Die Gewinnung von Nucleinsäuren insbesondere von Plasmid-DNA, hat in der Molekularbiologie und in der modernen Medizin eine gro e Bedeutung. Als Plasmid-DNA werden extrachromosomale DNA- Duplex-Moleküle bezeichnet, die üblicherweise eine Grö e von 1 bis mehr als 200 kb aufweisen und in Wirtszellen in einer bis mehreren Hundert von Kopien vorliegen. Plasmid-DNA wird im allgemeinen in Zellen, z. B. in gram-negativen Bakterien, ins- besondere in B.coli amplifiziert. Anschlie end werden die Zellen aufgeschlossen und die Plasmid-DNA daraus isoliert. Die isolierte Plasmid-DNA kann dann für molekularbiologische oder medizinische Anwendungen, z. B. zur Konstruktion von Klonie- rungsvektoren, zur Transformation von prokaryontischen und zur Transfektion von eukaryontischen Zellen, eingesetzt werden.

Zum Aufschlu der Zellen und zur Gewinnung der Plasmid-DNA sind verschiedene Methoden bekannt (siehe J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Bei einem von Birnboim & Doly entwickelten Verfahren zur Iso- lierung von Plasmid-DNA aus Zellen (Birnboim & Doly, Nucl.

Acid Res. 7 (1979) 1513-1523) wird die Biomasse mit einer NaOH/Detergenzlösung lysiert und anschlie end der pH-Wert mit K-Acetat auf ca. 5,0 eingestellt. Dabei entsteht ein Nieder- schlag, der überwiegend genomische DNA und Zellwandfragmente enthält. Zur Abtrennung dieser Verunreinigungen wird die Sus- pension in Zentrifugenbecher überführt. Der Niederschlag wird dann mittels einer Becherzentrifuge abzentrifugiert, um den Überstand mit der Plasmid-DNA zu erhalten.

Auch bei Fermentationsprozessen ist die Verwendung von Zen- trifugen gebräuchlich, um beispielsweise Fermenterüberstände von Zellen und Zellfragmenten zu trennen. Hierzu werden übli- cherweise Siebzentrifugen und Festwandzentrifugen verwendet (siehe Gerhartz W., Enzymes in industry: production and app- lications, 1990, VCH, Weinheim, Deutschland, Kap. 3.2.1).

Mit gebräuchlichen Laborzentrifugen ist das bearbeitbare Volu- men durch das Volumen des Rotors bzw. der Rotorbecher auf unter zehn Liter begrenzt (z. B. Sorvall-Zentrifuge, GSA-Ro- tor, 6 x 250 ml). Somit kann dieses Verfahren nur zur Gewin- nung von Plasmid-DNA in geringen Mengen eingesetzt werden.

Eine Übertragung des Verfahrens auf gro technische Prozesse bereitet aufgrund des begrenzten Zentrifugenvolumens erheb- liche Probleme.

Gro e Volumina können mittels Durchflusszentrifugen verarbei- tet werden. W092/12780 beschreibt eine technische Ausgestal- tung einer Durchflu zentrifuge und ihre Verwendung zur Auf- trennung von Makromolekülgemischen. Die Trennung von bespiels- weise vier Standardproteinen erfolgt dabei in einem wässrigen 2-Phasensystem bei maximal 1000 Upm entsprechend den jeweili- gen Verteilungskoeffizienten der Proteine. Aufgrund der zeit- lich verschiedenen Elution werden die Bestandteile des Gemi- sches getrennt voneinander erhalten.

Durch die immer grö ere Verbreitung von molekularbiologischen Methoden steigt jedoch der Bedarf nach gereinigter Plasmid-DNA für analytische und therapeutische Anwendungen in der For- schung und Medizin. Eine der vorliegenden Erfindung zugrunde- liegende Aufgabe war es deshalb, ein Verfahren bereitzustel- len, das eine effiziente und schnelle Reinigung von Plasmid- DNA in gro en Mengen ermöglicht.

In einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Aufreinigung von extrachromosomaler DNA, welches dadurch gekennzeichnet ist, da eine extrachromosomale DNA und

weitere Zellbestandteile enthaltende Flüssigkeit unter Bedin- gungen durch eine Durchflu zentrifuge geleitet wird, die zur Abtrennung der extrachromosomalen DNA von unlöslichen Zell- bestandteilen führen und die gereinigte extrachromosomale DNA gewonnen wird.

