Nach dem Stand der Technik sind als Nanostrukturen z. B. Koh- lenstoff-Nanokanäle bekannt. Allerdings ist deren Synthese bisher sehr aufwendig ; sie erfolgt üblicherweise mittels CVD.

Die chemische Funktionalisierung derartiger Nanoverbindungen ist bisher entweder nicht oder nur sehr eingeschränkt und mit aufwendigen Reaktionen möglich.

Aus Johnson, S. A., Ollivier, P. J. and Mallouk, T. E. Orde- red mesoporous polymers of tunable pore size from colloidal silica templates. Science 283,963-965 (1999) ist ein Verfah- ren zur Herstellung von organischen Nano-Kanälen auf der Grundlage eines Templates bekannt. Damit können Nano-Kanäle mit einem Durchmesser von 5 bis 35 nm hergestellt werden.

Die synthetische Herstellung metallischer Nanokanäle ist bis- her nicht gelungen. Es wird erwartet, daß metallische Nanoka- näle als hervorragende Bauteile im Bereich der Quanten- Elektronik dienen können. Die geringe Dicke der metallischen Wandungen läßt erwarten, daß auch im Bereich der Hochfre- quenz-Technik ein besonderer Bedarf an derartigen Bauteilen besteht.

Aufgabe der Erfindung ist es, die Nachteile nach den Stand der Technik zu beseitigen. Es soll insbesondere ein möglichst einfaches Verfahren zur Herstellung regelmäßiger Nanostruktu- ren angegeben werden.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1 und 41 bis 43 gelöst. Zweckmäßige Weiterbildungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 39 sowie 44 und 45.

Nach Maßgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von regelmäßigen Nanostrukturen mit folgenden Schritten vor- gesehen : a) Bereitstellen von kanalbildenden Proteinen aus Gram- positiven Bakterien und b) Aufbringen der kanalbildenden Proteine auf ein Sub- strat.

Unter den kanalartigen Proteinen werden solche Proteine ver- standen, die natürlicherweise insbesondere in der Zellwand der Gram-positiven Bakterien vorkommen.

Kanalbildende Proteine aus Gram-positiven Bakterien zeigen eine ungewöhnliche chemische und thermische Stabilität, die eine Herstellung von Nanostrukturen mit verringertem Aufwand ermöglicht. Kanalbildende Proteine lassen sich z. B. in orga- nischen Lösungsmitteln, wie CHCl3/MeOH, lösen, ohne zu dena- turieren. Außerdem lassen sie sich mit Aceton fällen oder in Detergentien kochen, ohne zu denaturieren. Die Fähigkeit zur Kanalbildung bleibt dabei überraschenderweise erhalten.

Durch Aufbingen kanalbildender Proteine aus Gram-positiven Bakterien lassen sich durch Aufbringen auf ein Substrat auf relativ einfach Nanostrukturen herstellen. Das Verfahren bzw. die damit hergestellten Nanostrukturen weisen die folgenden Vorteile auf :

aa) Jede beliebige Stelle des kanalbildenden Proteins kann durch Mutation des kodierenden Gens modifiziert werden, d. h. seine chemischen und physikalischen Eigenschaften können lo- kal verändert werden. Neben der Änderung protein-spezifischer Eigenschaften können Veränderungen vorgenommen werden, welche die Selbstassemblierung oder die Assoziation mit anderen Ma- terialien verbessern. Das ermöglicht u. a. die Konstruktion von Komponenten für elektronische oder physikalische Geräte. bb) Die Eindringtiefe des Lichts ist bei Proteinen besser als bei den meisten anderen Materialien. Das ermöglicht die Durchführung von photochemische Reaktionen im Innern von ka- nalbildenden Proteinen. cc) Kanalbildende Proteine besitzen meistens Ladungen an der Oberfläche, welche eine Selbstassemblierung an Elektroden und dadurch die Durchführung von elektrochemischen Reaktionen wie z. B. die Abscheidung von Metallen ermöglichen.

Nach einer Ausgestaltung kann eine das kanalbildende Protein enthaltende Lösung auf das Substrat gesprüht werden. An- schließend wird zweckmäßigerweise die Oberfläche des Sub- strats, vorzugsweise im Hochvakuum, und bei einer vorgegebe- nen Temperatur oder einem vorgegebenen Temperaturgradienten dehydratisiert wird. Mit dem vorgeschlagenen Verfahren kann das kanalbildende Protein einfach reproduzierbar auf das Sub- strat aufgebracht werden.

Nach einer weiteren Ausgestaltung kann das mit dem kanalbil- denen Protein versehene Substrat in eine metall-ionenhaltige Lösung getaucht und einer Elektrolyse ausgesetzt werden. Da- bei sind in der Lösung zweckmäßigerweise die aus der folgen- den Gruppe ausgewählten Ionen enthalten :

Cu2+Agi+,Au3+Fe2+,Fe3+,Co2+,Co3+,Ni3+,Ru2+,Ru3+,Rh3+, Pt2+, Pd2+, Pb2+, Cd2+, Cr3+, Re2+ Die Dauer der Elektrolyse beträgt zweckmäßigerweise 10-20 Stunden, vorzugsweise 13-17 Stunden. Die vorgenannten Merk- male ermöglichen auf einfache Weise eine Metallisierung der kanalbildenden Proteine und/oder die Herstellung von metalli- schen Nanokanälen.

Insbesondere für elektronische Anwendungen kann es vorteil- haft sein, daß auf der aus kanalbildenden Proteinen gebilde- ten Schicht mindestens eine weitere aus Kunststoff, halblei- tendem oder metallischem Material gebildete Schicht elektro- chemisch aus einer Elektrolytlösung abgeschieden wird. Es kann zur Abscheidung der weiteren Schicht der Elektrolytlö- sung mindestens eine der folgenden Verbindungen zugesetzt werden : Fe2 (CO) lu, (Ru (bpy) 3) 2+-Diacetat oder TiCl3. Damit kön- nen im Nanomaßstab elektrotechnische Bauelemente hergestellt werden ; die Eigenschaft der weiteren Schicht kann durch ge- eignete Zusätze gezielt eingestellt werden.

Insbesondere zur Herstellung von Sensoren können an der In- nenseite des kanalbildenden Proteins zweckmäßigerweise fluo- rophore Moleküle angelagert oder chemisch gebunden werden.

Die fluorophoren Moleküle können aus der folgenden Gruppe ausgewählt sein : Substituierte aromatische Kohlenwasserstof- fe, vorzugsweise Naphtalin, Anthracen, Pyren, heterocyclische Verbindungen, vorzugsweise Fluorescein, Ruthenium (II)- polypyridylkomplexe.

Zweckmäßig ist es, daß das Substrat aus einem der folgenden Materialien gebildet ist : Graphit, Kunststoff, Metall, Glas, Keramik.

Nach einem weiteren verfahrensgemäßen Ausgestaltungsmerkmal werden die kanalbildenden Proteine gelöst in einem Pufferge- misch auf das Substrat aufgebracht. Dabei kann dem Pufferge- misch ein Monomer zugesetzt sein. Dem Puffergemisch kann fer- ner ein Dien, vorzugsweise Divinylbenzol, 2,3-Diphenyl- butadien und/oder ein Präpolymerisat oder ein Polymer zuge- setzt sein.

Zur Herstellung insbesondere von Nanopartikeln und Nanostruk- turen ist es zweckmäßig, daß das kanalbildende Protein in Li- posomen, Micellen oder in den Tröpfchen einer Emulsion, vor- zugsweise einer Mikroemulsion, aufgenommen ist.

Das mit kanalbildenden Proteinen beschichtete Substrat kann einer Bestahlung mit elektromagnetischen Wellen ausgesetzt und/oder mit Elektronen bestrahlt werden. Dadurch können die Eigenschaften des kanalbildenden Proteins gezielt beeinflußt werden.

