Изобретение относится к области защиты растений, в частности к способу применения комплекса фосфодиэстераз, экзонуклеаз, эндонуклеаз и рибонуклеаз, для защиты овощных культур от вирусов в условиях защищенного грунта.

Способ заключается в опрыскивании овощных культур препаратом, включающим в себя ферменты бактериального синтеза и активатор.

Аналогом изобретения является способ применения панкреатической рибонуклеазы, обладающей гидролитическими свойствами в отношении фитопатогенных вирусов, что позволяет замедлить или предотвратить размножение вирусов [1].

Недостатком способа применения панкреатической рибонуклеазы в качестве противовирусного средства защиты растений является высокая себестоимость фермента, производство которого в промышленных масштабах экономически не целесообразно.

Ещё одним аналогом является способ применения средства защиты растений от вирусных инфекций и профилактики заболеваний, обладающий широкой областью применения, высокой эффективностью защиты, экологической безопасностью и безвредностью для человека, животных, растений. При данном способе в качестве ингибитора репликации вирусов используют продуцируемый бактериями Bacillus pumilus внеклеточный фермент - бактериальную рибонуклеазу Bacillus pumilus [2].

Недостатком этого способа является отсутствие возможности экономически выгодного промышленного производства для удовлетворения потребностей сельхозтоваропроизводителей, а также наличие результатов исследований только по ингибирующей способности фермента.

1

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Наиболее близок к заявленному способу, является способ применения бактериальной нуклеазы Serratia marcescens для защиты картофеля от вирусов [3,4].

Недостатком данного способа является трудоемкость наработки, отсутствие способа промышленного производства, использование для получения бактериальной нуклеазы Serratia marcescens трансгенных растений, проблема безопасности которых недостаточно изучена и дороговизной осуществления технологии, а также наличие условной патогенности применяемого штамма-продуцента ферментов бактерии Serratia marcescens.

Перечисленные недостатки различных способов защиты овощных культур, основанных на применении ферментов с гидролитической активностью в отношении нуклеиновых кислот, существенно ограничивают возможности применения данных способов для защиты растений, использующихся в пищевых целях, от вирусиндуцированных заболеваний.

Технической задачей предлагаемого изобретения является разработка способа защиты растений от вирусных инфекций и профилактики вирусиндуцированных заболеваний, адаптированного под условия производства, оказывающего высокоэффективную защиту от вирусов, обладающего экологической безопасностью и стимулирующим действием на развитие растений благодаря комплексу микроэлементов.

Цели достигают тем, что в качестве противовирусного средства используют продуцируемый несовершенным грибом Penicillium citrinum внеклеточный фермент- грибковую нуклеазу Pl Р. citrinum. Использовался Penicillium citrinum, полученный без применения трансгенных растений, который нарабатывался в достаточном для широкого применения количестве, отличающийся от аналогов степенью очистки и наличием ферментов, оказывающих гидролитическое действие не только на ДНК/РНК, но и на

2

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) липопротеиды, в частности на белковую оболочку вирусов (капсид). Активацию фермента проводили активатором (далее по тексту активатор), в состав которого входят сульфат магния, оксид кремния, оксид кальция, хелат магния, хелат железа.

Отличительной особенностью настоящего изобретения являются подходы к способам обработки, в частности расчет кратности обработок и концентрации рабочего раствора с учетом степени распространения вирусной инфекции в тепличном комплексе, с применением молекулярно -генетических методов контроля вирусной нагрузки, как в помещениях (оборудование, инвентарь, вспомогательные материалы, стены, настилы), так и в растениях. Определена концентрация активатора, которая необходима для активации фермента.

Технический результат достигается следующим образом.

Скрининг на наличие/ отсутствие вирусов в растениях проводят раз в две недели. В качестве исследуемого материала используют листья растений и смывы с поверхностей помещений. После выявления РНК вирусов в исследуемом материале до обнаружения внешних проявлений признаков инфекции исследования производили еженедельно. От момента выявления РНК в исследуемом материале, до появления признаков инфекции проходит инкубационный период развития вирусной инфекции, который в среднем составляет до 3 недель.

Заявляемое техническое решение характеризуется примерами.

Пример 1. Рассаду огурца, инфицированную вирусом зеленой крапчатой мозаики огурца (ВЗКМО), обрабатывали 1 литром рабочего раствора приготовление, которого осуществляли смешиванием 150 мг (15000 ЕА) ферментов с 3 г активатора в теплой воде (37-50°С). Обработки проводили ежедневно для недопущения развития внешних признаков инфекции. До начала обработки проводили отбор проб для определения вирусной нагрузки.

3

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Её значение составляло 7,87x10 ¹⁰ После 3 обработок на контрольном и опытном участках были обнаружены следы вируса (ВЗКМО). После 4 обработок количество вирусных копий в смывах с рабочих поверхностей и настила общей площадью 20 см ² составило - 0,068х10 ⁶ копий (Фиг.1). Полученные в ходе эксперимента данные, свидетельствую о снижении числа инфицированных растений.

