeugung des modifizierten Fructosyltransfera- se-Gens ftf (A4-222, #2254#2385) wurde unter Ver- wendung der DNA des Plasmides pDHE113 als Template und den Primern ftf3 (upper) und ftf6 (lower) eine PCR-Reaktion durchgeführt. Nach Integration des Amplifikationsproduktes in den Vektor pJOE2702 wur- de das Plasmid pDHE172 erhalten.

Zur Herstellung des modifizierten Fructosyltransfe- rase-Gens lcZα(1#83) : : ftf (105-2388, 2254->2385) wurde unter Verwendung der DNA des Vektor pDHE113 und der Primer ftf4 (upper) und ftf6 (lower) eine PCR-Reaktion durchgeführt. Das erhaltene, etwa 2,2 kb große PCR-Produkt wurde über die Schnittstellen SalI und BamHI in den Vektor Bluescript II KS+ in- tegriert. Dabei wurde das Plasmid pDHE140 erhalten.

Anschließend wurde eine zweite PCR-Reaktion durch- geführt, wobei die Primer ftf5 (upper) und ftf6 (lower) sowie die DNA des Plasmides pDHE140 als Template verwendet wurden. Das erhaltene, etwa 2,3 kb große PCR-Produkt wurde isoliert, mit den Restriktasen NdeI und BamHI gespalten und in den Vektor pJOE2702 ligiert, der zuvor mit den gleichen Restriktasen gespalten worden war. Dabei wurde das Plasmid pDHE143 erhalten.

Beispiel 3 Heterologe Expression der verschiedenen Varianten des ftf-Gens in E. coli Zum Nachweis der Genprodukte in Rohextrakten des zur Expression verwendeten E. coli-Stammes JM109 wurden E. coli-Stämme, die eines der vorstehend hergestellten Plasmide beziehungsweise das Plasmid pJ0E2702 zur Kontrolle enthielten, kultiviert und induziert. Die Stämme wurden die Nacht über in 5 ml dYT-Vollmedium (Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2. Ausgabe (1989), CSH Labora- tory Press, Cold Spring Harbor, New York) mit 100 ug Ampicillin/ml bei 30°C im Brutroller vorkulti- viert. Mit der Übernachtkultur wurden je 50 ml dYT- Medium so angeimpft, dass die optische Dichte bei 600 nm (OD600) etwa 0,02 betrug. Dann wurden die Zellen in Erlenmeyerkolben auf dem Brutschüttler bis zu einer OD600 von 0,2 kultiviert. Zur Induktion des mit L-Rhamnose induzierbaren Promoters wurden 0, 2 % (Gew./Vol.) L-Rhamnose zum Medium gegeben.

Anschließend wurden die Zellen weitere 7 Stunden kultiviert. Nach der 7-stündigen Induktion wurden die Zellen mittels Zentrifugation, Waschen der Zel- len in 50 mM KH2PO4/K2HPO4-Puffer, pH-Wert 6,5, und anschließender Resuspension der Zellen in dem glei- chen Puffer geerntet. Danach wurde die Suspension auf einen OD60o-Wert von 10 eingestellt. Die Zellen wurden mittels Ultraschallbehandlung oder mittels French-Press-Behandlung aufgeschlossen. Anschlie- ßend wurden alle Extrakte mittels einer. 20- minütigen Zentrifugation bei 10000 x g behandelt.

Danach wurde der Gesamt-Proteingehalt nach Bradford (Bradford, Anal. Biochem., 72 (1976), 248-254) be- stimmt, wobei ein Rinderserumalbumin-kalibriertes Reagenz von Biorad (Biorad-Laboratories GmbH, Mün- chen) verwendet wurde. Zum Vergleich der Protein- muster der erhaltenen Rohextrakte mit dem Protein- muster der nicht-induzierten Kontrolle wurden die Extrakte elektrophoretisch in 7,5 % igen SDS- Polyacrylamid-Gelen aufgetrennt (Laemmli, Nature, 227 (1979) 680-685).

Die quantitative Bestimmung der Ftf-Aktivitäten er- folgte, indem die spezifischen Ftf-Aktivitäten in Rohextrakten gemessen wurden. Zellkultivierung, Zellaufschluss und die Herstellung der Rohextrakte wurden durchgeführt, wie vorstehend beschrieben. Da bei jedem Umsatz von einem Molekül Saccharose je- weils ein Molekül Glucose freigesetzt wird, wurde die Aktivität ermittelt, indem die pro Zeiteinheit freigesetzte Glucose-Menge ermittelt wurde. Die Be- stimmung der Ftf-Aktivitäten erfolgte über einen Zeitraum von 60 Minuten bei 30°C unter Verwendung einer etwa 1 bis 3 mE Fructosyltransferase enthal- tenden Rohextraktmenge in einem Volumen von 1 ml mit 100 mM Scr in 50 mM K2HPO4/KH2P04-Puffer, pH 6,5. Eine Einheit entspricht dabei der Freisetzung von 1 umol Glucose pro Minute in Gegenwart von 100 mM Saccharose bei 30°C und einem pH-Wert von 6,5.