Als besonders vorteilhaft wird es angesehen, das kanalbilden- de Protein durch heterologe Expression oder durch Aufreini- gung aus Mykobakterien zu gewinnen. Ein solche Gewinnung ist besonders effizient. Sie bietet die Möglichkeit einer weitge- henden Automatisierung der chromatographischen Aufreinigung und ermöglicht eine drastisch erhöhte Ausbeute.

Das Gram-positive Bakterium kann ein mindestens eine Mycol- säure enthaltendes Bakterium sein. Nach einer Ausgestaltung ist das Bakterium ein Mykobakterium, vorzugsweise Mycobacte- ri um smegma ti s.

Das kanalbildende Protein kann ein Porin sein. Bevorzugt wird ein Porin, das gegenüber organischen Lösungsmitteln chemisch stabil und/oder bis zu einer Temperatur von 80°C, vorzugswei-

se 100°C, thermisch stabil ist. Das Porin ist vorzugsweise MspA. Dieses Protein eignet sich wegen seinen überraschenden chemischen und thermischen Stabilität besonders gut zur Her- stellung von Nanostrukturen. Zur weiteren Erhöhung der Aus- beute kann das kanalbildende Protein durch Überexpression, vorzugsweise aus E. coli oder Mycobakterien, gewonnen werden.

Zweckmäßigerweise wird zur Expression ein für ein kanalbil- dendes Protein, vorzugsweise ein Porin, codierendes Gen be- nutzt. Vorteilhaft ist es weiter, daß zur Überexpression ein mspA-Gen gemäß Sequenz 1 (siehe unten) benutzt wird. Zur Ex- pression kann insbesondere aber auch ein von der Sequenz 1 abgeleitetes mutiertes Gen benutzt werden, wobei die Mutation so ausgebildet ist, daß die chemische und thermische Stabili- tät sowie die kanalartige Struktur des exprimierten Proteins im wesentlichen denen von MspA entspricht. Die Mutation kann auch im wesentlichen in einer Angleichung der Codons von mspA an die Codons der in E. coli hoch exprimierten Gene bestehen.

Zur Überexpression kann ferner ein mutiertes mspA-Gen benutzt werden, wobei die Mutation im wesentlichen darin besteht, daß der GC-Gehalt auf weniger als 66% vermindert ist.-Die Anpas- sung der Codon-Benutzung verbessert die Überexpression von MspA in E. coli erheblich.

Durch Herstellung des kanalbildenden Proteins MspA aus E. co- li kann die Ausbeute gegenüber dem oben beschriebenen Verfah- ren zur Präparation des nativen Proteins noch einmal um den Faktor 10 bis 20 gesteigert werden.

Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, zur Überexpression das synmspA-Gen gemäß Sequenz 4 zu benutzen. Dazu kann ein zur Überexpression in E. coli geeigneter Vektor verwendet werden, in den das synmspA-Gen gemäß Sequenz 4 eingesetzt ist. Solche geeigneten Vektoren sind z. B. von Hannig, G. und Makrides, S. C. in Trends in Biotechnology, 1998, Vol. 16, pp54 be-

schrieben. Der Offenbarungsgehalt dieses Dokuments wird hier- mit einbezogen.

Es hat sich weiter als vorteilhaft erwiesen, das kanalbilden- de Protein mittels nicht-ionischer oder zwitterionischer De- tergentien aus der Zellwand von Gram-positiven Bakterien zu gewinnen. Die Detergentien können aus der folgenden Gruppe ausgewählt sein : Isotridecylpoly (ethyleneglycolether) n ; Al- kylglucoside, insbesondere Octylglucosid ; Alkylmaltoside, insbesondere Dodecylmaltosid ; Alkylthioglucoside, insbesonde- re Octylthioglucosid, Octyl-Polyethylenoxide und Lauyldiam- minoxid.

Es kann dabei zweckmäßigerweise eine zweifache kritische micellare Konzentration (CMC) in einem Phosphatpuffer (100 mM Na2HP04/NaH2PO4, pH 6.5,150 mM NaCl) eingestellt werden.- Die zwitterionischen und nicht-ionischen Detergentien lösen insbesondere das kanalbildende Protein MspA sehr selektiv und mit guter Ausbeute aus der Zellwand von M. smegmatis.

Weiter ist es vorteilhaft, daß die Temperatur bei der Extrak- tion zwischen 80 und 110°C, vorzugsweise zwischen 90 und 100 °C, und/oder die Extraktionszeit 5 bis 120 Minuten, vorzugs- weise 25-35 Minuten, beträgt. Zweckmäßigerweise kann ein Puffer mit einer Ionenstärke von mehr als 50 mM NaCl oder Na- Phosphat benutzt werden.

Insbesondere eine Durchführung der Extraktion bei 100 C, die Verwendung eines Puffers mit hoher Ionenstärke sowie zwitte- rionischer und nicht-ionischer Detergentien verbessern das Extraktionsverfahren für Porine aus Mycobacterium smegmatis.

Dieses Extraktionsverfahren bietet Vorteile gegenüber den bisherigen Verfahren zur Aufreinigung solcher Proteine, näm- lich :

i) Verzicht auf organische Lösungsmittel ii) geringe Verunreinigungen mit anderen Proteinen iii) effiziente Extraktion Von besonderem Vorteil ist es, MspA zur Aufreinigung in Dime- thylsulfoxid bei einer Temperatur im Bereich von 50-110 °C zu lösen ; danach kann die Lösung vom Rückstand getrennt und MspA durch Abkühlen ausgefällt werden. Durch heterologe Ex- pression gewonnenes MspA kann durch Anlegen einer Gleichspan- nung renaturiert werden. Zweckmäßig ist das Anlegen einer Gleichspannung im Bereich von 50 V für eine Zeit von etwa 30 Minuten.

Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Nanostruktur herge- stellt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren.

Ferner wird als erfindungsgemäß die Verwendung kanalbildender Proteine aus Gram-positiven Bakterien zur Herstellung von Nanopartikeln oder von regelmäßigen Nanostrukturen auf Sub- straten und/oder eines für kanalbildende Proteine aus Gram- positiven Bakterien codierenden Gens zur Herstellung von Nanopartikeln oder regelmäßigen Nanostukturen auf Substraten beansprucht. Bei den kanalbildenden Proteienen kann es sich um Porine, vorzugsweise MspA, handeln.

Nachfolgend werden anhand der Figuren Beispiele der Erfindung erläutert. Es zeigen : Fig. 1 die Reinigung von MspA aus M. smegmatis in gelelek- trophoretischer Darstellung, Fig. 2 die Reinigung von MspA aus E. coli in gelelektro- phoretischer Darstellung, Fig. 3 die Konstruktion des Plasmidvektors pMN501,

Fig. 4 eine schematische Ansicht eine Vorrichtung zur Re- naturierung, Fig. 5 ein renaturiertes MspA in gelelektrophoretischer Darstellung, Fig. 6a-c elektronenmikroskopische Aufnahmen von aus MspA hergestellten Nanostrukturen und Fig. 7a-d die Herstellung von Nanostrukturen und Nanoparti- keln aus Polymethylmethacrylat.