Im Stand der Technik wurden Durchflu zentrifugen bisher aus- schlie lich zur Zellabtrennung verwendet. Es wurde nun über- raschenderweise festgestellt, da Durchflu zentrifugen auch dazu verwendet werden können, extrachromosomale DNA in gro en Mengen aufzureinigen, ohne da die extrachromosomale DNA durch die auftretenden Scherkräfte geschädigt wird. Überraschend war ebenfalls die Tatsache, da die in der Suspension der aufge- schlossenen Zellen anwesende chromosomale DNA während der Durchflu zentrifugation nicht fragmentiert wird und damit quantitativ von der extrachromosomalen DNA abgetrennt werden kann.

Die extrachromosomale DNA, die durch das erfindungsgemä e Verfahren aufgereinigt wird, kann linear oder zirkulär, ein- zel- oder doppelsträngig sein. Vorzugsweise ist die DNA eine zirkuläre und doppelsträngige Plasmid-DNA. Die extrachromoso- male DNA enthaltende Zelle kann eine prokaryontische oder eukcryontische Zelle sein, vorzugsweise ist sie eine Bakte- rienzelle, insbesondere eine gram-negative Zelle, wie etwa eine E.coli-Zelle. Gegebenenfalls können Zellen verwendet werden, in denen als extrachromosomale DNA sogenannte artifi- zielle Chromosomen enthalten sind. Artifizielle Chromosomen sind lineare doppelsträngige DNA-Moleküle, die im allgemeinen als YAC (yeast artificial chromosome) bezeichnet werden und in Hefezellen amplifiziert werden.

Die in das erfindungsgemä e Verfahren eingesetzte, extrachro- mosomale DNA enthaltende Flüssigkeit, ist vorzugsweise ein Zell-Lysat. Besonders bevorzugt wird das Zell-Lysat durch alkalische Lyse von extrachromosomale DNA enthaltenden Zellen und anschlie endes Ansäuern hergestellt. Es können aber auch

andere gebräuchliche Zellaufschu methoden verwendet werden, wie beispielsweise die Kombinationen von Enzym- (Lysozym) und Hitzebehandlung.

Es kann jede beliebige Menge an zellulärer Biomasse als Aus- gangsmaterial für das erfindungsgemä e Verfahren eingesetzt werden. Vorzugsweise wird pro Ansatz eine Biomasse von 100 g bis 50 kg lysiert.

Die extrachromosomale DNA enthaltende Flüssigkeit wird im allgemeinen durch Gefälle oder/und Pumpen in die Durchflu zen- trifuge eingeleitet. In dem erfindungsgemä en Verfahren wird eine Durchflu zentrifuge mit einem dem Lyse-Ansatz angepa ten Volumen eingesetzt. Vorzugsweise wird ein Volumen von minde- stens 0,1 bis 50 1, besonders bevorzugt von 0,2 bis 4 1 ver- wendet. Der Zentrifugenbehälter ist vorzugsweise zylinderför- mig ausgebildet. Die Durchflu zentrifuge wird bei einer ge- eigneten g-Zahl, vorzugsweise bei 10.000 bis 40.000 x g be- trieben. Beispiele für kommerziell erhältliche Durchflu zen- trifugen sind "CEPA"-Schnellzentrifugen oder Hochleistungszen- trifungen der Fa. Carr (USA), die momentan eine Kapazität von bis zu 9.000 l/h aufweisen.

Das erfindungsgemä e Verfahren wird im allgemeinen kontinuier- lich durchgeführt. Die Suspension der lysierten Biomasse wird von unten in die Durchflu zentrifuge eingeleitet. Durch die Rotation des Zentrifugengefä es (10.000 - 40.000 x g) scheiden sich feste Bestandteile wie etwa Zellwandbestandteile und an ihr haftende genomische DNA an der Wand des Zentrifugengefä es ab. Die gereinigte extrachromosomale DNA enthaltende Lösung tritt im allgemeinen nach oben aus der Durchflu zentrifuge aus, wobei jedoch auch ein Austreten der extrachomosomale DNA enthaltenden Lösung seitlich, nach unten oder an anderer Stel- le denkbar ist.

Die Durchflu zentrifuge kann mit unterschiedlichen Temperatu- ren betrieben werden, vorzugsweise wird das Verfahren bei 40 C

bis Raumtemperatur durchgeführt.