Nach einer einstündigen Inkubation wurde die Reak- tion durch 10-minütiges Erhitzen bei 100°C beendet.

Danach erfolgte eine. 10-minütige Zentrifugation bei 10000 x g. Anschließend wurde in einem 100 ul- Aliquot die freigesetzte Glucose-Menge mit Hilfe des gekoppelten Glucoseoxidase (GOD)/Peroxidase

(POD)-Enzymtests (Werner et al., Z. Analyt. Chem., 252 (1970) 224-228) bestimmt. Dabei wurde der GOD- Perido-Test (Roche Diagnostics) verwendet, bei dem photometrisch die Oxidation des Farbstoffs 2,2'- <BR> <BR> <BR> Azino-di-(3-ethylbenzthiazolin-sulfonat) (ABTS@) nachgewiesen wird. Der Test wurde in einem Gesamt- volumen von 1 ml mit 80 ug/ml GOD, 10 ug/ml POD und 1 ug/ml ABTS° in 50 mM K2HP04/KH2P04-Puffer, pH-Wert 6,5, durchgeführt, wobei nach 30 Minuten die Ex- tinktion bei 578 nm gemessen wurde. Die Kalibrie- rung des Testes erfolgte mit Hilfe von Glucose- Standardlösungen. Die für die Rohextrakte der ver- schiedenen Expressionsstämme ermittelten Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

Tabelle 1 Spezifische Ftf-Aktivitäten im Rohextrakt von E. coli- Stämmen, die mit den erfindungsgemäßen Plasmiden trans- formiert wurden Spez. Ftf- Stamm, ftf-Induktionsdauer Aktivität Genvariante (50 ml dYT, 30°C) OD600 im Rohex- trakt [E/mg] E. coli (pJOE2702 6 h 5, 8 <0,1 E. coli (pDHE113), 3 h 1,6 1,8 ftf 6 h 2, 0 0,9 E. coli (pDHE132) 3 h 1,5 5,2 ftf(A2254-+2385) "6 h4, 9 7,8 E. coli (pDHE225), 3 h 1,7 0,5 ftf(A4->222) " 6 h 3, 8 2,6 E. coli (pDHE172) 3 h 1,7 1,5 ftf (#4#222, A2254->2385) " 6 h 5, 7 5,0 E. coli (pDHE171), 3 h 1, 8 1,7 lacZa (1-+83) : : ftf (105-+2388) " 6 h 4, 1 2,5 E. coli (pDHE143) 3 h 1,7 1,0 lacZa (1-83) : : ftf (105->2388) A2254-+2385) 6 h 5, 0 5,2 E. coli (pDHE140), 3 h 1,7 2,2 lacZα(1#83) : : ftf (105-+2388) (#2254#2385), in pBluescript KSII+ " 6 h 2. 9 1,0 Wie aus der Tabelle ersichtlich, zeigen E. coli- Stämme, die mit einem im Vektor pJOE2702 enthalte- nen, erfindungsgemäßen ftf-Nucleotidmolekül trans- formiert sind, nach einer Induktionsdauer von 6 h

gegenüber dem E. coli-Stamm, der das vollständige ftf-Gen enthält, ein deutlich erhöhte Zelldichte, d. h. das Wachstum dieser Stämme ist somit deutlich verbessert. Gleichzeitig ist auch die Volumenaus- beute des exprimierten Proteins gegenüber dem E. coli-Stamm mit dem vollständigen ftf-Gen deutlich erhöht.

Beispiel 4 Isolierung und Immobilisierung der Fructosyltrans- ferase Vorkultur 1 : 5 ml Medium (pro 1000 ml Wasser, pH 7,0,16 g Trypton, 10 g Hefeextrakt, 5 g NaCl und 100 mg Ampicillin) wurden mit dem Stamm E. coli JM109 (pDHE143) beimpft und 12 bis 15 Stunden bei 37°C unter Schütteln (150 Upm) inkubiert.

Vorkultur 2 : 200 ml des gleichen Mediums wurden mit 1 ml der Vorkultur 1 beimpft und 12 bis 15 Stunden bei 37°C unter Schütteln inkubiert.

Kultivierung im Fermenter und Expression der Fruc- tosyltransferase : 16 1 Medium, dem 0,2 % L-Rhamnose zur Expression der Fructosyltransferase zugesetzt worden waren, wurden mit 200 ml Vorkultur 2 beimpft und bei 30°C, 400 Upm und 0,5 vvm Luft etwa 12 Stunden, das heißt bis zu einer optischen Dichte (OD578) von etwa 0,6 oder mehr kultiviert.