Fig. 1 zeigt ein mit Coomassie Blau gefärbtes 10 % iges SDS- Polyacrylamidgel. Spur M : Massenstandard : 200,116,3,97,4, 66,3,55,4,36,5,31,21,5 und 14,4 kDa. Spur 1 : 40 g Prote- in eines aus M. smegmatis mit POP05-Puffer (100 mM Na2HP04/NaH2P04, pH 6,5,0,1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,5 % Oc- tylpolyethylenoxid (OPOE)) gewonnenen Extrakts. Spur 2 : 40 yg Protein aus dem Extrakt nach Fällung mit Aceton. Spur 3 : 4 Hg Protein aus vereinigten MspA enthaltenden Fraktionen einer Anionenaustauscher-Chromatographie. Spur 4 : 4 Hg Protein der MspA enthaltenden Fraktionen nach Fällung mit Aceton. Spur 5 : 4 tig Protein aus vereinigten MspA enthaltenden Fraktionen nach Größenausschluß-Chromatographie. Die Sequenzen des mspA- Gens, des mspA-Gens + Promotor sowie des MspA-Proteins mit vermuteter Signalsequenz sind im Sequenzprotokoll als Sequen- zen 1-3 wiedergeben.

Fig. 2 zeigt die Reinigung des Kanalproteins MspA aus E. coli. Die Proteine wurden mit einem 10 % igen SDS-Poly- acrylamidgel getrennt. Das Gel wurde mit Coomassie Blue ge- färbt. Spuren : (1) Lysat von E. coli BL21 (DE3)/pMN501 vor der Induktion durch IPTG. (2) Lysat von E. coli BL21 (DE3)/pMN501 nach der Induktion durch IPTG. (3) Massenstandard : 200,116, 97,66,55,36.5,31,21.5,14.4 kDa. Die Proben wurden 30 min bei 37 °C inkubiert, bevor sie auf das Gel aufgetragen wurden.

In Fig. 3 ist schematisch die Konstruktion des Plasmids pMN501 zur Überexpression von MspA in E. coli BL21 (DE3) dargestellt. Die verwendeten Abkürzungen bedeuten : lad : Gen codierend für den Laktose-Repressor nptI : Gen codierend für die Neomycinphosphotransferase ; sie vermittelt Kanamycinresistenz Ori : Replikationsursprung RBS : Ribosomenbindestelle Fig. 4 zeigt schematischen eine Vorrichtung zur Renaturierung von monomerem MspA. Eine Pipettenspitze aus Polyethylen von 5 cm Länge, dessen unteres Ende nach ca. 2 mm abgeschnitten wurde, wurde mit einer 1.7 % igen Agarose-Lösung (in TAE- Puffer) gefüllt. Eine Bleistiftmine (Typ : Eberhard Faber, 3H) wurde auf eine Länge von 5 cm gekürzt. Ein Polypropylengefäß ohne Deckel wurde mit 60 pl einer Lösung mit 5 Jg denaturi- ertem MspA gefüllt und die Pipettenspitze und die Blei- stiftmine in die Lösung gestellt. Dann wurde die Pipetten- spitze als Kathode und die Bleistiftmine als Anode angeschlossen.

Fig. 5 zeigt die Renaturierung von denaturiertem MspA. Die Proteine wurden mit einem 10 % igen SDS-Polyacrylamidgel getrennt. Das Gel wurde mit Silber gefärbt. Spuren : (M) Mas- senstandard : 116,97,66,55,36.5,31,21.5,14.4 kDa ; (1) 800 ng denaturiertes MspA (2) 800 ng MspA nach der Renatu- rierungsreaktion. Die Proben wurden 30 min bei 37 °C inku- biert, bevor sie auf das Gel aufgetragen wurden.

Die Fig. 6a bis c zeigen elektronenmikroskopische Aufnahmen von Modifikationen des Kanalproteins MspA aus M. smegmatis.

Die Herstellung der Proben erfolgt nach folgendem Protokoll :

Ein Milliliter einer Lösung des Kanalproteins MspA (c (MspA) = 17,2 x 10-9 mol/L, 100 mM Na2HPO4/NaH2PO4, pH 6,5,150 mM NaCl, 0,10 g/L SDS) werden bei 24,5°C in einem Ultraschallbad dispergiert. Zwischen der Flüssigkeitsoberfläche und der HOPG (Kohlenstoff)-Oberfläche (1,0 mm2) wird ein konstanter Ab- stand von 5,0 cm eingestellt. Die HOPG-Oberfläche wird für 20 Sekunden den dispergierten Flüssigkeitströpfchen ausgesetzt.

Die Fig. 7a bis d zeigen die Herstellung einer Nanstroktur und von Nanopartiklen aus Polymethylmethacrylat (PMMA). Zur Herstellung der Proben wird zunächst MspA gemäß Beispiel 5 auf die Oberfläche des Substrats aufgebracht. Dann wird die Oberfläche mit einer Lösung in Kontakt gebracht, die ein Ge- misch aus einem Puffer, einem Methylmethacrylat und 10% Poly- methylmethacrylat (MW=100.000) und Benzoin enthält. Die Lö- sung wird einer Elektronenstahlpolymerisation ausgesetzt. Es ist auch möglich, dem vorgenannten Gemisch MspA zuzusetzen und dieses unmittelbar auf des Substrat aufzuspühen. In den Fig. 7a bis d sind die gebildeten Strukturen in Abhängigkeit der Einwirkungszeit des Elektronenstrahl gezeigt. Insbesonde- re aus Fig. 7d sind die gebildeten Nanokänäle ersichtlich.

Die Nanokanäle sind mit Polymer bzw. Nanopartikeln verfüllt.

Beispiel 1 : Aufreinigung von MspA aus aus M. smegmatis.

10 g M. smegmatis (Naßgewicht) wurden mit PBS gewaschen, in 35 ml POP05-Puffer resuspendiert und unter Rühren für 30 Minuten in einem Wasserbad gekocht. Die Zellsuspension wurde für 10 Minuten auf Eis gekühlt und bei 4°C für 15 Miunten bei 27000 g zentrifugiert. 42 ml des Überstands wurden vorsichtig mit einem gleichen Volumen eisgekühlten Acetons gemischt. Die Mischung wurde eine Stunde auf Eis gekühlt und bei 4°C für 15 Minuten bei 8000 g zentrifugiert. Das ausgefällte Protein wurde in 10 ml 25 mM AOP05 (N- (2-Hydroxyethyl) piperazin-N'-2- ethansulfonsäure (Hepes), pH 7,5,10 mM NaCl, 0,5 % OPOE)

gelöst und auf eine Anionenaustauscher-Säule POROS 20HQ mit einem Volumen von 1,7 ml (Perseptive Biosystems, Cambridge, MA) geladen. Nach Waschen der Säule mit 14 ml AOP05 wurden gebundene Proteine mit einem Gradienten von 100% AOP05 bis 100 % BOP05 (25 mM Hepes, pH 7,5,2 M NaCl, 0,5 % OPOE) über 34 ml eluiert. Es wurden 90 1 ml-Fraktionen gesammelt und ge- lelektrophoretisch analysiert. MspA eluierte zwischen 0,48 und 0,74 M NaCl mit einem Peak bei 0,57 M NaCl. Die 4 Frak- tionen mit der höchsten MspA-Menge wurden vereinigt und mit Aceton gefällt. Das resultierende Pellet wurde in 600 Hl AOP05 aufgenommen, auf Eis inkubiert und bei 4°C für 5 Minuten zentrifugiert um unlösliches Material zu entfernen.

Die resultierende Proteinlösung wurde auf eine Superdex 200 Gelfiltrations-Säule mit einem Volumen von 24 ml (Pharmacia, Freiburg, Deutschland) aufgetragen. Proteine wurden mit 48 ml AOP05 bei einer Flußrate von 0,2 ml/Minute eluiert. 50 1 ml- Fraktionen wurden gesammelt und gelelektrophoretisch analy- siert. Fraktionen mit nahezu reinem MspA wurden vereinigt.

Die einzelnen Reinigungsstufen sind aus Fig. 2 ersichtlich.

Die Ausbeute beträgt 700 Hg. 1 Hg dieser Probe zeigte in einem silbergefärbten SDS-Polyacrylamidgel keinerlei Kontami- nationen mit anderen Proteinen (nicht gezeigt). MspA ist bis oder nahezu bis zur Homogenität aufgereinigt worden.