In dem vorliegenden Verfahren kann extrachromosomale DNA un- terschiedlicher Grö e aufgereinigt werden, vorzugsweise wird extrachromosomale DNA mit einer Grö e von 1 kbp bis 200 kbp aufgereinigt. Die extrachromosomale DNA ist vorzugsweise line- are, zirkuläre oder supercoiled Plasmid-DNA.

Nach dem Verlassen der Zentrifuge kann die extrachromosomale DNA weiter aufgereinigt werden. So wird, um RNA aus der Lösung zu entfernen, gegebenenfalls eine RNase-Behandlung durchge- führt. Weiterhin können auch chromatographische Reinigungs- schritte, wie beispielsweise Anionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie oder Hydroxylapatitchromatographie durchgeführt werden. Beispiele geeigneter Materialien für die Anionenaustauschchromatographie sind organische oder anorga- nische Polymere und Copolymere, wie etwa Polymethacrylat (Ma- kroprep-Biorad, Deutschland), Polystyrol-Divinylbenzol (Poros- Perseptive, HyperD-Biosepra, Source-Pharmacia) oder Silicagel, an deren Oberfläche positiv geladene Gruppen z. B. Diethylami- noethyl (DEAE) oder Dimethylaminoethyl (DMAE) - Gruppen gebun- den sind. Ein besonders bevorzugtes Material für die Anionen- austauschchromatographie ist Q-Sepharose. Ein besonders bevor- zugtes Material für die Affinitätschromatographie ist Hydrox- ylapatit.

Darüber hinaus kann die erhaltene DNA-Lösung zur weiteren Rei- nigung, Konzentrierung oder/und Umpufferung einer Cross-Flow- Filtration ausgesetzt werden. Bei dieser Cross-Flow-Filtration kann auch eine weitgehende Entfernung von Endotoxinen aus der DNA-Präparation erreicht werden. Dazu wird die DNA-Lösung tangential an einer oder mehreren semipermeablen Membranen vorbeigeleitet, deren Ausschlu grö e so gewählt wird, da die DNA-Moleküle von den Membranen zurückgehalten werden und Sub- stanzen mit einem geringeren Molekulargewicht durch die Mem- branen durchtreten können, wobei eine endotoxinfreie DNA-Lö- sung erhalten wird.

Die nach dem erfindungsgemä en Verfahren erhaltene extrachro- mosomale DNA ist im wesentlichen unbeschädigt und weist im wesentlichen keine Einzel- oder Doppel-Strangbrüche auf. Ins- besondere zeigt eine erfindungsgemä aufgereinigte Plasmid-DNA nach gelelektrophoretischer Auftrennung nur eine dominante Bande, die der Konformation "Covalently Closed Circle" ent- spricht. Des weiteren sind neben den Konformationen "Open Circle" und "Linearized Circle" entsprechenden Banden keine weiteren Banden vorhanden.

Die nach dem erfindungsgemä en Verfahren erhaltene DNA kann ohne weiteres für übliche molekularbiologische und medizi- nische Anwendungen, wie etwa zum Klonieren, zur Transforma- tion, zur Transfektion, zur Mikroinjektion in Zellen, zur Verwendung bei Verfahren der Gentherapie, der DNA-Vakzinierung oder/und zur Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) verwendet wer- den.

In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Durchflu zentrifuge zur Aufreinigung von extrachromosomaler DNA.

Beispiel In dem durchgeführten Versuch wird eine CEPA-Laborzentrifuge LE (offene Ausführung) mit einem Klärzylinder aus rostfreiem Stahl (1.4571, V4A) verwendet. Ca.2.000 g Biomasse werden nach der Alkali-Lysemethode (modifiziertes Verfahren nach Birnboim & Doly Birnboim & Doly, Nucl. Acid Res. 7 (1979) 1513-1523) aufgeschlossen.

1. Lyse der E.coli Biomasse 2.000 g feuchte E.coli Biomasse wird aus dem Fermenter in entpyrogenisierte Becher abgefüllt. Es werden 22,5 1 Resuspen- sionspuffer (50 mmol/l Tris-HCl, 10 mmol/l EDTA-Na2, pH 8 + 0,2) zugegeben und mindestens 24 Stunden bei 5 + 40 C langsam

(ca. 35 RPM) gerührt, bis die Biomasse vollständig suspendiert ist. Dann wird die Temperatur der Suspension langsam auf 250 C erhöht. Zur Suspension werden 22,5 1 0,2 mol/l NaOH, 1 % SDS unter Rühren mit ca. 80 RPM zugegeben und bei 250 C 5 Minuten inkubiert. Es werden 22,5 1 Kaliumacetatpuffer (3 mol/l Kali- umacetatpuffer pH 5,5) unter Rühren zugefügt und die Tempera- tur der Biomasse möglichst schnell auf 40 C abgesenkt. Der erhaltene Aufschlu wird mit Hilfe der Durchflu zentrifuge im "'continuous-flow-through-mode" klarfiltriert.