Zellernte und Aufschluss : Die Zellen wurden mit ei- ner kontinuierlichen Zentrifuge, beispielsweise ei- ner Contifuge (Heraeus) bei 4°C und 24300 x g ab- zentrifugiert. Die Zellmasse wurde 1-mal mit 2000

ml eines 100 mM-Phosphatpuffers, pH-Wert 6,5, gewa- schen und dann in 100 ml Phosphatpuffer resuspen- diert. Anschließend wurden die Zellen im Homogeni- sator bei 800 bar aufgeschlossen. Danach wurde die Suspension 20 Minuten bei 17360 x g zentrifugiert, um Zelltrümmer von dem im Überstand vorliegenden Enzym zu trennen.

Immobilisierung : Der Rohextrakt wurde zunächst ge- friergetrocknet. Vom Lyophylisat wurden 23,6 g (ca.

10 g Protein) in 500 ml 1 M Phosphatpuffer, pH-Wert 6,5, gelöst und nach Zugabe von 100 g EUPERGITX C (Röhm) 94 Stunden bei Raumtemperatur unter Schüt- teln inkubiert. Das Ftf-Immobilisat wurde danach mit 50 mM Phosphatpuffer gewaschen.

Beispiel 5 Umsetzung von Saccharose mit dem Ftf-Protein zur Polyfructan-Herstellung 60 1 einer 10 % igen Saccharoselösung, pH-Wert 6,5, wurden nach Zugabe von 640 E Fructosyltransferase pro Liter Ansatzlösung 28 Stunden bei 30°C unter Rühren inkubiert, wobei ein Rohextrakt des E. coli- Stammes JM109 (pDHE143) verwendet wurde. Anschlie- ßend wurde die Lösung einer direkten Ultrafiltrati- on (Sartocon Mini ; 3 Module mit einem molekularen Rückhaltevermögen von 100 000 Dalton) ausgesetzt.

Das erhaltene Retentat von 4,5 1 wurde 2-mal mit jeweils 6 1 entsalztem Wasser verdünnt und schließ- lich auf 4,5 l konzentriert. Anschließend wurde Inulin mit Isopropanol (Endkonzentration 62 Gew.-%) ausgefällt. Der abgetrennte Niederschlag wurde mit

5 1 der gleichen Isopropanol-Lösung gewaschen und anschließend bei 45°C schonend getrocknet. Dabei wurden 0.36 kg eines weißen Produktes mit einem Trockensubstanzgehalt (TS) von 93 % erhalten. Bezo- gen auf den Saccharoseverbrauch wurde eine Ausbeute von 8,5 % erreicht. Das unter Verwendung des HPLC- GPC-Verfahrens ermittelte Molekulargewicht von Inu- lin beträgt 40 x 106 g/mol, wobei der Verzweigungs- grad 3 Mol% beträgt.

Beispiel 7 Umsetzung von Ftf-Inulin mit Endo-Inulinase zur Herstellung von Fructooligosacchariden 20 g des in Beispiel 6 erhaltenen Ftf-Inulins mit 95 % TS wurden nach Herstellung einer 1 % igen Lö- sung durch 15-minütiges Erhitzen bei 95°C und Ein- stellen des pH-Wertes auf 5,0 unter Verwendung von 0,1 molarer Essigsäure mit Endo-Inulinase (0,13 ml/Ansatz ; SP 168, Fa. Novo) 8 Stunden bei 50°C un- ter Rühren inkubiert. Nach Inaktivierung des Enzyms durch 15-minütiges Erhitzen bei 95°C wurden die ge- bildeten Fructooligosaccharide mittels Ultrafiltra- tion (Sartocon Mini, Modul mit einem molekularen Rückhaltevermögen von 10 000 Dalton) abgetrennt.

Das Permeat enthielt 7,5 g Fructooligosaccharide, während das auf 1 1 verdünnte Retentat entsprechend 11,6 g TS enthielt. Anschließend wurde das Retentat nach erneutem Einstellen des pH-Wertes mit Endo- Inulinase bei einem konstanten Enzym/Substrat- Verhältnis inkubiert, wie zuvor beschrieben. Dieser Vorgang wurde insgesamt 5-mal wiederholt. Mittels einer Gelpermeations-Chromatographie wurde in den vereinigten Permeaten die folgende Kettenlängenver- teilung bestimmt : DP 1 9, 5 % DP 2-5 50, 0 % _ DP6-10 18, 0 % DP 11-25 23, 5 % Summe : 100 %

Die Kohlenhydratzusammensetzung wurde wie folgt be- stimmt : 0,5 ml vereinigte Permeatlösung (1 % TS) wurden nach Zugabe von 0,5 ml 1 % iger Oxalsäure 2, 5 h bei 65°C hydrolysiert. Eine Analyse mittels des HPAEC-Verfahrens zeigte, dass Fructose der einzige Kohlenhydratbaustein war, das heißt bei den iso- lierten Oligosacchariden handelt es sich um homoo- ligomere Fructooligosaccharide vom Typ Fn mit n = 1-25.