Beispiel 2 : Verfahren zur Präparation des Kanalproteins MspA aus E. coli Zur weiteren Erhöhung der Ausbeute an MspA wird eine Überex- pression des entsprechenden Gens vorgeschlagen. Zunächst wird das mspA-Gen kloniert, das für das Kanalprotein MspA aus My- cobacterium smegmatis mc2155 kodiert. Es wird das T7- Expressionssystem für die Überexpression des mspA-Gens ge- wählt.

Das mspA-Gen wird aus dem Plasmid pPOR6 über PCR amplifi- ziert. In der nativen mspA-Sequenz werden alle Codons verän- dert, die in stark exprimierten Genen aus Escherichia coli selten vorkommen. Im Sequenzprotokoll 4, sind alle eingeführ- ten Mutationen aufgelistet. Diese synmspA genannte DNA wird nach der Methode von Stemmer (Stemmer, W. P., Crameri, A., Ha, K. D., Brennan, T. M. and Heyneker, H. L. Single-step as- sembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides. Gene 164,49-53 (1995)) durch As- semblierung von Oligonucleotiden synthetisiert und anstelle des mspA-Gens in den Vektor pMN500 eingesetzt. Das resultie- rende Plasmid pMN501 (siehe Fig. 3) vermittelt in Zellen von E. coli BL21 (DE3) eine starke Expression von denaturiertem MspA-Monomer (20 kDa) nach Induktion mit IPTG. Das so expri- mierte MspA kann dem Sequnenzprotokoll 5 entnommen werden Beispiel 3 : Aufreinigung von MspA aus E. coli Ein Liter LB-Medium mit 30 pg/mL Kanamycin wird mit E. coli BL21 (DE3)/pMN500 beimpft und bei 37°C bis zu einer OD600 von 0.6 geschüttelt. Dann wird mit 1 mM IPTG induziert und die Zellen noch sechs Stunden bei 37°C bis zu einer OD600 von 2.2 geschüttelt. Die Zellen werden in 40 mL A-Puffer (25 mM He- pes, pH 7.5,10 mM NaCl) resuspendiert und durch zehnminüti- ges Kochen in Wasser aufgeschlossen. Nach einer zehnminütigen Inkubation auf Eis werden die Zelltrümmer und die ausgefalle- nen Proteine durch Zentrifugation bei 10000 g für 10 min ab- getrennt. Der Überstand wird an einem Anionenaustauscher (POROS HQ20) mit einem linearen NaCl-Gradienten von 10 mM bis 2 M NaCl getrennt. Denaturiertes MspA eluiert bei 350 mM NaCl. Um höhermolekulare Proteine abzutrennen, werden die Fraktionen mit MspA vereinigt und eine Gelfiltration durchge- führt. Die Ausbeute beträgt 10 mg MspA mit einer Reinheit von über 95 % (Daten nicht gezeigt).

Beispiel 4 : Elektrochemische Assemblierung des Kanalpro- teins MspA Durch die Überexpression von MspA in E. coli ist es zwar leicht möglich, das Kanalprotein mit einer guten Ausbeute zu isolieren. Das gewonnene Protein liegt zum großen Teil in in- aktiver Form vor. Die Überführung in die aktive Form bzw. Re- naturierung von monomerem MspA kann nach folgendem Protokoll erfolgen : Die Renaturierung findet in einer speziell für diesen Zweck entwickelten Apparatur gemäß Fig. 4 statt. Die Renaturie- rungsreaktion wird mit 5 jg MspA in monomerer Form in dieser Reaktionsapparatur durch Anlegen einer Spannung von 50 V für 30 min durchgeführt. Zum Schluß wird die Spannung für fünf Sekunden umgepolt, um an der Bleistiftmine adsorbiertes Porin wieder zu lösen.

Das Protein wird nach der oben beschriebenen Renaturierungs- reaktion in einem Proteingel untersucht (siehe Fig. 5). Dabei stellt sich heraus, daß ein großer Teil des Proteins zu oli- gomeren Einheiten assembliert ist. Durch Rekonstitutionsexpe- rimente kann gezeigt werden, daß das MspA in dieser Form wie- der hohe Kanalaktivität besitzt. Das beweist, daß die Renatu- rierung von MspA durch geringe Gleichspannungen möglich ist.

Diese Renaturierungsreaktion ist sehr einfach durchzuführen ; sie ist ein besonders vorteilhafter Bestandteil der Präpara- tion von funktionalem Kanalprotein MspA aus überproduzieren- den E. coli.

Beispiel 5 : Herstellung von Nano-Kanälen : Zur Konstituierung von lateralen Nanostrukturen auf Oberflä- chen durch das Aufbringen sehr geringer Mengen (~ 10 Dg cm-3)

des Kanalproteins MspA aus M. smegmatis wird folgendes Proto- koll vorgeschlagen : Das Kanalprotein MspA wird in einem geeigneten Puffer gelöst (c (MspA) = 17,2 x 10-9 mol L-1,100 mM Na2HP04/NaH2P04, pH 6.5,150 mM NaCl, 0.10 g L-1 SDS) und 1 mL bei 24.5 °C in ei- nem Ultraschallbad (elektrische Leistung : 10 W). Zwischen der Flüssigkeitsoberfläche und der HOPG (Kohlenstoff)-Oberflä- che (1.0 mm2) wird ein konstanter Abstand von 5.0 cm einge- stellt. Die HOPG-Oberfläche wird für 20 Sekunden den disper- gierten Flüssigkeitströpfchen ausgesetzt. Danach werden drei verschiedene Temperaturen zur Nachbehandlung gewählt : I : 24,5 °C, II : 28 °C, III : 35 °C. Die Nachbehandlungszeit beträgt in allen Fällen 15 min. Danach wird ein Hochvakuum angelegt (1 x 10-6 bar) und für 3 h dehydratisiert. Die entstandenen Struk- turen wurden mit Hilfe der durchstrahlenden Elektronen- mikroskopie untersucht. Es sind die in den Fig. 6a bis c ge- zeigten drei unterschiedlichen Modifikationen des Kanalpro- teins MspA aus M. smegmatis erkennbar.

In Fig. 6a liegen isolierte Kanalproteine vor. In Fig. 6b ist eine Bänderstruktur erkennbar, die große Poren mit einem Durchmesser von 12 nm aufweist. Aus Fig. 6c ist ersichtlich, daß die Bänderstruktur zwei Typen von Kanälen beitzt, nämlich erste Kanäle mit einem kleinen Durchmesser von etwa 2.4 nm und zweite Kanäle mit größeren Durchmesser von etwa 9.0 bis 10,0 nm.

Beispiel 6 : Herstellung von Molekularsieben :

Die Herstellung von Molekularsieben kann durch Integration der Porine in durch S-Layer unterstützte biomimetische Mem- branen erfolgen (Sleytr, U. B., Pum, D. and Sara, M. Advances in S-layer nanotechnology and biomimetics. Adv Biophys 34, 71-9 (1997)). Eine Alternative ist die Verwendung von porösen Filmen aus Cadmiumsulfid oder-tellurid mit hydrophoben Löchern im Nanometerbereich (Service, R. F. Making devices smaller, brighter and more bendy. Science 282,2179-2180 (1998)).