2. Durchflu zentrifugation Die viskose Suspension wird durch die Einla öffnung in die Durchflu zentrifuge gepumpt. Die Zentrifuge wird dabei mit einer g-Zahl von 10.000-18.000 x g betrieben. Sobald austre- tende Flüssigkeit trüb wird, ist der Niederschlag vom Zylinder zu entfernen und nach Einsetzen des gereinigten Zylinders die Zentrifugation fortzusetzen. Die klare von den zellulären Verunreinigungen befreite Plasmid-DNA-Lösung tritt nach oben aus der Durchflu zentrifuge aus und wird in einem Gefä gesam- melt.

3. Weitere Aufreinigungsschritte: Q-Sepharose-Chromatographie, Hydroxylapatit-Chromatographie und Cross-Flow-Filtration In einem nächsten Schritt wird eine Chromatographie an Q-Se- pharose und Hydroxylapatit durchgeführt. Der dekantierte Zen- trifugenüberstand wird durch Zugabe von TE-Puffer (10 mmol/l Tris-HCl, 1 mmol/l EDTA pH 8,5 + 0,2) auf 49 - 50 mS/cm Leit- fähigkeit eingestellt und auf 5 + 40 C abgekühlt. Die gesamte Chromatographie wird bei dieser Temperatur durchgeführt. Der Zentrifugationsüberstand wird auf die aquilibrierte Säule aufgezogen. Anschlie end wird die Säule mit ca. 8 SV 10 mmol/l Tris-HCl, 1 mmol/l EDTA, 0,65 mol/l NaCl pH 8,5 + 0,2 gewa- schen.

Zur Elution wird an die Säule ein Gradient (5 SV Puffer A (10 mmol/l Tris-HCl, 1 mmol/l EDTA, 0,65 mmol/l NaCl pH 8,0 + 2), 5 SV Puffer B (10 mmol/l Tris-HC1, 1 mmol/l EDTA, 0,85 mol/l NaCl pH 8,0 + 0,2)) angelegt und das Eluat fraktioniert, die Detektion erfolgt bei 254 nm. Der Vorpeak (Verunreinigungen) wird vom Hauptpeak (Plasmid-DNA) abgetrennt, indem der Haupt- peak ab ansteigender Flanke in einem separatem Gefä aufgefan- gen wird.

Im folgendem wird eine Chromatographie an Hydroxylapatit (MA Ceramic) bei 5 + 40 C durchgeführt.

Äquilibrierungspuffer: 0,1 mol/l Kaliumphosphat, 6 mol/l Harn- stoff pH 7, 0 + 0,2.

Waschpuffer 1: 0,15 mol/1 Kaliumphosphat, 6 mol/l Harnstoff pH 7,0 + 0,2.

Waschpuffer 2: 0,02 mol/l Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 + 0,2.

Elutionspuffer: 0,5 mol/l Kaliumphosphat pH 7,0 + 0,2.

Die Detektion erfolgt bei 254 nm mit einer W-Detektor/Schrei- bereinheit. Als Eichlösung wird eine 1 % Produktlösung (Plas- mid-DNA) , vermessen mit einem kalibrierten Photometer, ver- wendet.

Der Q-Sepharose-Pool wird auf eine Endkonzentration von 1,1 mmol/l Calciumchlorid gebracht und auf die äquilibrierte Säule aufgezogen.

Anschlie end wird die Säule nacheinander gewaschen mit: 1. 0,1 mol/l Kaliumphosphat, 6 mol/l Harnstoff pH 7,0 + 0,2, bis am Detektor keine Absorption mehr erkennbar ist.

2. 2-4 SV, 0,15 mol/l Kaliumphosphat, 6 mol/l Harnstoff pH 7,0 + 0,2.

3. 5 SV, 0,02 mol/l Kaliumphosphat pH 7,0 + 0,2.