Пример 2. Растения огурца, выращиваемые в личном подсобном хозяйстве на участке 8 м ² обрабатывали 10 л рабочего раствора, используя 1,5 г ферментов (150 TEA) и 30 г активатора. Обработки проводили еженедельно для профилактики развития вируса мозаики огурца (ВОМ). После 5 недель обработок на исследуемом участке наблюдается значительное снижение растений с поражениями верхнего яруса (Фиг.2).

Пример 3. Один из участков тепличного комбината, на котором выращивались томаты, инфицированные вирусом желтой курчавости листьев томата (ВЖКЛТ), обрабатывали 100 л рабочего раствора: 15 г ферментов (1,5 МЕА) и 300 г активатора. Томаты обрабатывали еженедельно опрыскиванием листовых пластин. Наблюдалось отрастание здоровых верхушек и восстановление процессов цветения и плодообразования (Фиг.З).

Пример 4. Растения огурца выращиваемые на площади в 1 га тепличного комбината, инфицированные ВЗКМО, обрабатывались 1000 л рабочего раствора для приготовления, которого использовали 140 г ферментов (14 МЕА) и 1000 г активатора. При еженедельной обработке растений удавалось добиться отрастания здоровых верхушек, восстановления процессов оплодотворения и плодообразования. Лабораторные исследования показали достоверное снижение вирусной нагрузки в опытных группах, которые обрабатывались заявленным способом (Фиг.4).

Пример 5. Растения томата, инфицированные ВЖКЛТ, 2 раза в неделю обрабатывали 5 литрами рабочего раствора: 0,75 г фермента (75000 ЕА) и 15 г

4

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) активатора. По прошествии 5 недель обрабатываемые растения значительно превосходили по высоте и облиственности растения, которые не были подвержены обработке (Фиг.5).

Известно, что Penicillium citrinum продуцирует фермент гидролизующий нуклеиновые кислоты вирусов (РНК или ДНК), кроме того, данный микроорганизм продуцирует ряд других ферментов, которые гидролизуют оболочку вирусов, состоящую как правило из липопротеидов, то есть сложных белков, не является токсином для человека и животных. Заявленный способ защиты овощных культур от вирусных инфекций заключается в следующем: фермент с активатором применяют в производственных условиях, с использованием интерплантинга, при выращивании овощных культур гидропонным методом, а также в производственных условиях без применения интерплантинга с применением гидропонного метода выращивания.

Для приготовления рабочего раствора фермента (активностью 14 МЕА) и активатора фермента, предварительно наливают 10 л воды, температура которой от 37 до 40 °C; измеряют pH, оптимальным считается pH 8, допустимым 7-9. Пакет с активатором всктрывают и вносят в воду до полного растворения, после чего пакет с ферментом вскрывают и вносят в раствор с активатором, перемешивая до полного растворения. Затем полученный концентрированный раствор выливают в емкость с водой доводя объем до 1000 л.

Обработку осуществляют методом опрыскивания листовых пластин в концентрациях, приведенных в таблице 1.

5

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Таблица 1.

Объём рабочих растворов и масса их компонентов

Краткое описание чертежей.

Фигура 1. - Представлена динамика снижения вирусной нагрузки в образцах из рассадного отделения тепличного комбината после 4 недель обработки заявленным способом.

Фигура 2. - Описана динамика изменения количества растений с поражениями верхнего яруса.

Фигура 3. - Представлено образование новых цветков на растении томата инфицированного ВЖКЛТ.

Фигура 4. - Представлено распределение вирусной нагрузки в опытных и контрольных группах при применении разных методик контроля вирусных инфекций (1-3 домик - общепринятая методика борьбы с вирусными инфекциями; 4-6 домик - заявленная в описании методика).

Фигура 5. - Продемонстрирована разница по высоте и облиственности между опытной и контрольной группами после 5 недель обработки заявленным способом (опыт- обработка производилась; контроль- обработка не проводилась).

Список литературы

1. Мартынова Р.В. Ингибирующее действие панкреатической рибонуклеазы на фитопатогенные вирусы // Биологические исследования на Дальнем Востоке. Владивосток: ДВНЦ АН СССР, 1975. - С.149-152.

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) 2. Шарипова M.P., Балабан Н.П., Марданова А.М., Тойменцева А.А. Применение фермента рибонуклеазы bacillus pumilus в качестве ингибитора фитопатогенных вирусов. Патент 2542480 RU от 20.05.2015.

3. Леонова Н.С., Салганик Р.П. Применение бактериальной эндонуклеазы для оздоровления картофеля от вирусов / Сибирский вестник сельскохозяйственной науки, 1991, №5, С.25-28.

4. Блажко Н. В., Вышегуров С. X., Хрипко Ю. И., Рябинина В. А. Способ защиты овощных культур от инфекций, вызываемых вирусами. Патент 2 720 423 RU от 1.02.2019.

7

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)