Beispiel 7 : Herstellung von metallischen Nano-Kanälen : Porine mit einem Kanaldurchmesser von 2-10 nm eignen sich zur Synthese von metallischen Nanokanälen. Die Abscheidung von Kupfer-, Silber-und Golddrähten gelingt an den o. g. Sub- straten in Gegenwart des Kanalproteins aus M. smegmatis unter Verwendung von 0.010 molaren Lösungen von Cu (II)-Diacetat, Ag (I)-Acetat und Au (III)-Acetat in Anwesenheit von 1.0 mol L- 1 Triethylammonium-perchlorat, gelöst in n-Hexan. Das kanal- bildende Proteins wird auf der Oberfläche eines Substrats nach in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren abgeschieden. Dann wird die lateral-strukturierte Oberfläche in den Elektrolyt getaucht und für 15h bei einer negativen Spannung von-2.0 V galvanisiert. Nach dem Ende der Abscheidung wird die erhal- tene zweidimensionale Nanostruktur viermal unter Verwendung von n-Hexan (4 x 5.0 mL) gewaschen und danach im Hochvakuum (1 x 10-6 bar) getrocknet.

Beispiel 8 : Herstellung von Nano-Partikeln : Zur Synthese von Nanopartikeln wurden folgende Verfahren vor- geschlagen : Verfahren A : Adsorption, Hydrolyse und nachfolgende Oxidation von Halbleiter-Vorstufen

TiF3 und Ti (III)-ethylenglykolat adsorbieren in leicht saurer Lösung (pH = 6.4-6.2) im Inneren der Kanäle von MspA. Beim vorliegenden pH-Wert erfolgt in einer Argonathmosphäre bei einer Temperatur von 30 °C die Oxidation von Ti (III) zu Ti (IV) nur sehr langsam (t1/2 : 30 min). Unter Verwendung ei- ner Osmose-Membran kann ein konstanter pH-Wert während der Abscheidereaktion realisiert werden.

Nach diesem Verfahren, nämlich (1) der Verwendung des Kanal- proteins MspA aus M. smegmatis als Template, (2) eines was- serlöslichen Precursors, (3) einer schnellen Abscheidereakti- on, (4) einer langsamen Oxidation zur gewünschten Oxidations- stufe, (5) einem Wiederauflösen des Templates in DMSO und (6) einer nachfolgenden Wiedergewinnung durch Kristallisation können auch andere Halbleiter-Nanopartikel synthetisiert wer- den.

Lösungen von TiF3 und Ti (III)-ethylenglykolat werden in einer NaCl-Lösung (2.0 mol L-1) bei T = 0°C unter Argon als Schutz- gas gelöst (c = 5 x 10-3 mol L-1). Danach wird das Kanal- protein (c = 1 x 10-5 mol, gelöst in 100 mM Na2HP04/NaH2P04, pH 6.5,150 mM NaCl, 0.10 g L-1 SDS) hinzugegeben. Die Volu- men betragen V = 1.0 mL für die Ti (III)-Lösungen und 0.05 mL für das gelöste Kanalprotein. Danach wird die Temperatur der Lösung innerhalb von 10 min. auf T = 30°C linear gesteigert.

Innerhalb von 2 h wird die Abscheidereaktion in einer 02- gesättigten Lösung durchgeführt. Der pH-Wert der Lösung wird innerhalb dieser Zeit unter Verwendung einer Osmose- Membran bei 6.2-6.4 gehalten. Danach werden die TiO2- dotierten Kanalproteine unter Verwendung einer Ultrazentrifu- ge abgetrennt (30 min.) und danach in V = 1.0 mL des hier be- schriebenen Puffers gelöst. Der Reinigungsprozeß wird zweimal wiederholt. Die Befreiung der Titandioxid-Nanopartikel vom

Kanalprotein-Templat wird durch zwei unterschiedliche Metho- den erreicht : a) Durch Eintrag in DMSO (V = 1.0 mL) wird das Kanalprotein- Templat aufgelöst. b) Durch Verwendung von Proteinase K wird das Kanalprotein- Templat aufgelöst.

Verfahren B : Photochemische Reduktion Auch dieses Verfahren kann im wäßrigen Medium erfolgen. Dazu wird Phenothiazin als irreversibler photochemischer Elektro- nendonor verwendet. Da Phenothiazin ein positiver, hydropho- ber Heterozyklus ist, wird dieser in den Kanalstrukturen des Porins aus M. smegmatis co-adsorbiert. Nach Bestrahlung mit UVB+UVA-Photonen erfolgt in den Kanälen ein irreversibler Elektronentransfer, wobei reduktive Abscheidungsreaktionen stattfinden können. Hierdurch ist die photoelektrochemische Reduktion von Silber (I), Gold (III), Kupfer (II) und Pla- tin (II)-Salzen möglich. Ein Vorteil dieses Verfahrens ist es, daß kein Elektrolyt zugesetzt werden muß.

Die photochemische Abscheidung von Kupfer-, Silber-und Gold- partikeln gelingt unter Verwendung von Phenothiazin (c = 5 x 10-3 mol L-1), das in n-Hexan gelöst ist. Die experimentellen Bedingungen entsprechen denen im Beispiel 1, mit der Ausnah- me, daß kein Elektrolyt zugesetzt werden muß. Unter Verwen- dung einer Quecksilber-Mitteldrucklampe (z. B. TQ 150, Heraeus Noblelight) wurde die Oberfläche unter Verwendung eines Pyr- ex-Filters für 30 min belichtet. Der Abstand zwischen der Lampenoberfläche und der bestrahlten Struktur betrug 20 cm.

Verfahren C : Elektrochemische Abscheidung von Nanopartikeln Nach der Konstituierung von lateralen Nanostrukturen an lei- tenden Oberflächen (z. B. ITO oder Graphit) gemäß Beispiel 5 kann eine elektrochemische Erzeugung von Nanopartikeln unter

Verwendung des Kanalproteins aus M. smegmatis erfolgen. Hier- zu wird eine geeignete Precursorverbindung (z. B. TiF3, Ti (III)-ethylenglykolat, Kupfer (I) acac oder d-Block- Carbonylverbindungen) in Hexan gelöst und ein geeignetes an- odisches Potential der verwendeten Elektrode eingestellt. Um eine ausreichende elektrische Leitfähigkeit des Lösungsmit- tels zu gewährleisten, wird ein in Tetrabutylammonium- perchlorat löslicher Elektrolyt zugesetzt. Durch dieses Ver- fahren können anorganische Nanopartikel abgeschieden werden.

Nach dem Entfernen des organischen Lösungsmittels kann eine Hydratisierung der gebildeten Strukturen erfolgen, auch wenn weiterhin ein anodisches Potential der Elektrode eingestellt wird. Dadurch wird ein Anhaften des negativ geladenen Kanal- proteins an der Oberfläche sichergestellt. Organische Nano- partikel sind analog durch Elektropolymerisation von aromati- schen Aminen, wie z. B. Anilin, Diaminobenzol oder Diphenyla- min erhältlich. Das verwendete Kanalprotein-Templat läßt sich nach beendeter Reaktion wieder weitestgehend ablösen, indem Detergens-haltige Puffer oder DMSO verwendet werden.

Die Abscheidung von Ti02, CuO, Fe203 und organisch leitenden Nanopartikeln gelingt an den o. g. Substraten in Gegenwart des Kanalproteins MspA aus M. smegmatis unter Verwendung von 0.010 molaren Lösungen von TiF3 und Ti (III)-ethylenglykolat, Cu (II)-Diacetat, Fe2 (CO) lu, Anilin, Diaminobenzol oder Diphe- nylamin in Anwesenheit von 1.0 mol L-1 Triethylammonium- perchlorat, gelöst in n-Hexan. Nach der Abscheidung des Kanalproteins auf der Oberfläche der Substrate gemäß Beispiel 1, wird die lateral-strukturierte Oberfläche in die Abschei- delösung eingetaucht und für 15h bei einer positiven Abschei- despannung von +2,3 V elektrolysiert. Nach dem Ende der Ab- scheidung wird die erhaltene zweidimensionale Nanostruktur viermal unter Verwendung von n-Hexan (4 x 5.0 mL) gewaschen und danach im Hochvakuum (1 x 10-6 bar) getrocknet.