Im Anschlu an die Waschschritte wird mit 0,5 mol/1 Kalium- phosphatpuffer pH 7,0 + 0,1 bei einer Flu rate von 5-6 SV/h eluiert.

Der Peak wird gesammelt und mit einer Cross-Flow-Filtration auf ca. 50 ml konzentriert. Die CFF wird mit einer Retentat- durchflu rate von 100-200 l/him2, einem Transmembrandruck von ca. 0,8 bar und einem Überströmdruck von ca. 1,2 bar durch- geführt. Anschlie end wird das Retentat gegen TE-Puffer (10 mmol/l Tris/HCl, 1 mmol/l EDTA, pH 8.0) flie end diafiltriert, bis die Werte für pH und Leitfähigkeit von Retentat und TE- Puffer übereinstimmen. Nach Beendigung des Diafiltrationsvor- ganges wird das Retentat durch Verdünnung mit Diafiltrations- puffer auf eine Plasmid-DNA-Konzentration von 1 mg/ml einge- stellt.

4. Gelelektrophorese Die Intaktheit der erhaltenen Plasmid-DNA wird mittels Aga- rose-Gelelektrophorese überprüft.

Dazu wird ein Aliquot der Plasmid-DNA in verschiedenen Konzen- trationen auf ein Agarosegel aufgetragen. Das dargestellte Agarosegel zeigt in den Spuren 1 und 10 den DNA-Längenstandard Nr. II (Fragmentgrö en: 125, 564, 2027, 2322, 4361, 6557, 9416, 23130 bp) und in den Spuren 2 und 9 DNA-Längenstandard III (Fragmentgrö en: 125, 564, 831, 947, 1375, 1584, 1904, 2027, 3530, 4268, 4973, 5148, 21226 bp). Als Vergleichplasmid ist in Spur 3 pBR322 (4162 bp) aufgetragen, das nach konven- tioneller Cäsiumchloridgradientenmethode aufgereinigt wurde.

Es ist bekannt, da nach dieser Methode gereinigte Plasmid-DNA im wesentlichen Plasmid-DNA enthält, die der Konformation "Covalently Closed Circle" (dominante "Supercoiled-Bande") entspricht. In den Spuren 4, 5 und 6 ist die nach dem erfin- dungsgemä en Verfahren aufgereinigte Plasmid-DNA (pCMV-CAT) in unterschiedlichen Mengen aufgetragen.

Diese Plasmid-DNA war im Anschlu an das erfindungegemä e Verfahren über Q-Sepharose und Hydroxylapatit-Chromatographie, sowie Cross-Flow-Filtration weitergereinigt worden.

Legende: 1%ges Agarosegel Spur 1: DNA-Längenstandard II (Boehringer Mannheim GmbH, Kat.-Nr. 236250) Spur 2: DNA-Längenstandard III (Boehringer Mannheim GmbH, Kat.-Nr. 528552) Spur 3: pBR322 (Boehringer Mannheim GmbH, Kat.-Nr. 481238) (0,4 Ug) Spur 4: pCMV-CAT nach CFF, 0,19 yg (Bulk-Wirkstofflösung) Spur 5: pCMV-CAT nach CFF, 0,45 Hg (Bulk-Wirkstofflösung) Spur 6: pCMV-CAT nach CFF, 0,71 ijg (Bulk-Wirkstofflösung) Spur 7: TE-Puffer Spur 8: pBR322 (Boehringer Mannheim GmbH, Kat.-Nr. 481238) (0,4 Ug) Spur 9: DNA-Längenstandard III (Boehringer Mannheim GmbH, Kat.-Nr. 528552) Spur 10: DNA-Längenstandard II (Boehringer Mannheim GmbH, Kat.-Nr. 236250) Die erfindungsgemä gereinigte Plasmid-DNA zeigt wie auch die Vergleichsplasmid-DNA (Spur 3) im wesentlichen eine dominante Bande. Dies zeigt, da die erfindungsgemä gewonnene Plasmid- DNA nicht geschädigt wird und in ihrer ursprünglichen Konfor- mation erhalten bleibt. Au erdem zeigt das Fehlen von zusätz- lichen Banden in dem Agarosegel, da die in der aufgeschlosse- nen Zellsuspension enthaltene chromosomale DNA während der Durchlaufzentrifugation nicht fragmentiert wird, sondern als präzipitiertes Makromolekül vollständig von der Plasmid-DNA abgetrennt werden kann.