Beispiel 8 Umsetzung von Saccharose mit dem Ftf-Protein und immobilisierter Endo-Inulinase Endo-Inulinase (beispielsweise SP 168 ; NOVO) wurde wie in Beispiel 5 für Fructosyltransferase be- schrieben, an EUPERGITs C (Röhm) immobilisiert. Zu 1 1 einer 10 % igen Saccharoselösung, pH-Wert 6,5, wurden bei 30°C 50 g immobilisierte Fructosyltrans- ferase (vergleiche Beispiel 2) und 20 g immobili- sierte Endo-Inulinase zugegeben und unter langsamen

Rühren inkubiert. Stündlich wurden Proben entnommen und auf den Saccharosegehalt überprüft. Sobald kei- ne Saccharose mehr nachweisbar war, war die Reakti- on beendet und die Enzyme wurden aus dem Ansatz mittels Filtration entfernt. Mittels Gelpermeati- ons-Chromatographie wurde die Zusammensetzung der dabei erhaltenen Produktlösung wie folgt bestimmt : DP 1 32, 5 % DP 2-5 35, 0 % DP 6-10 14, 0 % DP 11-25 18, 5 % Summe : 100,0 % Gegenüber Beispiel 7 wurden somit Produkte mit ei- nem wesentlich höheren Fructosegehalt erhalten.

Beispiel 9 Herstellung von hydrierten Fructooligosacchariden Die in den Beispielen 7 und 8 erhaltenen homooligo- meren Fructooligosaccharid-Gemische mit einer Ket- tenlänge von DP 1-DP 25 wurden durch Eindampfen auf jeweils einen Trockensubstanzgehalt von 10 % eingestellt. 450 ml jeder Lösung wurden in einem Laborautoklaven in Gegenwart von Raney-Nickel 10 Stunden mit Wasserstoff bei 150 bar und 80°C hyd- riert. Die dabei erhaltene Lösung wurde aus dem Au-

toklaven gepumpt, filtriert und mittels Ionenaus- tauscher gereinigt. Eine Analyse zeigte, dass die Lösung (Fructosyl) n-mannit, (Fructosyl) n-sorbit (n = 1-24) sowie Mannit und Sorbit, die aus der in der Ausgangslösung vorhandenen Fructose gebildet worden waren, enthielt. Mannit und Sorbit wurden mit Hilfe bekannter Chromatographie-Verfahren abgetrennt, so dass ein aus (Fructosyl) n-mannit und (Fructosyl) n- sorbit bestehendes Produkt erhalten wurde.

Beispiel 10 Umsetzung von Saccharose mit Fructosyltransferase, Endo-Inulinase und Arthrobacter ureafaciens zur Bildung von Difructosedianhydrid III Zellen des Stammes Arthrobacter ureafaciens ATCC 21124 wurden in vier Schüttelkolben mit jeweils 100 ml einer Nährlösung, enthaltend 8 g Zichorien- Inulin (Raftiline@), 2 g Na2HPO4, 1 g KH2P04, 1 g NH4N03, 0, 5 g MgSO4, 0,01 g Fe2S04, 0,03 g CaS04, 0,5 g Hefe-Extrakt in entsalztem Wasser, überimpft. Da- nach wurde eine 24-stündige Inkubation bei 27°C un- ter Schütteln bei 150 Upm durchgeführt. Danach wur- den die Zellen mittels Zentrifugation abgeerntet und in Polyvinylalkohol-Gelpartikeln immobilisiert.

Zu 1 1 einer 10 % igen Saccharoselösung, pH-Wert 6,5, wurden bei 30°C 50 g immobilisierte Fructo- syltransferase (vergleiche Beispiel 5) und 20 g im- mobilisierte Endo-Inulinase sowie immobilisierte A. ureafaciens-Zellen gegeben. Danach wurde bei 30°C

unter langsamem Rühren eine Inkubation durchge- führt. Es wurden stündlich Proben entnommen und auf den Saccharosegehalt überprüft. Sobald keine Sac- charose mehr nachweisbar war, war die Reaktion be- endet und die Enzyme wurden aus dem Ansatz mittels Filtration abgetrennt.

Eine HPLC-Analyse der erhaltenen Produktlösung zeigte die Bildung von 18 g DFA III.