Beispiel 9 : Herstellung von Nano-Drähten : Gemäß dem Verfahren lit. C in Beispiel 3 können durch elek- trochemische Reduktion von Silber (I)-, Gold (III)- und Kup- fer (II)-Salzen auch Nanodrähte hergestellt werden. Dazu muß ein genügend negatives Potential der Trägerelektrode einge- stellt werden. Vorteilhaft ist die verwednung von Acetaten der vorgenannten Metalle.

Das Verfahren lit. C besitzt den Vorteil, daß die auf Ober- flächen gezielt erzeugten Kanäle-in Abhängigkeit der ausge- wählten Oberflächenmodifikation und/oder Kanalstruktur-in jedem Falle länger als 2 nm sind. Es ist die Synthese von echten Nano-Drähten durch elektrochemische Abscheidung von Ionen und anderen elektrochemischen Precursorverbindungen, z. B. Metallchloriden, Metallfluoriden oder Acetaten, möglich.

Beispiel 10 : Herstellung von Käfigen und Wirtsverbindungen für Katalysatoren Die ausgezeichnete Langzeitstabilität des Kanalproteins MspA aus M. smegmatis und sein hohes negatives Oberflächenpotenti- al machen es als Käfig für Katalysatoren sehr interessant.

Aus wäßriger Lösung lassen mittels Ionenaustausch Eisen (III)- Partikel einlagern. Diese Einlagerung erfolgt spontan und kann durch die eingesetzten Konzentrationen an Eisen (II/III)- Salzen und an Kanalprotein gezielt gesteuert werden. Ein wei- terer wichtiger Parameter ist die gewählte Abscheidungstempe- ratur. Neben anorganischen Salzen können auch Metallkomplexe vom Eisen (II)- bzw. Ruthenium (II)-polypyridyl-Typ erfolgreich in die Kanalstrukturen integriert werden.

Die Verwendung des Kanalproteins ermöglicht außerdem die Syn- these von anorganischen und organischen Nanopartikeln. Z. B.

können Ti02-Partikel durch elektrochemische Oxidation von TiCl3 hergestellt werden (L. Kavan, B. O'Reagan, A. Kay, M.

Grätzel, J. Electroanal. Chem., Preparation of Ti02 (anata- se) films on electrodes by anodic oxidative hydrolysis of TiCl3.291-307 (1993)). Auch die Herstellung redoxaktiver, organischer Nanopartikel ist möglich (B. J. Palys, J. Bukows- ka, K. Jackowska. SERS of 1,8-diaminonaphthalene on gold, silver and copper electrodes. Polymerisation and complexes formed with the electrode material. Journal of Electroanaly- tical Chemistry 428,19-24. (1997)). Dabei werden die Parti- kel durch anodische Elektropolymerisation die im Inneren der Kanäle abgeschieden. Das kanalbildende Protein wirkt hier als chemisch resistente Umgebung. Es schützt vor Auflösung und Koagulation der katalytischen Partikel.

Eine weitere Möglichkeit besteht in der Auflösung des Kanal- proteins nach der Synthese und der nachfolgenden in-situ Syn- these einer einbettenden Schicht. Hierzu können organische Polymere (z. B. PMMA) verwendet werden, die in-situ durch die Methode der (Photo) polymerisation dargestellt werden können (E. Zagladko, Y. Medvedevskikh, A. Turovski, G. Zaikov. The Kinetics of the Three-Dimensional Photopolymerization of Some Dimethacrylates : The Microheterogeneous Model. International Journal of Polymeric Materials 39,227-236 (1998)).

Zur Trennung der katalytischen Nanopartikel können auch Zwi- schenschichten sythetisch hergestellt werden. Dazu werden Lö- sungen (0.01 mol L-1) von Fe2 (CO) 1o, (Ru (bpy) 3) 2+-Diacetat und TiCl3 verwendet. Danach wird das Kanalprotein (c = 1 x 10-5 mol, gelöst in 100 mM Na2HP04/NaH2P04, pH 6.5,150 mM NaCl, 0.10 g L-1 SDS) hinzugegeben. Die Volumen betragen V = 1,0 mL für die Lösungen von Fe2 (CO) lu, (Ru (bpy) 3) 2+-Diacetat und TiCl3 und 0,05 mL für das gelöste Kanalprotein. Nach ei- ner Reaktionszeit von 12 h wird das dotierte Kanalprotein un-

ter Verwendung einer Ultrazentrifuge angetrennt. Alternativ können die dotierten Proine durch Eintauchen eines ITO- Trägers Oberfläche (1.0 mm2) an dessen Oberfläche fixiert werden. Nach dem Zufügen von (1.0 mL3) MMA, welches 0.1 g L-1 Benzoindeimethylether als Initiator enthält, gelingt eine Photopolymerisation. Die Bedingungen entsprechen denen in Beispeil 8.

Im Gegensatz zu zeolithischen Wirtsverbindungen stellt das Kanalprotein MspA aus M. smegmatis einen idealen passiven mo- lekularen Reaktor dar. Es weist keine funktionalen Gruppen aufweist, die mit den abzuscheidenden Nanopartikeln chemische Bindungen eingehen. Die wichtigsten Vorteile der beschriebe- nen Syntheseverfahren für Nanopartikel und Katalysatoren lie- gen -im Wachstum von Nanopartikeln zu definierten Größen -kostensenkenden Recycling des Templates und -einer erhöhten Langzeitstabilität von Katalysatoren, die Nanopartikel als aktive Komponenten enthalten.

Beispiel 11 : Herstellung chemischer Sensoren : Zur Herstellung eines Sensors werden die aromatischen Kohlen- wasserstoffen Trimethyl-1-Methylpyren-ammoniumchlorid und Trimethyl-1-Butylpyren in den Kanalstrukturen von M. smegma- tis physisorbiert. Als photophysikalisches Analysenverfahren wird die Anregung linear polarisiertem Licht verwendet. Auch die Messung der emittierten Fluoreszenz erfolgte unter Ver- wendung eines Polarisationsprismas. Am Beispiel von zwei Po- ly (Amidoamine) Dendrimeren wurde das Funktionsprinzip dieses Sensortyps erprobt : Während die kleinere SBD-Generation 2.0 (deff ; 0. 8 nm)'die linear polarisierte Fluoreszenz beider Pyren-Fluorophore löscht, wird die signifikant größere SBD

Generation 6.0 (deff z 3. 2 nm) vom Porin ausgeschlossen und löscht die Fluoreszenz daher nicht. Die Konzentrationen be- trugen in diesem Experiment (T = 298 K) : Trimethyl-1- Methylpyren-ammoniumchlorid = 1 x 10-6 mol L-1, Trimethyl-1- Butylpyren = 1 x 10-6 mol L-1, Kanalprotein aus M. smegmatis = 1 x 10-7 mol L-1, gelöst in 100 mM Na2HP04/NaH2P04, pH 6.5, 150 mM NaCl, 0.10 g L-1 SDS, V = 0.10 mL. Während SBD G 2.0 bereits in einer Konzentration von = 1 x 10-7 mol L-1, die Lumineszenz beider Luminophore vollständig löscht, wird sogar bei einer Konzentration von SBD G 6.0 von = 1 x 10-4 mol L-1 ledglich eine Lumineszenzlöschung von 11% bzw. 17% beobach- tet. Um eine vollständige Lumineszenzlöschung durch SBD G 6.0 zu bewirken, muß dessen Konzentration auf = 1,25 x 10-3 mol L-1 ansteigen.

Liste der Sequenzprotokolle : 1. mspA-Gen, translatiert 2. mspA-Gen + Promotor, translatiert 3. MspA-Proteins mit vermuteter Signalsequenz 4. synmspA-Gen, translatiert 5. rMspA-Protein

SEQUENZPROTOKOLLE <110> Niederweis Dr., Michael Bossmann Dr., Stefan <120> Synthese von Nanostrukturen mit Kanalproteinen <130> MN01 <140> <141> <160> 5 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 636 <212> DNA <213> Mycobacterium smegmatis <220> <221> CDS <222> (1).. (636) <223> mspA-Gen <400> 1 atg aag gca atc agt cgg gtg ctg atc gcg atg gtt gca gcc atc gcg 48 Met Lys Ala Ile Ser Arg Val Leu Ile Ala Met Val Ala Ala Ile Ala 1 5 10 15 gcg ctt ttc acg agc aca ggc acc tct cac gca ggc ctg gac aac gag 96 Ala Leu Phe Thr Ser Thr Gly Thr Ser His Ala Gly Leu Asp Asn Glu 20 25 30 ctg agc ctc gtt gat ggc cag gac cgc acc ctc acc gtg cag cag tgg 144 Leu Ser Leu Val Asp Gly Gln Asp Arg Thr Leu Thr Val Gln Gln Trp 35 40 45 gac acc ttc ctc aat ggt gtg ttc ccc ctg gac cgc aac cgt ctt acc 192 Asp Thr Phe Leu Asn Gly Val Phe Pro Leu Asp Arg Asn Arg Leu Thr 50 55 60 cgt gag tgg ttc cac tcc ggt cgc gcc aag tac atc gtg gcc ggc ccc 240 Arg Glu Trp Phe His Ser Gly Arg Ala Lys Tyr Ile Val Ala Gly Pro 65 70 75 80 ggt gcc gac gag ttc gag ggc acg ctg gaa ctc ggc tac cag atc ggc 288 Gly Ala Asp Glu Phe Glu Gly Thr Leu Glu Leu Gly Tyr Gln Ile Gly 85 90 95 ttc ccg tgg tcg ctg ggt gtg ggc atc aac ttc agc tac acc acc ccg 336 Phe Pro Trp Ser Leu Gly Val Gly Ile Asn Phe Ser Tyr Thr Thr Pro 100 105 110 aac atc ctg atc gac gac ggt gac atc acc gct ccg ccg ttc ggc ctg 384 Asn Ile Leu Ile Asp Asp Gly Asp Ile Thr Ala Pro Pro Phe Gly Leu 115 120 125 aac tcg gtc atc acc ccg aac ctg ttc ccc ggt gtg tcg atc tcg gca 432 Asn Ser Val Ile Thr Pro Asn Leu Phe Pro Gly Val Ser Ile Ser Ala 130 135 140

gat ctg ggc aac ggc ccc ggc atc cag gaa gtc gca acg ttc tcg gtc 480 Asp Leu Gly Asn Gly Pro Gly Ile Gln Glu Val Ala Thr Phe Ser Val 145 150 155 160 gac gtc tcc ggc gcc gag ggt ggc gtg gcc gtg tcg aac gcc cac ggc 528 Asp Val Ser Gly Ala Glu Gly Gly Val Ala Val Ser Asn Ala His Gly 165 170 175 acc gtg acc ggt gcg gcc ggc ggt gtg ctg ctg cgt ccg ttc gcc cgc 576 Thr Val Thr Gly Ala Ala Gly Gly Val Leu Leu Arg Pro Phe Ala Arg 180 185 190 ctg atc gcc tcg acc ggt gac tcg gtc acc acc tac ggc gaa ccc tgg 624 Leu Ile Ala Ser Thr Gly Asp Ser Val Thr Thr Tyr Gly Glu Pro Trp 195 200 205 aac atg aac tga 636 Asn Met Asn 210

<210> 2 <211> 1423 <212> DNA <213> Mycobacterium smegmatis <220> <221>-10_signal <222> (323).. (328) <223> vermuteter Promotor <220> <221> CDS <222> (499).. (1134) <223> mspA-Gen <220> <221> RBS <222> (492).. (496) <223> vermutete Ribosomenbindestelle <400> 2 gttaacggag tcgggccgtc gatacggcgg cgaagatcat ccggcagatt ggcgcctggt 60 taaacccgcg taaacactgg taccgccggt ccgcgccgga aaaggttttg cctcacggtg 120 aatatgtgac ctgaattgca cttcacgggt aaaagcggag gtaaccgacg gttgccgcag 180 caccctcaca gcttgggcca aggtgacgtg cagcgcacgc ctgccggtgc cggatggcgg 240 tcaccgcaaa gtgtcaggca ctgccgaaag gtcagtcagc aaacttcact gcggctgtgg 300 tgcgaagtgc ggttgtggga cgtatccgtt gctgccgcgc gccctggcgt ttatgtttct 360 gctgccaact gtgagcgagg cattagagac agatgtgatc ctcttagatc tccgaagtct 420 ctgaacaggt gttgagccgg ttgcagacaa caaaacaggt gggcctgagg ggccgccggc 480 gatacagtta gggagaac atg aag gca atc agt cgg gtg ctg atc gcg atg 531 Met Lys Ala Ile Ser Arg Val Leu Ile Ala Met 1 5 10 gtt gca gcc atc gcg gcg ctt ttc acg agc aca ggc acc tct cac gca 579 Val Ala Ala Ile Ala Ala Leu Phe Thr Ser Thr Gly Thr Ser His Ala 15 20 25 ggc ctg gac aac gag ctg agc ctc gtt gat ggc cag gac cgc acc ctc 627 Gly Leu Asp Asn Glu Leu Ser Leu Val Asp Gly Gln Asp Arg Thr Leu 30 35 40 acc gtg cag cag tgg gac acc ttc ctc aat ggt gtg ttc ccc ctg gac 675 Thr Val Gln Gln Trp Asp Thr Phe Leu Asn Gly Val Phe Pro Leu Asp 45 50 55 cgc aac cgt ctt acc cgt gag tgg ttc cac tcc ggt cgc gcc aag tac 723 Arg Asn Arg Leu Thr Arg Glu Trp Phe His Ser Gly Arg Ala Lys Tyr 60 65 70 75 atc gtg gcc ggc ccc ggt gcc gac gag ttc gag ggc acg ctg gaa ctc 771 Ile Val Ala Gly Pro Gly Ala Asp Glu Phe Glu Gly Thr Leu Glu Leu 80 85 90 ggc tac cag atc ggc ttc ccg tgg tcg ctg ggt gtg ggc atc aac ttc 819

Gly Tyr Gln Ile Gly Phe Pro Trp Ser Leu Gly Val Gly Ile Asn Phe 95 100 105 agc tac acc acc ccg aac atc ctg atc gac gac ggt gac atc acc gct 867 Ser Tyr Thr Thr Pro Asn Ile Leu Ile Asp Asp Gly Asp Ile Thr Ala 110 115 120 ccg ccg ttc ggc ctg aac tcg gtc atc acc ccg aac ctg ttc ccc ggt 915 Pro Pro Phe Gly Leu Asn Ser Val Ile Thr Pro Asn Leu Phe Pro Gly 125 130 135 gtg tcg atc tcg gca gat ctg ggc aac ggc ccc ggc atc cag gaa gtc 963 Val Ser Ile Ser Ala Asp Leu Gly Asn Gly Pro Gly Ile Gln Glu Val 140 145 150 155 gca acg ttc tcg gtc gac gtc tcc ggc gcc gag ggt ggc gtg gcc gtg 1011 Ala Thr Phe Ser Val Asp Val Ser Gly Ala Glu Gly Gly Val Ala Val 160 165 170 tcg aac gcc cac ggc acc gtg acc ggt gcg gcc ggc ggt gtg ctg ctg 1059 Ser Asn Ala His Gly Thr Val Thr Gly Ala Ala Gly Gly Val Leu Leu 175 180 185 cgt ccg ttc gcc cgc ctg atc gcc tcg acc ggt gac tcg gtc acc acc 1107 Arg Pro Phe Ala Arg Leu Ile Ala Ser Thr Gly Asp Ser Val Thr Thr 190 195 200 tac ggc gaa ccc tgg aac atg aac tga ttcctggacc gccgttcggt 1154 Tyr Gly Glu Pro Trp Asn Met Asn 205 210 cgctgagacc gcttgagatc ggcgcgtccc gctcccggtg tcgtcagctc atcgttgaca 1214 cgtgaactga cactcttcct agccggagcg kacgcgccga tcttgtgttc tgagcagttc 1274 tcagtccgtc cgccgcaaca ccagcgctga cggcgtacgc agcctgccca ccaccgcgcg 1334 ccagggacgc cccagcctgg gcaccacctc agcggtcggc acgatgcgcg gatcggtcac 1394 ctcgaacgtc tcaccgttca tcaccgcgc 1423

<210> 3 <211> 211 <212> PRT <213> Mycobacterium smegmatis <220> <221> SIGNAL <222> (1).. (27) <223> vermutete Signalsequenz des MspA-Proteins <220> <221> PEPTIDE <222> (28).. (211) <223> reifes MspA-Protein <400> 3 Met Lys Ala Ile Ser Arg Val Leu Ile Ala Met Val Ala Ala Ile Ala 1 5 10 15 Ala Leu Phe Thr Ser Thr Gly Thr Ser His Ala Gly Leu Asp Asn Glu 20 25 30 Leu Ser Leu Val Asp Gly Gln Asp Arg Thr Leu Thr Val Gln Gln Trp 35 40 45 Asp Thr Phe Leu Asn Gly Val Phe Pro Leu Asp Arg Asn Arg Leu Thr 50 55 60 Arg Glu Trp Phe His Ser Gly Arg Ala Lys Tyr Ile Val Ala Gly Pro 65 70 75 80 Gly Ala Asp Glu Phe Glu Gly Thr Leu Glu Leu Gly Tyr Gln Ile Gly 85 90 95 Phe Pro Trp Ser Leu Gly Val Gly Ile Asn Phe Ser Tyr Thr Thr Pro 100 105 110 Asn Ile Leu Ile Asp Asp Gly Asp Ile Thr Ala Pro Pro Phe Gly Leu 115 120 125 Asn Ser Val Ile Thr Pro Asn Leu Phe Pro Gly Val Ser Ile Ser Ala 130 135 140 Asp Leu Gly Asn Gly Pro Gly Ile Gln Glu Val Ala Thr Phe Ser Val 145 150 155 160 Asp Val Ser Gly Ala Glu Gly Gly Val Ala Val Ser Asn Ala His Gly 165 170 175 Thr Val Thr Gly Ala Ala Gly Gly Val Leu Leu Arg Pro Phe Ala Arg 180 185 190 Leu Ile Ala Ser Thr Gly Asp Ser Val Thr Thr Tyr Gly Glu Pro Trp 195 200 205 Asn Met Asn 210

<210> 4 <211> 558 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : synthetisch <220> <221> CDS <222> (1).. (558) <223> synmspA-Gen <400> 4 atg ggc ctg gac aac gaa ctg tcc ctg gtt gac ggc cag gac cgt acc 48 Met Gly Leu Asp Asn Glu Leu Ser Leu Val Asp Gly Gln Asp Arg Thr 1 5 10 15 ctg acc gtt cag cag tgg gac acc ttc ctg aac ggt gtt ttc ccg ctg 96 Leu Thr Val Gln Gln Trp Asp Thr Phe Leu Asn Gly Val Phe Pro Leu 20 25 30 gac cgt aac cgt ctg acc cgt gaa tgg ttc cac tcc ggt cgt gcg aaa 144 Asp Arg Asn Arg Leu Thr Arg Glu Trp Phe His Ser Gly Arg Ala Lys 35 40 45 tac atc gtt gcg ggt ccg ggt gcg gac gag ttc gaa ggt acc ctg gaa 192 Tyr Ile Val Ala Gly Pro Gly Ala Asp Glu Phe Glu Gly Thr Leu Glu 50 55 60 ctg ggt tac cag atc ggc ttc ccg tgg tcc ctg ggt gtt ggt atc aac 240 Leu Gly Tyr Gln Ile Gly Phe Pro Trp Ser Leu Gly Val Gly Ile Asn 65 70 75 80 ttc tct tac acc acc ccg aac atc ctg atc gac gac ggt gac atc acc 288 Phe Ser Tyr Thr Thr Pro Asn Ile Leu Ile Asp Asp Gly Asp Ile Thr 85 90 95 gct ccg ccg ttc ggt ctg aac tct gtt atc acc ccg aac ctg ttc ccg 336 Ala Pro Pro Phe Gly Leu Asn Ser Val Ile Thr Pro Asn Leu Phe Pro 100 105 110 ggt gtt tct atc tct gct gat ctg ggc aac ggt ccg ggt atc cag gaa 384 Gly Val Ser Ile Ser Ala Asp Leu Gly Asn Gly Pro Gly Ile Gln Glu 115 120 125 gtt gct acc ttc tct gta gac gtc tct ggt gct gaa ggt ggt gtt gct 432 Val Ala Thr Phe Ser Val Asp Val Ser Gly Ala Glu Gly Gly Val Ala 130 135 140 gtt tct aac gct cac ggc acc gtt acc ggt gcg gct ggc ggt gtt ctg 480 Val Ser Asn Ala His Gly Thr Val Thr Gly Ala Ala Gly Gly Val Leu 145 150 155 160 ctg cgt ccg ttc gct cgt ctg atc gct tct acc ggt gac tct gtt acc 528 Leu Arg Pro Phe Ala Arg Leu Ile Ala Ser Thr Gly Asp Ser Val Thr 165 170 175 acc tac ggt gaa ccg tgg aac atg aac tga 558 Thr Tyr Gly Glu Pro Trp Asn Met Asn 180 185

<210> 5 <211> 185 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> <221> PEPTIDE <222> (1).. (184) <223> rMspA <220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : synthetisch <400> 5 Met Gly Leu Asp Asn Glu Leu Ser Leu Val Asp Gly Gln Asp Arg Thr 1 5 10 15 Leu Thr Val Gln Gln Trp Asp Thr Phe Leu Asn Gly Val Phe Pro Leu 20 25 30 Asp Arg Asn Arg Leu Thr Arg Glu Trp Phe His Ser Gly Arg Ala Lys 35 40 45 Tyr Ile Val Ala Gly Pro Gly Ala Asp Glu Phe Glu Gly Thr Leu Glu 50 55 60 Leu Gly Tyr Gln Ile Gly Phe Pro Trp Ser Leu Gly Val Gly Ile Asn 65 70 75 80 Phe Ser Tyr Thr Thr Pro Asn Ile Leu Ile Asp Asp Gly Asp Ile Thr 85 90 95 Ala Pro Pro Phe Gly Leu Asn Ser Val Ile Thr Pro Asn Leu Phe Pro 100 105 110 Gly Val Ser Ile Ser Ala Asp Leu Gly Asn Gly Pro Gly Ile Gln Glu 115 120 125 Val Ala Thr Phe Ser Val Asp Val Ser Gly Ala Glu Gly Gly Val Ala 130 135 140 Val Ser Asn Ala His Gly Thr Val Thr Gly Ala Ala Gly Gly Val Leu 145 150 155 160 Leu Arg Pro Phe Ala Arg Leu Ile Ala Ser Thr Gly Asp Ser Val Thr 165 170 175 Thr Tyr Gly Glu Pro Trp Asn Met Asn 180 185